BRPI0610253A2 - processo para hidrólise enzimática de arabinoxilano, produto, composição para hidrólise de arabinoxilano, e, uso da mesma - Google Patents

Abstract

A presente invenção se refere a um processo para hidrólise enzimática de arabinoxilano, e uma composição enzimática adequada para uso em um tal processo.

Description

"PROCESSO PARA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE ARABINOXILANO,PRODUTO, COMPOSIÇÃO PARA HIDRÓLISE DE ARABINOXILANO,E, USO DA MESMA"

A presente invenção compreende uma listagem de seqüências.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a um processo para hidróliseenzimática de arabinoxilano, e uma composição enzimática adequada parauso em um tal processo.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Arabinoxilano, um polissacarídeo composto de xilose earabinose, é parte da fibra solúvel e insolúvel em água presente em cereais,em particular nas paredes celulares. Hidrólise de arabinoxilano é um pré-requisito importante para utilização melhorada de hemicelulose de cereal, e.g.na indústria de fermentação de etanol e outras indústrias baseadas em cereais.

Arabinoxilano consiste de resíduos de alfa-L-arabinofuranoseacoplados como pontos de ramificação a um esqueleto polimérico de xilosebeta-(l-4)-ligada. Os resíduos de xilose podem ser monossubstituídos naposição C2 ou C3 ou dissubstituídos tanto na posição C2 como C3. Emadição, ácido ferúlico e ácido p-cumárico podem ser covalentemente ligados aarabinoxilano através de esterificação na posição C5 de algumas das unidadesde arabinosil. Estas substituições no esqueleto de xilano retardam as ações dexilanases e a hidrólise completa de arabinoxilano assim requer tanto clivagemde grupo lateral como atividades despolimerizantes. Os principais produtos dehidrólise de arabinoxilano são os açúcares C5 xilose e arabinose.

Um processo para hidrólise de arabinoxilano usando interaçõessinergísticas entre enzimas apresenta composições enzimáticas comerciais deHumicola insolence e Trichoderma reesei foi previamente descrito pelospresentes inventores em Sorensen, H.R. et al. (Biotechnology andBioengineering, Vol. 81, No. 6, March 20, 726-731, 2003). Hidrólisecatalisada por enzima de > 50% da parte solúvel do arabinoxilano deendosperma de trigo pode ser atingida, mas apenas baixos rendimentos demonossacarídeos foram obtidos com tratamentos enzimáticos similares emarabinoxilano de trigo insolúvel. Entretanto, uma vez que as atividadesenzimáticas degradadoras de arabinoxilano estão presentes como atividadeslaterais em preparações comerciais tendo outras atividades enzimáticas comosua atividade principal, altos níveis de dosagem de 5 - 10 %-p da preparaçãode enzima por peso do substrato devem ser adicionados para obter hidróliseeficiente.

Tais altos níveis de adição de enzima não são viáveis para usoem aplicações de produção em escala natural e processos melhorados parahidrólise de arabinoxilano são assim necessárias.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os inventores encontraram processos melhorados parahidrólise de arabinoxilano e uma composição enzimática adequada para usoem um tal processo. No processo da invenção um substrato contendoarabinoxilano é colocado em contato com uma enzima tendo atividade paraxiloses dissubstituídas, e.g. tal como uma alfa-L-arabinofuranosidase deFamília de Glicosídeo Hidrolase 43 (GH43), e uma enzima tendo atividadepara xiloses monossubstituídas em posição C2 ou C3, e.g. tal como uma alfa-L-arabinofuranosidase de Família de Glicosídeo Hidrolase 51, 54 ou 62(GH51,GH54 ou GH62).

Por conseguinte a invenção fornece em um primeiro aspectoum processo compreendendo adicionar a um substrato contendo arabinoxilanouma enzima tendo atividade para xiloses dissubstituídas, e, uma enzima tendoatividade para xiloses monossubstituídas em posição C2 ou C3.

A invenção fornece em um segundo aspecto uma composiçãopara hidrólise de arabinoxilano dita composição compreendendo uma enzimatendo atividade para xiloses dissubstituídas, e, uma enzima tendo atividadepara xiloses monossubstituídas em posição C2 ou C3.

A invenção fornece em aspectos adicionais usos dacomposição do segundo aspecto.

BREVE DESCRIÇÃO DAS ILUSTRAÇÕES

Fig. 1A-C mostram polímeros de arabinoxilano:

Fig. IA mostra arabinoxilano intacto. Resíduos dearabinofuranosil ligados a xiloses internas alfa(l—>3) (monossubstituídas) ealfa(l—»2) e alfa(l—>3) (dissubstituídas).

Fig. 1B mostra arabinoxilano dissubstituído. Resíduos dearabinofuranosil ligados a xiloses internas alfa(l—>2) e alfa(l—>3)(dissubstituídas).

Fig. 1C mostra arabinoxilano unicamente substituído.Resíduos de arabinofuranosil ligados a xiloses internas alfa(l—>2) ealfa(1^3)(monossubstituídas).

Fig. 2 A-C mostram arabinoxilo-oligossacarídeos:

Fig. 2A mostra grupos arabinosil ligados a C-3 interno.Resíduos de arabinofuranosil ligados a xiloses internas alfa( 1—>3)(monossubstituídas) e alfa(l—*2) e alfa(l—»3) (dissubstituídas).

Fig. 2B mostra grupos arabinosil ligados a C-3 terminal.Resíduos de arabinofuranosil ligados a xiloses terminais alfa(l—>3)(monossubstituídas) e a xiloses internas alfa(l—>2) e alfa(l—>3)(dissubstituídas).

Fig. 2C mostra grupos arabinosil ligados a C-2 interno.Resíduos de arabinofuranosil ligados a xiloses internas alfa(l—>2) ealfa(1^3)(monossubstituídas).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Na descrição e reivindicações que seguem as seguintes sãodefinições de alguns dos termos técnicos que são empregados.

A numeração de Famílias de Glicosídeo Hidrolase aplicadanesta descrição segue o conceito de Coutinho, P.M. & Henrissat, B. (1999)CAZy - Carbohydrate Active Enzymes server at URL: http://afmb.cnrs-mrs.fr/-cazv/CAZY/index.html ou alternativamente Coutinho, P.M. &Henrissat, B. 1999; The modular structure of celulases and othercarbohydrate-active enzymes: an integrated database approach. In "Genetics,Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation"., K. Ohmiya, K.Hayashi, K. Sakka, Y. Kobayashi, S. Karita and T. Kimura eds., UniPublishers Co., Tokyo, pp. 15-23, e Bourne, Y. & Henrissat, B. 2001;Glycoside hydrolases and glycosyltransferases: families and functionalmodules, Current Opinion in Structural Biology 11:593-600.

O termo "amido granular" no contexto da presente invenção éentendido como amido não cozido bruto, i.e. amido que não foi sujeito a umagelatinização.

O termo "biomassa" significa no contexto da presenteinvenção todos os materiais contendo hemicelulose. Biomassa é um recursomuito heterogêneo e quimicamente complexo compreendendo subprodutos deprocessamento agrícola e industrial de todas as formas de material vegetal. Abiomassa pode ser qualquer matéria orgânica derivada de planta incluindosafras herbáceas e lenhosas energéticas, safras agrícolas de subsistência eforrageiras, resíduo de safra agrícola e resíduos tal como palha, caules, folhas,farelo de milho, cascas, espigas, raspa, cascas, e vagens, resíduo de madeiratal como cortiça, aparas, serragem, polpa de madeira e licor de polpação. Abiomassa pode incluir biomassa de resíduo, tal como papel, papelão velho,resíduo de madeira de construção e demolição. A biomassa também podeincluir lodo ou sólidos recuperados de tratamento de água residual industrialou municipal assim como de estrume animal.

O "substrato contendo arabinoxilano" a ser tratado no processoda presente invenção pode ser obtido de qualquer fonte vegetal, em particularser obtido de tubérculos, raízes, caules, legumes, cereais ou grão integral.Preferidos são produtos residuais agrícolas contendo hemicelulose (i.e.resíduos e/ou subprodutos) tal como cascas de mandioca, vagens de cacau,cascas e/ou cascas de arroz, farelo de arroz de polimento de arroz, espigas,palha, cascas e/ou cascas de grão de cereal, palha de cana-de-açúcar prensada,polpa de beterraba açucareira, polpa de alfarroba ou outras polpas dehortaliças ou frutas. O substrato pode ser qualquer biomassa.

Preferido é um substrato obtido de grão de cereal, e.g. tal comogrão moído ou subprodutos de processamento de grão de cereal, e.g. umsubproduto contendo arabinoxilano de moagem úmida ou a seco de cereal. Ogrão de cereal pode ser qualquer grão de cereal embora seja preferido um grãode cereal selecionado a partir do grupo consistindo de milho (mais), trigo,cevada, aveia, arroz, sorgo e milheto. Mais preferido para a presente invençãoé um substrato contendo arabinoxilano derivado de trigo.

O substrato contendo arabinoxilano pode ser o grão ou misturade uma produção de cerveja e/ou processo de fermentação, ou ele pode ser umsubproduto de uma produção de cerveja e/ou processo de fermentação, e.g.grão úmido ou seco de destilaria, bagaço de malte, vinhaça, bagaço etc.

Substratos contendo arabinoxilano normalmente compreendemtanto arabinoxilano solúvel em água como insolúvel em água. Contempladopara os aspectos da presente invenção é substratos compreendendoarabinoxilano solúvel em água e/ou arabinoxilano insolúvel em água.

Processos

O processo do primeiro aspecto, caracterizado pelo fato de queum substrato contendo arabinoxilano com atividades enzimáticascompreendendo uma enzima tendo atividade para xiloses dissubstituídas, euma enzima tendo atividade para xiloses monossubstituídas em posição C2 ouC3 é particularmente adequado para a produção de polímeros lineares dexilose (homopolímero de xilano) com poucos ou nenhum grupo lateral dearabinose. Em uma forma de realização preferida a enzima tendo atividadepara xiloses dissubstituídas é uma alfa-L-arabinofuranosidase de GH43, euma enzima tendo atividade para xiloses monossubstituídas em posição C2 ouC3 é uma alfa-L-arabinofuranosidase de GH51, GH54 ou/ou GH62, maispreferivelmente a GH51.

Quando as duas arabinofuranosidases são adicionadas a umasolução de arabinoxilano os produtos resultantes serão polímeros lineares dexilose e moléculas de arabinose de alto peso molecular. Isto irá levar em contauma fácil separação do polímero linear de xilose por técnicas conhecidas(ultrafiltração ou precipitação de solvente do xilano em uma solução deetanol) de arabinose.

Os polímeros lineares de xilose podem ser adicionalmentedigeridos parcialmente com atividades enzimáticas, tal como uma beta-xilosidase, e/ou uma endo-1,4-beta-xilanase, para produzir xilo-oligossacarídeos, que também têm aplicações dietéticas. Preferivelmente abeta-xilosidase é uma beta-xilosidase de GH3, e/ou preferivelmente a endo-1,4-beta-xilanase é uma endo-l,4-betaxilanase de GH10 ou GH11.

Quando uma endo-l,4-beta-xilanase é adicionada aospolímeros lineares de xilose purificados (purificados como descrito acima) osprodutos resultantes serão xilo-oligossacarídeos essencialmente livres degrupos laterais de arabinose. O tamanho dos ohgossacarídeos pode sercontrolado pela dose da endo-l,4-beta-xilanase assim como pelo comprimentodo tempo de reação.

Quando tanto uma endo-l,4-beta-xilanase como uma beta-xilosidase são adicionadas aos polímeros lineares de xilose purificados oproduto resultante será xilose.

Assim a invenção fornece um processo para obter um polímerolinear de xilose essencialmente livre de substituintes de arabinose, umprocesso para obter um produto de xilo-oligossacarídeo essencialmente livrede grupos laterais de arabinose e um processo para separar xilose e arabinosede uma maneira mais simples do que tecnologia prévia (cromatografia detroca iônica).

Além disso a invenção fornece um produto de polímero linearde xilose de alto peso molecular e essencialmente livre de grupos laterais dearabinose e um produto de xilo-oligossacarídeo essencialmente livre degrupos laterais de arabinose.

Preferivelmente o produto de polímero de xilose linear ouproduto de xilo-oligossacarídeo compreende pelo menos 50%, pelo menos60%, pelo menos 70%, pelo menos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 90%,pelo menos 95%, tal como pelo menos 98% de polímero em peso do produtocujo polímero tem um grau de polimerização de pelo menos 3, pelo menos 4,pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelomenos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelomenos 35, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelomenos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 120 pelo menos 150,pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 500, pelo menos 1000, pelomenos 2000, pelo menos 5000, ou pelo menos 10000.

Preferivelmente o produto de polímero de xilose linear ouproduto de xilo-oligossacarídeo compreendendo pelo menos 50%, pelo menos60%, pelo menos 70%, pelo menos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 90%,pelo menos 95%, tal como pelo menos 98% de polímero em peso do produtocujo polímero tem um grau de polimerização de menos do que 5000, menosdo que 2500, menos do que 1500, menos do que 1000, menos do que 500,menos do que 100, menos do que 75, menos do que 50, menos do que 25,menos do que 10, menos do que 9, menos do que 8, menos do que 7, menosdo que 6, menos do que 5, e preferivelmente menos do que 4.

Preferivelmente o produto de polímero de xilose linear ouproduto de xilo-oligossacarídeo compreende pelo menos 50%, pelo menos60%, pelo menos 70%, pelo menos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 90%,pelo menos 95%, tal como pelo menos 98% de polímero em peso do produtocujo polímero tem um grau de polimerização selecionado a partir do grupoconsistindo dos intervalos de 3 a 10, de 11 a 25, de 26 a 50, de 51 a 100, de-101 a 200, de 201 a 500, de 501 a 1000, de 1001 a 5000, e de 5001 a 10000.

Os polímeros lineares de xilose produzidos podem ser usadoscomo um aditivo alimentar, e.g. como um agente de corpo, um substituto degordura de baixa caloria ou fibra dietética, tal como uma fibra dietética nãosolúvel. Aplicações serão e.g. em bolos, aperitivos extrusados, outrosprodutos de cereais, e confeitaria. Aplicações técnicas irão incluir aditivo paraprodutos de papel e polpa, materiais plásticos (películas), onde plastificantespodem ser adicionados, e como um agente de encolamento.

O produto de xilo-oligossacarídeo terá aplicações como fibrasdietéticas, tal como fibras dietéticas solúveis. Estas fibras dietéticas podem serusadas para aumentar a quantidade de bactérias bífidicas no intestino inferior.

Aplicações serão e.g. em iogurte, sorvete, e refrigerantes.

Uma forma de realização do primeiro aspecto, caracterizadapelo fato de que atividades enzimáticas adicionais estão presentes, tal comouma beta-xilosidase de GH3, e/ou uma endo-l,4-beta-xilanase de GH10 éparticularmente útil quando mais hidrólise completa de arabinoxilano édesejada. Além de liberar açúcares C5 a hidrólise de arabinoxilano tambémcria polímeros associados de glicose tal como amido e celulase maisacessíveis para a ação das enzimas apropriadas. Isto é particularmente útilquando degradação de substratos complexos é requerida, e.g. em fermentaçãoou em hidrólise de amido ou biomassa para produção de combustível deetanol, ou em composição de ração animal.

Xilose e/ou arabinose liberadas durante hidrólise enzimática dearabinoxilano no processo do primeiro aspecto e/ou segundo aspecto podemser usadas como uma fonte de xilose e/ou arabinose como tal, ou comomatéria-prima para síntese química/enzimática ou processos de fermentação,e.g. para produção de xilitol, ácido xilárico, ácidos xilônicos, ácido arabônico,ácido arabinóico, 2,3-butanodiol, ácido láctico, ácido lactônico, furanos e/ouetanol.

Para degradação de substratos ainda mais complexos, ou ondeuma degradação mais completa é requerida, a presença de atividadesenzimáticas ainda adicionais pode ser desejada. Em uma forma de realizaçãopreferida a(s) atividade/atividades de enzima compreendem adicionalmenteum acetil xilano esterase (EC 3.1,1.72) e/ou uma feruloil esterase (EC3.1,1.73) e/ou uma alfa-glucuronidiase (EC 3.2.1,139).

Em uma forma de realização do processo do primeiro aspectoa(s) atividade/atividades de enzima compreendem adicionalmente umaenzima selecionada a partir da lista consistindo de um acetil xilano esterase,uma feruloil esterase, uma alfa-amilase, uma glucoamilase, uma fitase e umaprotease.

Em produção de cerveja e outros processos de fermentaçãobaseados em cereal arabinoxilanos de grãos podem ser extraídos de paredescelulares com água quente e podem formar soluções de alta viscosidade. Seem processos de fermentação são usados maltes que não são adequadamentemodificados durante maltagem, extratos de malte podem conter altos níveis dearabinoxilanos e outros polissacarídeos causando um aumento em viscosidadedos extratos. As dificuldades associadas com a filtração de tais extratospodem diminuir significantemente a velocidade do processo de fermentação.Em uma forma de realização da presente invenção o substrato contendoarabinoxilano a ser colocado em contato com a composição da invenção é ummalte moído de um processo de fermentação de cerveja, através do qual e.g. aviscosidade do malte moído é reduzida e/ou polissacarídeos adicionaisliberados.

Em uma forma de realização da presente invenção o processo équalquer processo de etanol, baseado em hidrólise enzimática de amidogelatinizado ou granular, e.g. em amido granular como descrito emW02004080923 ou W02004081193. Colocando em contato o malte moídocom a composição da invenção a viscosidade do malte moído pode serreduzida. Também polissacarídeos adicionais podem ser liberados, não apenascomo açúcares C5 mas também como glicose quando a degradação dearabinoxilano deixa o amido mais acessível para enzimas amilolíticasnormalmente presentes durante tais processos. Uma enzima adicional quepode ser vantajosamente aplicada em um processo de etanol baseado emamido é uma enzima selecionada a partir da lista consistindo debeta-glucanase, alfa-amilase, glucoamilase, CGTase, fitase e protease.

O processo da presente invenção pode ser qualquer processode etanol, compreendendo hidrólise enzimática de biomassa e/ou efluente depré-tratamento de biomassa. Uma enzima adicional que pode servantajosamente aplicada em um processo de etanol baseado em biomassa éuma enzima selecionada a partir da lista consistindo de beta-glucanase,celulase, celobiohidrolase, e beta-glucosidase.

Em um processo de fermentação o hidrolisado dearabinoxilano pode vantajosamente ser colocado em contato com umalevedura ou outro organismo fermentador capaz de utilizar açúcares C5.

Alternativamente, o hidrolisado de arabinoxilano pode ser colocado emcontato com uma xilose isomerase (EC 5.3.1,5) para isomerização de xiloseem xilulose que é fermentável para etanol usando uma leveduraSaccharomyces.

A composição da invenção também pode ser usada emprocessamento de uma matéria-prima de cereal pretendida para uso como umproduto de ração/alimento ou a composição pode ser aplicada como umaditivo de ração/alimento. Tais aditivos de ração/alimento baseados emenzimas podem ser incorporados em um produto de ração/alimento baseadoem cereal que inclui um ou mais de trigo, cevada, triticale, centeio, arroz emilho. O aditivo de ração/alimento tem a vantagem de melhorar a proporçãode conversão de ração/alimento e/ou aumentar a digestibilidade do produto deração/alimento baseado em cereal no qual ele está incluído. A composição dainvenção usada como aditivo de ração/alimento pode preferivelmente serusada junto com uma fitase.

A presente invenção além disso se refere uma composição paratratar um substrato contendo arabinoxilano, dita composição compreendendouma enzima tendo atividade para xiloses dissubstituídas, e.g. tal como umaalfa-L-arabinofuranosidase de GH43, e uma enzima tendo atividade paraxiloses substituídas em posição C2 ou C3, e.g. tal como uma alfa-L-arabinofuranosidase de GH51, GH54 ou GH62.

A presente invenção se refere adicionalmente a composiçõescompreendendo uma alfa-L-arabinofuranosidase de GH43, uma alfa-L-arabinofuranosidase de GH51, GH54 ou GH62, uma beta-xilosidase, e/ouuma endo-l,4-beta-xilanase, assim como a composição compreendendo asatividades acima mencionadas e uma enzima selecionada a partir do grupoconsistindo de alfa-amilase, CGTase, glucoamilase, fitase, protease, beta-glucanase, celulase, celobio-hidrolase, e/ou beta-glicosidase.

A composição pode compreender alfa-L-arabinofuranosidasede GH43 em uma quantidade de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelomenos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos40%, pelo menos 50%, pelo menos 70%, ou mesmo pelo menos 80% w/w deproteína enzima arabinofuranosidase total presente na composição. Maispreferivelmente a composição pode compreender alfa-L-arabinofuranosidasede GH43 em uma quantidade de pelo menos 5%, tal como pelo menos 10%pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelomenos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 70% w/w de proteína enzima totalpresente na composição.

A composição pode ser usada para tratamento de um substratocontendo arabinoxilano, e.g. em um processo de fermentação, e.g. pararedução de viscosidade de uma pasta e/ou solução compreendendo umsubstrato contendo arabinoxilano. A composição pode ser usada para produzirum produto de ração/alimento, e.g. para produzir ou modificar uma fibranutricional/dietética e/ou para produzir uma xilose, arabinose e/ou xiloselinear ou para produzir derivados de xilose, arabinose por fermentação,processamento enzimático ou síntese química.

A invenção além disso fornece um processo, caracterizadopelo fato de que um substrato e/ou uma biomassa contendo arabinoxilano écolocado em contato com uma enzima arabinofuranosidase capaz de liberararabinose de xiloses dissubstituídas. Preferivelmente a enzima capaz deliberar arabinose de xiloses dissubstituídas é uma arabinofuranosidase.Preferivelmente a alfa-L-arabinofiiranosidase é uma alfa-L-arabinofuranosidase de GH43. A alfa-L-arabinofuranosidase de GH43 épreferivelmente derivada de origem bacteriana, fungica ou vegetal.

Preferivelmente o substrato e/ou a biomassa contendoarabinoxilano é selecionado a partir da lista consistindo de safras herbácease/ou lenhosas energéticas, safras agrícolas de subsistência e forrageiras,produtos de ração animal, tubérculos, raízes, caules, legumes, cascas demandioca, vagens de cacau, cascas e/ou tampas de arroz, farelo de arroz,espigas, palha, tampas, cascas, polpa de beterraba açucareira, polpa dealfarroba, polpas de hortaliças, resíduo de safra agrícola, palha, talos, folhas,farelo de milho, cascas, espigas, raspa, cascas, vagens, resíduo de madeira,cortiça, aparas, serragem, polpa de madeira, licor de polpação, papel, papelãovelho, resíduo de madeira, sólidos de água residual industrial ou municipal,estrume, subproduto de produção de cerveja e/ou processos de fermentação,grão úmido de destilaria, grão seco de destilaria, bagaço de malte, vinhaça ebagaço.

EnzimasAlfa-L-arabinofuranosidase tendo atividade para xiloses dissubstituídas

A enzima tendo atividade para xiloses dissubstituídas, e.g. talcomo uma alfa-L-arabinofuranosidase de GH43, pode ser de origemmicrobiana, e.g. derivável de uma linhagem de um fungo filamentoso (e.g.,Humicola, Aspergillus, Trichoderma, Fusarium, Penicillum) ou de umabactéria (e.g. Bacillus, Bifidobacterium). Uma tal enzima adequada pode serselecionada pelo ensaio para atividade de alfa-arabinofuranosidase emarabinoxilano dissubstituídos na seção de métodos.

Preferivelmente a alfa-L-arabinofuranosidase de GH43 éderivada de Humicola insolens. Mais preferivelmente a alfa-L-arabinofuranosidase de GH43 é o polipeptídeo mostrado como SEQ ID NO:l,mais preferivelmente o polipeptídeo mostrado como aminoácidos 19-558 deSEQ ID NO:l, ou ainda mais preferivelmente um polipeptídeo que tem pelomenos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidadecom a seqüência de aminoácidos mostrada como aminoácidos 19-558 de SEQID NO:l (daqui por diante "polipeptídeos homólogos").

A alfa-L-arabinofuranosidase de GH43 também pode serderivada de Bifidobacterium adolescenti. Mais preferivelmente a alfa-L-arabinofuranosidase de GH43 é a enzima descrita por Van Laere, 1997, emAppl.Microbiol.Biotechnol, 47, 231-235 e/ou por Van den Broek, 2005, emApplied Microbiology and Biotechnology.

Uma enzima tendo atividade para xiloses dissubstituídas, e.g.tal como uma alfa-L-arabinofuranosidase de GH43, pode ser adicionada emquantidades de 0,001-1,0 g/kg DM de substrato, preferivelmente nasquantidades de 0,005-0,5 g/kg DM de substrato, e mais preferivelmente de0,05-0,10 g/kg DM de substrato.

Alfa-L-arabinofuranosidase tendo atividade para xiloses monossubstituídas

A enzima tendo atividade para xiloses monossubstituídas emposição C2 e/ou C3, e.g. tal como uma alfa-L-arabinofuranosidase de GH51,GH54 ou GH62, pode ser de origem microbiana, tal como derivável de umalinhagem de um fungo filamentoso (e.g., Meripilus, Humicola, Aspergillus,Trichoderma, Fusarium, Penicillum) ou de uma bactéria (e.g. Bacillus).Preferivelmente a enzima é uma alfa-L-arabinofuranosidase de GH51, e aindamais preferivelmente a alfa-L-arabinofuranosidase GH51 é derivada deMeripilus giganteus. O polipeptídeo pode preferivelmente ter pelo menos75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%,pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade com aseqüência de aminoácidos mostrada como aminoácidos 17-643 de SEQ IDNO:2 (daqui por diante "polipeptídeos homólogos"). Mais preferivelmente aalfa-L-arabinofuranosidase é o polipeptídeo mostrado como SEQ ID NO:2,ainda mais preferivelmente o polipeptídeo mostrado como aminoácidos 17-643 de SEQ ID NO:2.

Alfa-L-arabinofuranosidase de GH51, GH54 ou GH62 podeser adicionada em quantidades de 0,001-1,0 g/kg DM de substrato,preferivelmente nas quantidades de 0,005-0,5 g/kg DM de substrato, e maispreferivelmente de 0,05-0,10 g/kg DM de substrato.

Beta-xilosidase

A beta-xilosidase é preferivelmente uma beta-xilosidase deGH3. A beta-xilosidase pode ser de origem microbiana, tal como derivável deuma linhagem de um fungo filamentoso (e.g., Trichoderma, Meripilus,Humicola, Aspergillus, Fusarium) ou de uma bactéria (e.g. Bacillus).Preferivelmente a beta-xilosidase é uma beta-xilosidase de GH3 derivada deTrichoderma reesei e mais preferivelmente a beta-xilosidase de GH3 é opolipeptídeo mostrado como SEQ ID NO:3 ou um polipeptídeo que tem pelomenos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidadecom a seqüência de aminoácidos mostrada como aminoácidos de SEQ IDNO:3 (daqui por diante "polipeptídeos homólogos"). Betaxilosidase de GH3pode ser adicionada em quantidades de 0,001-1,0 g/kg DM de substrato,preferivelmente nas quantidades de 0,005-0,5 g/kg DM de substrato, e maispreferivelmente de 0,05-0,10 g/kg DM de substrato.

Endo-1,4-beta-xilanase

A endo-l,4-beta-xilanase é preferivelmente uma endo-1,4-beta-xilanase de GH10 ou GH11. A endo-l,4-beta-xilanase pode ser deorigem microbiana, tal como derivável de uma linhagem de um fungofilamentoso (e.g., Trichoderma, Meripilus, Humicola, Aspergillus, Fusarium)ou de uma bactéria (e.g. Bacillus). A endo-l,4-beta-xilanase é preferivelmenteuma endo-l,4-beta-xilanase de GH10 derivada de Humicola insolens e maispreferivelmente a endo-l,4-beta-xilanase de GH10 é o polipeptídeo mostradocomo SEQ ID NO:4, mais preferivelmente como aminoácidos 17-389 de SEQID NO:4, ou ainda mais preferivelmente um polipeptídeo que tem pelo menos75%, pelo menos 85%), pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%,pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade com aseqüência de aminoácidos mostrada como aminoácidos 17-389 de SEQ IDNO:4 (daqui por diante "polipeptídeos homólogos").

Endo-l,4-beta-xilanase de GH10 pode ser adicionada emquantidades de 0,001-1,0 g/kg DM de substrato, preferivelmente nasquantidades de 0,005-0,5 g/kg DM de substrato, e mais preferivelmente de0,05-0,10 g/kg DM de substrato.

MATERIAIS E MÉTODOS

Enzimas usadas

Uma alfa-L-arabinofuranosidase GH43 de H. insolens (SEQID NO:l), uma alfa-L-arabinofuranosidase GH51 de M. giganteus (SEQ IDNO:2), uma beta-xilosidase GH3 de Trichoderma reesei (SEQ ID NO:3) euma endo-l,4-beta-xilanase GH10 de H. insolens (SEQ ID NO:4). Asenzimas acima mencionadas foram clonadas usando técnicas molecularesbásicas (Ausubel et aL, 2003, Curr. Prot. Mol. Biol., John Wiley & Sons,Cambridge, USA, Christgau et al. 1995, Curr. Genet. 27, 135-141).

Ultraflo L e Celluclast 1,5 L são composições enzimáticascomerciais, e disponíveis a partir de Novozymes A/S. Ultraflo L é derivada deHumicola insolence e compreende celulases e hemicelulases. Celluclast 1,5 Lé derivada de Trichoderma reesei e compreende celobiohidrolases eendoglucanases.

Bio-Feed Wheat L é uma xilanase comercial para aplicação deração e disponível a partir de Novozymes A/S. Bio-Feed Wheat L é derivadade Termomyces lanuginosus.

Químicos e substratos

Arabinose e xilose foram adquiridas a partir de Merck(Darmstadt, Alemanha). Arabinoxilanos de trigo solúveis em água einsolúveis em água foram obtidos a partir de Megazyme (Bray, CountyWicklow, Irlanda). O efluente de fermentação de etanol, "vinhaça", foifornecido por Tate & Lyle, Amylum UK (Greenwich, UK).

Substrato de arabinoxilano de trigo solúvel

Arabinoxilano de trigo solúvel em água de viscosidade médiafoi obtido a partir de Megazyme (Bray, County Wicklow, Irlanda). Teores demonossacarídeos depois de hidrólise ácida (0,4 N HCI, 2 h, 100°C) e HPAECforam: 275,8 mg/g de arabinose, 479,2 mg/g de xilose (= A:X 0,58), comapenas traços de galactose e glicose. De acordo com a folha de produto osteores de amido, beta-glucano, proteína, umidade, e cinza em peso foram<0,1%, <0,1%, 0,9%, 1,9%, e 2,2%, respectivamente.

Substrato de vinhaça de trigo

Vinhaça de trigo, um subproduto de fermentação industrial deetanol, foi fornecida por Tate & Lyle, Amylum UK, (Greenwich, UK). O teorde material seca da vinhaça foi 9,02 %-p. Teores de monossacarídeos depoisde hidrólise ácida (0,4 N HCI, 2 h, 100°C) e HPAEC foram: Arabinose 82,9g/kg DM de vinhaça, xilose 119 g/kg DM de vinhaça mg/g, galactose 21,6g/kg DM de vinhaça, e 78,2 g/kg DM de vinhaça. Ácidos orgânicos, proteína,cinza, e ácido ferúlico constituíram 30%, 16%, 11%, e 0,2% em peso,respectivamente da matéria seca.

Preparação de polímeros e oligossacarídeos específicos de arabinoxilano

Arabinoxilano duplamente substituído foi preparadoincubando arabinoxilano de trigo solúvel (lg) em 0,1 M de tampão acetato(100 mL), pH 6,0 com 0,167 g de a-L-arabinofuranosidase de Meripilusgiganteus (GHSl)kg"1 arabinoxilano de trigo solúvel em água por 48 horas a30°C. Arabinoxilano unicamente substituído foi preparado incubandoarabinoxilano de trigo solúvel em água (lg) em 0,1 M de tampão acetato (42mL), pH 6,0 com 0,147 g de a-L-arabinofuranosidase de Humicola insolens(GH43) «kg"1 arabinoxilano de trigo solúvel em água por 48 horas a 30°C.

Para interromper as reações enzimáticas as misturas foram aquecidas para100°C por 10 min. Polímeros de arabinoxilano foram precipitados por adiçãode etanol (126 ml). Os precipitados foram filtrados (Miracloth) e secos avácuo.

Oligossacarídeos contendo grupos arabinosil ligados a (1-3)terminais foram preparados incubando o arabinoxilano de trigo insolúvel emágua (lg) em 0,1 M de tampão acetato (100 mL), pH 6,0 com 6,67 g deShearzyme (xilanase GH10) «kg"1 arabinoxilano de trigo insolúvel em águapor 2 horas a 30°C. Oligossacarídeos contendo grupos arabinosil ligados a(1—*3) internos foram preparados incubando arabinoxilano de trigo insolúvelem água (lg) em 0,1 M de tampão acetato (100 mL), pH 6,0 com 0,03 g dePentopan Mono (xilanase GH11) «kg"1 arabinoxilano de trigo insolúvel emágua por 2 horas a 30°C. Oligossacarídeos contendo grupos arabinosil ligadosa (1—>2) internos foram preparados incubando arabinoxilano de trigoinsolúvel em água (lg) em 0,1 M de tampão acetato (100 mL), pH 6,0 com0,03 g de Pentopan Mono (xilanase GH11) -kg"1 arabinoxilano de trigoinsolúvel em água e alfa-L-arabinofuranosidase de H. insolens (GH43) «kg"1arabinoxilano de trigo solúvel em água por 2 horas a 30°C. Para interromperas reações enzimáticas as misturas foram aquecidas para 100°C por 10 min.Os arabinoxilo-oligossacarídeos foram concentrados em um evaporadorrotatório e avaliados por 1H-RMN.

Análise de substrato

Teores de arabinose e xilose em substratos contendoarabinoxilano foram determinados por hidrólise ácida com ácido hidroclórico(0,4 N de HCI, 2 horas, 100°C) seguido por HPAEC (Sorensen et al., 2003).Todos os rendimentos, incluindo rendimentos de hidrólise enzimática, estãorelatados como mg por g de matéria seca de substrato ou como rendimentosrelativos em percentual.

Ensaio para atividade para atividade de alfa-L-arabinofuranosidase

Atividade de alfa-L-arabinofuranosidase pode ser verificadacomo descrito por Poutanen et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 1988, 28,425-432) usando 5 mM de p-nitrofenil alfa-L-arabinofuranosídeo comosubstratos. As reações podem ser realizadas em 50 mM de tampão citrato empH 6,0, 40°C com um tempo de reação total de 30 min. A reação éinterrompida adicionando 0,5 ml de 1 M de carbonato de sódio e o p-nitrofenol liberado é medido em 405 nm. Atividade é expressa em U/ml.

Ensaio para atividade de alfa-arabinofuranosidase em arabinoxilanodissubstituído

Arabinoxilano de trigo solúvel em água de viscosidade média(Megazyme, Bray, Irlanda) foi tratado com uma alfa-arabinofuranosidase deGH51 de Meripilus giganteus (SEQ ID NO:2) para remover substituintesúnicos de alfa-arabinofuranosil acoplados a arabinose C(0)-3 do arabinoxilanoa fim de produzir um substrato de arabinoxilano dissubstituído comsubstituintes de arabinofuranosil acoplados a ambos C(0)-2,3 dos resíduos dexilose. O substrato foi dialisado e liofilizado.Uma solução de 0,1% do arabinoxilano dissubstituído foipreparada e a atividade de alfa-arabinofuranosidase foi medida misturando 0,1ml de enzima, 0,9 ml de tampão (0,12 M de ácido succínico, pH 6,0) e 1,0 mlde solução de substrato em um tubo eppendorf. O tubo eppendorf foiincubado a 60°C por 1 hora com agitação. A quantidade de arabinose liberadafoi medida por HPAEC (cromatografia de troca aniônica de altaperformance).

HPAEC

Hidrolisados (10 ul) foram aplicados em um sistema DionexBioLC ajustado com uma coluna de guarda Dionex CarboPac™ PAI (4 x 250mm) (Dionex Corporation, Sunnyvale, CA, USA) combinada com uma pré-coluna CarboPac™ PAI (4 x 50 mm). Os monossacarídeos foram separadosisocraticamente com 10 mM de KOH por 15 min, fluxo: 1 mLmin"1.Monossacarídeos foram detectados por um detector eletroquímico pulsado nomodo de detecção amperiométrico pulsado. O potencial do eletrodo foiprogramado para +0,1 V (t = 0-0,4 s) para -2,0 V (t = 0,410,42 s) para 0,6 V(t = 0,43 s) e finalmente -0,1 V (t = 0,44-0,50 s), embora integrando o sinalresultante de t = 0,2-0,4 s. Uma mistura de arabinose e xilose (concentraçãode cada componente: 0,0025-0,1 g'L"1)foi usada como padrão.

Análise ^-RMN

Todos os produtos de degradação foram liofilizados duas vezesa partir de 99,9% D20 e re-dissolvidos em 99.9% D20. Alguns hidrolisadosforam dialisados (Spectra/Por corte de peso membrana molecular 1000) pararemover arabinose livre antes da análise espectral. Os espectros de 'H-RMNforam registrados a 30°C em um instrumento Varian Mercury-VX operado a400 MHz e equipado com uma sonda auto-comutável de 4 núcleos. Dadosforam coletados por 128-512 varreduras e o sinal de HDO foi usado como umsinal de referência (4,67 ppm).

EXEMPLOSExemplo 1

Hidrólise enzimática de arabinoxilano insolúvel em águaSubstrato de arabinoxilano de trigo insolúvel em água (0,05 g)dissolvido em 50 ml de água duplamente deionizada por ensaio (0,1% DM)foi incubado com uma composição da invenção, ou com 10%-p de umamistura 50:50 de Ultraflo e Celluclast 1,5 L. E/S se refere ao peso depreparação enzimática (E) adicionada em percentual por peso de substrato (S).

A composição da invenção compreendeu 0,075 g de alfa-arabinofuranosidase GH51 de M. giganteus/kg DM de arabinoxilano, 0,075 gde alfa-arabinofuranosidase GH43 de H. insolens/kg DM de arabinoxilano,0,075 g de beta-xilosidase de T. reesei/kg DM de arabinoxilano, e 0,075 g dexilanase de H. insolens/kg DM de arabinoxilano.

Os tratamentos foram realizados por 24 horas em pH 5 e 50°C.Amostras foram retiradas depois de 24 horas e imediatamente aquecidas a100°C por 10 min. As amostras foram filtradas (filtro de 0,2 microM) e osníveis de arabinose, e xilose foram determinados por HPAEC. Experimentosde hidrólise enzimática foram realizados em triplicata e os valores médiosrelatados estão em porcentagem das quantidades liberadas por hidrólise ácida.

Resultados são apresentados em Tabela 1.

Tabela 1. Arabinose e xilose liberadas de arabinoxilano de trigo insolúvel emágua por hidrólise enzimática. Números estão em percentual de peso daquantidade de cada monossacarídeo liberado por hidrólise ácida das amostrasde arabinoxilano de trigo solúvel em água.

<table>table see original document page 21</column></row><table>

Hidrólise enzimática de arabinoxilano solúvel em águaSubstrato de arabinoxilano de trigo solúvel em água (0,05 g)dissolvido em 50 ml de água duplamente deionizada por ensaio (0,1% DM)foi incubado com uma composição da invenção, ou com 10 %-p de umamistura 50:50 de Ultraflo e Celluclast 1,5 L. E/S se refere ao peso depreparação enzimática (E) adicionada em percentual por peso de substrato (S).

A composição da invenção compreendeu 0,080 g de alfa-arabinofuranosidase GH51 de M giganteus/kg DM de arabinoxilano, 0,080 gde alfa-arabinofuranosidase GH43 de H. insolenslkg DM de arabinoxilano,0,16 g de beta-xilosidase de T. reesei/kg DM de arabinoxilano, e 0,080 g dexilanase de H. insolenslkg DM de arabinoxilano.

Os tratamentos foram realizados por 24 horas em pH 5 e 50°C.

Amostras foram retiradas depois de 24 horas e imediatamente aquecidas a100°C por 10 min. As amostras foram filtradas (filtro de 0,2 microM) e osníveis de arabinose, e xilose foram determinados por HPAEC. Experimentosde hidrólise enzimática foram realizados em triplicata e os valores médiosrelatados estão em porcentagem das quantidades liberadas por hidrólise ácida.

Resultados são apresentados em Tabela 2.

Tabela 2. Arabinose e xilose liberadas de arabinoxilano de trigo solúvel emágua por hidrólise enzimática. Números estão em percentual de peso daquantidade de cada monossacarídeo liberado por hidrólise ácida das amostrasde arabinoxilano de trigo solúvel em água.

<table>table see original document page 22</column></row><table>

Exemplo 2

A hidrólise de vinhaça foi realizada de acordo com o métododescrito para arabinoxilano solúvel em água em Exemplo 1 exceto que adosagem de beta-xilosidase foi 0,050 g/kg de vinhaça DM e o nível desubstrato foi 5 %-p de DM. Amostras foram retiradas depois de 24 h eimediatamente aquecidas a 100°C por 10 min para interromper a reaçãoenzimática, centrifugadas (14000 rpm, 10 min), filtradas (filtro de 0,2microM) e sujeitas à análise HPAEC para determinar os níveis de arabinose exilose, veja abaixo. Experimentos de hidrólise enzimática foram realizadosem duplicata e os valores médios relatados estão em porcentagem dasquantidades liberadas por hidrólise ácida. Resultados são apresentados emTabela 2.

Tabela 3. Arabinose e xilose liberadas de vinhaça por hidrólise enzimática.Números estão em percentual de peso da quantidade de cada monossacarídeoliberado por hidrólise ácida das amostras de arabinoxilano de trigo solúvel emágua.

<table>table see original document page 23</column></row><table>

Exemplo 3

Trigo arabinoxilano compreende arabinofuranosídeo como ummonossubstituinte ligado à posição 3 de xilose interna e a arabinofuranosídeoligado às posições 3 e 2 em xilose dissubstituída, respectivamente. Substratosforam produzidos compreendendo apenas um dos 3 tipos de ligações dearabinofuranosídeo. A atividade das arabinofuranosidases para estessubstratos foi investigada.

Tabela 4. Atividade em polímeros de arabinoxilano selecionados, incubaçãoem pH 6, 40°C por 2 horas.

<table>table see original document page 23</column></row><table>

xx se refere a mais do que 75% de hidrólise, x(x) a 50-75% de hidrólise, x a 25-50% dehidrólise e (x) a 5-25% de hidrólise. — se refere a nenhuma hidrólise detectável

Exemplo 4

Arabinoxilano de trigo solúvel foi incubado com 0,1 g deproteína enzima por kg DM de alfa-L-arabinofuranosidase de H. insolens(GH43), B. adolescentis (GH43), H. insolens (GH51), e M. giganteus(GH51). A arabinose liberada como mg por g de arabinoxilano de trigosolúvel em água, sua soma hipotética, e sua liberação de arabinose depois detratamento com 0,2 g de proteína enzima por kg DM de uma mistura 50:50 dealfa-L-arabinofuranosidases de H. insolens (GH43), BL sp. (GH43), H.insolens (GH51), e M. giganteus (GH51) foi medida. Resultados sãoexpressos como a média de determinações de triplicata, coeficiente devariação em média < 6,4.

Tabela 5. Arabinose liberada de arabinoxilano de trigo solúvel tratado comalfa-L-arabinofuranosidase em duas condições diferentes temperatura e pH.

<table>table see original document page 24</column></row><table>

Valores dentro de uma coluna não compartilhando um índice alfabético comum diferemcom signifícância estatística (P<0,05).

Tabela 6. Arabinose liberada de arabinoxilano de trigo solúvel tratado commisturas 50%:50% de alfa-L-arabinofuranosidases em pH 5, 50°C.

<table>table see original document page 24</column></row><table>

Valores dentro de uma coluna não compartilhando um índice alfabético comum diferemcom signifícância estatística (P<0,05).

Exemplo 5

Bagaço de malte foi obtido de um processo de produção decerveja tipo Pilsner usando malte de cevada moído em martelos. O bagaço demalte foi liofilizado para um teor de matéria seca de 96,1% w/w e moído. Omaterial de bagaço de malte foi suspenso 5 g de matéria seca/100 ml de ácidosuccínico - tampão succinato de sódio pH 5,0 e sujeito à hidrólise por doistratamentos: 1) um tratamento convencional usando uma mistura 50:50 deCelluclast 1,5 L + Ultraflo L com 6,5 g de proteína enzima por kg de matériaseca de bagaço de malte e 2) um tratamento da invenção aplicando umamistura 25:25:25:25 em base de peso protéico da alfa-L-arabinofuranosidaseGH43 de H. insolens (SEQ ID NO:l), da alfa-L-arabinofuranosidase GH51 deM. giganteus (SEQ ID NO:2), da betaxilosidase GH3 de Trichoderma reesei(SEQ ID NO:3) e da endo-l,4-beta-xilanase GH10 de H. insolens (SEQ IDNO:4). Uma dosagem de enzima equivalente a 0,6 g de proteína enzima porkg de matéria seca de bagaço de malte foi usada.

A hidrólise foi realizada em tubos Eppendorf incubados emum Thermomixer Compact a 1000 rpm por 16 horas a 50°C. As amostrasforam cozidas por 10 minutos, centrifugadas por 10 minutos a 14000 x g e afase solúvel foi carboidratos analisada em HPLC. HPLC foi realizada em umDionex BioLC usando um GS50 Gradient Pump, AS50

Autosampler, e um detector eletroquímico ED40. Aconcentração de arabinose e xilose liberadas foi medida.

Tabela 7. Bagaço de malte: Resultados de análises HPLC de arabinose exilose liberadas em g/litro.

<table>table see original document page 25</column></row><table>

Exemplo 6

Uma solução contendo arabinoxilano foi obtida cozinhandopalha de trigo a 190°C seguido por separação do líquido da palha porfiltração. Em todos os experimentos 1,5 g do líquido foi adicionalmentediluído para 2,0 g por adição de ácido/base para ajuste de pH, por adição desolução enzimática e por adição de água deionizada. O líquido foi incubadocom 2,5 g de proteína enzima por litro de volume de reação ou com a misturaenzimática da invenção, com a mistura de celulose convencional consistindode uma mistura 50:50 de Ultraflo e Celluclast 1,5 L (proporção de misturabaseada em teor protéico).

A composição da invenção compreendeu uma mistura10:10:5:25 em base de peso protéico da alfa-arabinofuranosidase de H.insolens (SEQ ED NO:l), da alfa-arabinofuranosidase de M. giganteus (SEQID NO:2), da beta-xilosidase de T. reesei (SEQ ID NO:3) e da xilanase de H.insolens (SEQ ED NO:4). Os tratamentos foram realizados por 24 horas emtrês níveis de pH (4, 5, 6) e em duas temperaturas (40, 50°C). Amostras foramretiradas depois de 24 horas e imediatamente aquecidas a 100°C por 10 min.

As amostras foram filtradas (filtro de 0,2 microM) e os níveis de arabinose, exilose foram determinados por HPAEC. Todos os experimentos de hidróliseenzimática foram realizados em duplicata e os valores médios relatados estãoem porcentagem das quantidades liberadas por hidrólise ácida. Resultados sãoapresentados em Tabela 8.

Tabela 8. Arabinose e xilose liberadas a partir de arabinoxilano de trigosolúvel em água por hidrólise enzimática. Números estão em percentual depeso da quantidade de cada monossacarídeo liberado por hidrólise ácida doarabinoxilano de trigo solúvel em água.

<table>table see original document page 26</column></row><table>LISTAGEM DAS SEQÜÊNCIAS

<110> Novozymes a/s

<120> Hidrólise de arabinoxilano

<130> 10882.s04-wo

<160> 4

<170> Patentlf» versão 3.3

<210> 1

<211> 558

<212> PRT

<213> Humicola insolence<22q>

<221> mat peptídeo

<222> (19)..(558)

<400> 1

Met Leu Gly Leu Lys vai Leu Cys Leu Ser Ala Vai Vai Gly Thr Ala-15 -10 -5

Vai Ser Vai Pro His Ala Gly Asn Leu Pro Arg Gln Ala ser Thr phe

-11 s 10

Thr Asn Pro Vai Letl Trp Glu Asp His Pro Asp Leu Glu Vai Phe Arg15 20 25 30

vai Gly ser vai phe Tyr Tyr ser ser ser Thr Phe Ala Tyr ser Pro35 40 45

Gly Ala Pro vai Leu Lys Ser Tyr Asp Leu vai His Trp Thr Pro vai50 55 60

Thr His Ser Vai Pro Arg Leu Asn Phe Gly ser Aso Tyr Asp Leu Pro65 70 75

Ser Gly Thr Pro Gly Ala Tyr Vai Lys Gly lie Trp Ala ser Thr Leu80 85 90

Arg Tyr Arg Arg ser Asn Asp Arg Phe Tyr Trp Tyr Gly Cys Vai Glu95 100 10% 110

Gly Arg Thr Tyr Leu Trp Thr ser Pro Gly Gly Asn Ala Leu Ala Asn115 120 125

Asn Gly Glu vai Pro Pro Ser Ala Trp Asn Trp Gln His Thr Alá Thr130 135 140

lie Asp Asn Cys Tyr Tyr Asp Ala Gly Leu Leu lie Asp Asp Asp Asp145 150 155Thr Met Tyr Ile Ala Tyr Gly Asn Pro Thr He Asn Vai Ala Gln Leu160 165 170

ser Pro asp Gly Thr Arg Gln Vai Arg Vai Gln Gln Arg vai Tyr Ala175 180 185 190

His Pro Gln Gly Gln Thr vai Glu Gly Ala Arg tôet Tyr Lys lie Arg195 200 205

Gly Asn Tyr Tyr lie Leu vai Thr Arg Pro Ala Asp Ala Glu Tyr Vai210 215 220

Leu Arg Ser Thr Thr Gly ser Pro Phe Gly Pro Tyr Glu Ala Arg Thr22S 230 235

Leu vai ser Arg lie Gln Gly Pro Leu Ala Asn Ala Gly Phe Ala His240 245 250

Gln Gly Gly lie vai Asp Ala Pro Asp Gly Thr Trp His Tyr Vai Ala255 260 265 270

Phe Met Asp Ala Tyr Pro Gly Gly Arg lie Pro vai vai Ala pro Leu275 280 285

Arg Trp Thr Ala Asp Gly Trp Pro Glu vai vai Thr Asp Ser Gln Gly290 295 300

Arg Trp Gly Thr Ser Tyr Pro Ile Pro vai Arg Gly Ala Lys Asn Ala305 310 315

Thr Glu Gly Leu Alá Ser Thr Asp Leu Asp Glu Phe Arg Gly Thr Arg320 325 330

Phe Ser Glu His Trp Gly Trp Asn His Asn pro Asp Thr ser Lys Phe335 340 345 350

Thr Leu Leu Gly Gly Asn Glu Gly Gly Leu lie Leu Arg Thr Ala Thr355 360 365

vai Thr Gly Asp Leu Phe Ala Ala Arg Asn Thr Leu Thr Arg Arg lie370 37! 380

Ala Gly Pro Lys Ala ser Gly ile Phe Arg Leu Asp vai Arg Gly Met385 390 395

Arg Asp Gly Asp Arg Ala Gly Ala vai Leu Phe Arg Asp Arg Ala Ala400 405 410

Tyr lie Gly vai Trp Lys Gln Gly Asn Glu Ala Arg ile Vai mt Vai415 420 425 430Asp Asp Leu Aro Leu Asn Glu*Asp Gly~Trp Arg Thr Ala Ser Thr Gly435 440 44S

Arg vai Ala Ala Asn Gly Pro vai lie Asp Thr Asn Ala Gln Gln Asp450 455 460

He Trp Leu Arg ile Asp Ala Asp ile Thr pro Ala Phe Gly Thr Asn465 470 475

Thr Glu Arg Thr Thr Thr Phe Tyr Tyr Ser lie Asp Gly Gly Arg Thr480 485 490

Tyr Thr Arg Leu Gly Pro Ala Phe Ala Met Thr Asn Sêr Trp Arg Tyr495 500 505 510

Phe Thr Gly Tyr Arg Phe Gly Vai Phe Asn Phe ser Thr Lys Ser Leu515 520 525

Gly Gly Glu Vai Lys Vai Lys Gly Phe Lys Met Asn Met lie530 535 540

<210> 2<211> 643<212> PRT

<213> Merípilus glganteus<220>

<221> mat_peptídieo<222> (17)..(643)

<400> 2

Met Lys Leu Leu Phe Leu Leu Gly Ala Phe vai Ala Gln cys Lêu Ala-15 -10 -5 -1

Vai Thr vai Thr vai Asn Lys Asn Pro Ser His Thr Vai pfo ser Thr15 10 15

Leu Tyr Gly Leu Met Phe Glu Asp lie Asn His ser Gly Asp Gly Gly20 25 30

Leu Tyr Ala Glu Leu Leu Gln Asn Arg Ala Phe Gln Gln Vai Thr Pro35 40 45

Asn Thr Ala Ala Ala Leu Ala Ala Trp His Pro Ile ser Asn Ala Lys50 55 60

Leu Ala vai ile Gln Asp Pro Ser Pro Vai Ser Asn Ala Leu Pro Asn65 70 75 80

Ser Lei» Gln Phe Ser vai Pro Ser Gly Ser Ser Gly Arg vai Gly Phe85 90 95Thr asíi Glu Gly Phe Trp Gly Ile Lys~ Vai Asp Ser Thr Trp Thr TyrXOO 105 110

Lys Ala ser Leu Phe Phe Arg Phe Pro Thr Ser Ser ser Phe ser Gly115 120 125

Ala Leu Thr vai Gly Leu Gln Thr Asn Ala Gly Arg Vai Leu Ala Gln130 135 140

Asn Ser Thr Gln lie Arg Gly Thr Thr Thr Lys Trp Thr Gln ile Asn

Leu Glu Leu His Pro Thr Ala Ser Ala pro Asp vai Ser Asn Ser Phe165 170 175

Phe vai Thr Ile Asp Gly Ala Ala Gly Ala Gly Gln Thr ile Asn Phe180 185 150

Ala Met Phe ser Leu Phe Pro pro Thr Phe Lys Asn Ar| Pro Asn Gly

195

200

20!

Leu Arg Ala Asp Ile Ala Glu Thr Leu Ala Glu Met Gly Pro ser Phe210 215 220

Phe Arg Phe Pro Gly Gly Asn Asn Leu Glu Gly Gln Thr Thr Ala Thr225 230 235 240

Arg Trp Gln Trp Asn Ala Thr vai Gly ser Leu Leu Asp Arg Pro Gly245 250 255

Arg Vai Gly Asp Trp Gly Tyr Vai Asn Thr Asp Gly Leu Gly Leu Leu260 265 270

Glu Tyr Leu Gln Phe phe Glu Asp Thr Gly Met Glu Pro lie Met Ala275 280 285

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Leu Ala Pro Tyr ile Gln Gln Ala lie Asp Gln ile Asn Phe vai ile305 310 315 320

Gly Asp Pro Ala Lys Ser Ala Pro Ala Ala Leu Arg Ala ser Leu Gly325 330 335

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Phe Phe Ala Ala Gly Ser Tyr Pro Tyr Arg Trp His Asp Phe Vai Thr355 360 365Ala Leu Gln Ala Gln Phe ProGln Ile" Arg Phe ile Ala Thr Thr Asn370 375 380

Ala Trp Asn Pro Vai Leu Ser Pro Vai Pro Gln ser Tyr Asp Vâl His385 390 395 400

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565 570 575

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Gly Ile Gln Gly Gly Vai Asp Pro Glu His Leu Lys Vai Ala Ala Thr210 215 220vai Lys His Phe Ala Gly Tyr Asp teu Glu Asn Trp Asn Asn Gln ser225 230 235 240

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Asn ser Thr Thr Gly phe Ala Lys Ala Ile Ala Ala Ala Lys Lys ser485 490 495Asp Ala Ile lie Tyr Leu Gly Gly ile~A$p Asn Thr Ile Glu Gln Glu500 505 510

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pro Leu Leu Tyr Asp Arg Asp Tyr Arg Pro Lys Ala Ala Tyr Asn Ala355 360 365

Leu Met Asn Ala Leu370

Claims (34)

1. Processo para hidrólise enzimática de arabinoxilano,caracterizado pelo fato de que compreende colocar em contato um substratocontendo arabinoxilano com:a) uma enzima tendo atividade para xiloses dissubstituídas, e,b) uma enzima tendo atividade para xiloses monossubstituídasem posição C2 ou C3.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a enzima tendo atividade para xiloses dissubstituídas, é umaalfa-L-arabinofuranosidase de GH43, e/ou a enzima tendo atividade paraxiloses monossubstituídas em posição C2 ou C3 é uma alfa-L-arabinofuranosidase de GH51, GH54 ou GH62.

3. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2,caracterizado pelo fato de que as atividades enzimáticas compreendemadicionalmente,a) uma beta-xilosidase, e/ou,b) uma endo-l,4-beta-xilanase.

4. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3,caracterizado pelo fato de que a beta-xilosidase é uma beta-xilosidase deGH3.

5. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4,caracterizado pelo fato de que a e preferivelmente a endo-1,4-beta-xilanase éuma endo-l,4-beta-xilanase de GH10 ou GH11.

6. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5,caracterizado pelo fato de que as atividades enzimáticas compreendemadicionalmente uma enzima selecionada a partir da lista consistindo de acetilxilano esterase, feruloil esterase, alfa-amilase, CGTase, glucoamilase, fitase,protease, beta-glucanase, celulase, celobio-hidrolase, e beta-glicosidase.

7. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6,caracterizado pelo fato de compreender produzir um hidrolisadocompreendendo xilose linear e/ou xilo-oligossacarídeo e/ou xilose e/ouarabinose.

8. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7,caracterizado pelo fato de compreender produzir um produto de ração animal.

9. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8,caracterizado pelo fato de compreender colocar em contanto o substratocontendo arabinoxilano com um organismo fermentador e produzir umproduto de fermentação.

10. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9,caracterizado pelo fato de compreender produzir uma bebida alcoólica,combustível e/ou etanol potável.

11. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o substrato é derivado de um cereal,preferivelmente selecionado a partir do grupo consistindo de trigo, centeio,cevada, milho, arroz, sorgo e milheto.

12. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o substrato é um subproduto de umprocesso de moagem a úmido, de um processo de fermentação, ou deprodução de açúcar.

13. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente colocar emcontato o substrato contendo arabinoxilano com um organismo fermentadorcapaz de utilizar açúcares C5.

14. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de compreender modificar uma fibra alimentar.

15. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de compreender produzir um produto que é umproduto de polímero linear de xilose ou produto de xilo-oligossacarídeocompreendendo pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelomenos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, tal comopelo menos 98% de polímero em peso do produto, dito polímero tendo umgrau de polimerização de pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelomenos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelomenos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 35, pelomenos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelomenos 90, pelo menos 100, pelo menos 120, pelo menos 150, pelo menos-200, pelo menos 300, pelo menos 500, pelo menos 1000, pelo menos 2000,pelo menos 5000, ou pelo menos 10000.

16. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a-15, caracterizado pelo fato de compreender produzir um produto que é umproduto de polímero linear de xilose ou produto de xilo-oligossacarídeocompreendendo pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelomenos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, tal comopelo menos 98% de polímero em peso do produto, dito polímero tendo umgrau de polimerização de menos do que 5000, menos do que 2500, menos doque 1500, menos do que 1000, menos do que 500, menos do que 100, menosdo que 75, menos do que 50, menos do que 25, menos do que 10, menos doque 9, menos do que 8, menos do que 7, menos do que 6, menos do que 5, epreferivelmente menos do que 4.

17. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a-16, caracterizado pelo fato de compreender produzir um produto que é umproduto de polímero linear de xilose ou produto de xilo-oligossacarídeocompreendendo pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelomenos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, tal comopelo menos 98% de polímero em peso do produto, dito polímero tendo umgrau de polimerização selecionado a partir do grupo consistindo dosintervalos de 3 a 10, de 11 a 25, de 26 a 50, de 51 a 100, de 101 a 200, de 201a 500, de 501 a 1000, de 1001 a 5000, e de 5001 a 10000.

18. Processo para hidrólise enzimática de arabinoxilano,caracterizado pelo fato de que compreende colocar em contato um substratocontendo arabinoxilano com uma enzima, dita enzima capaz de liberararabinose de xiloses dissubstituídas, em que dito substrato contendoarabinoxilano é selecionado a partir do grupo consistindo de safras herbácease/ou lenhosas energéticas, safras agrícolas de subsistência e forrageiras,produtos de ração animal, tubérculos, raízes, caules, legumes, cascas demandioca, vagens de cacau, folhelhos de arroz, cascas de arroz, farelo dearroz, espigas, palha, cascas, folhelhos, polpa de beterraba açucareira, polpade alfarroba, polpas de hortaliças, resíduo de safra agrícola, palha, caules,folhas, farelo de milho, folhelhos, espigas, raspa, cascas, vagens, resíduo demadeira, cortiça, aparas, serragem, polpa de madeira, licor de polpação, papel,papelão velho, resíduo de madeira, sólidos de água residual industrial oumunicipal, estrume, subproduto de produção de cerveja e/ou processos defermentação, grão úmido de destilaria, grão seco de destilaria, bagaço demalte, vinhaça e bagaço.

19. Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizadopelo fato de que a enzima é uma alfa-L-arabinofuranosidase de GH43.

20. Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizadopelo fato de que a enzima é de origem bacteriana, fiíngica ou vegetal.

21. Produto, caracterizado pelo fato de ser produzido peloprocesso como definido nas reivindicações 15 a 17.

22. Composição para hidrólise de arabinoxilano, caracterizadapelo fato de compreender as atividades enzimáticas;a) uma enzima tendo atividade para xiloses dissubstituídas, e,b) uma enzima tendo atividade para xiloses monossubstituídasem posição C2 ou C3.

23. Composição de acordo com a reivindicação 22caracterizada pelo fato de que a enzima tendo atividade para xilosesdissubstituídas, é uma alfa-L-arabinofuranosidase de GH43, e/ou a enzimatendo atividade para xiloses monossubstituídas em posição C2 ou C3 é umaalfa-L-arabinofuranosidase de GH51, GH54 ou GH62.

24. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 22ou 23 caracterizada pelo fato de que as atividades enzimáticas compreendemadicionalmente,a) uma beta-xilosidase, e/ou,b) uma endo-l,4-beta-xilanase.

25. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 22a 24 caracterizada pelo fato de que a beta-xilosidase é uma beta-xilosidase deGH3.

26. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 22a 25 caracterizada pelo fato de que a endo-1,4-beta-xilanase é uma endo-1,4-beta-xilanase de GH10 ou GH11.

27. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 22a 26 caracterizada pelo fato de que a(s) atividade/atividades de enzimacompreendem adicionalmente uma enzima selecionada a partir do grupoconsistindo de acetil xilano esterase, feruloil esterase, alfa-amilase, CGTase,glucoamilase, fitase, protease, beta-glucanase, celulase, celobiohidrolase, e/oubeta-glicosidase.

28. Uso da composição como definida em qualquer dasreivindicações 22 a 27, caracterizado pelo fato de ser para tratamento de umsubstrato contendo arabinoxilano.

29. Uso de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelofato de ser empregado em um processo de fermentação.

30. Uso de acordo com qualquer das reivindicações 28 ou 29,caracterizado pelo fato de ser para redução de viscosidade de uma pasta e/ousolução compreendendo um substrato contendo arabinoxilano.

31. Uso de acordo com qualquer das reivindicações 28 a 30,caracterizado pelo fato de ser para produção de um produto de ração animalou um produto alimentício.

32. Uso de acordo com qualquer das reivindicações 28 a 31,caracterizado pelo fato de ser para produção de xilose, arabinose, xilo-oligossacarídeos e/ou xilose linear.

33. Uso de acordo com qualquer das reivindicações 28 a 32,caracterizado pelo fato de ser para produção de uma fibra dietética.

34. Uso de acordo com qualquer das reivindicações 28 a 33,caracterizado pelo fato de ser para produção do produto como definido emqualquer das reivindicações 15 a 17.