BRPI0610253B1

BRPI0610253B1 - Processo para hidrólise enzimática de arabinoxilano, composição para hidrólise de arabinoxilano, e, uso da mesma

Info

Publication number: BRPI0610253B1
Application number: BRPI0610253-0A
Authority: BR
Inventors: Hanne Risbjerg Soerensen; Sven Pedersen; Anders Viksoe-Nielsen; Christel Thea Joergensen; Lars Hylling Christensen; Christian Isak Joergensen; Carsten Hoerslev Hansen; Lene Venke Kofod
Original assignee: Novozymes A/S
Priority date: 2005-04-26
Filing date: 2006-04-25
Publication date: 2019-08-06
Also published as: EP1877568A1; AU2006239644A1; EP1877568B1; AU2006239644B2; US20080274527A1; EP1877568B9; CA2605258A1; DK1877568T4; DK1877568T3; ES2393090T3; ES2393090T5; US7993890B2; BRPI0610253A2; CA2910102A1; WO2006114095A1; CA2605258C; EP1877568B2

Abstract

a presente invenção se refere a um processo para hidrólise enzimática de arabinoxilano, e uma composição enzimática adequada para uso em um tal processo.

Description

A presente invenção compreende uma listagem de seqüências. CAMPO DA INVENÇÃO

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Arabinoxilano, um polissacarídeo composto de xilose e arabinose, é parte da fibra solúvel e insolúvel em água presente em cereais, em particular nas paredes celulares. Hidrólise de arabinoxilano é um prérequisito importante para utilização melhorada de hemicelulose de cereal, e.g. na indústria de fermentação de etanol e outras indústrias baseadas em cereais.

Arabinoxilano consiste de resíduos de alfa-L-arabinofuranose acoplados como pontos de ramificação a um esqueleto polimérico de xilose beta-(1-4)-ligada. Os resíduos de xilose podem ser monossubstituídos na posição C2 ou C3 ou dissubstituídos tanto na posição C2 como C3. Em adição, ácido ferúlico e ácido p-cumárico podem ser covalentemente ligados a arabinoxilano através de esterificação na posição C5 de algumas das unidades de arabinosil. Estas substituições no esqueleto de xilano retardam as ações de xilanases e a hidrólise completa de arabinoxilano assim requer tanto clivagem de grupo lateral como atividades despolimerizantes. Os principais produtos de hidrólise de arabinoxilano são os açúcares C5 xilose e arabinose.

Um processo para hidrólise de arabinoxilano usando interações sinergísticas entre enzimas apresenta composições enzimáticas comerciais de Humicola insolence e Trichoderma reesei foi previamente descrito pelos presentes inventores em Sorensen, H.R. et al. (Biotechnology and Bioengineering, Vol. 81, No. 6, March 20, 726-731, 2003). Hidrólise

Petição 870180045393, de 28/05/2018, pág. 11/18 catalisada por enzima de > 50% da parte solúvel do arabinoxilano de endosperma de trigo pode ser atingida, mas apenas baixos rendimentos de monossacarídeos foram obtidos com tratamentos enzimáticos similares em arabinoxilano de trigo insolúvel. Entretanto, uma vez que as atividades enzimáticas degradadoras de arabinoxilano estão presentes como atividades laterais em preparações comerciais tendo outras atividades enzimáticas como sua atividade principal, altos níveis de dosagem de 5 - 10 %-p da preparação de enzima por peso do substrato devem ser adicionados para obter hidrólise eficiente.

Tais altos níveis de adição de enzima não são viáveis para uso em aplicações de produção em escala natural e processos melhorados para hidrólise de arabinoxilano são assim necessárias.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os inventores encontraram processos melhorados para hidrólise de arabinoxilano e uma composição enzimática adequada para uso em um tal processo. No processo da invenção um substrato contendo arabinoxilano é colocado em contato com uma enzima tendo atividade para xiloses dissubstituídas, e.g. tal como uma alfa-L-arabinofuranosidase de Família de Glicosídeo Hidrolase 43 (GH43), e uma enzima tendo atividade para xiloses monossubstituídas em posição C2 ou C3, e.g. tal como uma alfaL-arabinofuranosidase de Família de Glicosídeo Hidrolase 51, 54 ou 62 (GH51,GH54 ouGH62).

Por conseguinte a invenção fornece em um primeiro aspecto um processo compreendendo adicionar a um substrato contendo arabinoxilano uma enzima tendo atividade para xiloses dissubstituídas, e, uma enzima tendo atividade para xiloses monossubstituídas em posição C2 ou C3.

A invenção fornece em um segundo aspecto uma composição para hidrólise de arabinoxilano dita composição compreendendo uma enzima tendo atividade para xiloses dissubstituídas, e, uma enzima tendo atividade

para xiloses monossubstituídas em posição C2 ou C3.

A invenção fornece em aspectos adicionais usos da composição do segundo aspecto.

BREVE DESCRIÇÃO DAS ILUSTRAÇÕES

Fig. 1A-C mostram polímeros de arabinoxilano:

Fig. IA mostra arabinoxilano intacto. Resíduos de arabinofuranosil ligados a xiloses internas alfa(1^3) (monossubstituídas) e alfa(l—>2) e alfa(l—>3) (dissubstituídas).

Fig. 1B mostra arabinoxilano dissubstituído. Resíduos de arabinofuranosil ligados a xiloses internas alfa(l—>2) e alfa(1^3) (dissubstituídas).

Fig. 1C mostra arabinoxilano unicamente substituído. Resíduos de arabinofuranosil ligados a xiloses internas alfa( 1 —>2) e alfa( 1 —>3 )(monossubstituídas).

Fig. 2 A-C mostram arabinoxilo-oligossacarídeos:

Fig. 2A mostra grupos arabinosil ligados a C-3 interno. Resíduos de arabinofuranosil ligados a xiloses internas alfa(l—>3) (monossubstituídas) e alfa(l—>2) e alfa(l—>3) (dissubstituídas).

Fig. 2B mostra grupos arabinosil ligados a C-3 terminal. Resíduos de arabinofuranosil ligados a xiloses terminais alfa(l—>3) (monossubstituídas) e a xiloses internas alfa(l—>2) e alfa(l—>3) (dissubstituídas).

Fig. 2C mostra grupos arabinosil ligados a C-2 interno. Resíduos de arabinofuranosil ligados a xiloses internas alfa(l—>2) e alfa( 1 —>3 )(monossubstituídas).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Na descrição e reivindicações que seguem as seguintes são definições de alguns dos termos técnicos que são empregados.

A numeração de Famílias de Glicosídeo Hidrolase aplicada nesta descrição segue o conceito de Coutinho, P.M. & Henrissat, B. (1999) CAZy - Carbohydrate Active Enzymes server at URL: http://afmb.cnrsmrs.fr/-cazv/CAZY/index.html ou altemativamente Coutinho, P.M. & Henrissat, B. 1999; The modular structure of celulases and other carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach. In Genetics, Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation., K. Ohmiya, K. Hayashi, K. Sakka, Y. Kobayashi, S. Karita and T. Kimura eds., Uni Publishers Co., Tokyo, pp. 15-23, e Boume, Y. & Henrissat, B. 2001; Glycoside hydrolases and glycosyltransferases: families and functional modules, Current Opinion in Structural Biology 11:593-600.

O termo amido granular no contexto da presente invenção é entendido como amido não cozido bruto, i.e. amido que não foi sujeito a uma gelatinização.

O termo biomassa significa no contexto da presente invenção todos os materiais contendo hemicelulose. Biomassa é um recurso muito heterogêneo e quimicamente complexo compreendendo subprodutos de processamento agrícola e industrial de todas as formas de material vegetal. A biomassa pode ser qualquer matéria orgânica derivada de planta incluindo safras herbáceas e lenhosas energéticas, safras agrícolas de subsistência e forrageiras, resíduo de safra agrícola e resíduos tal como palha, caules, folhas, farelo de milho, cascas, espigas, raspa, cascas, e vagens, resíduo de madeira tal como cortiça, aparas, serragem, polpa de madeira e licor de polpação. A biomassa pode incluir biomassa de resíduo, tal como papel, papelão velho, resíduo de madeira de construção e demolição. A biomassa também pode incluir lodo ou sólidos recuperados de tratamento de água residual industrial ou municipal assim como de estrume animal.

O substrato contendo arabinoxilano a ser tratado no processo da presente invenção pode ser obtido de qualquer fonte vegetal, em particular ser obtido de tubérculos, raízes, caules, legumes, cereais ou grão integral.

Preferidos são produtos residuais agrícolas contendo hemicelulose (i.e. resíduos e/ou subprodutos) tal como cascas de mandioca, vagens de cacau, cascas e/ou cascas de arroz, farelo de arroz de polimento de arroz, espigas, palha, cascas e/ou cascas de grão de cereal, palha de cana-de-açúcar prensada, polpa de beterraba açucareira, polpa de alfarroba ou outras polpas de hortaliças ou frutas. O substrato pode ser qualquer biomassa.

Preferido é um substrato obtido de grão de cereal, e.g. tal como grão moído ou subprodutos de processamento de grão de cereal, e.g. um subproduto contendo arabinoxilano de moagem úmida ou a seco de cereal. O grão de cereal pode ser qualquer grão de cereal embora seja preferido um grão de cereal selecionado a partir do grupo consistindo de milho (mais), trigo, cevada, aveia, arroz, sorgo e milheto. Mais preferido para a presente invenção é um substrato contendo arabinoxilano derivado de trigo.

O substrato contendo arabinoxilano pode ser o grão ou mistura de uma produção de cerveja e/ou processo de fermentação, ou ele pode ser um subproduto de uma produção de cerveja e/ou processo de fermentação, e.g. grão úmido ou seco de destilaria, bagaço de malte, vinhaça, bagaço etc.

Substratos contendo arabinoxilano normalmente compreendem tanto arabinoxilano solúvel em água como insolúvel em água. Contemplado para os aspectos da presente invenção é substratos compreendendo arabinoxilano solúvel em água e/ou arabinoxilano insolúvel em água. Processos

O processo do primeiro aspecto, caracterizado pelo fato de que um substrato contendo arabinoxilano com atividades enzimáticas compreendendo uma enzima tendo atividade para xiloses dissubstituídas, e uma enzima tendo atividade para xiloses monossubstituídas em posição C2 ou C3 é particularmente adequado para a produção de polímeros lineares de xilose (homopolímero de xilano) com poucos ou nenhum grupo lateral de arabinose. Em uma forma de realização preferida a enzima tendo atividade para xiloses dissubstituídas é uma alfa-L-arabinofuranosidase de GH43, e uma enzima tendo atividade para xiloses monossubstituídas em posição C2 ou C3 é uma alfa-L-arabinofuranosidase de GH51, GH54 ou/ou GH62, mais preferivelmente a GH51.

Quando as duas arabinofuranosidases são adicionadas a uma solução de arabinoxilano os produtos resultantes serão polímeros lineares de xilose e moléculas de arabinose de alto peso molecular. Isto irá levar em conta uma fácil separação do polímero linear de xilose por técnicas conhecidas (ultrafiltração ou precipitação de solvente do xilano em uma solução de etanol) de arabinose.

Os polímeros lineares de xilose podem ser adicionalmente digeridos parcialmente com atividades enzimáticas, tal como uma betaxilosidase, e/ou uma endo-1,4-beta-xilanase, para produzir xilooligossacarídeos, que também têm aplicações dietéticas. Preferivelmente a beta-xilosidase é uma beta-xilosidase de GH3, e/ou preferivelmente a endo-

1,4-beta-xilanase é uma endo-l,4-betaxilanase de GH10 ou GH11.

Quando uma endo-1,4-beta-xilanase é adicionada aos polímeros lineares de xilose purificados (purificados como descrito acima) os produtos resultantes serão xilo-oligossacarídeos essencialmente livres de grupos laterais de arabinose. O tamanho dos oligossacarídeos pode ser controlado pela dose da endo-1,4-beta-xilanase assim como pelo comprimento do tempo de reação.

Quando tanto uma endo-l,4-beta-xilanase como uma betaxilosidase são adicionadas aos polímeros lineares de xilose purificados o produto resultante será xilose.

Assim a invenção fornece um processo para obter um polímero linear de xilose essencialmente livre de substituintes de arabinose, um processo para obter um produto de xilo-oligossacarídeo essencialmente livre de grupos laterais de arabinose e um processo para separar xilose e arabinose de uma maneira mais simples do que tecnologia prévia (cromatografia de troca iônica).

Além disso a invenção fornece um produto de polímero linear de xilose de alto peso molecular e essencialmente livre de grupos laterais de arabinose e um produto de xilo-oligossacarídeo essencialmente livre de grupos laterais de arabinose.

Preferivelmente o produto de polímero de xilose linear ou produto de xilo-oligossacarídeo compreende pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 98% de polímero em peso do produto cujo polímero tem um grau de polimerização de pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 35, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 120 pelo menos 150, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 500, pelo menos 1000, pelo menos 2000, pelo menos 5000, ou pelo menos 10000.

Preferivelmente o produto de polímero de xilose linear ou produto de xilo-oligossacarídeo compreendendo pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 98% de polímero em peso do produto cujo polímero tem um grau de polimerização de menos do que 5000, menos do que 2500, menos do que 1500, menos do que 1000, menos do que 500, menos do que 100, menos do que 75, menos do que 50, menos do que 25, menos do que 10, menos do que 9, menos do que 8, menos do que 7, menos do que 6, menos do que 5, e preferivelmente menos do que 4.

Preferivelmente o produto de polímero de xilose linear ou produto de xilo-oligossacarídeo compreende pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, tal como pelo menos 98% de polímero em peso do produto cujo polímero tem um grau de polimerização selecionado a partir do grupo consistindo dos intervalos de 3 a 10, de 11 a 25, de 26 a 50, de 51 a 100, de 101 a 200, de 201 a 500, de 501 a 1000, de 1001 a 5000, e de 5001 a 10000.

Os polímeros lineares de xilose produzidos podem ser usados como um aditivo alimentar, e.g. como um agente de corpo, um substituto de gordura de baixa caloria ou fibra dietética, tal como uma fibra dietética não solúvel. Aplicações serão e.g. em bolos, aperitivos extrusados, outros produtos de cereais, e confeitaria. Aplicações técnicas irão incluir aditivo para produtos de papel e polpa, materiais plásticos (películas), onde plastificantes podem ser adicionados, e como um agente de encolamento.

O produto de xilo-oligossacarídeo terá aplicações como fibras dietéticas, tal como fibras dietéticas solúveis. Estas fibras dietéticas podem ser usadas para aumentar a quantidade de bactérias bífidicas no intestino inferior. Aplicações serão e.g. em iogurte, sorvete, e refrigerantes.

Uma forma de realização do primeiro aspecto, caracterizada pelo fato de que atividades enzimáticas adicionais estão presentes, tal como uma beta-xilosidase de GH3, e/ou uma endo-l,4-beta-xilanase de GH10 é particularmente útil quando mais hidrólise completa de arabinoxilano é desejada. Além de liberar açúcares C5 a hidrólise de arabinoxilano também cria polímeros associados de glicose tal como amido e celulase mais acessíveis para a ação das enzimas apropriadas. Isto é particularmente útil quando degradação de substratos complexos é requerida, e.g. em fermentação ou em hidrólise de amido ou biomassa para produção de combustível de etanol, ou em composição de ração animal.

Xilose e/ou arabinose liberadas durante hidrólise enzimática de arabinoxilano no processo do primeiro aspecto e/ou segundo aspecto podem ser usadas como uma fonte de xilose e/ou arabinose como tal, ou como matéria-prima para síntese química/enzimática ou processos de fermentação,

e.g. para produção de xilitol, ácido xilárico, ácidos xilônicos, ácido arabônico, ácido arabinóico, 2,3-butanodiol, ácido láctico, ácido lactônico, furanos e/ou etanol.

Para degradação de substratos ainda mais complexos, ou onde uma degradação mais completa é requerida, a presença de atividades enzimáticas ainda adicionais pode ser desejada. Em uma forma de realização preferida a(s) atividade/atividades de enzima compreendem adicionalmente um acetil xilano esterase (EC 3.1,1.72) e/ou uma feruloil esterase (EC 3.1,1.73) e/ou uma alfa-glucuronidiase (EC 3.2.1,139).

Em uma forma de realização do processo do primeiro aspecto a(s) atividade/atividades de enzima compreendem adicionalmente uma enzima selecionada a partir da lista consistindo de um acetil xilano esterase, uma feruloil esterase, uma alfa-amilase, uma glucoamilase, uma fitase e uma protease.

Em produção de cerveja e outros processos de fermentação baseados em cereal arabinoxilanos de grãos podem ser extraídos de paredes celulares com água quente e podem formar soluções de alta viscosidade. Se em processos de fermentação são usados maltes que não são adequadamente modificados durante maltagem, extratos de malte podem conter altos níveis de arabinoxilanos e outros polissacarídeos causando um aumento em viscosidade dos extratos. As dificuldades associadas com a filtração de tais extratos podem diminuir significantemente a velocidade do processo de fermentação. Em uma forma de realização da presente invenção o substrato contendo arabinoxilano a ser colocado em contato com a composição da invenção é um malte moído de um processo de fermentação de cerveja, através do qual e.g. a viscosidade do malte moído é reduzida e/ou polissacarídeos adicionais liberados.

Em uma forma de realização da presente invenção o processo é qualquer processo de etanol, baseado em hidrólise enzimática de amido gelatinizado ou granular, e.g. em amido granular como descrito em W02004080923 ou W02004081193. Colocando em contato o malte moído com a composição da invenção a viscosidade do malte moído pode ser reduzida. Também polissacarídeos adicionais podem ser liberados, não apenas como açúcares C5 mas também como glicose quando a degradação de arabinoxilano deixa o amido mais acessível para enzimas amilolíticas normalmente presentes durante tais processos. Uma enzima adicional que pode ser vantajosamente aplicada em um processo de etanol baseado em amido é uma enzima selecionada a partir da lista consistindo de beta-glucanase, alfa-amilase, glucoamilase, CGTase, fitase e protease.

O processo da presente invenção pode ser qualquer processo de etanol, compreendendo hidrólise enzimática de biomassa e/ou efluente de pré-tratamento de biomassa. Uma enzima adicional que pode ser vantajosamente aplicada em um processo de etanol baseado em biomassa é uma enzima selecionada a partir da lista consistindo de beta-glucanase, celulase, celobiohidrolase, e beta-glucosidase.

Em um processo de fermentação o hidrolisado de arabinoxilano pode vantajosamente ser colocado em contato com uma levedura ou outro organismo fermentador capaz de utilizar açúcares C5. Altemativamente, o hidrolisado de arabinoxilano pode ser colocado em contato com uma xilose isomerase (EC 5.3.1,5) para isomerização de xilose em xilulose que é fermentável para etanol usando uma levedura Saccharomyces.

A composição da invenção também pode ser usada em processamento de uma matéria-prima de cereal pretendida para uso como um produto de ração/alimento ou a composição pode ser aplicada como um aditivo de ração/alimento. Tais aditivos de ração/alimento baseados em enzimas podem ser incorporados em um produto de ração/alimento baseado em cereal que inclui um ou mais de trigo, cevada, triticale, centeio, arroz e milho. O aditivo de ração/alimento tem a vantagem de melhorar a proporção de conversão de ração/alimento e/ou aumentar a digestibilidade do produto de ração/alimento baseado em cereal no qual ele está incluído. A composição da invenção usada como aditivo de ração/alimento pode preferivelmente ser usada junto com uma fitase.

A presente invenção além disso se refere uma composição para tratar um substrato contendo arabinoxilano, dita composição compreendendo uma enzima tendo atividade para xiloses dissubstituídas, e.g. tal como uma alfa-L-arabinofuranosidase de GH43, e uma enzima tendo atividade para xiloses substituídas em posição C2 ou C3, e.g. tal como uma alfa-Larabinofuranosidase de GH51, GH54 ou GH62.

A presente invenção se refere adicionalmente a composições compreendendo uma alfa-L-arabinofuranosidase de GH43, uma alfa-Larabinofuranosidase de GH51, GH54 ou GH62, uma beta-xilosidase, e/ou uma endo-l,4-beta-xilanase, assim como a composição compreendendo as atividades acima mencionadas e uma enzima selecionada a partir do grupo consistindo de alfa-amilase, CGTase, glucoamilase, fitase, protease, betaglucanase, celulase, celobio-hidrolase, e/ou beta-glicosidase.

A composição pode compreender alfa-L-arabinofuranosidase de GH43 em uma quantidade de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 70%, ou mesmo pelo menos 80% w/w de proteína enzima arabinofuranosidase total presente na composição. Mais preferivelmente a composição pode compreender alfa-L-arabinofuranosidase de GH43 em uma quantidade de pelo menos 5%, tal como pelo menos 10% pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 70% w/w de proteína enzima total presente na composição.

A composição pode ser usada para tratamento de um substrato contendo arabinoxilano, e.g. em um processo de fermentação, e.g. para redução de viscosidade de uma pasta e/ou solução compreendendo um substrato contendo arabinoxilano. A composição pode ser usada para produzir um produto de ração/alimento, e.g. para produzir ou modificar uma fibra nutricional/dietética e/ou para produzir uma xilose, arabinose e/ou xilose linear ou para produzir derivados de xilose, arabinose por fermentação, processamento enzimático ou síntese química.

A invenção além disso fornece um processo, caracterizado pelo fato de que um substrato e/ou uma biomassa contendo arabinoxilano é colocado em contato com uma enzima arabinofuranosidase capaz de liberar arabinose de xiloses dissubstituídas. Preferivelmente a enzima capaz de liberar arabinose de xiloses dissubstituídas é uma arabinofuranosidase. Preferivelmente a alfa-L-arabinofuranosidase é uma alfa-Larabinofuranosidase de GH43. A alfa-L-arabinofuranosidase de GH43 é preferivelmente derivada de origem bacteriana, íungica ou vegetal.

Preferivelmente o substrato e/ou a biomassa contendo arabinoxilano é selecionado a partir da lista consistindo de safras herbáceas e/ou lenhosas energéticas, safras agrícolas de subsistência e forrageiras, produtos de ração animal, tubérculos, raízes, caules, legumes, cascas de mandioca, vagens de cacau, cascas e/ou tampas de arroz, farelo de arroz, espigas, palha, tampas, cascas, polpa de beterraba açucareira, polpa de alfarroba, polpas de hortaliças, resíduo de safra agrícola, palha, talos, folhas, farelo de milho, cascas, espigas, raspa, cascas, vagens, resíduo de madeira, cortiça, aparas, serragem, polpa de madeira, licor de polpação, papel, papelão velho, resíduo de madeira, sólidos de água residual industrial ou municipal, estrume, subproduto de produção de cerveja e/ou processos de fermentação, grão úmido de destilaria, grão seco de destilaria, bagaço de malte, vinhaça e bagaço.

Enzimas

Alfa-L-arabinofuranosidase tendo atividade para xiloses dissubstituídas

A enzima tendo atividade para xiloses dissubstituídas, e.g. tal como uma alfa-L-arabinofuranosidase de GH43, pode ser de origem microbiana, e.g. derivável de uma linhagem de um fungo filamentoso (e.g., Humicola, Aspergillus, Trichoderma, Fusarium, Penicillum) ou de uma bactéria (e.g. Bacillus, Bifldobacterium). Uma tal enzima adequada pode ser selecionada pelo ensaio para atividade de alfa-arabinofuranosidase em arabinoxilano dissubstituídos na seção de métodos.

Preferivelmente a alfa-L-arabinofuranosidase de GH43 é derivada de Humicola insolens. Mais preferivelmente a alfa-Larabinofuranosidase de GH43 é o polipeptídeo mostrado como SEQ ID NO:1, mais preferivelmente o polipeptídeo mostrado como aminoácidos 19-558 de SEQ ID NO:1, ou ainda mais preferivelmente um polipeptídeo que tem pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade com a seqüência de aminoácidos mostrada como aminoácidos 19-558 de SEQ ID NO:1 (daqui por diante polipeptídeos homólogos”).

A alfa-L-arabinofuranosidase de GH43 também pode ser derivada de Bifldobacterium adolescenti. Mais preferivelmente a alfa-Larabinofuranosidase de GH43 é a enzima descrita por Van Laere, 1997, em Appl.Microbiol.Biotechnol, 47, 231-235 e/ou por Van den Broek, 2005, em Applied Microbiology and Biotechnology.

Uma enzima tendo atividade para xiloses dissubstituídas, e.g. tal como uma alfa-L-arabinofuranosidase de GH43, pode ser adicionada em quantidades de 0,001-1,0 g/kg DM de substrato, preferivelmente nas quantidades de 0,005-0,5 g/kg DM de substrato, e mais preferivelmente de 0,05-0,10 g/kg DM de substrato.

Alfa-L-arabinofuranosidase tendo atividade para xiloses monossubstituídas

A enzima tendo atividade para xiloses monossubstituídas em posição C2 e/ou C3, e.g. tal como uma alfa-L-arabinofuranosidase de GH51, GH54 ou GH62, pode ser de origem microbiana, tal como derivável de uma linhagem de um fungo filamentoso (e.g., Meripilus, Humicola, Aspergillus, Trichoderma, Fusarium, Penicillum) ou de uma bactéria (e.g. Bacillus). Preferivelmente a enzima é uma alfa-L-arabinofuranosidase de GH51, e ainda mais preferivelmente a alfa-L-arabinofuranosidase GH51 é derivada de Meripilus giganteus. O polipeptídeo pode preferivelmente ter pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade com a seqüência de aminoácidos mostrada como aminoácidos 17-643 de SEQ ID NO:2 (daqui por diante polipeptídeos homólogos'*). Mais preferivelmente a alfa-L-arabinofuranosidase é o polipeptídeo mostrado como SEQ ID NO:2, ainda mais preferivelmente o polipeptídeo mostrado como aminoácidos 17643 de SEQ ID NO:2.

Alfa-L-arabinofuranosidase de GH51, GH54 ou GH62 pode ser adicionada em quantidades de 0,001-1,0 g/kg DM de substrato, preferivelmente nas quantidades de 0,005-0,5 g/kg DM de substrato, e mais preferivelmente de 0,05-0,10 g/kg DM de substrato.

Beta-xilosidase

A beta-xilosidase é preferivelmente uma beta-xilosidase de GH3. A beta-xilosidase pode ser de origem microbiana, tal como derivável de uma linhagem de um fungo filamentoso (e.g., Trichoderma, Meripilus, Humicola, Aspergillus, Fusarium) ou de uma bactéria (e.g. Bacillus). Preferivelmente a beta-xilosidase é uma beta-xilosidase de GH3 derivada de Trichoderma reesei e mais preferivelmente a beta-xilosidase de GH3 é o polipeptídeo mostrado como SEQ ID NO:3 ou um polipeptídeo que tem pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade com a seqüência de aminoácidos mostrada como aminoácidos de SEQ ID

NO:3 (daqui por diante polipeptídeos homólogos). Betaxilosidase de GH3 pode ser adicionada em quantidades de 0,001-1,0 g/kg DM de substrato, preferivelmente nas quantidades de 0,005-0,5 g/kg DM de substrato, e mais preferivelmente de 0,05-0,10 g/kg DM de substrato.

Endo-1,4-beta-xilanase

A endo-l,4-beta-xilanase é preferivelmente uma endo-1,4beta-xilanase de GH10 ou GH11. A endo-l,4-beta-xilanase pode ser de origem microbiana, tal como derivável de uma linhagem de um fungo filamentoso (e.g., Trichoderma, Meripilus, Humicola, Aspergillus, Fusarium) ou de uma bactéria (e.g. Bacillus). A endo-l,4-beta-xilanase é preferivelmente uma endo-l,4-beta-xilanase de GH10 derivada de Humicola insolens e mais preferivelmente a endo-l,4-beta-xilanase de GH10 é o polipeptídeo mostrado como SEQ ID NO:4, mais preferivelmente como aminoácidos 17-389 de SEQ ID NO:4, ou ainda mais preferivelmente um polipeptídeo que tem pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade com a seqüência de aminoácidos mostrada como aminoácidos 17-389 de SEQ ID NO:4 (daqui por diante polipeptídeos homólogos).

Endo-l,4-beta-xilanase de GH10 pode ser adicionada em quantidades de 0,001-1,0 g/kg DM de substrato, preferivelmente nas quantidades de 0,005-0,5 g/kg DM de substrato, e mais preferivelmente de 0,05-0,10 g/kg DM de substrato.

MATERIAIS E MÉTODOS

Enzimas usadas

Uma alfa-L-arabinofuranosidase GH43 de H insolens (SEQ ID NO:1), uma alfa-L-arabinofuranosidase GH51 de M. giganteus (SEQ ID NO:2), uma beta-xilosidase GH3 de Trichoderma reesei (SEQ ID NO:3) e uma endo-l,4-beta-xilanase GH10 de H. insolens (SEQ ID NO:4). As enzimas acima mencionadas foram clonadas usando técnicas moleculares básicas (Aúsubel et aL, 2003, Curr. Prot. Mol. Biol., John Wiley & Sons, Cambridge, USA, Christgau et al. 1995, Curr. Genet. 27, 135-141).

Ultraflo L e Celluclast 1,5 L são composições enzimáticas comerciais, e disponíveis a partir de Novozymes A/S. Ultraflo L é derivada de Humicola insolence e compreende celulases e hemicelulases. Celluclast 1,5 L é derivada de Trichoderma reesei e compreende celobiohidrolases e endoglucanases.

Bio-Feed Wheat L é uma xilanase comercial para aplicação de ração e disponível a partir de Novozymes A/S. Bio-Feed Wheat L é derivada de Termomyces lanuginosus.

Químicos e substratos

Arabinose e xilose foram adquiridas a partir de Merck (Darmstadt, Alemanha). Arabinoxilanos de trigo solúveis em água e insolúveis em água foram obtidos a partir de Megazyme (Bray, County Wicklow, Irlanda). O efluente de fermentação de etanol, vinhaça, foi fornecido por Tate & Lyle, Amylum UK (Greenwich, UK).

Substrato de arabinoxilano de trigo solúvel

Arabinoxilano de trigo solúvel em água de viscosidade média foi obtido a partir de Megazyme (Bray, County Wicklow, Irlanda). Teores de monossacarídeos depois de hidrólise ácida (0,4 N HCI, 2 h, 100°C) e HPAEC foram: 275,8 mg/g de arabinose, 479,2 mg/g de xilose (= A:X 0,58), com apenas traços de galactose e glicose. De acordo com a folha de produto os teores de amido, beta-glucano, proteína, umidade, e cinza em peso foram <0,1%, <0,1%, 0,9%, 1,9%, e 2,2%, respectivamente.

Substrato de vinhaça de trigo

Vinhaça de trigo, um subproduto de fermentação industrial de etanol, foi fornecida por Tate & Lyle, Amylum UK, (Greenwich, UK). O teor de material seca da vinhaça foi 9,02 %-p. Teores de monossacarídeos depois de hidrólise ácida (0,4 N HCI, 2 h, 100°C) e HPAEC foram: Arabinose 82,9 g/kg DM de vinhaça, xilose 119 g/kg DM de vinhaça mg/g, galactose 21,6 g/kg DM de vinhaça, e 78,2 g/kg DM de vinhaça. Ácidos orgânicos, proteína, cinza, e ácido ferúlico constituíram 30%, 16%, 11%, e 0,2% em peso, respectivamente da matéria seca.

Preparação de polímeros e oligossacarídeos específicos de arabinoxilano

Arabinoxilano duplamente substituído foi preparado incubando arabinoxilano de trigo solúvel (lg) em 0,1 M de tampão acetato (100 mL), pH 6,0 com 0,167 g de α-L-arabinofuranosidase de Meripilus giganteus (GH51)'kg^-1 arabinoxilano de trigo solúvel em água por 48 horas a 30°C. Arabinoxilano unicamente substituído foi preparado incubando arabinoxilano de trigo solúvel em água (lg) em 0,1 M de tampão acetato (42 mL), pH 6,0 com 0,147 g de α-L-arabinofuranosidase de Humicola insolens (GH43) •kg¹ arabinoxilano de trigo solúvel em água por 48 horas a 30°C. Para interromper as reações enzimáticas as misturas foram aquecidas para 100°C por 10 min. Polímeros de arabinoxilano foram precipitados por adição de etanol (126 ml). Os precipitados foram filtrados (Miracloth) e secos a vácuo.

Oligossacarídeos contendo grupos arabinosil ligados a (1-3) terminais foram preparados incubando o arabinoxilano de trigo insolúvel em água (lg) em 0,1 M de tampão acetato (100 mL), pH 6,0 com 6,67 g de Shearzyme (xilanase GH10) •kg'¹ arabinoxilano de trigo insolúvel em água por 2 horas a 30°C. Oligossacarídeos contendo grupos arabinosil ligados a (1—>3) internos foram preparados incubando arabinoxilano de trigo insolúvel em água (lg) em 0,1 M de tampão acetato (100 mL), pH 6,0 com 0,03 g de Pentopan Mono (xilanase GH11) *kg^_1 arabinoxilano de trigo insolúvel em água por 2 horas a 30°C. Oligossacarídeos contendo grupos arabinosil ligados a (l—>2) internos foram preparados incubando arabinoxilano de trigo insolúvel em água (lg) em 0,1 M de tampão acetato (100 mL), pH 6,0 com 0,03 g de Pentopan Mono (xilanase GH11) -kg¹ arabinoxilano de trigo

Uma solução de 0,1% do arabinoxilano dissubstituído foi preparada e a atividade de alfa-arabinofuranosidase foi medida misturando 0,1 ml de enzima, 0,9 ml de tampão (0,12 M de ácido succínico, pH 6,0) e 1,0 ml de solução de substrato em um tubo eppendorf. O tubo eppendorf foi incubado a 60°C por 1 hora com agitação. A quantidade de arabinose liberada foi medida por HPAEC (cromatografia de troca aniônica de alta performance).

HPAEC

Hidrolisados (10 μΐ) foram aplicados em um sistema Dionex

TTLjf

BioLC ajustado com uma coluna de guarda Dionex CarboPac PAI (4 x 250 mm) (Dionex Corporation, Sunnyvale, CA, USA) combinada com uma précoluna CarboPac PAI (4 x 50 mm). Os monossacarídeos foram separados isocraticamente com 10 mM de KOH por 15 min, fluxo: 1 mLmin¹. Monossacarídeos foram detectados por um detector eletroquímico pulsado no modo de detecção amperiométrico pulsado. O potencial do eletrodo foi programado para +0,1 V (t = 0-0,4 s) para -2,0 V (t = 0,410,42 s) para 0,6 V (t = 0,43 s) e finalmente -0,1 V (t = 0,44-0,50 s), embora integrando o sinal resultante de t = 0,2-0,4 s. Uma mistura de arabinose e xilose (concentração de cada componente: 0,0025-0,1 g'L^-1) foi usada como padrão.

Análise *H-RMN

Todos os produtos de degradação foram liofilizados duas vezes a partir de 99,9% D₂0 e re-dissolvidos em 99.9% D₂0. Alguns hidrolisados foram dialisados (Spectra/Por corte de peso membrana molecular 1000) para remover arabinose livre antes da análise espectral. Os espectros de ^-RMN foram registrados a 30°C em um instrumento Varian Mercuiy-VX operado a 400 MHz e equipado com uma sonda auto-comutável de 4 núcleos. Dados foram coletados por 128-512 varreduras e o sinal de HDO foi usado como um sinal de referência (4,67 ppm).

EXEMPLOS

Exemplo 1

Hidrólise enzimática de arabinoxilano insolúvel em água

Substrato de arabinoxilano de trigo insolúvel em água (0,05 g) dissolvido em 50 ml de água duplamente deionizada por ensaio (0,1% DM) foi incubado com uma composição da invenção, ou com 10%-p de uma mistura 50:50 de Ultraflo e Celluclast 1,5 L. E/S se refere ao peso de preparação enzimática (E) adicionada em percentual por peso de substrato (S).

A composição da invenção compreendeu 0,075 g de alfaarabinofuranosidase GH51 de M. giganteus/kg DM de arabinoxilano, 0,075 g de alfa-arabinofuranosidase GH43 de H. insolens/kg DM de arabinoxilano, 0,075 g de beta-xilosidase de T. reesei/kg DM de arabinoxilano, e 0,075 g de xilanase de H. insolens/kg DM de arabinoxilano.

Os tratamentos foram realizados por 24 horas em pH 5 e 50°C. Amostras foram retiradas depois de 24 horas e imediatamente aquecidas a 100°C por 10 min. As amostras foram filtradas (filtro de 0,2 microM) e os níveis de arabinose, e xilose foram determinados por HPAEC. Experimentos de hidrólise enzimática foram realizados em triplicata e os valores médios relatados estão em porcentagem das quantidades liberadas por hidrólise ácida. Resultados são apresentados em Tabela 1.

Tabela 1. Arabinose e xilose liberadas de arabinoxilano de trigo insolúvel em água por hidrólise enzimática. Números estão em percentual de peso da quantidade de cada monossacarídeo liberado por hidrólise ácida das amostras de arabinoxilano de trigo solúvel em água.

Enzima	Arabinose	Xilose
Celluclast 1,5 L: Ultraflo L	43	56,7
Composição da invenção ArabinoseXilose	57	64

Hidrólise enzimática de arabinoxilano solúvel em água

Substrato de arabinoxilano de trigo solúvel em água (0,05 g) dissolvido em 50 ml de água duplamente deionizada por ensaio (0,1% DM) foi incubado com uma composição da invenção, ou com 10 %-p de uma

mistura 50:50 de Ultraflo e Celluclast 1,5 L. E/S se refere ao peso de preparação enzimática (E) adicionada em percentual por peso de substrato (S).

A composição da invenção compreendeu 0,080 g de alfaarabinofuranosidase GH51 de M. giganteus/kg DM de arabinoxilano, 0,080 g de alfa-arabinofuranosidase GH43 de H. insolenslkg DM de arabinoxilano, 0,16 g de beta-xilosidase de T reesei/kg DM de arabinoxilano, e 0,080 g de xilanase de H. insolenslkg DM de arabinoxilano.

Os tratamentos foram realizados por 24 horas em pH 5 e 50°C. Amostras foram retiradas depois de 24 horas e imediatamente aquecidas a 100°C por 10 min. As amostras foram filtradas (filtro de 0,2 microM) e os níveis de arabinose, e xilose foram determinados por HPAEC. Experimentos de hidrólise enzimática foram realizados em triplicata e os valores médios relatados estão em porcentagem das quantidades liberadas por hidrólise ácida. Resultados são apresentados em Tabela 2.

Tabela 2. Arabinose e xilose liberadas de arabinoxilano de trigo solúvel em água por hidrólise enzimática. Números estão em percentual de peso da quantidade de cada monossacarídeo liberado por hidrólise ácida das amostras de arabinoxilano de trigo solúvel em água.

Enzima	Arabinose	Xilose
Celluclast 1,5 L: Ultraflo L	25	51
Composição da invenção	116	107

Exemplo 2

A hidrólise de vinhaça foi realizada de acordo com o método descrito para arabinoxilano solúvel em água em Exemplo 1 exceto que a dosagem de beta-xilosidase foi 0,050 g/kg de vinhaça DM e o nível de substrato foi 5 %-p de DM. Amostras foram retiradas depois de 24 h e imediatamente aquecidas a 100°C por 10 min para interromper a reação enzimática, centrifugadas (14000 rpm, 10 min), filtradas (filtro de 0,2 microM) e sujeitas à análise HPAEC para determinar os níveis de arabinose e xilose, veja abaixo. Experimentos de hidrólise enzimática foram realizados em duplicata e os valores médios relatados estão em porcentagem das quantidades liberadas por hidrólise ácida. Resultados são apresentados em Tabela 2.

Tabela 3. Arabinose e xilose liberadas de vinhaça por hidrólise enzimática. Números estão em percentual de peso da quantidade de cada monossacarídeo liberado por hidrólise ácida das amostras de arabinoxilano de trigo solúvel em água.

Enzima	Arabinose	Xilose
Celluclast 1,5 L:UltrafIo L	77	75
Composição da invenção	103	81

Exemplo 3

Trigo arabinoxilano compreende arabinofuranosídeo como um monossubstituinte ligado à posição 3 de xilose interna e a arabinofuranosídeo ligado às posições 3 e 2 em xilose dissubstituída, respectivamente. Substratos foram produzidos compreendendo apenas um dos 3 tipos de ligações de arabinofuranosídeo. A atividade das arabinofuranosidases para estes substratos foi investigada.

Tabela 4. Atividade em polímeros de arabinoxilano selecionados, incubação em pH 6, 40°C por 2 horas.

		Enzima
Substrato	Ligação	H. insolens (GH43)	Bifidobacterium adolescentis (GH43)	H. insolens (GH51)	M. giganteus (GH51)
Arabinoxilano intacto	Monossubstituído (1-3) Dissubstituído (1—2)	-		X	XX
			-
Dissubstituído (1—3)	XX	X		-
Arabinoxilano dissubstituído	Dissubstituído (1—2)		-	-
Dissubstituído (1—3)	XX	XX
Arabinoxilano monosubstituído xx se refere a ir	Monossubstituído (1-2)	-		XX	XX
Monossubstituído (1-3) iais do que 75% de	hidrólise, x(	(x) a 50-75% de hi	XX drólise, x	XX a 25-50% c

hidrólise e (x) a 5-25% de hidrólise. — se refere a nenhuma hidrólise detectável

Exemplo 4

Arabinoxilano de trigo solúvel foi incubado com 0,1 g de

proteína enzima por kg DM de alfa-L-arabinofuranosidase de H insolens (GH43), B. adolescentis (GH43), H. insolens (GH51), e M. giganteus (GH51). A arabinose liberada como mg por g de arabinoxilano de trigo solúvel em água, sua soma hipotética, e sua liberação de arabinose depois de 5 tratamento com 0,2 g de proteína enzima por kg DM de uma mistura 50:50 de alfa-L-arabinofuranosidases de H. insolens (GH43), BL sp. (GH43), H. insolens (GH51), e M. giganteus (GH51) foi medida. Resultados são expressos como a média de determinações de triplicata, coeficiente de variação em média < 6,4.

Z10 Tabela 5. Arabinose liberada de arabinoxilano de trigo solúvel tratado com alfa-L-arabinofuranosidase em duas condiçõesdiferentes temperatura e pH.

	pH 6, 40°C	pH 5,50°C
H. insolens (GH43)	128,0 a	147,0 a
M. giganteus (GH51)	48,15 c	121,0b
B. adolescentis (GH43)	63,43 b	4,833 d
H. insolens (GH51)	20,75 d	18,47 c

Valores dentro de uma coluna não compartilhando um índice alfabético comum diferem com significância estatística (P<0,05).

Tabela 6. Arabinose liberada de arabinoxilano de trigo solúvel tratado com misturas 50%:50% de alfa-L-arabinofuranosidases em pH 5, 50°C.______

	pH 5, 50°C	pH 5, 50°C
H insolens (GH43) e H. insolens (GH51)	-	168,3 b
H. insolens (GH43) e M. Giganteus (GH51)	-	289,0 a
B. adolescentis (GH43) e H insolens (GH51)	-	17,43 d
B. adolescentis (GH43) e M. giganteus (GH51)	-	131,0 c

Exemplo 5

Bagaço de malte foi obtido de um processo de produção de cerveja tipo Pilsner usando malte de cevada moído em martelos. O bagaço de malte foi liofilizado para um teor de matéria seca de 96,1% w/w e moído. O material de bagaço de malte foi suspenso 5 g de matéria seca/100 ml de ácido succínico - tampão succinato de sódio pH 5,0 e sujeito à hidrólise por dois tratamentos: 1) um tratamento convencional usando uma mistura 50:50 de

Celluclast 1,5 L + Ultraflo L com 6,5 g de proteína enzima por kg de matéria seca de bagaço de malte e 2) um tratamento da invenção aplicando uma mistura 25:25:25:25 em base de peso protéico da alfa-L-arabinofuranosidase GH43 de H. insolens (SEQ ID NO:1), da alfa-L-arabinofuranosidase GH51 de M. giganteus (SEQ ID NO:2), da betaxilosidase GH3 de Trichoderma reesei (SEQ ID NO:3) e da endo-l,4-beta-xilanase GH10 de H. insolens (SEQ ID NO:4). Uma dosagem de enzima equivalente a 0,6 g de proteína enzima por kg de matéria seca de bagaço de malte foi usada.

A hidrólise foi realizada em tubos Eppendorf incubados em um Thermomixer Compact a 1000 rpm por 16 horas a 50°C. As amostras foram cozidas por 10 minutos, centrifugadas por 10 minutos a 14000 x g e a fase solúvel foi carboidratos analisada em HPLC. HPLC foi realizada em um Dionex BioLC usando um GS50 Gradient Pump, AS50

Autosampler, e um detector eletroquímico ED40. A concentração de arabinose e xilose liberadas foi medida.

Tabela 7. Bagaço de malte: Resultados de análises HPLC de arabinose e xilose liberadas em g/litro. ______________________

	Arabinose	Xilose
Controle, nenhuma enzima	0,00	0,00
1) Tratamento convencional	1,19	1,98
2) Tratamento.da invenção	1,48	2,12

Exemplo 6

Uma solução contendo arabinoxilano foi obtida cozinhando palha de trigo a 190°C seguido por separação do líquido da palha por filtração. Em todos os experimentos 1,5 g do líquido foi adicionalmente diluído para 2,0 g por adição de ácido/base para ajuste de pH, por adição de solução enzimática e por adição de água deionizada. O líquido foi incubado com 2,5 g de proteína enzima por litro de volume de reação ou com a mistura enzimática da invenção, com a mistura de celulose convencional consistindo de uma mistura 50:50 de Ultraflo e Celluclast 1,5 L (proporção de mistura

baseada em teor protéico).

A composição da invenção compreendeu uma mistura 10:10:5:25 em base de peso protéico da alfa-arabinofuranosidase de H. insolens (SEQ ID NO:1), da alfa-arabinofuranosidase de M. giganteus (SEQ 5 ID NO:2), da beta-xilosidase de T. reesei (SEQ ID NO:3) e da xilanase de H. insolens (SEQ ID NO:4). Os tratamentos foram realizados por 24 horas em três níveis de pH (4, 5, 6) e em duas temperaturas (40, 50°C). Amostras foram retiradas depois de 24 horas e imediatamente aquecidas a 100°C por 10 min. As amostras foram filtradas (filtro de 0,2 microM) e os níveis de arabinose, e ZHO xilose foram determinados por HPAEC. Todos os experimentos de hidrólise enzimática foram realizados em duplicata e os valores médios relatados estão em porcentagem das quantidades liberadas por hidrólise ácida. Resultados são apresentados em Tabela 8.

Tabela 8. Arabinose e xilose liberadas a partir de arabinoxilano de trigo solúvel em água por hidrólise enzimática. Números estão em percentual de peso da quantidade de cada monossacarídeo liberado por hidrólise ácida do arabinoxilano de trigo solúvel em água.

Temperatura	pH	Arabinose	Xilose
	Referência	Invenção	Referência	Invenção
[°C]
40	4	63	95	66	72
40	5	70	91	71	78
40	6	76	94	79	88
50	4	60	93	71	72
50	5	66	92	81	88
50	6	87	99	87	87

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para hidrólise enzimática de arabinoxilano, caracterizado pelo fato de que compreende colocar em contato um substrato contendo arabinoxilano com:

a) uma enzima tendo atividade para xiloses dissubstituídas, em que a enzima tendo atividade para xiloses dissubstituídas é uma alfa-Larabinofuranosidase GH43;

b) uma enzima tendo atividade para xiloses monossubstituídas na posição C2 ou C3, em que a enzima tendo atividade para xiloses monossubstituídas na posição C2 ou C3 é uma alfa-L-arabinofuranosidase GH51;

c) uma beta-xilosidase; e

d) uma endo-1,4-beta-xilanase.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a beta-xilosidase é uma GH3 beta-xilosidase.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a endo-1,4-beta-xilanase é uma GH10 endo-1,4-betaxilanase.
4. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que as atividades enzimáticas compreendem adicionalmente uma enzima selecionada a partir da lista consistindo de acetil xilano esterase, feruloil esterase, alfa-amilase, CGTase, glucoamilase, fitase, protease, beta-glucanase, celulase, celobio-hidrolase, e beta-glicosidase.
5. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de compreender produzir um hidrolisado compreendendo xilose linear e/ou xilo-oligossacarídeo e/ou xilose e/ou arabinose.
6. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de compreender produzir um produto de ração animal.

Petição 870180045393, de 28/05/2018, pág. 12/18
7. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de compreender colocar em contanto o substrato contendo arabinoxilano com um organismo fermentador e produzir um produto de fermentação.
8. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de compreender produzir uma bebida alcoólica, combustível e/ou etanol potável.
9. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o substrato é derivado de um cereal, preferivelmente selecionado a partir do grupo consistindo de trigo, centeio, cevada, milho, arroz, sorgo e milheto.
10. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o substrato é um subproduto de um processo de moagem a úmido, de um processo de fermentação, ou de produção de açúcar.
11. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a

10, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente colocar em contato o substrato contendo arabinoxilano com um organismo fermentador capaz de utilizar açúcares C5.
12. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a

11, caracterizado pelo fato de compreender modificar uma fibra alimentar.
13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o dito substrato contendo arabinoxilano é selecionado a partir do grupo consistindo de safras herbáceas e/ou lenhosas energéticas, safras agrícolas de subsistência e forrageiras, produtos de ração animal, tubérculos, raízes, caules, legumes, cascas de mandioca, vagens de cacau, folhelhos de arroz, cascas de arroz, farelo de arroz, espigas, palha, cascas, folhelhos, polpa de beterraba açucareira, polpa de alfarroba, polpas de hortaliças, resíduo de safra agrícola, palha, caules, folhas, farelo de milho, folhelhos, espigas, raspa, cascas, vagens, resíduo de madeira, cortiça, aparas,

Petição 870180045393, de 28/05/2018, pág. 13/18 serragem, polpa de madeira, licor de polpação, papel, papelão velho, resíduo de madeira, sólidos de água residual industrial ou municipal, estrume, subproduto de produção de cerveja e/ou processos de fermentação, grão úmido de destilaria, grão seco de destilaria, bagaço de malte, vinhaça e bagaço.
14. Composição para hidrólise de arabinoxilano, caracterizada pelo fato de compreender as atividades enzimáticas;

a) uma enzima tendo atividade para xiloses dissubstituídas, em que a enzima tendo atividade para xiloses dissubstituídas é uma alfa-Larabinofuranosidase GH43;

b) uma enzima tendo atividade para xiloses monossubstituídas em posição C2 ou C3, em que a enzima tendo atividade para xiloses monossubstituídas na posição C2 ou C3 é uma alfa-L-arabinofuranosidase GH51;

c) uma beta-xilosidase; e

d) uma endo-1,4-beta-xilanase.
15. Composição de acordo com a reivindicação 14 caracterizada pelo fato de que a beta-xilosidase é uma GH3 beta-xilosidase.
16. Composição de acordo com a reivindicação 14 caracterizada pelo fato de que a endo-1,4-beta-xilanase é uma GH10 endo-

1,4-beta-xilanase.
17. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 14 a 16 caracterizada pelo fato de que a(s) atividade/atividades de enzima compreendem adicionalmente uma enzima selecionada a partir do grupo consistindo de acetil xilano esterase, feruloil esterase, alfa-amilase, CGTase, glucoamilase, fitase, protease, beta-glucanase, celulase, celobiohidrolase, e/ou beta-glicosidase.
18. Uso da composição como definida em qualquer das reivindicações 14 a 17, caracterizado pelo fato de ser para tratamento de um

Petição 870180045393, de 28/05/2018, pág. 14/18 substrato contendo arabinoxilano.
19. Uso de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de ser empregado em um processo de fermentação.
20. Uso de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de ser para redução de viscosidade de uma pasta e/ou solução compreendendo um substrato contendo arabinoxilano.
21. Uso de acordo com qualquer das reivindicações 18 a 20, caracterizado pelo fato de ser para produção de um produto de ração animal ou um produto alimentício.
22. Uso de acordo com qualquer das reivindicações 18 a 21, caracterizado pelo fato de ser para produção de xilose, arabinose, xilooligossacarídeos e/ou xilose linear.
23. Uso de acordo com qualquer das reivindicações 18 a 22, caracterizado pelo fato de ser para produção de uma fibra dietética.
24. Uso de acordo com qualquer das reivindicações 18 a 23, caracterizado pelo fato de ser para produção do produto como definido em qualquer das reivindicações 15 a 17.