ES2393090T3

ES2393090T3 - Hidrólisis de arabinoxilano

Info

Publication number: ES2393090T3
Application number: ES06722906T
Authority: ES
Inventors: Hanne Risbjerg Soerensen; Sven Pedersen; Anders Viksoe-Nielsen; Christel Thea Joergensen; Lars Hylling Christensen; Christian Isak Joergensen; Carsten Hoerslev Hansen; Lene Venke Kofod
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2005-04-26
Filing date: 2006-04-25
Publication date: 2012-12-18
Anticipated expiration: 2026-04-25
Also published as: ES2393090T5; AU2006239644A1; AU2006239644B2; DK1877568T4; DK1877568T3; BRPI0610253A2; EP1877568B9; CA2605258C; CA2910102A1; BRPI0610253B1; US20080274527A1; WO2006114095A1; EP1877568B1; CA2605258A1; EP1877568A1; EP1877568B2; US7993890B2

Abstract

Proceso comprendiendo i) puesta en contacto de un sustrato conteniendo arabinoxilano, con una composición quecomprende,a) una alfa-L-5 arabinofuranosidasa de GH43, teniendo actividad hacia xilosas di-sustituidas,b) una alfa-L-arabinofuranosidasa de GH51, GH54 o GH62 teniendo actividad hacia xilosas mono-sustituidasde posición C2 o C3, eii) hidrólisis de arabinoxilano, donde la alfa-L-arabinofuranosidasa de GH43 tiene al menos 85% de identidad con lasecuencia de aminoácidos mostrada como los aminoácidos 19-558 de la SEC ID NO: 1 y está presente en una cantidadde al menos 5% p/p de proteína enzimática total presente en la composición.

Description

Hidrólisis de arabinoxilano

Campo de la invenci6n

[0001] La presente invención se refiere a un proceso para hidrólisis enzimática de arabinoxilano, y una composición enzimática adecuada para el uso en tal proceso.

Antecedentes de la invenci6n

[0002] Arabinoxilano, un polisacárido compuesto por xilosa y arabinosa, es parte de la fibra insoluble y soluble en agua presente en cereales, en particular en las membranas celulares. La hidrólisis de arabinoxilano es un prerequisito importante para una utilización mejorada de la hemicelulosa del cereal, por ejemplo en la industria de fermentación de etanol y otras industrias a base de cereales.

[0003] Arabinoxilano consiste en residuos de alfa-L-arabinofuranosa unidos como puntos de ramificación a un esqueleto polimérico de xilosa beta-(1-4)-unido. Los residuos de xilosa pueden estar mono-sustituidos en la posición C2 o C3 o disustituidos en ambas posiciones C2 y C3. Además, ácido ferúlico y ácido p-cumárico puede ser enlazado covalentemente a arabinoxilano vía esterificación a la posición C5 de algunas de las unidades de arabinosilo. Estas sustituciones en el esqueleto de xilano retardan las acciones de xilanasas y la hidrólisis completa de arabinoxilano así requiere ambas actividades de escisión y despolimerizantes de grupo lateral. Los productos principales de hidrólisis de arabinoxilano son los azúcares C5 xilosa y arabinosa.

[0004] Un proceso para hidrólisis de arabinoxilano usando interacciones sinergísticas entre enzimas presentes en composiciones comerciales enzimáticas de Humicola insolence y Trichoderma reesei ha sido descrito previamente por los presentes inventores en Sørensen, H.R. et al. (Biotechnology and Bioengineering, Vol. 81, No. 6, 20 March, 726-731, 2003 ) y Sørensen, H.R. et al. Enzyme and Microbial Technology, Vol. 36, No. 5-6, 1 April 2005, 773-784 ). Hidrólisis catalizada de enzima de > 50% de la parte soluble del arabinoxilano de endospermo de trigo podría ser conseguida, pero sólo rendimientos de monosacáridos bajos fueron obtenidos con tratamientos enzimáticos similares en el arabinoxilano de trigo insoluble. No obstante, ya que las actividades enzimáticas de degradación de arabinoxilano están presentes como actividades secundarias en preparaciones comerciales con otras actividades enzimáticas como su actividad principal, niveles de dosificación altos de 5 - 10 % en peso de la preparación enzimática por peso del sustrato se tiene que añadir para obtener una hidrólisis eficaz. Tales altos niveles de adición enzimáticos no son realizables para el uso en aplicaciones de producción de escala completa y procesos mejorados para hidrólisis de arabinoxilano son por tanto necesitados.

Resumen de la invenci6n

[0005] Los inventores han encontrado ahora procesos mejorados para hidrólisis de arabinoxilano y una composición enzimática adecuada para el uso en tal proceso. En el proceso de la invención un sustrato con arabinoxilano se contacta con una enzima con actividad hacia xilosas di-sustituidas, como por ejemplo una alfa-L-arabinofuranosidasa de de glucósido hidrolasa familia 43 (GH43), y una enzima con actividad hacia xilosas mono-sustituidas de posición C2 o C3, por ejemplo tal como una alfa-L-arabinofuranosidasa de glucósido hidrolasa familia 51, 54 o 62 (GH51, GH54 o GH62).

[0006] Por consiguiente la invención proporciona en un primer aspecto un proceso que comprende poner en contacto un sustrato con arabinoxilano, con una composición que comprende, a) una alfa-L-arabinofuranosidasa de GH43, teniendo actividad hacia xilosas di-sustituidas, b) una alfa-L-arabinofuranosidasa de GH51, GH54 o GH62 teniendo actividad hacia xilosas mono-sustituidas de posición C2 o C3, y c) hidrolizar arabinoxilano, donde la alfa-L-arabinofuranosidasa de GH43 tiene al menos 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrados como aminoácidos 19-558 de SEC ID nº: 1 y está presente en una cantidad de al menos 5% p/p de proteína enzimática total presente en la composición.

[0007] La invención proporciona en un segundo aspecto una composición para hidrólisis de arabinoxilano de dicha composición que comprende las actividades enzimáticas; a) una alfa-L-arabinofuranosidasa de GH43 teniendo actividad hacia xilosas di-sustituidas, y, b) una alfa-L-arabinofuranosidasa de GH51, GH54 o GH62 teniendo actividad hacia xilosas mono-sustituidas de posición C2 o C3, donde la alfa-L-arabinofuranosidasa de GH43 tiene al menos 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada como aminoácidos 19-558 de la SEC ID nº: 1 y está presente en una cantidad de al menos 5% p/p de proteína enzimática total presente en la composición.

[0008] La invención proporciona en otros aspectos usos de la composición del segundo aspecto para tratamiento de un sustrato con arabinoxilano.

Breve descripci6n del dibujo

[0009] Fig. 1A-C muestran polímeros de arabinoxilano: Fig. 1A muestra arabinoxilano intacto. Residuos de arabinofuranosilo enlazados alfa(1ൺ3) (mono-sustituidos) y alfa(1ൺ2)

y alfa(1ൺ3) (di-sustituidos) a xilosas internas.

Fig. 1B muestra arabinoxilano di-sustituido. Residuos de arabinofuranosilo enlazados alfa(1ൺ2) y alfa(1ൺ3) (disustituido) a xilosas internas. Fig. 1C muestra arabinoxilano individualmente sustituido. Residuos de arabinofuranosilo enlazados alfa(1ൺ2) y alfa(1ൺ3) (mono-sustituidos) a xilosas internas

Fig. 2A-C muestran oligosacáridos de arabinoxilo: Fig. 2A muestra grupos de arabinosilo enlazados a C-3 interno. Residuos de arabinofuranosilo enlazados alfa(1ൺ3)

(mono- sustituidos) y alfa(1ൺ2) y alfa(1ൺ3) (di-sustituidos) a xilosas internas.

Fig. 2B muestra grupos de arabinosilo enlazados a C-3 terminal. Residuos de arabinofuranosilo enlazado alfa(1ൺ3)

(mono- sustituidos) a xilosas terminales y alfa(1ൺ2) y alfa(1ൺ3) (di-sustituidos) a xilosas internas

Fig. 2C muestra grupos de arabinosilo enlazados a C-2 interno. Residuos de arabinofuranosilo enlazado alfa(1ൺ2) y

alfa(1ൺ3)(mono-sustituidos) a xilosas internas

Descripci6n detallada de la invenci6n

[0010] En la descripción y reivindicaciones que sigue lo siguiente hay definiciones de algunos de los términos técnicos que son empleados.

[0011] La numeración de familias de glucósido hidrolasa aplicada en esta descripción sigue el concepto de Coutinho,

P.M. & Henrissat, B. (1999) CAZy -Carbohydrate-Active Enzymes server en URL: http://afmb.cnrsmrs.fr/ฏcazy/CAZY/index.html o alternativamente Coutinho, P.M. & Henrissat, B. 1999; The modular structure of cellulases and other carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach. En "Genetics, Biochemistry and

Ecology of Cellulose Degradation"., K. Ohmiya, K. Hayashi, K. Sakka, Y. Kobayashi, S. Karita and T. Kimura eds., Uni Publishers Co., Tokyo, pp. 15-23 , and Bourne, Y. & Henrissat, B. 2001; Glycoside hydrolases and glycosyltransferases: families and functional modules, Current Opinion in Structural Biology 11:593-600.

[0012] El término "almidón granulado" en el contexto de la presente invención se entiende como almidón crudo no cocido, es decir almidón que no ha sido sometido a una gelatinización.

[0013] El término "biomasa" significa en el contexto de la presente invención todos los materiales con hemicelulosa. Biomasa es un recurso muy heterogéneo y químicamente complejo que comprende subproductos de procesamiento industrial y agrícolo de todos los tipos de material vegetal. La biomasa puede ser cualquier materia orgánica derivada de plantas que incluye brotes herbáceos de cultivos energéticos leñosos, cultivos alimentarios y forrajeros y cultivos agrícolas desechos y residuos tal como paja, tallos, hojas, salvado de maíz, cáscaras, mazorcas, cortezas, cubiertas, y vainas, desechos de madera tal como corteza, virutas, serrín, pulpa de madera y licor de pulpa. La biomasa puede incluir biomasa de desechos, tal como desechos de papel, cartón, desecho de madera de construcción y de demolición. La biomasa puede también incluir lodo o sólidos recuperados de tratamiento de agua de desecho industrial o municipal al igual que de abono animal.

[0014] El "sustrato con arabinoxilano" a ser tratado en el proceso de la presente invención se puede obtener de cualquier fuente vegetal, en particular ser obtenido de tubérculos, raíces, tallos, leguminosas, cereales o grano entero. Preferidos son hemicelulosa con productos de desechos agrícolos (es decir residuos y/o subproductos) tal como cáscaras de mandioca, vainas de cacao, cáscaras de arroz y/o cascos, salvado de arroz de pulido de arroz, mazorcas, paja, cascos y/o cáscaras de grano de cereal, tallo de caña de azúcar prensado, pulpa de remolacha azucarera, pulpa de semilla de algarroba u otro vegetal o pulpas de fruta. El sustrato puede ser cualquier biomasa.

[0015] Preferido es un sustrato obtenido de grano de cereal, por ejemplo tal como grano molido o subproductos de procesamiento de grano de cereal, por ejemplo un arabinoxilano con subproducto de molido en húmedo o en seco de cereal, el grano de cereal puede ser cualquier grano de cereal aunque preferido es un grano de cereal seleccionado del grupo que consiste en grano (maíz), trigo, cebada, avena, arroz, sorgo y mijo. Los más preferidos para la presente invención es un sustrato con arabinoxilano derivado de trigo.

[0016] El sustrato con arabinoxilano puede ser la molienda o trituración de un proceso de fabricación de cerveza y/o de fermentación, o puede ser un subproducto de un proceso de fabricación de cerveza y/o de fermentación, por ejemplo

grano de destilación en seco o en húmedo, grano consumido, vinaza, bagazo etc.

[0017] Sustratos con arabinoxilano normalmente comprenden tanto arabinoxilano soluble en agua e insoluble de agua. Contemplado para los aspectos de la presente invención es sustratos que comprenden tanto arabinoxilano soluble en agua y/o arabinoxilano insoluble en agua.

Procesos [0018] El proceso donde un sustrato con arabinoxilano se contacta con actividades enzimáticas que comprenden una enzima con actividad hacia xilosas di-sustituidas, y una enzima con actividad hacia xilosas mono-sustituidas de posición C2 o C3 es particularmente adecuado para la producción de polímeros de xilosa lineales (homopolímero de xilano) con pocos o ningunos grupos laterales de arabinosa. La enzima con actividad hacia xilosas di-sustituidas es una alfa-Larabinofuranosidasa de GH43, y una enzima con actividad hacia xilosas mono-sustituidas de posición C2 o C3 es un alfa-L- arabinofuranosidasa de GH51, GH54 o/o GH62, más preferiblemente un GH51.

[0019] Cuando las dos arabinofuranosidasas se agregan a una solución de arabinoxilano los productos resultantes serán polímeros de xilosa lineales de peso molecular alto y moléculas de arabinosa. Esto permitirá una separación fácil del polímero de xilosa lineal por técnicas conocidas (ultrafiltración o precipitación de solvente del xilano en una solución de etanol) de arabinosa.

[0020] Los polímeros de xilosa lineales pueden ser adicionalmente parcialmente digeridos con actividades enzimáticas, tal como una beta-xilosidasa, y/o una endo-1,4-beta-xilanasa, para producir xilo-oligosacáridos, que también tienen aplicaciones dietéticas. Preferiblemente la beta-xilosidasa es una beta-xilosidasa de GH3, y/o preferiblemente la endo1,4-beta xilanasa es una endo-1,4- betaxilanasa de GH10 o GH11.

[0021] Cuando una endo-1,4-beta-xilanasa se adiciona a los polímeros de xilosa purificados lineales (purificado como se ha descrito anteriormente) los productos resultantes serán xilo-oligosacáridos esencialmente libres de grupos laterales de arabinosa. El tamaño de los oligosacáridos se puede controlar por la dosis de la endo-1,4-beta-xilanasa al igual que por la longitud del tiempo de reacción.

[0022] Cuando tanto una endo-1,4-beta-xilanasa y una beta-xilosidasa se agregan a los polímeros de xilosa purificados lineales el producto resultante será xilosa.

[0023] Así la descripción proporciona un proceso para obtener un producto de polímero de xilosa lineal esencialmente libre de sustituyentes de arabinosa, un proceso para obtener un producto de xilo-oligosacárido esencialmente libre de grupos laterales de arabinosa y un proceso para separar xilosa y arabinosa en una vía más simple que la tecnología precedente (cromatografía de intercambio iónico).

[0024] Además la invención proporciona un producto de polímero de xilosa lineal de alto peso molecular y esencialmente libre de grupos laterales de arabinosa y un producto de xilo-oligosacárido esencialmente libre de grupos laterales de arabinosa.

[0025] Preferiblemente el producto de polímero de xilosa lineal o producto de xilo-oligosacárido comprende al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 90%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, tal como al menos 98% de polímero en peso del producto, polímero que tiene un grado de polimerización de al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 120 al menos 150, al menos 200, al menos 300, al menos 500, al menos 1000, al menos 2000, al menos 5000, o al menos 10000.

[0026] Preferiblemente el producto de polímero de xilosa lineal o producto de xilo-oligosacárido que comprende al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 90%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, tal como al menos 98% de polímero en peso del producto cuyo polímero tiene un grado de polimerización inferior a 5000, menos que 2500, menos que 1500, menos que 1000, menos que 500, menos que 100, menos que 75, menos que 50, menos que 25, menos que 10, menos que 9, menos que 8, menos que 7, menos que 6, menos que 5, y preferiblemente menos que 4.

[0027] Preferiblemente el producto de polímero de xilosa lineal o producto de xilo-oligosacárido comprende al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 90%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, tal como al menos 98% de polímero en peso del producto cuyo polímero tiene un grado de polimerización seleccionado del grupo que consiste en los intervalos de 3 a 10, de 11 a 25, de 26 a 50, de 51 a 100, de 101 a 200, de 201 a 500, de 501 a 1000, de 1001 a 5000, y de 5001 a 10000.

[0028] Los polímeros de xilosa lineales producidos se pueden utilizar como un aditivo alimenticio, por ejemplo como un agente de carga, un sustituto de grasa de caloría baja o fibra dietética, tal como una fibra dietética no soluble. Aplicaciones por ejemplo estarán en pasteles, snacks extruidos, otros productos de cereal, y confitería. Aplicaciones técnicas incluirán aditivo para papel y productos de pulpa, materiales plásticos (películas), donde plastificantes pueden

ser añadidos, y como un agente de encolado.

[0029] El producto de xilo-oligosacárido tendrá aplicaciones como fibras dietéticas, tal como fibras dietéticas solubles. Estas fibras dietéticas se pueden utilizar para aumentar la cantidad de bacterias bifidus en el intestino inferior. Aplicaciones serán por ejemplo en yogur, helado, y refrescos.

[0030] Una forma de realización, donde actividades enzimáticas adicionales están presentes, tal como una betaxilosidasa de GH3, y/o una endo-1,4-beta-xilanasa de GH10 es particularmente útil cuando hidrólisis más completa de arabinoxilano es deseada. Además de liberación azúcares C5 la hidrólisis de arabinoxilano también hace polímeros de glucosa asociados como almidón y celulasa más accesibles para la acción de las enzimas apropiadas. Esto es particularmente útil cuando la degradación de sustratos complejos son requeridos, por ejemplo en la elaboración o en la hidrólisis de almidón o biomasa para la producción de etanol de combustible, o en composición de pienso para animales.

[0031] Xilosa y/o arabinosa liberadas durante la hidrólisis enzimática de arabinoxilano en el proceso de la invención se pueden utilizar como una fuente de xilosa y/o arabinosa como tal, o como materia prima para síntesis química/enzimática o procesos de fermentación, por ejemplo para la producción de xilitol, ácido xilárico, ácidos xilónicos, ácido arabónico, ácido arabinoico, 2,3-butanodiol, ácido láctico, ácido lactónico, furanos y/o etanol.

[0032] Para la degradación de incluso más sustratos complejos, o donde una degradación más completa es requerida, se puede desear la presencia de incluso actividades enzimáticas adicionales. En una forma de realización preferida la/s actividad/es enzimática/s además comprende/n una acetil xilano esterasa (EC 3.1.1.72) y/o una feruloil esterasa (EC 3.1.1.73) y/o una alfa-glucuronidiasa (EC 3.2.1.139).

[0033] En una forma de realización del proceso del primer aspecto la/s actividad/es enzimática/s además comprende/n una enzima seleccionada de la lista que consiste en una esterasa de acetil xilano, una feruloil esterasa, una alfaamilasa, una glucoamilasa, una fitasa y una proteasa.

[0034] En la elaboración y otros procesos de fermentación basados en molienda de cereal arabinoxilanos pueden ser extraídos de membranas celulares con agua caliente y pueden formar soluciones de alta viscosidad. Si en los procesos de elaboración se usan maltas que no están adecuadamente modificadas durante malteado, extractos de malta pueden contener niveles altos de arabinoxilanos y otros polisacáridos causando un aumento en la viscosidad de los extractos. Las dificultades asociadas a la filtración de tales extractos pueden significativamente atrasar el proceso de elaboración. En una forma de realización de la presente invención el sustrato con arabinoxilano para ser contactado con la composición de la invención es una mezcla de un proceso de elaboración de cerveza, por el cual por ejemplo la viscosidad de la mezcla es reducida y/o se liberan polisacáridos adicionales.

[0035] En una forma de realización de la presente invención el proceso es cualquier proceso de etanol, basado en hidrólisis enzimática de almidón gelatinizado o granulado, por ejemplo en almidón granulado como se describe en WO2004080923 o WO2004081193. Contactando la mezcla con la composición de la invención se puede reducir la viscosidad de la mezcla. También polisacáridos adicionales pueden ser liberados, no sólo como azúcares C5 pero también como glucosa cuando la descomposición de arabinoxilano deja el almidón más accesible a enzimas amilolíticas normalmente presentes durante los procesos de este tipo. Una enzima adicional que ventajosamente se puede aplicar en un proceso de etanol a base de almidón es una enzima seleccionada de la lista que consiste en beta-glucanasa, alfaamilasa, glucoamilasa, CGTasa, fitasa y proteasa.

[0036] El proceso de la presente invención puede ser cualquier proceso de etanol, que comprende hidrólisis enzimática de biomasa y/o efluente de pretratamiento de biomasa. Una enzima adicional que ventajosamente se puede aplicar en un proceso de etanol basado en biomasa es una enzima seleccionada de la lista que consiste en beta-glucanasa, celulasa, celobiohidrolasa, y beta-glucosidasa.

[0037] En un proceso de fermentación el hidrolizado de arabinoxilano puede ventajosamente ser contactado con un organismo de levadura u otro organismo de fermentación capaz de utilizar azúcares C5. Alternativamente, el hidrolizado de arabinoxilano se puede contactar con una xilosa isomerasa (EC 5.3.1.5) para isomerización de xilosa en xilulosa que es fermentable a etanol usando levadura Saccharomyces.

[0038] La composición de la invención puede también ser usada en el procesamiento de una materia prima de cereal destinada para uso como un producto de pienso/alimento o la composición se puede aplicar como un aditivo de pienso/alimento. Tales aditivos de pienso/alimento basados en enzima se pueden incorporar en un producto de pienso/alimento a base de cereales que incluye uno o más de trigo, cebada, triticale, centeno, arroz y maíz. El aditivo de pienso/alimento tiene la ventaja de mejorar la relación de conversión de pienso/alimento y/o aumentar la digestibilidad del producto de pienso/alimento a base de cereales en el que es incluido. La composición de la invención usada como aditivo de pienso/alimento puede preferiblemente ser usada junto con una fitasa.

[0039] La presente divulgación además se refiere a composición para tratar un sustrato con arabinoxilano, dicha composición comprendiendo una enzima con actividad hacia xilosas di-sustituidas, por ejemplo tal como una alfa-L

arabinofuranosidasa de GH43, y una enzima con actividad hacia xilosas sustituidas de posición C2 o C3, por ejemplo tal como una alfa-L-arabinofuranosidasa de GH51, GH54 o GH62.

[0040] La presente divulgación además se refiere a composiciones que comprenden una alfa-L-arabinofuranosidasa de GH43, una alfa-L-arabinofuranosidasa de GH51, GH54 o GH62, una beta-xilosidasa, y/o una endo-1,4-beta-xilanasa al igual que a una composición que comprende las actividades mencionadas y una enzima seleccionada del grupo que consiste en alfa-amilasa, CGTasa, glucoamilasa, fitasa, proteasa, beta-glucanasa, celulasa, celobiohidrolasa, y/o betaglicosidasa.

[0041] La composición puede comprender alfa-L-arabinofuranosidasa de GH43 en una cantidad de al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 70%, o incluso al menos 80% p/p de proteína enzimática de arabinofuranosidasa total presente en la composición. Más preferiblemente la composición puede comprender alfa-L-arabinofuranosidasa de GH43 en una cantidad de al menos 5%, tal como al menos 10% al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 70% p/p de proteína enzimática total presente en la composición.

[0042] La composición se puede utilizar para tratamiento de un sustrato con arabinoxilano, por ejemplo en un proceso de fermentación, por ejemplo para reducción de viscosidad de un lodo y/o solución que comprende un sustrato con arabinoxilano. La composición se puede utilizar para producir un producto de pienso/alimento, por ejemplo para producir

o modificar una fibra nutritiva/dietética y/o para producir una xilosa, arabinosa y/o xilosa lineal o para producir derivados de xilosa, arabinosa por fermentación, tratamiento enzimático o síntesis química.

[0043] La descripción además proporciona un proceso donde un sustrato con arabinoxilano y/o una biomasa se contacta con una arabinofuranosidasa enzimática capaz de liberar arabinosa de xilosas di-sustituidas. Preferiblemente la enzima capaz de liberar arabinosa de xilosas di-sustituidas es una arabinofuranosidasa. Preferiblemente la alfa-Larabinofuranosidasa es una alfa-L-arabinofuranosidasa de GH43. La alfa-L-arabinofuranosidasa de GH43 es preferiblemente derivada de origen bacteriano, fúngico o vegetal. Preferiblemente el sustrato con arabinoxilano y/o la biomasa se selecciona de la lista que consiste en cultivos energéticos herbáceos y/o leñosos, cultivos agrícolas y alimentarios, productos de pienso para animales, tubérculos, raíces, tallos, leguminosas, cáscaras de mandioca, vainas de cacao, cáscaras de arroz y/o cascos, salvado de arroz, mazorcas, paja, cascos, cáscaras, pulpa de remolacha azucarera, pulpa de semilla de algarroba, pulpas vegetales, desechos de cosecha agrícolas, paja, tallos, hojas, salvado de maíz, cáscaras, mazorcas, cáscara, cubiertas, vainas, desechos de madera, corteza, virutas, serrín, pulpa de madera, licor de pulpa, desecho de papel, cartón, desechos de madera, sólidos de agua de desechos industriales o municipales, abono, subproducto de procesos de elaboración y/o de fermentación, grano de destilación en húmedo, grano de destilación en seco, grano consumido, vinaza y bagazo.

Enzimas

Alfa-L-arabinofuranosidasa con actividad hacia xilosas di-sustituidas

[0044] La enzima con actividad hacia xilosas di-sustituidas, por ejemplo tal como una alfa-L-arabinofuranosidasa de GH43, puede ser de origen microbiano, por ejemplo derivable de una cepa de un hongo filamentoso (p. ej., Humicola, Aspergillus, Trichoderma, Fusarium, Penicillum) o de una bacteria (p. ej. Bacillus, Bifidobacterium). Una tal enzima adecuada se puede seleccionar por el ensayo para actividad de alfa-arabinofuranosidasa en el arabinoxilano disustituido en la sección de Métodos.

[0045] Preferiblemente la alfa-L-arabinofuranosidasa de GH43 se deriva de Humicola insolens. De la forma más preferible la alfa-L-arabinofuranosidasa de GH43 es el polipéptido mostrado como SEC ID NO:1, más preferiblemente el polipéptido mostrado como los aminoácidos 19-558 de la SEC ID NO:1, o incluso más preferible un polipéptido que tiene, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada como los aminoácidos 19-558 de la SEC ID NO:1 (de ahora en adelante "polipéptidos homólogos").

[0046] Una enzima con actividad hacia xilosas di-sustituidas, por ejemplo tal como una alfa-L-arabinofuranosidasa de GH43, se puede adicionar en cantidades de 0,001-1,0 g/kg de sustrato DM, preferiblemente en las cantidades de 0,0050,5 g/kg de sustrato DM, y de la forma más preferible de 0,05-0,10 g/kg de sustrato DM.

Alfa-L-arabinofuranosidasa con actividad hacia xilosas mono-sustituidas

[0047] La enzima con actividad hacia xilosas mono-sustituidas de posición C2 y/o C3, por ejemplo tal como una alfa-Larabinofuranosidasa de GH51, GH54 o GH62, puede ser de origen microbiano, tal como derivable de una cepa de un hongo filamentoso (p. ej., Meripilus, Humicola, Aspergillus, Trichoderma, Fusarium, Penicillum) o de unas bacterias (e.g.Bacillus). Preferiblemente la enzima es una alfa-L-arabinofuranosidasa de GH51, e incluso más preferiblemente la alfa-L-arabinofuranosidasa GH51 se deriva de Meripilus giganteus. El polipéptido puede preferiblemente tener al menos 75%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada como los aminoácidos 17-643 de la SEC ID NO:2 (de ahora en

adelante "polipéptidos homólogos"). Más preferiblemente la alfa-L-arabinofuranosidasa es el polipéptido mostrado como la SEC ID NO:2, incluso más preferiblemente el polipéptido mostrado como los aminoácidos 17-643 de la SEC ID NO:2.

[0048] Alfa-L-arabinofuranosidasa de GH51, GH54 o GH62 se puede adicionar en cantidades de 0,001-1,0 g/kg de sustrato DM, preferiblemente en las cantidades de 0,005-0,5 g/kg de sustrato DM, y de la forma más preferible de 0,050,10 g/kg de sustrato DM.

Beta-xilosidasa

[0049] La beta-xilosidasa es preferiblemente una beta-xilosidasa de GH3. La beta-xilosidasa puede ser de origen microbiano, tal como derivable de una cepa de un hongo filamentoso (p. ej., Trichoderma, Meripilus, Humicola, Aspergillus, Fusarium o de una bacteria (p. ej. Bacillus). Preferiblemente la beta-xilosidasa es una beta-xilosidasa de GH3 derivada de Trichoderma reesei y más preferiblemente la beta-xilosidasa de GH3 es el polipéptido mostrado como SEC ID NO:3 o un polipéptido que tiene al menos 75%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada como aminoácidos SEC ID NO:3 (de ahora en adelante "polipéptidos homólogos"). Beta-xilosidasa de GH3 se puede adicionar en cantidades de 0,001-1,0 g/kg de sustrato DM, preferiblemente en las cantidades de 0,005-0,5 g/kg de sustrato DM, y de la forma más preferible de 0,05-0,10 g/kg de sustrato DM

Endo-1,4-beta-xilanasa

[0050] La endo-1,4-beta-xilanasa es preferiblemente una endo-1,4-beta-xilanasa de GH10 o GH11. El endo-1,4-betaxilanasa puede ser de origen microbiano, tal como derivable de una cepa de un hongo filamentoso (p. ej., Trichoderma, Meripilus, Humicola, Aspergillus, Fusarium) o de una bacteria (p. ej. Bacillus). La endo-1,4-beta-xilanasa es preferiblemente una endo-1,4-beta-xilanasa de GH10 derivada de Humicola insolens y más preferiblemente la endo-1,4beta-xilanasa de GH10 es el polipéptido mostrado como SEC ID NO:4, más preferiblemente como los aminoácidos 17389 de SEC ID NO:4, o incluso más preferiblemente un polipéptido que tiene al menos 75%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada como aminoácidos 17-389 de la SEC ID NO:4 (de ahora en adelante "polipéptidos homólogos").

[0051] Endo-1,4-beta-xilanasa de GH10 se puede adicionar en cantidades de 0,001-1,0 g/kg de sustrato DM, preferiblemente en las cantidades de 0,005-0,5 g/kg de sustrato DM, y de la forma más preferible de 0,05-0,10 g/kg de sustrato DM.

MATERIALES Y METODOS

Enzimas usadas

[0052] Una alfa-L-arabinofuranosidasa GH43 de H. Insolens (SEC ID NO:1), una alfa-L-arabinofuranosidasa GH51 de

M. giganteus (SEC ID NO:2), una beta-xilosidasa GH3 de Trichoderma Reesei (SEC ID NO:3) y una endo-1,4-betaxilanasa GH10 de H. insolens (SEC ID NO:4). Las enzimas mencionadas fueron clonadas usando técnicas moleculares básicas (Ausubel et al., 2003, Curr. Prot. Mol.Biol., John Wiley & Sons, Cambridge, USA , Christgau et al. 1995, Curr. Genet. 27, 135-141 ).

[0053] Ultraflo L y Celluclast 1,5 L son composiciones enzimáticas comerciales, y disponibles de Novozymes A/S. Ultraflo L se deriva de Humicola Insolence y comprende celulasas y hemicelulasas. Celluclast 1,5 L se deriva de Trichoderma reesei y comprende celobiohidrolasas y endoglucanasas.

[0054] Bio-Feed Wheat L es una xilanasa comercial para aplicación en piensos y disponible de Novozymes A/S. Bio-Feed Wheat L se deriva de Termomyces lanuginosus.

Productos químicos y sustratos

[0055] Arabinosa y xilosa fueron compradas de Merck (Darmstadt, Alemania). Arabinoxilanas de trigo solubles en agua e insolubles en agua fueron obtenidas de Megazyme, (Bray, County Wicklow, Irlanda). El efluente de fermentación de etanol, "vinaza", fue proporcionado por Tate & Lyle, Amylum UK (Greenwich, Reino Unido).

Sustrato de arabinoxilano de trigo soluble

[0056] Arabinoxilano de trigo de viscosidad media soluble en agua fue obtenido de Megazyme (Bray, County Wicklow, Irlanda). Contenidos monosacáridos después de hidrólisis ácida (0,4 N HCl, 2 h, 100°C) y HPAEC fueron: Arabinosa 275,8 mg/g, xilosa 479,2 mg/g (= A:X 0,58), con sólo indicios de galactosa y glucosa. Según la hoja de producto el almidón,beta-glucano, proteína, humedad, y contenido de ceniza en peso fueron <0,1%<0,1%, 0,9%, 1,9%, y 2,2%, respectivamente.

Sustrato de vinaza de trigo

[0057] Vinaza de trigo, un subproducto de fermentación de etanol industrial, fue proporcionado por Tate & Lyle, Amylum UK, (Greenwich, Reino Unido). El contenido de sustancia en seco de vinaza fue 9,02 % en peso. Contenidos de monosacáridos después de la hidrólisis ácida (0,4 N HCl, 2 h, 100 °C) y HPAEC fueron: Arabinosa 82,9 g/kg vinaza DM, xilosa 119 g/kg vinaza DM mg/g, galactosa 21,6 g/kg vinaza DM, y 78,2 g/kg vinaza DM. Ácidos orgánicos, proteína,

ceniza, y ácido ferúlico constituido ฏ30%, ฏ16%, -11%, y 0,2% en peso, respectivamente de la sustancia seca.

Preparación de polímeros de arabinoxilano específicos y oligosacáridos

[0058] Arabinoxilano doblemente sustituido fue preparado incubando arabinoxilano de trigo soluble (1g) en 0,1 M tampón de acetato (100 mL), pH 6,0 con 0,167 g ˞-L-arabinofuranosidasa de Meripilus giganteus (GH51)·kg-1 arabinoxilano de trigo soluble en agua durante 48 horas a 30°C. Arabinoxilano individualmente sustituido fue preparado incubando arabinoxilano de trigo soluble en agua (1g) en 0,1 M tampón de acetato (42 mL), pH 6,0 con 0,147 g ˞-Larabinofuranosidasa de Humicola insolens (GH43) ·kg-1 arabinoxilano de trigo soluble en agua durante 48 horas a 30°C.

Para detener las reacciones enzimáticas las mezclas fueron calentadas a 100°C durante 10 min. Polímeros de arabinoxilano fueron precipitados por adición de etanol (126 ml). Los precipitados fueron filtrados (Miracloth) y secados al vacío.

[0059] Los oligosacáridos conteniendo grupos de arabinosilo enlazados al terminal (1ൺ3) fueron preparados incubando el arabinoxilano de trigo insoluble en agua (1g) en 0,1 M tampón de acetato (100 mL), pH 6,0 con 6,67 g Shearzyme (xilanasa GH10) ·kg-1 arabinoxilano de trigo insoluble en agua durante 2 horas a 30°C. Los oligosacáridos conteniendo grupos de arabinosilo enlazados a (1ൺ3) interno fueron preparados incubando arabinoxilano de trigo insoluble en agua (1g) en 0,1 M tampón de acetato (100 mL), pH 6,0 con 0,03 g Pentopan Mono (xilanasa GH11) ·kg-1 arabinoxilano de trigo insoluble en agua durante 2 horas a 30°C. Los oligosacáridos con grupos de arabinosilo enlazados a (1ൺ2) interno fueron preparados incubando arabinoxilano de trigo insoluble en agua (1g) en 0,1 M tampón de acetato (100 mL), pH

6,0 con 0,03 g Pentopan Mono (xilanasa GH11) ·kg-1 arabinoxilano de trigo insoluble en agua y alfa-Larabinofuranosidasa de H. insolens (GH43) ·kg-1 arabinoxilano de trigo soluble en agua durante 2 horas a 30°C. Para detener las reacciones enzimáticas las mezclas fueron calentadas a 100°C durante 10 min. Los arabinoxilooligosacáridos fueron concentrados en un evaporador giratorio y evaluados por 1H-NMR.

Análisis de sustrato

[0060] Contenido de arabinosa y xilosa en arabinoxilano con sustratos fueron determinados por hidrólisis ácida con ácido clorhídrico (0,4 N HCl, 2 horas, 100°C) seguido por HPAEC (Sørensen et al., 2003). Todos los rendimientos, incluyendo rendimientos de hidrólisis enzimática, se proporcionan como mg por g sustrato de sustancia seca o como rendimientos relativos en porcentaje.

Ensayo para actividad hacia actividad de alfa-L-arabinofuranosidasa

[0061] Actividad de alfa-L-arabinofuranosidasa se puede evaluar como descrito por Poutanen et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 1988, 28, 425-432) usando 5 mM de alfa-L-arabinofuranosida de p-nitrofenilo como sustratos. Las reacciones se pueden llevar a cabo en 50 mM de tampón de citrato a pH 6,0, 40°C con un tiempo de reacción total de 30 min. La reacción se detiene añadiendo 0,5 ml de 1 M carbonato de sodio y el p-nitrofenol liberado se mide a 405 nm. La actividad se expresa en U/ml.

Ensayo para actividad de alfa-arabinofuranosidasa en arabinoxilano di-sustituido

[0062] Arabinoxilano de trigo soluble en agua de viscosidad media (Megazyme, Bray, Irlanda) fue tratado con una alfaarabinofuranosidasa de GH51 de Meripilus giganteus (SEC ID NO:2) para eliminar sustituyentes de alfaarabinofuranosilo únicos fijados a la C(O)-3 arabinosa del arabinoxilano para producir un sustrato de arabinoxilano disustituido con sustituyentes de arabinofuranosilo fijados a ambos C(O)-2,3 de los residuos de xilosa. El sustrato fue dializado y liofilizado.

[0063] Una solución de 0,1% del arabinoxilano di-sustituido fue preparada y la actividad de alfa-arabinofuranosidasa fue medida mezclando 0,1 ml de enzima, 0,9 ml de tampón (0,12 M de ácido succínico, pH 6,0) y 1,0 ml de solución de sustrato en un tubo de Eppendorf. El tubo de Eppendorf fue incubado a 60°C durante 1 hora con agitación. La cantidad de arabinosa liberada fue medida por HPAEC (cromatografía de alta resolución de intercambio aniónico).

HPAEC

[0064] Hidrolizados (10 μl) fueron aplicados sobre un sistema Dionex BioLC equipado con una columna Dionex

CarboPac™ PA1 guard (4 x 250 mm) (Dionex Corporation, Sunnyvale, CA, EEUU) combinada con una columna CarboPac™ PA1 guard (4 x 50 mm). Los monosacáridos fueron separados isocráticamente con 10 mM de hidróxido de potasio durante 15 min, flujo: 1 mL·min-1. Monosacáridos fueron detectados por un detector electroquímico pulsado en el modo de detección amperométrica pulsada. El potencial del electrodo fue programado para +0,1 V (t = 0-0,4 s) a -2,0 V (t = 0,41-0,42 s) a 0,6 V (t = 0,43 s) y finalmente -0,1 V (t = 0,44-0,50 s), mientras se integra la señal resultante de t = 0,2-0,4 s. Una mezcla de arabinosa y xilosa (concentración de cada componente: 0,0025-0,1 g·L-1) fue usada como estándar.

Analistas de 1H-NMR

[0065] Todos los productos de degradación fueron liofilizados dos veces de 99,9% de D2O y redisueltos en 99,9% de D2O. Algunos hidrolizados fueron dializados (Spectra/Por peso molecular de membrana cortado 1000) para eliminar arabinosa libre antes del análisis espectral. Los espectros 1H-NMR fueron registrados a 30°C en un instrumento Varian Mercury-VX accionado a 400 MHz y equipados con una sonda auto-conmutable de 4-núcleos. Datos fueron recogidos sobre 128-512 sondeos y la señal HDO fue usada como una señal de referencia (4,67 ppm).

EJEMPLOS

Ejemplo 1

Hidrólisis enzimática de arabinoxilano insoluble en agua

[0066] Sustrato de arabinoxilano de trigo insoluble en agua (0,05 g) disuelto en 50 ml de agua doblemente desionizada por ensayo (0,1% de DM) fue incubado con una composición de la invención, o con 10 % en peso de un 50:50 de mezcla de Ultraflo y Celluclast 1,5 L. E/S se refiere al peso de preparación enzimática (E) adicionado en porcentaje en peso de sustrato (S).

[0067] La composición de la invención comprendió 0,075 g GH51 alfa-arabinofuranosidasa de M. giganteus/kg de arabinoxilano DM, 0,075 g de alfa-arabinofuranosidasa GH43 de H. insolens/kg de arabinoxilano DM, 0,075 g betaxilosidasa de T. reesei/kg arabinoxilano DM, y 0,075 g de xilanasa de H. insolens/kg arabinoxilano DM.

[0068] Los tratamientos fueron realizados durante 24 horas a pH 5 y 50°C. Las muestras fueron retiradas después de 24 horas e inmediatamente calentadas a 100°C durante 10 min. Las muestras fueron filtradas (filtro 0,2 microM) y los niveles de arabinosa, y xilosa fueron determinados por HPAEC. Experimentos de hidrólisis enzimática fueron realizados por triplicado y los valores medios proporcionados están en porcentaje de las cantidades liberadas por hidrólisis ácida. Los resultados se presentan en tabla 1.

Tabla 1. Arabinosa y xilosa liberadas de arabinoxilano de trigo insoluble en agua por hidrólisis enzimática. Los números están en porcentaje en peso de la cantidad de cada monosacárido liberado por hidrólisis ácida de las muestras de arabinoxilano de trigo soluble en agua.

Enzima A: rabinosa Xilosa

Celluclast 1,5 L: Ultraflo L: 43 56,7

Composición de la invención: 57 64

Hidrólisis enzimática de arabinoxilano soluble en agua

[0069] Sustrato de arabinoxilano de trigo soluble en agua (0,05 g) disuelto en 50 ml de agua doblemente desionizada por ensayo (0,1% DM) fue incubado con una composición de la invención, o con 10 % en peso de una mezcla 50:50 de Ultraflo y Celluclast 1,5 L. E/S se refiere al peso de preparación enzimática (E) adicionado en porcentaje en peso de sustrato (S).

[0070] La composición de la invención comprendió 0,080 g GH51 alfa-arabinofuranosidasa de M. giganteus/kg de arabinoxilano DM, 0,080 g GH43 alfa-arabinofuranosidasa de H. insolens/kg de arabinoxilano DM, 0,16 g beta-xilosidasa de T. reesei/kg de arabinoxilano DM, y 0,080 g xilanasa de H. insolens/kg de arabinoxilano DM.

[0071] Los tratamientos fueron realizados durante 24 horas a pH 5 y 50°C. Las muestras fueron retiradas después de 24 horas e inmediatamente calentadas a 100°C durante 10 min. Las muestras fueron filtradas (filtro 0,2 microM) y los niveles de arabinosa, y xilosa fueron determinados por HPAEC. Experimentos de hidrólisis enzimática fueron realizados por triplicado y los valores medios proporcionados están en porcentaje de las cantidades liberadas por hidrólisis ácida. Los resultados se presentan en tabla 2.

Tabla 2. Arabinosa y xilosa liberadas de arabinoxilano de trigo soluble en agua por hidrólisis enzimática. Los números están en porcentaje en peso de la cantidad de cada monosacárido liberado por hidrólisis ácida de las muestras de arabinoxilano de trigo soluble en agua.

Enzima A rabinosa Xilosa

Celluclast 1,5 L: Ultraflo L 25 51

Composición de la invención 116 107

Ejemplo 2

[0072] La hidrólisis de vinaza fue realizada según el método descrito para arabinoxilano soluble en agua en el ejemplo 1

5 excepto que la dosificación de beta-xilosidasa fue 0,050 g/kg de vinaza DM y el nivel de sustrato fue 5 % en peso DM. Muestras fueron retiradas después de 24 h y calentadas inmediatamente a 100°C durante 10 min para detener la reacción enzimática, centrifugadas (14000 r.p.m., 10 min), filtradas (filtro 0,2 microM) y sometidas a análisis HPAEC para determinar los niveles de arabinosa y xilosa, ver más abajo. Experimentos de hidrólisis enzimática fueron realizados por duplicado y los valores medios proporcionados están en porcentaje de las cantidades liberadas por

10 hidrólisis ácida. Los resultados se presentan en la tabla 2.

Tabla 3. Arabinosa y xilosa liberadas de vinaza por hidrólisis enzimática. Los números están en porcentaje en peso de

la cantidad de cada monosacárido liberado por hidrólisis ácida de las muestras de arabinoxilano de trigo soluble en

agua.

Enzima A: rabinosa Xilosa

Celluclast 1,5 L:Ultraflo L Composición de la invención: 77 103 75 81

Ejemplo 3

[0073] Arabinoxilano de trigo comprende arabinofuranósido como un monosustituyente enlazado a la 3-posición de

20 xilosa interna y arabinofuranósido enlazado a la 3- y 2-posición en xilosa di-sustituida, respectivamente. Los sustratos fueron producidos comprendiendo sólo uno de los 3 tipos de enlaces de arabinofuranósido. La actividad de las arabinofuranosidasas hacia estos sustratos fue investigada.

Tabla 4. Actividad en polímeros de arabinoxilano seleccionados, incubación a pH 6, 40°C durante 2 horas. 25

Enzima

Sustrato En: lace H. insolens (GH43) Bifidobacterium adolescentis (GH43) H. insolens (GH51) M. giganteus (GH51)

Arabinoxilano intacto: Mono-sustituido (13) - - x xx

Di-sustituido (12): - - - -

Di-sustituido (13): xx x - -

Arabinoxilano disustituido: Di-sustituido (12) - - - -

Di-sustituido (13): xx xx - -

Arabinoxilano mono-sustituido: Mono-sustituido (12) - - xx xx

Mono-sustituido (13): - - xx xx

xx se refiere a más de 75% de hidrólisis, x(x) a 50-75% de hidrólisis, x a 25-50% de hidrólisis y (x) a 5-25% de hidrólisis. - se refiere a ninguna hidrólisis detectable

Ejemplo 4

[0074] Arabinoxilano de trigo soluble fue incubado con 0,1 g de proteína enzimática por kg DM de alfa-Larabinofuranosidasa de H. insolens (GH43), B. adolescentis (GH43), H. insolens (GH51), y M. giganteus (GH51). La

5 arabinosa liberada como mg por g de arabinoxilano de trigo soluble en agua, su suma hipotética, y su liberación de arabinosa después de tratamiento con 0,2 g de proteína enzimática por kg DM de una mezcla 50:50 de alfa-Larabinofuranosidasas de H. insolens (GH43), Bi. sp. (GH43), H. insolens (GH51), y M. giganteus (GH51) fueron medidas. Los resultados se expresan como el promedio de determinaciones por triplicado, coeficiente de variación en medio < 6,4.

10 Tabla 5. Arabinosa liberada de arabinoxilano de trigo soluble tratado con alfa-L-arabinofuranosidasa a dos temperaturas diferentes y condiciones de pH.

pH 6, 40°C: pH 5, 50°C

H. insolens (GH43): 128,0 a 147,0 a

M. giganteus (GH51): 48,15 c 121,0 b

B. adolescentis (GH43): 63,43 b 4,833 d

H. insolens (GH51): 20,75 d 18,47 c

Valores dentro de una columna no compartiendo un índice de letra común difieren con significación estadística (P<0,05).

15 Tabla 6 . Arabinosa liberada de arabinoxilano de trigo soluble tratado con mezclas 50%:50% de alfa-Larabinofuranosidasas a pH 5, 50°C.

: pH 5, 50°C pH 5, 50°C

H. insolens (GH43) y H. insolens (GH51): - 168,3 b

H. insolens (GH43) y M. Giganteus (GH51): - 289,0 a

B. adolescentis (GH43) y H. insolens (GH51): - 17,43 d

B. adolescentis (GH43) y M. giganteus (GH51): - 131,0 c

Ejemplo 5

20 [0075] Grano consumido se obtuvo de un proceso de elaboración de cerveza usando malta de cebada molida a martillo. El grano consumido fue liofilizado a un contenido de sustancia en seco de 96,1 % p/p y molido. El material de grano consumido fue suspendido 5 g materia seca/100 ml de ácido succínico - tampón de succinato de sodio pH 5,0 y sometido a hidrólisis por dos tratamientos: 1) un tratamiento convencional usando una mezcla 50:50 de Celluclast 1,5 L

25 + Ultraflo L con 6,5 g de proteína enzimática por kg de materia seca de grano consumido y 2) un tratamiento de la invención aplicando una mezcla 25:25:25:25 en la base de peso de proteína de la alfa-L-arabinofuranosidasa GH43 de

H. insolens (SEC ID NO:1), la alfa-L-arabinofuranosidasa GH51 de M. giganteus (SEC ID NO:2), la beta-xilosidasa GH3 de Trichoderma reesei (SEC ID NO:3) y la endo-1,4-beta-xilanasa GH10 de H. insolens (SEC ID NO:4). Un equivalente de dosificación enzimática a 0,6 g de proteína enzimática por kg de sustancia seca de grano consumido fue usada.

30 [0076] La hidrólisis fue realizada en tubos Ependorfer incubados en un Thermomixer Compact a 1000 r.p.m. durante 16 horas a 50°C. Las muestras fueron cocinadas durante 10 minutos, centrifugadas durante 10 minutos a 14000 x g y la fase soluble fue carbohidratos analizados en HPLC. HPLC fue realizada en un Dionex BioLC usando una bomba de gradiente GS50, automuestreador AS50, y un detector electroquímico ED40. La concentración de arabinosa liberada y

35 xilosa fue medida.

Tabla 7: Grano consumido.: Resultados de análisis HPLC de arabinosa y xilosa liberada en g/litro.

Arabinosa Xilo: sa

Control, no enzima: 0,00 0,00

1) Tratamiento convencional: 1,19 1,98

2) Tratamiento de la invención: 1,48 2,12

Ejemplo 6

5 [0077] Una solución conteniendo arabinoxilano se obtuvo cociendo paja de trigo a 190°C seguido por separación del líquido de la paja por filtración. En todos los experimentos se diluyó 1,5 g del líquido adicionalmente a 2,0 g por adición de ácido/base para ajuste del pH, por adición de solución enzimática y por adición de agua desionizada. El líquido fue incubado con 2,5 g de proteína enzimática por litro de volumen de reacción con la mezcla enzimática de la invención,

10 con la mezcla de celulosa convencional que consiste en una mezcla 50:50 de Ultraflo y Celluclast 1,5 L (proporción de mezcla basada en contenido de proteína).

[0078] La composición de la invención comprendió una mezcla 10:10:5:25 en base de peso de proteína de la alfaarabinofuranosidasa de H. insolens (SEC ID NO:1), la alfa-arabinofuranosidasa de M. giganteus (SEC ID NO:2), la beta15 xilosidasa de T. reesei (SEC ID NO:3) y la xilanasa de H. insolens (SEC ID NO:4). Los tratamientos fueron realizados durante 24 horas a tres niveles de pH (4, 5, 6) y a dos temperaturas (40, 50°C). Las muestras fueron retiradas después de 24 horas e inmediatamente calentadas a 100°C durante 10 min. Las muestras fueron filtradas (filtro 0,2 microM) y los niveles de arabinosa, y xilosa fueron determinados por HPAEC. Todos los experimentos de hidrólisis enzimática fueron realizados por duplicado y los valores medios proporcionados están en porcentaje de las cantidades liberadas por

20 hidrólisis ácida. Los resultados se presentan en la tabla 8.

Tabla 8. Arabinosa y xilosa liberada de arabinoxilano de trigo soluble en agua por hidrólisis enzimática. Los números están en porcentaje en peso de la cantidad de cada monosacárido liberado por hidrólisis ácida del arabinoxilano de trigo soluble en agua.

Temperatura p: H Arabinosa Xilosa

[°C]: Referencia Invención Referencia Invención

40: 4 63 95 66 72

40: 5 70 91 71 78

40: 6 76 94 79 88

50: 4 60 93 71 72

50: 5 66 92 81 88

50: 6 87 99 87 87

Listado de secuencias

30: [0079] <110> Novozymes A/S

<120> Hidrólisis de arabinoxilano

35: <130> 10882.504-WO

<160> 4

40 45: <170> Versión de patentIn 3,3 <210> 1 <211> 558 <212> PRT <213> Humicola insolence <220>

<221> mat_peptide

<222> (19)..(558)

<400> 1

<210> 2

<211> 643 5 <212> PRT

<213> Meripilus giganteus

<220>

<221> mat_peptide 10 <222> (17)..(643)

<400> 2

<210> 3

<211> 797

<212> PRT

<213> Trichoderma reesei

<220>

<221> mat_peptide

<222> (1)..(797)

<400> 3

<210> 4

<211> 389

<212> PRT 5 <213> Humicola insolens

<220>

<221> mat_peptide

<222> (17)..(389) 10

<400> 4

Claims

REIVINDICACIONES

1. Proceso comprendiendo i) puesta en contacto de un sustrato conteniendo arabinoxilano, con una composición que

comprende, a) una alfa-L-arabinofuranosidasa de GH43, teniendo actividad hacia xilosas di-sustituidas, b) una alfa-L-arabinofuranosidasa de GH51, GH54 o GH62 teniendo actividad hacia xilosas mono-sustituidas de posición C2 o C3, e

ii) hidrólisis de arabinoxilano, donde la alfa-L-arabinofuranosidasa de GH43 tiene al menos 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada como los aminoácidos 19-558 de la SEC ID NO: 1 y está presente en una cantidad de al menos 5% p/p de proteína enzimática total presente en la composición.
2.

Proceso según la reivindicación 1, donde la composición comprende además, una enzima seleccionada del grupo que consiste en una beta-xilosidasa, una endo-1,4-beta xilanasa, una acetil xilano esterasa, una feruloil esterasa, una alfa-amilasa, una glucoamilasa, una fitasa, una proteasa, beta-glucanasa, celulasa, celobiohidrolasa, y beta-glicosidasa.
3.

Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 el cual comprende la producción de un hidrolizado que comprende xilosa lineal y/o xilo-oligosacárido y/o xilosa y/o arabinosa.
4.

Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el cual comprende la producción de un producto de pienso para animales.
5.

Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el cual comprende la modificación de una fibra alimenticia.
6.

Composición para hidrólisis de arabinoxilano dicha composición comprendiendo las actividades enzimáticas; a) una alfa-L-arabinofuranosidasa fúngica de GH43 teniendo actividad hacia xilosas di-sustituidas, y, b) una alfa-L-arabinofuranosidasa de GH51, GH54 o GH62 teniendo actividad hacia xilosas mono-sustituidas de posición C2 o C3,

donde la alfa-L-arabinofuranosidasa de GH43 tiene al menos 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada como los aminoácidos 19-558 de la SEC ID NO: 1 y está presente en una cantidad de al menos 5% p/p de proteína enzimática total presente en la composición.
7.

Composición según la reivindicación 6, donde las actividades enzimáticas además comprenden una enzima seleccionada del grupo que consiste en una beta-xilosidasa, una endo-1,4-beta-xilanasa, una acetil xilano esterasa, una feruloil esterasa, una alfa-amilasa, una glucoamilasa, una fitasa, una proteasa, beta-glucanasa, celulasa, celobiohidrolasa, y beta-glicosidasa.
8.

Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 6-7 para tratamiento de un sustrato con arabinoxilano.
9.

Uso según la reivindicación 8 en un proceso de fermentación.
10.

Uso según cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9 para la reducción de la viscosidad de un lodo y/o solución que comprende un sustrato con arabinoxilano.
11.

Uso según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 para producir un producto de pienso para animales o un producto alimenticio.
12.

Proceso que comprende i) puesta en contacto de un sustrato con arabinoxilano, con una composición que

comprende, a) una alfa-L-arabinofuranosidasa de GH43, teniendo actividad hacia xilosas di-sustituidas, b) una alfa-L-arabinofuranosidasa de GH51, GH54 o GH62 teniendo actividad hacia xilosas mono-sustituidas de posición C2 o C3, e

ii) hidrólisis de arabinoxilano, donde la alfa-L-arabinofuranosidasa de GH43 está presente en una cantidad de al menos 5% p/p de proteína enzimática total presente en la composición y la alfa-L-arabinofuranosidasa de GH51 es un GH51 teniendo al menos 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada como los aminoácidos 17-643 de la SEC ID NO: 2.