BRPI0708949A2 - polipeptÍdeo isolado tendo atividade endoglucanase, polinucleotÍdeo, construÇço de Ácido nucleico, vetor de expressço recombinante, cÉlula hospedeira recombinante, mÉtodos para produzir o polipeptÍdeo, para produzir um mutante de uma cÉlula de origem, para produzir uma proteÍna, para produzir um polinucleotÍdeo, para degradar ou converter um material celulàsico, para produzir uma substÂncia, e para inibir a expressço de um polipeptÍdeo em uma cÉlula, cÉlula mutante, planta transgÊnica, parte de planta ou cÉlula de planta, e, molÉcula de rna de filamento duplo - Google Patents

polipeptÍdeo isolado tendo atividade endoglucanase, polinucleotÍdeo, construÇço de Ácido nucleico, vetor de expressço recombinante, cÉlula hospedeira recombinante, mÉtodos para produzir o polipeptÍdeo, para produzir um mutante de uma cÉlula de origem, para produzir uma proteÍna, para produzir um polinucleotÍdeo, para degradar ou converter um material celulàsico, para produzir uma substÂncia, e para inibir a expressço de um polipeptÍdeo em uma cÉlula, cÉlula mutante, planta transgÊnica, parte de planta ou cÉlula de planta, e, molÉcula de rna de filamento duplo Download PDF

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Abstract

POLIPEPTÍDEO ISOLADO TENDO ATIVIDADE ENDOGLUCANASE, POLINUCLEOTÍDEO, CONSTRUÇçO DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSçO RECOMBINANTE, CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE, METODOS PARA PRODUZIR O POLIPEPTÍDEO, PARA PRODUZIR UM MUTANTE DE UMA CÉLULA DE ORIGEM, PARA PRODUZIR UMA PROTEINA, PARA PRODUZIR UM POLINUCLEOTÍDEO, PARA DEGRADAR OU CONVERTER UM MATERIAL CELULàSICO, PARA PRODUZIR UMA SUBSTÂNCIA, E PARA INIBIR A EXPRESSçO DE UM POLIPEPTÍDEO EM UMA CÉLULA, CÉLULA MUTANTE, PLANTA TRANSGÊNICA, PARTE DE PLANTA OU CELULA DE PLANTA, E, MOLÉCULA DE RNA DE FILAMENTO DUPLO A presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados tendo atividade de endoglucanase e polinucleotídeos isolados codificando os polipeptídeos. A invenção também refere-se a construções de ácido nucleico, vetores, e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos, assim como métodos para produzir e usar os polipeptídeos.

Description

"POLIPEPTÍDEO ISOLADO TENDO ATIVIDADE ENDOGLUCANASE,POLINUCLEOTÍDEO, CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, VETORDE EXPRESSÃO RECOMBINANTE, CÉLULA HOSPEDEIRARECOMBINANTE, MÉTODOS PARA PRODUZIR O POLIPEPTÍDEO,PARA PRODUZIR UM MUTANTE DE UMA CÉLULA DE ORIGEM,PARA PRODUZIR UMA PROTEÍNA, PARA PRODUZIR UMPOLINUCLEOTÍDEO, PARA DEGRADAR OU CONVERTER UMMATERIAL CELULÓSICO, PARA PRODUZIR UMA SUBSTÂNCIA, EPARA INIBIR A EXPRESSÃO DE UM POLIPEPTÍDEO EM UMACÉLULA, CÉLULA MUTANTE, PLANTA TRANSGÊNICA, PARTE DEPLANTA OU CÉLULA DE PLANTA, E, MOLÉCULA DE RNA DEFILAMENTO DUPLO"Referência a uma Listagem de Seqüência
Este pedido contém uma Listagem de Seqüências em formalegível por computador. A forma legível por computador é incorporada aquipor referência.
Referência a um Depósito de Material Biológico
Este pedido contém uma referência a depósitos de materialbiológico que foram feitos no Northern Regional Research Center (NRRL)sob o Tratado de Budapeste e receberam os números de acesso NRRL B-3Q900N, NRRL B-30902, NRRL B-30903, e NRRL 8-30904, cujos depósitosmicrobianos são incorporados aqui por referência.Antecedente da InvençãoCampo da Invenção
A presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados tendoatividade de endoglucanase e polinucleotídeos isolados codificando ospolipeptídeos. A invenção também refere-se a construções de ácido nucleico,vetores, e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos assimcomo a métodos para produzir e usar os polipeptídeos.Descrição da Arte Relacionada
Celulose é um polímero da glicose de açúcar simplescovalentemente ligada por beta-l,4-ligações. Muitos microorganismosproduzem enzimas que hidrolisam glucanos beta-ligados. Estas enzimasincluem endoglucanases, celobiohidrolases, e beta-glucosidases.Endoglucanases digerem o polímero de celulose em locais aleatórios, abrindoo mesmo ao ataque por celobiohidrolases. Celobiohidrolases seqüencialmenteliberam moléculas de celobiose das extremidades do polímero de celulose.Celobiohidrolase I é uma atividade de 1,4-beta-D-glucano celobiohidrolase(E.G. 3.2.1.91) que catalisa a hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glucosídicasem celulose, celotetriose, ou qualquer polímero contendo glicose beta-1,4-ligada, liberando celobiose das extremidades redutoras da cadeia.Celiobiohidrolase II é uma atividade de 1,4-D-glucano celobiohidrolase (E.G.3.2.1.91) que catalisa a hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glucosídicas emcelulose, celotetriose, ou qualquer polímero contendo glicose beta-l,4-ligada,liberando celobiose das extremidades não redutoras da cadeia, Celobiose é umdímero de glicose beta-1,4-ligado solúvel em água. Beta-glucosidaseshidrolisam celobiose em glicose.
A conversão de cargas de alimentação celulósica em etanoltem as vantagens da pronta disponibilidade de grandes quantidades de cargasde alimentação, a característica desejável de evitar queimadas ou terra presaaos materiais, e a limpeza do combustível etanol. Madeira, resíduos agrícolas,culturas herbáceas, e refugos sólidos municipais foram considerados comocargas de alimentação para a produção de etanol. Estes materiaisprimariamente consistem de celulose, hemicelulose, e lignina. Uma vez que acelulose é convertida em glicose, a glicose é facilmente fermentada porlevedura em etanol.
Roy et al., 1990, Journal of General Microbiology 136; 1967 -1972, descrevem a purificação e as propriedades de uma endoglucanaseextracelular de Myceliophthora thermophila ATCC 48104, Chemoglazov etal., 1988, Biokhimiya 53; 475 - 482, descrevem o isolamento, a purificação, eespecificidade de substrato de uma endoglucanase de Myceliophthorathermophila. Klyosov et al., 1988, Biotechnology Letters 10: 351 - 354,descrevem uma endoglucanase termoestável de Myceliophthora thermophila,Guzhova e Loginova, 1987, Prikladnaya Biokhimiya I Mikrobiologiya 23:820 - 825, descrevem enzimas celulolíticas de Myceliophthora thermophila,Rabinovich et al., 1986, Bioorganicheskaya Khimiya 12: 1549 - 1560,descrevem a purificação e caracterização de uma endoglucanase deMyceliophthora thermophila. Svistova et al., 1986, Mikrobiologiya 55: 49 -54, descrevem a regulação de biossíntese de celulose em Myceliophthorathermophila. Bhat e Maheshwari, 1987, Applied and EnvironmentalMicrobiology 53; 2175 - 2182, descrevem a atividade de componentes dosistema de celulose extracelular de Myceliophthora thermophila. Klyosov etal., 1987, Prikladnaya Biokhimiya I Mikrobiologiya 23: 44 - 50, descrevemuma endoglucanase termoestável de Myceliophthora thermophila. Jorgensenet al., 2003, Enzyme and Mierobial Technology 32: 851 - 861, e Thygesen etal., 2003, Enzyme and Mierobial Technology 32: 606 - 615, descrevem asenzimas degradando celulose Penicillium brasilianum IBT 20888.
Seria uma vantagem na técnica identificar novasendoglucanases tendo propriedades melhoradas, como taxa de hidrólisemelhorada, melhor estabilidade térmica, absorção reduzida para lignina, ecapacidade para hidrolisar componentes não celulósicos de biomassa, comohemicelulose, além de hidrolisar celulose. Endoglucanases com uma faixaampla de atividades laterais em hemicelulose podem ser especialmentebenéficas para melhorar o rendimento global de hidrólise de substratos debiomassa ricos em hemicelulose complexa.
E um objeto da presente invenção prover polipeptídeosmelhorados tendo atividade de endoglucanase e polinucleotídeos codificandoos polipeptídeos.Sumário da Invenção
A presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados tendoatividade de endoglucanase selecionados dentre o grupo consistindo de:
(a) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de
aminoácido que tem pelo menos 80% de identidade com o polipeptídeomaduro de SEQ ID NO. 4 ou SEQ ID NO: 10, pelo menos 85% de identidadecom o polipeptídeo maduro de SEQ. ID NO: 6, ou pelo menos 75% deidentidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 8;
(b) um polipeptídeo que é codificado por um polinucleotídeoque hibridiza sob condições de alta estringência pelo menos com (i) aseqüência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, SEQ IDNO: 5, SEQ ID NO: 7, ou SEQ ID NO: 9, (ii) a seqüência de cDNA contidaem uma seqüência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3ou SEQ ID NO: 9 ou a seqüência de DNA genômico compreendendo aseqüência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5 ou SEQID NO: 7, ou (iii) um filamento complementar de comprimento completo de(i) ou (ii);
(c) um polipeptídeo que é codificado por um polinucleotídeotendo pelo menos 80% de identidade com a seqüência de codificação depolipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 9, pelo menos 85%de identidade com a seqüência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQID NO: 5, ou pelo menos 75% de identidade com a seqüência de codificaçãode polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 7; e
(d) uma variante compreendendo uma substituição, deleção,e/ou inserção de um ou mais aminoácidos do polipeptídeo maduro de SEQ IDNO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, ou SEQ ID NO: 10.
A presente invenção também refere-se a polinucleotídeosisolados codificando polipeptídeos tendo atividade de endoglucanase,selecionados dentre o grupo consistindo de:
(a) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeocompreendendo uma seqüência de aminoácido que tem pelo menos 80% deidentidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4 ou SEQ ED NO: 10,pelo menos 85% de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 6,ou pelo menos 75% de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ IDNO: 8;
(b) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições pelomenos de alta estringência com (i) a seqüência de codificação de polipeptídeomaduro de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, ou SEQ ID NO: 9,(ii) a seqüência de cDNA contida em uma seqüência de codificação depolipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 9 ou a seqüência deDNA genômico compreendendo a seqüência de codificação de polipeptídeomaduro de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7, ou (iii) um filamentocomplementar de (i) ou (ii);
(c) um polinucleotídeo tendo pelo menos 80% de identidadecom a seqüência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ. ID NO: 3 ouSEQ ID NO: 9, pelo menos 85% de identidade com a seqüência decodificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5, ou pelo menos 75% deidentidade com a seqüência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQID NO: 7; e
(d) um polinucleotídeo codificando uma variantecompreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção de um ou maisaminoácidos do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQID NO: 8, ou SEQ ID NO: 10,
Em um aspecto preferido, o polipeptídeo maduro contêm osaminoácidos 17 a 389 de SEQ ID NO: 4. Em outro aspecto preferido, opolipeptídeo maduro contêm os aminoácidos 16 a 397 de SEQ ID NO: 6. Emoutro aspecto preferido, o polipeptídeo maduro contêm os aminoácidos 22 a429 de SEQ ID NO: 8. Em outro aspecto preferido, o polipeptídeo madurocontêm os aminoácidos 25 a 421 de SEQ ID NO: 10. Em outro aspectopreferido, a seqüência de codificação de polipeptídeo maduro contêm osnucleotídeos 67 a 1185 de SEQ ID NO: 3. Em outro aspecto preferido, aseqüência de codificação de polipeptídeo maduro contêm os nucleotídeos 84 a1229 de SEQ ID NO: 5. Em outro aspecto preferido, a seqüência decodificação de polipeptídeo maduro contêm os nucleotídeos 77 a 1300 deSEQ ID NO: 7. Em outro aspecto preferido, a seqüência de codificação depolipeptídeo maduro contêm os nucleotídeos 73 a 1468 de SEQ ID NO: 9.
A presente invenção refere-se também à construção de ácidonucleico, vetores de expressão recombinantes, células hospedeirasrecombinantes compreendendo os polinucleotídeos, e métodos de produzirum polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase.
A presente invenção também refere-se a métodos de inibir aexpressão de um polipeptídeo em uma célula, compreendendo administrar àcélula ou expressar na célula uma molécula de RNA filamento duplo(dsRNA), em que o dsRNA compreende uma subseqüência de umpolinucleotídeo da presente invenção. O presente também refere-se a talmolécula de RNA filamento duplo inibidor (dsRNA), em que opcionalmenteo dsRNA é uma molécula de siRNA ou de miRNA.
A presente invenção também refere-se a métodos de usar ospolipeptídeos tendo atividade de endoglucanase na conversão de celulose emglicose e várias substâncias.
A presente invenção também refere-se às plantascompreendendo um polinucleotídeo isolado codificando este polipeptídeotendo atividade de endoglucanase.
A presente invenção também refere-se a métodos paraproduzir este um polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase,compreendendo: (a) cultivar uma planta transgênica ou uma célula plantacompreendendo um polinucleotídeo codificando este polipeptídeo tendoatividade de endoglucanase sob condições que conduzem à produção dopolipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.
A presente invenção ainda refere-se à construção de ácidonucleico compreendendo um gene codificando uma proteína, em que um geneé ligado operativamente a uma seqüência de nucleotídeos codificando umpeptídeo de sinal compreendendo ou consistindo de aminoácidos 1 a 16 deSEQ ID NO: 4, aminoácidos 1 a 15 de SEQ ID NO: 6, aminoácidos 1 a 21 deSEQ ID NO: 8, ou aminoácidos 1 a 16 de SEQ ID NO: 10 e uma segundaseqüência de nucleotídeos codificando um pró-peptídeo compreendendo ouconsistindo de aminoácidos 17 a 24 de SEQ ID NO: 10, em que um gene éestranho para a primeira e segunda seqüências de nucleotídeos.Breve Descrição das Figuras
Figura 1 mostra um mapa de restrição de pCIC161.
Figura 2 mostra a seqüência de DNA genômico e a seqüênciade aminoácido deduzida de endoglucanase de Myceliophthora thermophilaCBS 117.65 (SEQ ID NOs: 3 e 4, respectivamente).
Figura 3 mostra um mapa de restrição de pA2C161.
Figura 4 mostra um mapa de restrição de pCIC453.
Figura 5 mostra um mapa de restrição de pA2C453.
Figura 6 mostra a seqüência de cDNA e a seqüência deaminoácido deduzida de uma endoglucanase de basidiomicete CBS 495.95(SEQ ID NOs: 5 e 6, respectivamente).
Figura 7 mostra um mapa de restrição de pCIC486.
Figura 8 mostra um mapa de restrição de pA2C486.
Figura 9 mostra a seqüência de cDNA e a seqüência deaminoácido deduzida de uma endoglucanase de basidiomicete CBS 494.95(SEQ ID NOs: 7 e 8, respectivamente).
Figuras 1OA e 1OB mostram a seqüência de DNA genômico ea seqüência de aminoácido deduzida de uma endoglucanase de Penicilliumbrasilianum cepa IBT 20888 (SEQ ID NOs: 9 e 10, respectivamente).
Figura 11 mostra um mapa de restrição de pKBK03.
Figura 12 mostra um mapa de restrição de pPBCel5C.
Figura 13 mostra a atividade específica de endoglucanase dePenicillium brasilianum IBT 20888 CEL5C em valores de pH diferentes e50°C (n=2).
Figura 14 mostra a atividade específica de endoglucanase dePenieillium brasilianum IBT 20888 CEL5C em temperaturas diferentes e pH4,8 (n=2).
Figura 15 mostra a atividade residual de endoglucanase dePenicillium brasilianum IBT 20888 CEL5C após 20 horas de incubação emvalores de pH diferentes e 25°C e 50°C (n=2).
Figura 16 mostra a atividade relativa em PASC (2 mg/ml)como uma função de temperatura para basidiomicete CBS 494.95 ebasidiomicete CBS 495.95 a pH 5.0.
Figura 17 mostra a conversão relativa de PASC (2 mg/ml)como uma função de temperatura após 45 horas de hidrólise combasidiomicete CBS 494.95 e basidiomicete CBS 495.95 (0,5 mg de proteínapor g de PASC) a pH 5,0.
Figura 18 mostra uma comparação de endoglucanases deMyeetiophthora thermophila CBS 117.65, basidiomicete CBS 494.95,basidiomicete CBS 495.95, e Triehoderma reesei para produção de açúcaresredutores a partir de beta-glucano (1% p/v) após 2 horas de reação dehidrólise a pH 5,5 e 60°C.
Figura 19 mostra uma comparação de endoglucanases deMyceliophthora thermophila CBS 117.65, basidiomicete CBS 494.95,basidiomicete CBS 495.95, e Trichoderma reesei para a produção de açúcaresredutores a partir de beta-glucano (1% p/v) após 2 horas de reação dehidrólise a pH 5,5 e 60°C.
Definições
Atividade de endoglucanase: O termo "atividade deendoglucanase" é definido aqui como uma endo-1,4-beta-D-glucano 4-glucano-hidrolase (E.C. No. 3.2.1.4) que catalisa a endo-hidrólise de ligações1,4-beta-D-glicosídicas em celulose, derivados de celulose (comocarboximetil celulose e hidroxietil celulose), liquenina, ligações beta-1,4 emmisturas de beta-1,3 glucanos como beta-D-glucanos ou xiloglucanos decereais, e outro material de planta contendo componentes celulósicos. Para osfins da presente invenção, a atividade de endoglucanase é determinada usandohidrólise de carboximetil celulose (CMC) de acordo com o procedimento deGhose, 1987, Pure and Appl. Chem. 59: 257 - 268. Uma unidade de atividadede endoglucanase é definida como 1,0 μmol de açúcares redutores produzidospor minuto a 50°C, pH 4,8.
Em um aspecto preferido, os polipeptídeos da presenteinvenção tendo atividade de endoglucanase ainda apresentam atividade deenzima para um ou mais substratos selecionados dentre o grupo consistindode xilano, xiloglucano, arabinoxilano, 1,4-beta-D-manano, e galactomanano.A atividade dos polipeptídeos tendo atividade de endoglucanase nestessubstratos de polissacarídeo é determinada como a porcentagem do substratohidrolisado em açúcares redutores após incubar o substrato (5 mg por ml) comum polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase da presente invenção (5mg de proteína por g de substrato) durante 24 horas com agitação intermitentea pH 5,0 (50 mM de acetato de sódio) e 50°C. Açúcares redutores em misturasde hidrólise são determinados pelo teste de hidrazida de ácido p-hidroxibenzóico(PHBAH).
Em um aspecto mais preferido, os polipeptídeos da presenteinvenção tendo atividade de endoglucanase ainda têm atividade de enzimapara xilano. Em outro aspecto mais preferido os polipeptídeos da presenteinvenção tendo atividade de endoglucanase ainda têm atividade de enzimapara xiloglucano. Em outro aspecto mais preferido, os polipeptídeos dapresente invenção tendo atividade de endoglucanase ainda têm atividade deenzima para arabinoxilano. Em outro aspecto mais preferido, os polipeptídeosda presente invenção tendo atividade de endoglucanase ainda têm atividade deenzima para 1,4-beta-D-manano. Em outro aspecto mais preferido, ospolipeptídeos da presente invenção tendo atividade de endoglucanase aindatêm atividade de enzima para galactomanano. Em outro aspecto maispreferido, os polipeptídeos da presente invenção tendo atividade deendoglucanase ainda têm atividade de enzima para xilano, xiloglucano,arabinoxilano, 1,4-beta-D-manano, e/ou galactomanano.
Os polipeptídeos da presente invenção têm pelo menos 20%,preferivelmente pelo menos 40%, mais preferivelmente pelo menos 50%,mais preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, ainda mais preferivelmente pelomenos 90%, o mais preferivelmente pelo menos 95%, e ainda o maispreferivelmente pelo menos 100% da atividade de endoglucanase depolipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, ouSEQ ID NO: 10.
Família 5 de glicosídeo hidrolase ou família GH5: O termo"família 5 de glicosídeo hidrolase" ou "família GH5" é definido aqui comoum polipeptídeo dentro na família 5 glicosídeo hidrolase de acordo comHenrissat B., 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid seqüence similarities, Biochem. J. 280: 309 - 316, e Henrissat B., eBairoch A., 1996, Updating the seqüence-based classification of glycosylhydrolases, Biochem, J. 316: 695 -696.
Polipeptídeo isolado: O termo "polipeptídeo isolado" comousado aqui refere-se a um polipeptídeo que é pelo menos 20% puro,preferivelmente pelo menos 40% puro, mais preferivelmente pelo menos 60%puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 80% puro, o maispreferivelmente pelo menos 90% puro, e ainda o mais preferivelmente pelomenos 95% puro, como determinado por SDS-PAGE.
Polipeptídeo substancialmente puro: O termo "polipeptídeosubstancialmente puro" denota aqui uma preparação de polipeptídeo quecontém no máximo 10%, preferivelmente no máximo 8%, maispreferivelmente no máximo 6%, mais preferivelmente no máximo 5%, maispreferivelmente no máximo 4%, mais preferivelmente no máximo 3%, aindamais preferivelmente no máximo 2%, o mais preferivelmente no máximo 1%,e ainda o mais preferivelmente no máximo 0,5% em peso de outro material depolipeptídeo com que é naturalmente ou recombinantemente associado.Assim, prefere-se que o polipeptídeo substancialmente puro é pelo menos92% puro, preferivelmente pelo menos 94% puro, mais preferivelmente pelomenos 95% puro, mais preferivelmente pelo menos 96% puro, maispreferivelmente pelo menos 96% puro, mais preferivelmente pelo menos 97%puro, mais preferivelmente pelo menos 98% puro, ainda mais preferivelmentepelo menos 99%, o mais preferivelmente pelo menos 99,5% puro, e ainda omais preferivelmente 100% puro em peso do material de polipeptídeo totalpresente na preparação.
Os polipeptídeos da presente invenção estão preferivelmenteem uma forma substancialmente pura. Em particular, prefere-se que ospolipeptídeos estejam na "forma essencialmente pura", isto é, que apreparação de polipeptídeo seja essencialmente livre de outro material depolipeptídeo com o qual ele é naturalmente ou recombinantemente associado.Isto pode ser obtido, por exemplo, por preparação do polipeptídeo por meiode métodos recombinantes bem conhecidos ou por métodos clássicos depurificação.
Aqui, o termo "polipeptídeo substancialmente puro" ésinônimo de termos "polipeptídeo isolado" e '"polipeptídeo na forma isolada."Polipeptídeo maduro: O termo "polipeptídeo maduro" édefinido aqui como um polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase que éem sua forma final após tradução e quaisquer modificações pós-tradução ais,como processamento N-terminal, truncagem C-terminal, glicosilação, etc.
Seqüência de codificação de polipeptídeo maduro: O termo"seqüência de codificação de polipeptídeo maduro" é definido aqui como umaseqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro tendoatividade de endoglucanase.
Identidade: O parentesco entre duas seqüências deaminoácido ou entre duas seqüências de nucleotídeo é descrito pelo parâmetro"identidade".
Para os fins da presente invenção, o grau de identidade entreduas seqüências de aminoácido é determinado usando o algoritmoNeedleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443 -453) como implementado no programa Needle de EMBOSS com penalidadede abertura de espaço de 10, penalidade de extensão de espaço de 0,5, e amatriz de EBLOSUM62. A saída de Needle rotulada "identidade mais longa"é usada como a porcentagem de identidade e é calculada como a seguir:(Resíduos idênticos χ 100)/(Comprimento de Alinhamento - Número deespaços em alinhamento)
Para os fins da presente invenção, o grau de identidade entreduas seqüências de nucleotídeo é determinado usando o algoritmoNeedleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. MoL Biol. 48: 443 -453) como implementado no programa de Needle de EMBOSS compenalidade de abertura de espaço de 10, penalidade de extensão de espaço de0,5, e a matriz de EDNAFULL. A saída de Needle rotulada "identidade maislonga" é usada como a porcentagem de identidade e é calculada como aseguir:
(Resíduos idênticos χ 100)/(Comprimento de Alinhamento - Número deEspaços em Alinhamento)
Seqüência homóloga: O termo "seqüência homóloga" édefinido aqui como uma proteína prevista que dá um valor E (ou escore deexpectativa) de menos que 0,001 em uma busca fasta (Pearson, W. R., 1999,in Bioinformatics Methods and Protocols, S. Misener e S. A, Krawetz, ed, pp.185-219) com a endoglucanase madura de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6,SEQ ID NO: 8, ou SEQ ID NO: 10.
Fragmento de polipeptídeo: O termo "fragmento depolipeptídeo" é definido aqui como um polipeptídeo tendo um ou maisaminoácidos deletados do término amino e/ou carbóxi do polipeptídeomaduro de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, ou SEQ ID NO.10; ou uma seqüência homóloga do mesmo, em que um fragmento tematividade de endoglucanase. Em um aspecto preferido, um fragmento contémpelo menos 295 resíduos de aminoácido, mais preferivelmente pelo menos315 resíduos de aminoácido, e o mais preferivelmente pelo menos 335resíduos de aminoácido do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4 ou umaseqüência homóloga do mesmo. Em outro aspecto preferido, um fragmentocontém pelo menos 320 resíduos de aminoácido, mais preferivelmente pelomenos 340 resíduos de aminoácido, e o mais preferivelmente pelo menos 360resíduos de aminoácido do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 6 ou umaseqüência homóloga do mesmo. Em outro aspecto preferido, um fragmentocontém pelo menos 325 resíduos de aminoácido, mais preferivelmente pelomenos 345 resíduos de aminoácido, e o mais preferivelmente pelo menos 365resíduos de aminoácido do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 8 ou umaseqüência homóloga do mesmo. Em outro aspecto preferido, um fragmentocontém pelo menos 335 resíduos de aminoácido, mais preferivelmente pelomenos 355 resíduos de aminoácido, e o mais preferivelmente pelo menos 375resíduos de aminoácido do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 10 ou umaseqüência homóloga do mesmo.Subseqüência: O termo "subseqüência" é definido aqui comouma seqüência de nucleotídeo tendo um ou mais nucleotídeos deletados daextremidade 5' e/ou 3' da seqüência de codificação de polipeptídeo maduro deSEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, ou SEQ ID NO: 9; ou umaseqüência homóloga do mesmo; em que a subseqüência codifica umfragmento de polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase. Em um aspectopreferido, uma subseqüência contém pelo menos 885 nucleotídeos, maispreferivelmente pelo menos 945 nucleotídeos, e o mais preferivelmente pelomenos 1005 nucleotídeos da seqüência de codificação de polipeptídeo madurode SEQ. ID NO: 3 ou uma seqüência homóloga do mesmo. Em outro aspectopreferido, uma subseqüência contém pelo menos 960 nucleotídeos, maispreferivelmente pelo menos 1020 nucleotídeos, e o mais preferivelmente pelomenos 1080 nucleotídeos da seqüência de codificação de polipeptídeo madurode SEQ ID NO: 5 ou uma seqüência homóloga do mesmo. Em outro aspectopreferido, uma subseqüência contém pelo menos 975 nucleotídeos, maispreferivelmente pelo menos 1035 nucleotídeos, e o mais preferivelmente pelomenos 1095 nucleotídeos da seqüência de codificação de polipeptídeo madurode SEQ ID NO: 7 ou uma seqüência homóloga do mesmo. Em outro aspectopreferido, uma subseqüência contém pelo menos 1005 nucleotídeos, maispreferivelmente pelo menos 1065 nucleotídeos, e o mais preferivelmente pelomenos 1125 nucleotídeos da seqüência de codificação de polipeptídeo madurode SEQ ID NO: 9 ou uma seqüência homóloga do mesmo.
Variante alélica: O termo "variante alélica" denota aquiqualquer uma dentre duas ou mais formas alternativas de um gene ocupando omesmo locus cromossômico. Variação alélica surge naturalmente através damutação, e pode resultar em polimorfismo dentro das populações. Mutaçõesde gene podem ser silentes (sem mudança no polipeptídeo codificado) oupodem codificar polipeptídeos tendo seqüências de aminoácido alteradas.Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado poruma variante alélica de um gene.
Polinucleotídeo isolado: O termo "polinucleotídeo isolado"como usado aqui refere-se a um polinucleotídeo que é pelo menos 20% puro,preferivelmente pelo menos 40% puro, mais preferivelmente pelo menos 60%puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 80% puro, o maispreferivelmente pelo menos 90% puro, e ainda o mais preferivelmente pelomenos 95% puro, como determinado por eletroforese agarose.
Polinucleotídeo substancialmente puro: O termo"polinucleotídeo substancialmente puro" como usado aqui refere-se a umapreparação de polinucleotídeo livre de outros nucleotídeos estranhos ouindesejados e em uma forma apropriada para usar em sistemas de produção deproteína geneticamente engenheirados. Assim, um polinucleotídeosubstancialmente puro contém no máximo 10%, preferivelmente no máximo8%, mais preferivelmente no máximo 6%, mais preferivelmente no máximo5%, mais preferivelmente no máximo 4%, mais preferivelmente no máximo3%, ainda mais preferivelmente no máximo 2%, o mais preferivelmente nomáximo 1%, e ainda o mais preferivelmente no máximo 0,5% em peso deoutro material de polinucleotídeo com o qual ele é naturalmente ourecombinantemente associado. Um polinucleotídeo substancialmente puropode, no entanto, incluir regiões 5' e 3' de ocorrência natural não traduzidas,como promotores e terminadores. Prefere-se que o polinucleotídeosubstancialmente puro seja pelo menos 90% puro, preferivelmente pelomenos 92% puro, mais preferivelmente pelo menos 94% puro, maispreferivelmente pelo menos 95% puro, mais preferivelmente pelo menos 96%puro, mais preferivelmente pelo menos 97% puro, ainda mais preferivelmentepelo menos 98% puro, o mais preferivelmente pelo menos 99%, e ainda omais preferivelmente pelo menos 99,5% puro em peso. Os polinucleotídeosda presente invenção estão preferivelmente em uma forma substancialmentepura. Em particular, prefere-se que os polinucleotídeos descritos aqui estejamna "forma essencialmente pura", isto é, que a preparação de polinucleotídeoseja essencialmente livre de outro material de polinucleotídeo com o qual eleé naturalmente ou recombinantemente associado. Aqui, o termo"polinucleotídeo substancialmente puro" é sinônimo dos termos"polinucleotídeo isolado" e "polipeptídeo na forma isolada." Ospolinucleotídeos podem ser de origem genômica, cDNA, RNA, semi-sintética, sintética, ou quais combinações dos mesmos.
Seqüência de codificação: Quando usado aqui o termo"seqüência de codificação" significa uma seqüência de nucleotídeo, quediretamente especifica a seqüência de aminoácido de seu produto de proteína.Os limites da seqüência de codificação geralmente são determinados por umamatriz de leitura aberta, que geralmente começa com o códon de partida ATGou códons de partida alternativos como GTG e TTG e terminado com umcódon de parada como TAA, TAG, e TGA. A seqüência de codificação podeser uma seqüência de DNA, cDNA, ou de nucleotídeo recombinante.
Seqüência de codificação de polipeptídeo maduro: O termo"seqüência de codificação de polipeptídeo maduro" é definido aqui como umaseqüência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo maduro tendoatividade de endoglucanase.
cDNA: O termo "cDNA" é definido aqui como uma molécula
de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa de uma molécula demRNA maduro, emendada, obtida de uma célula eucariótica. cDNA não temas seqüências de íntrons que estão geralmente presentes no DNA genômicocorrespondente. O transcrito de RNA primário inicial é um precursor para25 mRNA que é processado através de uma série de etapas antes de aparecercomo um mRNA emendado maduro. Estas etapas incluem a remoção deseqüências de íntron por um processo chamado "emenda". cDNA derivado demRNA não apresenta, assim, quaisquer seqüências de íntron.
Construção de ácido nucleico: O termo "construção de ácidonucleico" como usado aqui refere-se a uma molécula de ácido nucleico, defilamento único ou duplo, que é isolada de um gene de ocorrência natural ouque é modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos em um modo quenão iria de outra forma existir na natureza. O termo construção de ácidonucleico é sinônimo do termo "cassete de expressão" quando a construção deácido nucleico contém as seqüências de controle requeridas para expressão deuma seqüência de codificação da presente invenção.
Seqüência de controle: O termo "seqüência de controle" édefinido aqui para incluir todos componentes, que são necessários ouvantajosos para a expressão de um polinucleotídeo codificando umpolipeptídeo da presente invenção. Cada seqüência de controle pode sernativa ou estranha para a seqüência de nucleotídeos codificando opolipeptídeo ou nativa ou estranha para cada outro. Tais seqüências decontrole incluem, mas não são limitados a um líder, seqüência depoliadenilação, seqüência de pró-peptídeo, promotor, seqüência de peptídeosinal, e terminador de transcrição. Em um mínimo, as seqüências de controleincluem um promotor, e sinais de parada transcripcional e translacional. Asseqüências de controle podem ser providas com ligadores para o fim deintroduzir sítios de restrição específicos facilitando a ligação das seqüênciasde controle com a região codificada da seqüência de nucleotídeos codificandoum polipeptídeo.
Ligado operativamente: O termo "ligado operativamente"denota aqui uma configuração em que uma seqüência de controle é colocadaem uma posição apropriada relativa na seqüência de codificação da seqüênciade polinucleotídeo de modo que a seqüência de controle dirige a expressão daseqüência de codificação de um polipeptídeo.
Expressão: O termo "expressão" inclui qualquer etapaenvolvida na produção do polipeptídeo incluindo, mas não limitado atranscrição, modificação pós-transcripcional, tradução, modificação pós-translacional, e secreção.
Vetor de expressão: O termo "vetor de expressão" é definidoaqui como uma molécula de DNA linear ou circular que compreende umpolinucleotídeo codificando um polipeptídeo da presente invenção, e que éligado operativamente a nucleotídeos adicionais que provê sua expressão.
Célula hospedeira: O termo "célula hospedeira", como usadoaqui, inclui qualquer tipo de célula que é suscetível para transformação,transfecção, transdução, e outros com uma construção de ácido nucleico ouvetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção.
Modificação: O termo "modificação" significa aqui qualquermodificação química do polipeptídeo consistindo do polipeptídeo maduro deSEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, ou SEQ ID NO: 10; ou umaseqüência homóloga do mesmo; assim como manipulação genética do DNAcodificando este polipeptídeo. A modificação pode incluir substituições,deleções e/ou inserções de um ou mais aminoácidos assim como substituiçõesde uma ou mais cadeias laterais de aminoácido.
Variante artificial: Quando usado aqui, o termo "varianteartificial" significa um polipeptídeo tendo atividade de endoglucanaseproduzida por um organismo expressando uma seqüência de nucleotídeomodificada da seqüência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ IDNO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, ou SEQ ID NO: 9; ou uma seqüênciahomóloga do mesmo. A seqüência de nucleotídeo modificada é obtida atravésde intervenção humana por modificação da seqüência de nucleotídeo descritana SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, ou SEQ ID NO: 9; ou umaseqüência homóloga do mesmo.
Descrição Detalhada da Invenção
Polipeptídeos tendo atividade de endoglucanase
Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se apolipeptídeos isolados compreendendo uma seqüência de aminoácido que temum grau de identidade no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4, SEQ IDNO: 6, SEQ ID NO: 8, ou SEQ LD NO: 10, de pelo menos 60%,preferivelmente pelo menos 65%, mais preferivelmente pelo menos 70%,mais preferivelmente pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, ainda mais preferivelmente pelomenos 90%, o mais preferivelmente pelo menos 95%, e ainda o maispreferivelmente pelo menos 96%, 97%, 98%, ou 99%, que tem atividade deendoglucanase (abaixo "polipeptídeos homólogos"). Em um aspectopreferido, os polipeptídeos homólogos têm uma seqüência de aminoácido quediferi por dez aminoácidos, preferivelmente por cinco aminoácidos, maispreferivelmente por quatro aminoácidos, ainda mais preferivelmente por trêsaminoácidos, o mais preferivelmente por dois aminoácidos, e ainda o maispreferivelmente por um aminoácido do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, ou SEQ ID NO: 10.
Um polipeptídeo da presente invenção preferivelmentecompreende a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 ou uma variantealélica do mesmo; ou um fragmento do mesmo que tem atividade deendoglucanase. Em um aspecto preferido, um polipeptídeo compreende aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 4. Em outro aspecto preferido, umpolipeptídeo compreende o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4. Em outroaspecto preferido, um polipeptídeo compreende aminoácidos 17 a 389 deSEQ ID NO: 4, ou uma variante alélica do mesmo; ou um fragmento domesmo que tem atividade de endoglucanase. Em outro aspecto preferido, umpolipeptídeo compreende aminoácidos 17 a 389 de SEQ ID NO: 4. Em outroaspecto preferido, um polipeptídeo consiste da seqüência de aminoácido deSEQ ID NO: 4 ou uma variante alélica do mesmo; ou um fragmento domesmo que tem atividade de endoglucanase. Em outro aspecto preferido, umpolipeptídeo consiste da seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 4. Emoutro aspecto preferido, um polipeptídeo consiste do polipeptídeo maduro deSEQ ID NO: 4. Em outro aspecto preferido, um polipeptídeo consiste deaminoácidos 17 a 389 de SEQ ID NO: 4 ou uma variante alélica do mesmo;ou um fragmento do mesmo que tem atividade de endoglucanase. Em outroaspecto preferido, um polipeptídeo consiste de aminoácidos 17 a 389 de SEQID NO: 4.
Um polipeptídeo da presente invenção preferivelmentetambém compreende a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 6 ou umavariante alélica do mesmo; ou um fragmento do mesmo que tem atividade deendoglucanase. Em um aspecto preferido, um polipeptídeo compreende aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 6. Em outro aspecto preferido, umpolipeptídeo compreende o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 6. Em outroaspecto preferido, um polipeptídeo compreende aminoácidos 16 a 397 deSEQ ID NO: 6, ou uma variante alélica do mesmo; ou um fragmento domesmo que tem atividade de endoglucanase. Em outro aspecto preferido, umpolipeptídeo compreende aminoácidos 16 a 397 de SEQ ID NO: 6. Em outroaspecto preferido, um polipeptídeo consiste da seqüência de aminoácido deSEQ ID NO: 6 ou uma variante alélica do mesmo; ou um fragmento domesmo que tem atividade de endoglucanase. Em outro aspecto preferido, umpolipeptídeo consiste da seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 6. Emoutro aspecto preferido um polipeptídeo consiste do polipeptídeo maduro deSEQ ID NO: 6. Em outro aspecto preferido, um polipeptídeo consiste deaminoácidos 16 a 397 de SEQ ID NO: 6 ou uma variante alélica do mesmo;ou um fragmento do mesmo que tem atividade de endoglucanase. Em outroaspecto preferido, um polipeptídeo consiste de aminoácidos 16 a 397 de SEQID NO: 6.
Um polipeptídeo da presente invenção preferivelmentetambém compreende a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 8 ou umavariante alélica do mesmo; ou um fragmento do mesmo que tem atividade deendoglucanase. Em um aspecto preferido, um polipeptídeo compreende aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 8. Em outro aspecto preferido, umpolipeptídeo compreende o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 8. Em outroaspecto preferido, um polipeptídeo compreende aminoácidos 22 a 429 deSEQ ID NO: 8, ou uma variante alélica do mesmo; ou um fragmento domesmo que tem atividade de endoglucanase. Em outro aspecto preferido, umpolipeptídeo compreende aminoácidos 22 a 429 de SEQ ID NO: 8. Em outroaspecto preferido, um polipeptídeo consiste da seqüência de aminoácido deSEQ ID NO: 8 ou uma variante alélica do mesmo; ou um fragmento domesmo que tem atividade de endoglucanase. Em outro aspecto preferido, umpolipeptídeo consiste da seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 8. Emoutro aspecto preferido, um polipeptídeo consiste do polipeptídeo maduro deSEQ ID NO: 8. Em outro aspecto preferido, um polipeptídeo consiste deaminoácidos 22 a 429 de SEQ ID NO: 8 ou uma variante alélica do mesmo;ou um fragmento do mesmo que tem atividade de endoglucanase. Em outroaspecto preferido, um polipeptídeo consiste de aminoácidos 22 a 429 de SEQID NO: 8.
Um polipeptídeo da presente invenção preferivelmentetambém compreende a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 ou umavariante alélica do mesmo; ou um fragmento do mesmo que tem atividade deendoglucanase. Em um aspecto preferido, um polipeptídeo compreende aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 10. Em outro aspecto preferido, umpolipeptídeo compreende o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 10. Emoutro aspecto preferido, um polipeptídeo compreende aminoácidos 25 a 421de SEQ ID NO: 10, ou uma variante alélica do mesmo; ou um fragmento domesmo que tem atividade de endoglucanase. Em outro aspecto preferido, umpolipeptídeo compreende aminoácidos 25 a 421 de SEQ ID NO: 10. Em outroaspecto preferido, um polipeptídeo consiste da seqüência de aminoácido deSEQ ID NO: 10 ou uma variante alélica do mesmo; ou um fragmento domesmo que tem atividade de endoglucanase. Em outro aspecto preferido, umpolipeptídeo consiste da seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 10. Emoutro aspecto preferido, um polipeptídeo consiste do polipeptídeo maduro deSEQ ID NO: 10. Em outro aspecto preferido, um polipeptídeo consiste deaminoácidos 25 a 421 de SEQ ID NO: 10 ou uma variante alélica do mesmo;ou um fragmento do mesmo que tem atividade de endoglucanase. Em outroaspecto preferido, um polipeptídeo consiste de aminoácidos 25 a 421 de SEQID NO: 10.
Em um segundo aspecto, a presente invenção refere-se apolipeptídeos isolados tendo atividade de endoglucanase que são codificadospor polinucleotídeos que hibridizam sob condições de estringência muitobaixa, preferivelmente condições de estringência baixa, mais preferivelmentecondições de estringência média, mais preferivelmente condições deestringência média a alta, ainda mais preferivelmente condições de altaestringência, e o mais preferivelmente condições de estringência muito altacom (i) a seqüência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3,SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, ou SEQ ID NO: 9, (ii) a seqüência de cDNAcontida em uma seqüência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ IDNO: 3 ou SEQ ID NO: 9 ou a seqüência de DNA genômico compreendendo aseqüência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5 ou SEQID NO: 7, (iii) uma subseqüência de (i) ou (ii), ou (iv) um filamentocomplementar de (i), (ii), ou (iii) (J. Sambrook, E, F, Fritsch, e T, Maniatis,1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a. edição, Cold SpringHarbor, New York). Uma subseqüência da seqüência de codificação depolipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, ouSEQ ID NO: 9 contém pelo menos 100 nucleotídeos contíguos oupreferivelmente pelo menos 200 nucleotídeos contíguos. Além disso, asubseqüência pode codificar um fragmento de polipeptídeo que tem atividadede endoglucanase. Em um aspecto preferido, a seqüência de codificação depolipeptídeo maduro contêm os nucleotídeos 67 a 1185 de SEQ ID NO: 3. Emoutro aspecto preferido, a seqüência de codificação de polipeptídeo madurocontêm os nucleotídeos 84 a 1229 de SEQ ID NO: 5. Em outro aspectopreferido, a seqüência de codificação de polipeptídeo maduro contêm osnucleotídeos 77 a 1300 de SEQ ED NO: 7. Em outro aspecto preferido, aseqüência de codificação de polipeptídeo maduro contêm os nucleotídeos 73 a1488 de SEQ ID NO: 9. Em outro aspecto preferido, o filamentocomplementar é o filamento complementar de comprimento completo daseqüência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, SEQ IDNO: 5, SEQ ID NO: 7, ou SEQ ID NO: 9.
A seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:5, SEQ SD NO: 7, ou SEQ ID NO: 9; ou a subseqüência do mesmo; assimcomo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ IDNO: 8, ou SEQ ID NO: 10; ou um fragmento do mesmo; pode ser usada paraprojetar uma sonda de ácido nucleico para identificar e clonar DNAcodificando polipeptídeos tendo atividade de endoglucanase de cepas degêneros ou espécies diferentes de acordo com os métodos bem conhecidos naarte. Em particular, tais sondas podem ser usadas para hibridização com ogenômico ou cDNA do gênero ou espécie de interesse, após os procedimentospadrões de Southern blotting, a fim de identificar e isolar o genecorrespondente no mesmo. Tais sondas podem ser consideravelmente maiscurtas do que a seqüência completa, mas devem ter pelo menos 14,preferivelmente pelo menos 25, mais preferivelmente pelo menos 35, e o maispreferivelmente pelo menos 70 nucleotídeos de comprimento. No entanto,prefere-se que a sonda de ácido nucleico seja de pelo menos 100 nucleotídeosde comprimento. Por exemplo, a sonda de ácido nucleico pode ter pelo menos200 nucleotídeos, preferivelmente pelo menos 300 nucleotídeos, maispreferivelmente pelo menos 400 nucleotídeos, ou o mais preferivelmente pelomenos 500 nucleotídeos de comprimento. Outras sondas mais longas podemser usadas, por exemplo, sondas de ácido nucleico que tem pelo menos 600nucleotídeos, pelo menos preferivelmente pelo menos 700 nucleotídeos, maispreferivelmente pelo menos 800 nucleotídeos, ou o mais preferivelmente pelomenos 900 nucleotídeos de comprimento. Ambas as sondas de DNA e RNApodem ser usadas. As sondas são tipicamente rotuladas para detectar o genecorrespondente (por exemplo, com 32P, 3H, 35S, biotina, ou avidina). Taissondas são englobadas pela presente invenção.
Uma biblioteca de DNA ou cDNA genômico preparado apartes destes outros organismos pode, assim, ser tríada para DNA quehibridiza com as sondas descritas acima e que codifica um polipeptídeo tendoatividade de endoglucanase. DNA genômico ou outro de tais outrosorganismos pode ser separado por agarose ou eletroforese gel depoliacrilamida, ou outras técnicas de separação, DNA das bibliotecas ou oDNA separado pode ser transferido para e imobilizado em nitrocelulose ououtro material de veículo apropriado. A fim de identificar um clone ou DNAque é homólogo com SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, ou SEQID NO: 9; ou uma subseqüência do mesmo; o material de veículo épreferivelmente usado em um Southern blot.
Para os fins da presente invenção, a hibridização indica que aseqüência de nucleotídeos hibridiza para uma sonda de ácido nucleicorotulada correspondente a seqüência de codificação de polipeptídeo madurode SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, ou SEQ ID NO: 9; aseqüência de cDNA contida em uma seqüência de codificação de polipeptídeomaduro de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 9 ou a seqüência de DNAgenômico compreendendo a seqüência de codificação de polipeptídeo madurode SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7; seu filamento complementar; ou umasubseqüência do mesmo; sob condições de estringência muito alta para muitobaixa. Moléculas em a sonda de ácido nucleico hibridiza sob estas condiçõespodem ser detectadas usando, por exemplo, filme de raios X.
Em um aspecto preferido, a sonda de ácido nucleico é aseqüência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3. Em outroaspecto preferido, a sonda de ácido nucleico contêm os nucleotídeos 67 a1185 de SEQ ID NO: 3. Em outro aspecto preferido, a sonda de ácidonucleico é uma seqüência de polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo deSEQ ID NO: 4, ou a subseqüência do mesmo. Em outro aspecto preferido, asonda de ácido nucleico é SEQ ID NO: 3. Em outro aspecto preferido, a sondade ácido nucleico é a seqüência de polinucleotídeo contida em plasmídeopCIClól que está contida em E. coli NRRL B-30902, em que a seqüência depolinucleotídeo do mesmo codifica um polipeptídeo tendo atividade deendoglucanase. Em outro aspecto preferido, a sonda de ácido nucleico é aregião de codificação de polipeptídeo maduro contida em plasmídeo pCIClólque está contido em E. coli NRRL B-30902.
Em outro aspecto preferido, a sonda de ácido nucleico é aseqüência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5. Em outroaspecto preferido, a sonda de ácido nucleico contêm os nucleotídeos 84 a1229 de SEQ ID NO: 5. Em outro aspecto preferido, a sonda de ácidonucleico é uma seqüência de polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo deSEQ ID NO: 6, ou uma subseqüência do mesmo. Em outro aspecto preferido,a sonda de ácido nucleico é SEQ ID NO: 5. Em outro aspecto preferido, asonda de ácido nucleico é a seqüência de polinucleotídeo contida emplasmídeo pCIC453 que está contido em E. coli NRRL B-30903, em que aseqüência de polinucleotídeo do mesmo codifica um polipeptídeo tendoatividade de endoglucanase. Em outro aspecto preferido, a sonda de ácidonucleico é a região de codificação de polipeptídeo maduro contido emplasmídeo pCIC453 que está contido em E. coli NRRL B-30903.
Em outro aspecto preferido, a sonda de ácido nucleico é aseqüência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 7. Em outroaspecto preferido, a sonda de ácido nucleico contêm os nucleotídeos 77 a1300 de SEQ ID NO: 7. Em outro aspecto preferido, a sonda de ácidonucleico é uma seqüência de polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo deSEQ ID NO: 8, ou uma subseqüência do mesmo. Em outro aspecto preferido,a sonda de ácido nucleico é SEQ ID NO: 7. Em outro aspecto preferido, asonda de ácido nucleico é a seqüência de polinucleotídeo contido emplasmídeo pCIC486 que está contido em E. coli NRRL B-30904, em que aseqüência de polinucleotídeo do mesmo codifica um polipeptídeo tendoatividade de endoglucanase. Em outro aspecto preferido, a sonda de ácidonucleico é a região de codificação de polipeptídeo maduro contida emplasmídeo pCIC486 que está contido em E. coli NRRL B-30904.
Em outro aspecto preferido, a sonda de ácido nucleico é aseqüência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 9. Em outroaspecto preferido, a sonda de ácido nucleico contêm os nucleotídeos 73 a1468 de SEQ ID NO: 9. Em outro aspecto preferido, a sonda de ácidonucleico é uma seqüência de polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo deSEQ ID NO: 10, ou uma subseqüência do mesmo. Em outro aspectopreferido, a sonda de ácido nucleico é SEQ ID NO: 9. Em outro aspectopreferido, a sonda de ácido nucleico é a seqüência de polinucleotídeo contidaem plasmídeo pPBCeI5C que está contido em E. coli NRRL B-30900N, emque a seqüência de polinucleotídeo do mesmo codifica um polipeptídeo tendoatividade de endoglucanase. Em outro aspecto preferido, a sonda de ácidonucleico é a região de codificação de polipeptídeo maduro contida emplasmídeo pPBCeI5C que está contido em E. coli NRRL B-30900N.
Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos emcomprimento, condições de estringência muito alta a muito baixa sãodefinidas como pré-hibridização e hibridização a 42°C em 5X SSPE, 0,3% deSDS, 200 μg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado e cisalhado, e ou25% de formamida para estringências baixa e muito baixa, 35% de formamidapara estringências média e meio alta, ou 50% de formamida para estringênciasalta e muito alta, seguindo procedimentos padrões de Southern blottingdurante 12 a 24 horas de modo ótimo.
Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos emcomprimento, o material de veículo é finalmente lavado três vezes cadadurante 15 minutos usando 2X SSC, 0,2% de SDS preferivelmente pelomenos a 45°C (estringência muito baixa), mais preferivelmente pelo menos a50°C (estringência baixa), mais preferivelmente pelo menos a 55°C(estringência média), mais preferivelmente pelo menos a 60°C (estringênciamédia a alta), ainda mais preferivelmente pelo menos a 65°C (estringênciaalta), e o mais preferivelmente pelo menos a 70°C (estringência muito alta).
Para sondas curtas que têm de cerca de 15 nucleotídeos e cercade 70 nucleotídeos em comprimento, condições de estringência são definidascomo pré-hibridização, hibridização, e lavagem pós-hibridização a cerca de5°C a cerca de IO0C abaixo do Tm calculado usando o cálculo de acordo comBolton e McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 48:1390) em 0,9 M de NaCl, 0,09 M de Tris-HCl pH 7,6, 6 mM deEDTA, 0,5% de NP-40, IX de solução de Denhardt, 1 mM pirofosfato desódio, 1 mM fosfato monobásico de sódio, 0,1 mM ATP, e 0,2 mg de RNA delevedura por ml seguindo procedimentos padrões de Southern blotting durante12 a 24 horas de modo ótimo.
Para sondas curtas que têm cerca de 15 nucleotídeos a cerda de70 nucleotídeos de comprimento, o material de veículo é lavado uma vez em6X SCC mais 0,1% de SDS durante 15 minutos e duas vezes cada durante 15minutos usando 6X SSC a 5°C a 10°C abaixo o Tm calculado.
Em um terceiro aspecto, a presente invenção refere-se apolipeptídeos isolados codificados por polinucleotídeos compreendendo ouconsistindo de seqüências de nucleotídeos que têm um grau de identidadepara a seqüência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3,SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, ou SEQ ID NO: 9 de pelo menos 60%,preferivelmente pelo menos 65%, mais preferivelmente pelo menos 70%,mais preferivelmente pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelomenos 90%, ainda mais preferivelmente pelo menos 95%, e o maispreferivelmente pelo menos 97% de identidade, que codifica um polipeptídeoativo. Em um aspecto preferido, a seqüência de codificação de polipeptídeomaduro contêm os nucleotídeos 67 a 1185 de SEQ ID NO: 3. Em outroaspecto preferido, a seqüência de codificação de polipeptídeo maduro contêmos nucleotídeos 84 a 1229 de SEQ ID NO: 5. Em outro aspecto preferido, aseqüência de codificação de polipeptídeo maduro contêm os nucleotídeos 77 a1300 de SEQ ID NO: 7. Em outro aspecto preferido, a seqüência decodificação de polipeptídeo maduro contêm os nucleotídeos 73 a 1468 deSEQ ID NO: 9. Ver seção de polinucleotídeo aqui.
Em um quarto aspecto, a presente invenção refere-se avariantes artificiais compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserçãode um ou mais aminoácidos do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4, SEQID NO: 6, SEQ ID NO: 8, ou SEQ ID NO: 10; ou uma seqüência homólogado mesmo. Preferivelmente, as mudanças de aminoácido são de uma naturezamenor, isto é as substituições de aminoácido conservadoras ou inserções quenão afetam significantemente da duplicação e/ou atividade da proteína;deleções pequenas, tipicamente de um a cerca de 30 aminoácidos; extensõespequenas de amino ou carboxil-terminal, como um resíduo de metioninaamino-terminal; um peptídeo ligador pequeno de até cerca de 20-25 resíduosou uma extensão pequena que facilita a purificação por mudança da cargalíquida ou outra função, como um trato poli-histidina, um epítopo antigênicoou um domínio de ligação.
Exemplos de substituições conservadoras estão dentro dogrupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidosacídicos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutaminae asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina),aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina), e aminoácidospequenos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). Substituições deaminoácido que não alteram geralmente a atividade específica são conhecidasna técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R. L. Hill, 1979, In,The Proteins, Academic Press, New York. As mudanças de ocorrência maiscomuns são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Asn/Thr, Ser/Asn,Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Vai,Ala/Glu, e Asp/Gly.
Além dos 20 aminoácidos padrões, aminoácidos não padrões(como 4-hidroxiprolina, 6-N-metil lisina, ácido 2-aminoisobutírico, isovalina,e alfa-metil serina) podem ser substituídos com resíduos de aminoácido de umpolipeptídeo de tipo selvagem. Um número limitado de aminoácidos nãoconservadores, aminoácidos que não são codificados pelo código genético, eaminoácidos desnaturados podem ser substituídos por resíduos deaminoácido. "Aminoácidos desnaturados" foram modificados após a síntesede proteína, e/ou têm uma estrutura química em sua(s) cadeia (s) lateral (ais)diferente (s) das dos aminoácidos padrões. Aminoácidos desnaturados podemser quimicamente sintetizados, e preferivelmente, são comercialmentedisponíveis, e incluem ácido pipecólico, ácido tiazolidina carboxílico,dehidroprolina, 3- e 4-metilprolina, e 3,3-dimetilprolina.
Alternativamente, as mudanças de aminoácido são de talnatureza que as propriedades físico-químicas do polipeptídeos são alteradas.Por exemplo, as mudanças de aminoácido podem melhorar a estabilidadetérmica do polipeptídeo, alterar a especificidade do substrato, mudar o pHótimo, e outros.
Aminoácidos essenciais no polipeptídeo parental podem seridentificados de acordo com os procedimentos conhecidos na arte, comomutagênese sítio-dirigida ou mutagênese de varredura de alanina(Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081 - 1085). Na última técnica,mutações de alanina única são introduzidas em cada resíduo na molécula, e asmoléculas mutantes resultantes são testadas para atividade biológica (isto é,atividade de endoglucanase) para identificar resíduos de aminoácido que sãocríticos para a atividade da molécula. Ver também, Hilton et al., 1996, J. Biol.Chem. 271: 4699 - 4708. O sítio ativo da enzima ou outra interação biológicatambém pode ser determinado por análise física de estrutura, comodeterminado por tais técnicas como ressonância magnética nuclear,cristalografia, difração de elétrons, ou rotulação de fotoafinidade, em conjuntocom mutação de aminoácidos de sítio de contato putativo. Ver, por exemplo,de Vos et al., 1992, Science 255: 306 - 312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol.224: 899 - 904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59 - 64. Asidentidades de aminoácidos essenciais também podem ser deduzidas daanálise de identidades com polipeptídeos que estão relacionados com umpolipeptídeo de acordo com a invenção.
Substituições de aminoácido único ou múltiplo podem serfeitas e testadas usando métodos conhecidos de mutagênese, recombinação,e/ou embaralhamento, seguido por um procedimento de triagem relevante,como os descritos por Reidhaar-Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53 - 57;Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 2152 - 2156; WO95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluemPCR propenso a erros, apresentação na superfície de fagos (por exemplo,Lowman et al., 1991, Biochem. 30: 10832 - 10837; patente U.S. 5.223.409;WO 92/06204), e mutagênese região -dirigida (Derbyshire et al., 1986, Gene46: 145; Ner etal., 1988, DNA 7: 127).
Métodos de mutagênese/ embaralhamento podem sercombinados com métodos de triagem automatizados, de elevada produção,para detectar a atividade de polipeptídeos mutagenizados clonadosexpressados por células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology17: 893 - 896). Moléculas de DNA mutagenizadas que codificampolipeptídeos ativos podem ser recuperadas das células hospedeiras erapidamente seqüenciadas usando métodos padrões na arte. Estes métodospermitem a determinação rápida da importância de resíduos de aminoácidoindividuais em um polipeptídeo de interesse, e podem ser aplicados empolipeptídeos de estrutura desconhecida.
O número total de substituições de aminoácido, deleções e/ouinserções do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ IDNO: 8, ou SEQ ID NO: 10, como aminoácidos 17 a 389 de SEQ ID NO: 2,aminoácidos 16 a 397 de SEQ ID NO: 6, aminoácidos 22 a 429 de SEQ IDNO: 8, ou aminoácidos 25 a 421 de SEQ ID NO: 10, é 10, preferivelmente 9,mais preferivelmente 8, mais preferivelmente 7, mais preferivelmente nomáximo 6, mais preferivelmente 5, mais preferivelmente 4, ainda maispreferivelmente 3, o mais preferivelmente 2, e ainda o mais preferivelmente 1.
Fontes de Polipeptídeos Tendo Atividade de EndogIucanase
Um polipeptídeo da presente invenção pode ser obtido a partirde microorganismos de qualquer gênero. Para os fins da presente invenção, otermo '"obtido a partir de" como usado aqui em conexão com uma dada fontedeve significar que o polipeptídeo codificado por uma seqüência denucleotídeo é produzido pela fonte ou por uma cepa em que a seqüência denucleotídeos a partir da fonte foi inserida. Em um aspecto preferido, opolipeptídeo obtido de uma fonte dada é secretado extracelularmente.
Um polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase da presenteinvenção pode ser um polipeptídeo bacteriano. Por exemplo, o polipeptídeopode ser um polipeptídeo bacteriano gram-positivo como um polipeptídeo deBacillus, Streptococcus, Streptomyees, Staphylocoeeus, Enteroeoceus,Lactobacillus, Lactoeoceus, Clostridium, Geobaeillus, ou Oceanobacillustendo atividade [enzima], ou um polipeptídeo bacteriano gram-negativo comoum de E. eoli, Pseudomonas, Salmonella, Campylobaeter, Helicobaeter,Flavobaeterium, Fusobaeterium, llyobaeter, Neisseria, ou polipeptídeo deUreaplasma tendo atividade de endoglucanase.
Em um aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo deBacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaeiens, Bacillus brevis, Bacilluscirculans, Bacillus ciausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacilluslautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacilluspumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, ou Bacillusthuringiensis tendo atividade de endoglucanase.
Em outro aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeode Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis,ou Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus tendo atividade deendoglucanase.
Em outro aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeode Streptomyees aehromogenes, Streptomyees avermitilis, Streptomyeescoelieolor, Streptomyees griseus, ou Streptomyees lividans tendo atividade deendoglucanase.
Um polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase da presenteinvenção também pode ser um polipeptídeo de fungo, e mais preferivelmenteum polipeptídeo de levedura como um polipeptídeo de Candida,Kluyveromyces, Piehia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrowiatendo atividade de endoglucanase; ou mais preferivelmente um polipeptídeode fungo filamentoso como um polipeptídeo de Aeremonium, Aspergillus,Aureobas idium, Chrysosporium, Cryptoeoceus, Filibasidium, Fusarium,Humieola, Magnaporthe, Mueor, Myeeliophthora, Neoeallimastix,Neurospora, Paeeilomyees, Penieillium, Piromyees, Sehizophyllum,Talaromyees, Thermoaseus, Thielavia, Tolypoeladium, ou Triehoderma tendoatividade de endoglucanase.
Em um aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo deSaccharomyees earlsbergensis, Saccharomyces eerevisiae, Saccharomycesdiastatieus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri,Saccharomyces norbensis, ou Saccharomyees oviformis tendo atividade deendoglucanase.
Em outro aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeode Aspergillus aeuleatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus,Aspergillus foetidus, Aspergillus japonieus, Aspergillus nidulans, Aspergillusniger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporiumlueknowense, Chrysosporium tropieum, Chrysosporiummerdarium, Chrysosporium inops, Chrysosporium pannieola,Chrysosporium queenslandieum, Chrysosporium zonatum, Fusariumbaetridioides, Fusarium eerealis, Fusarium erookwellense, Fusariumeulmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusariumheterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusariumretieulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusariumsareoehroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusariumtorulosum, Fusarium triehotheeioides, Fusarium venenatum, Humicolainsolens, Humieola lanuginosa, Mueor miehei, Myceliophthora thermophila,Neurospora crassa, Thielavia aehromatica, Thielavia albomyees, Thielaviaalbopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia mierospora,Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia spededonium, Thielaviasetosa, Thielavia subthermophifa, Thielavia terrestris, Triehodermaharzianum, Triehoderma koningii, Trichoderma longibraehiatum,Triehoderma reesei, ou Triehoderma viride tendo atividade de endoglucanase.
Em outro aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeode Penieillium brasilianum, Penieillium eamembertii, Penieilliumeapsulatum, Penicillium ehrysogenum, Penicillium eitreonigrum, Penicilliumeitrinum, Penicillium elaviforme, Penicillium corylophilum, Penicilliumerustosum, Penicillium digitatum, Penicillium expansum, Penieilliumfuniculosum, Penieillium glabrum, Penicillium granulatum, Penicilliumgriseofulvum, Penicillium islandieum, Penicillium italieum, Penieilliumjanthinellum, Penicillium lividum, Penieillium megasporum, Penicilliummelinii, Penieillium notatum, Penicillium oxalieum, Penicillium puberulum,Penieillium purpureseens, Penieillium pururogenum, Penicillium roquefortii,Penicillium rugulosum, Penicillium spinulosum, Penicillium waksmanii, ouPenicillium sp. tendo atividade de endoglucanase.
Em um aspecto mais preferido, o polipeptídeo é umpolipeptídeo de Myceliophthora thermophila, e o mais preferivelmente umpolipeptídeo Myeeliophthora thermophila CBS 111.65, por exemplo, opolipeptídeo de SEQ ED NO: 4, ou o polipeptídeo maduro do mesmo.
Em outro aspecto mais preferido, o polipeptídeo é umpolipeptídeo de basidiomicete CBS 495.95, por exemplo, o polipeptídeo deSEQ ID NO: 6, ou o polipeptídeo maduro do mesmo.
Em outro aspecto mais preferido, o polipeptídeo é umpolipeptídeo de basidiomiceto CBS 494.95, por exemplo, o polipeptídeo deSEQ ID NO: 8, ou o polipeptídeo maduro do mesmo.
Em outro aspecto mais preferido, o polipeptídeo é umpolipeptídeo de Penicillium brasilianum, e o mais preferivelmente umpolipeptídeo de Penicillium brasilianum IBT 20888, por exemplo, opolipeptídeo de SEQ ID NO: 10, ou o polipeptídeo maduro do mesmo.
Será entendido que para a espécie anteriormente mencionada ainvenção engloba tanto os estados perfeitos como os imperfeitos, e outrosequivalentes taxonômicos, por exemplo, anamorfos, sem levar em conta onome da espécie pela qual eles são conhecidos. O versado na técnica iráfacilmente reconhecer a identidade de equivalentes apropriados.
Cepas destas espécies são facilmente acessíveis para o públicoem várias coleções de cultura, como American Type Culture Collection(ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), e AgriculturalResearch Service Patent Culture Collection, Northern Regional ResearchCenter (NRRL).
Além disso, tais polipeptídeos podem ser identificados eobtidos de outras fontes incluindo microorganismos isolados de natureza (porexemplo, solo, compostagem, água, etc.) usando as sondas mencionadasacima. Técnicas para isolar os microorganismos de habitais naturais são bemconhecidas na arte. O polinucleotídeo pode então ser obtido por uma triagemsimilar de um cDNA genômico ou biblioteca deste microorganismo. Uma vezuma seqüência de polinucleotídeo codificando um polipeptídeo foi detectadacom a (s) sonda (s), o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado porutilização de técnicas que são bem conhecidas para o versado na técnica (ver,por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra).
Polipeptídeos da presente invenção também incluempolipeptídeos fiisionados ou polipeptídeos de fusão cliváveisem que outro polipeptídeo é fusionado no N-terminal ou o C-término dopolipeptídeo ou fragmento do mesmo. Um polipeptídeo fusionado éproduzido por fusão de uma seqüência de nucleotídeo (ou uma porção domesmo) codificando outro polipeptídeo para uma seqüência de nucleotídeo(ou uma porção do mesmo) da presente invenção. Técnicas para produzir ospolipeptídeos de fusão são conhecidas na arte, e incluem ligar a seqüência decodificação codificando os polipeptídeos de modo elas ficam na armação e aque expressão do polipeptídeo fusionado está sob o controle do mesmopromotor (s) e terminador.
Um polipeptídeo de fusão pode ainda compreender um sítio declivagem. Quando da secreção da proteína de fusão, o sítio é clivadoliberando o polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase da proteína defusão.
Exemplos de sítios de clivagem incluem, mas não sãolimitados a um sítio de Kex2 que codifica o dipeptídeo Lys-Arg (Martin et al.,2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568 - 76; Svetina et at., 2000, J.Biotechnol. 76: 245 - 251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ.Mierobiol 63: 3488 - 3493; Ward et al, 1995, Bioteehnology 13: 498 - 503; eContreras et al., 1991, Bioteehnology 9: 378 - 381), um sítio Ile-(Glu ou Asp)-Gly-Arg, que é clivado por uma protease de fator Xa após o resíduo dearginina (Eaton et al, 1986, Bioehem. 25: 505 - 512); um sítio Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, que é clivado por uma enteroquinase após a lisina (Collins-Racie etal, 1995, Bioteehnology 13: 982 - 987); um sítio His-Tyr-Glu ou sítio His-Tyr-Asp, que é clivado por Genenase I (Carter et al, 1989, Proteins:Strueture, Funetion, and Geneties 6: 240 - 248); um sítio Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser, que é clivado por trombina após o Arg (Stevens, 2003, DrugDiseovery World 4: 35- 48); um sítio Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly, que éclivado por protease TEV após o Gln (Stevens, 2003, supra)·, e um sítio Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro, que é clivado por uma forma geneticamenteengenheirada de 3C protease de rinovírus humano após o Gln (Stevens, 2003,supra).
Polinucleotídeos
A presente invenção também refere-se a um polinucleotídeoisolado compreendendo ou consistindo de uma seqüência de nucleotídeo quecodifica um polipeptídeo da presente invenção tendo atividade deendoglucanase.
Em um aspecto preferido, a seqüência de nucleotídeocompreende ou consiste de SEQ ID NO: 3. Em outro aspecto mais preferido,a seqüência de nucleotídeo compreende ou consiste da seqüência contida emplasmídeo pCIC161 que está contido em E. coli NRRL B-30902. Em outroaspecto preferido, a seqüência de nucleotídeo compreende ou consiste daregião de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3. Em outroaspecto preferido, a seqüência de nucleotídeo compreende ou consiste denucleotídeos 67 a 1185 de SEQ ID NO: 3. Em outro aspecto mais preferido, aseqüência de nucleotídeo compreende ou consiste da região de codificação depolipeptídeo maduro contida em plasmídeo pCIClól que está contido em E.coli NRRL B-30902. A presente invenção também engloba as seqüências denucleotídeos que codificam polipeptídeos compreendendo ou consistindo daseqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 ou o polipeptídeo maduro domesmo, que difere de SEQ ID NO: 3 ou a seqüência de codificação depolipeptídeo maduro do mesmo por virtude da degeneração do códigogenético. A presente invenção também refere-se as subseqüências de SEQ IDNO: 3 que codifica fragmentos de SEQ ID NO: 4 que tem atividade deendoglucanase.
Em outro aspecto preferido, a seqüência de nucleotídeocompreende ou consiste de SEQ ID NO: 5. Em outro aspecto mais preferido,a seqüência de nucleotídeo compreende ou consiste da seqüência contida emplasmídeo pCIC453 que está contido em E. coli NRRL B-30903. Em outroaspecto preferido, a seqüência de nucleotídeo compreende ou consiste daregião de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5. Em outroaspecto preferido, a seqüência de nucleotídeo compreende ou consiste denucleotídeos 84 a 1229 de SEQ ID NO: 5. Em outro aspecto mais preferido, aseqüência de nucleotídeo compreende ou consiste da região de codificação depolipeptídeo maduro contida em plasmídeo pCIC453 que está contido em E.coli NRRL B-30903. A presente invenção também engloba as seqüências denucleotídeos que codifica polipeptídeos compreendendo ou consistindo daseqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 6 ou o polipeptídeo maduro domesmo, que difere de SEQ ID NO: 5 ou a seqüência de codificação depolipeptídeo maduro do mesmo por virtude da degeneração do códigogenético. A presente invenção também refere-se às subseqüências de SEQ IDNO: 5 que codifica fragmentos de SEQ ID NO: 6 que tem atividade deendoglucanase.
Em outro aspecto preferido, a seqüência de nucleotídeocompreende ou consiste de SEQ ED NO: 7. Em outro aspecto mais preferido,a seqüência de nucleotídeo compreende ou consiste da seqüência contida emplasmídeo pCIC486 que está contido em E. coli NRRL B-30904. Em outroaspecto preferido, a seqüência de nucleotídeo compreende ou consiste daregião de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 7. Em outroaspecto preferido, a seqüência de nucleotídeo compreende ou consiste denucleotídeos 77 a 1300 de SEQ ID NO: 7. Em outro aspecto mais preferido, aseqüência de nucleotídeo compreende ou consiste da região de codificação dopolipeptídeo maduro contida em plasmídeo pCIC486 que está contido em E.coli NRRL B-30904. A presente invenção também engloba seqüências denucleotídeos que codificam polipeptídeos compreendendo ou consistindo daseqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 8 ou o polipeptídeo maduro domesmo, que difere de SEQ ID NO: 7 ou a seqüência de codificação depolipeptídeo maduro do mesmo por virtude da degeneração do códigogenético. A presente invenção também refere-se às subseqüências de SEQ IDNO: 7 que codificam fragmentos de SEQ ID NO: 8 quem tem atividade deendoglucanase.
Em outro aspecto preferido, a seqüência de nucleotídeocompreende ou consiste de SEQ ID NO: 9. Em outro aspecto mais preferido,a seqüência de nucleotídeo compreende ou consiste da seqüência contida emplasmídeo pPBCel5C que está contido em E. coli NRRL B-30900N. Em outroaspecto preferido, a seqüência de nucleotídeo compreende ou consiste daregião de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 9. Em outroaspecto preferido, a seqüência de nucleotídeo compreende ou consiste denucleotídeos 73 a 1488 de SEQ ID NO: 9. Em outro aspecto mais preferido, aseqüência de nucleotídeo compreende ou consiste da região de codificação depolipeptídeo maduro contida em plasmídeo pPBCel5C que está contido em E.coli NRRL B-30900N. A presente invenção também engloba seqüências denucleotídeos que codificam polipeptídeos compreendendo ou consistindo daseqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 ou o polipeptídeo maduro domesmo, que difere de SEQ ID NO: 9 ou a seqüência de codificação depolipeptídeo maduro do mesmo por virtude da degeneração do códigogenético. A presente invenção também refere-se às subseqüências de SEQ IDNO: 9 que codificam fragmentos de SEQ ID NO: 10 que tem atividade deendoglucanase.
A presente invenção também refere-se a polinucleotídeosmutantes compreendendo ou consistindo de pelo menos uma mutação em umaseqüência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, SEQ IDNO: 5, SEQ ID NO: 7, ou SEQ ID NO: 9, em que a seqüência de nucleotídeomutante codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6,SEQ ID NO: 8, ou SEQ ID NO: 10. Em um aspecto preferido, o polipeptídeomaduro contêm os aminoácidos 17 a 389 de SEQ ID NO: 4. Em outro aspectopreferido, o polipeptídeo maduro contêm os aminoácidos 16 a 397 de SEQ IDNO: 6. Em outro aspecto preferido, o polipeptídeo maduro contêm osaminoácidos 22 a 429 de SEQ ID NO: 8. Em outro aspecto preferido, opolipeptídeo maduro contêm os aminoácidos 25 a 421 de SEQ ID NO: 10.
As técnicas usadas para isolar ou clonar um polinucleotídeocodificando um polipeptídeo são conhecidas e incluem isolamento de DNAgenômico, preparação de cDNA, ou uma combinação dos mesmos. Aclonagem dos polinucleotídeos da presente invenção a partir deste DNAgenômico pode se efetuada, por exemplo, por uso da reação de cadeiapolimerase bem conhecida (PCR) ou triagem de anticorpo de bibliotecas deexpressão para detectar fragmentos de DNA clonados com aspectosestruturais compartilhados. Ver, por exemplo, Innis et al., 1990, P CR: AGuide to Methods and Application, Academic Press, New York. Outrosprocedimentos de amplificação de ácido nucleico como reação de cadeialigase (LCR), transcrição ativada ligada (LAT) e amplificação com base naseqüência de nucleotídeo (NASBA) podem ser usados. Os polinucleotídeospodem ser clonados a partir de uma cepa de Myceliophthora thermophilaCBS 117.65, basidiomicete CBS 494.95, ou basidiomicete CBS 495.95, ououtra ou um organismo relacionado e assim, por exemplo, pode ser umaespécie alélica ou variante da região de codificação de polipeptídeo daseqüência de nucleotídeo.
A presente invenção também refere-se a polinucleotídeosisolados compreendendo ou consistindo de seqüências de nucleotídeos quetem um grau de identidade para a seqüência de codificação de polipeptídeomaduro de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, ou SEQ ID NO: 9de pelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 65%, mais preferivelmentepelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 75%, maispreferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%,mais preferivelmente pelo menos 90%, ainda mais preferivelmente pelomenos 95%, e o mais preferivelmente pelo menos 97% de identidade, quecodifica um polipeptídeo ativo. Em um aspecto preferido, a seqüência decodificação de polipeptídeo maduro contêm os nucleotídeos 67 a 1185 deSEQ ID NO: 3. Em outro aspecto preferido, a seqüência de codificação depolipeptídeo maduro contêm os nucleotídeos 84 a 1229 de SEQ ID NO: 5. Emoutro aspecto preferido, a seqüência de codificação de polipeptídeo madurocontêm os nucleotídeos 77 a 1300 de SEQ ID NO: 7. Em outro aspectopreferido, a seqüência de codificação de polipeptídeo maduro contêm osnucleotídeos 73 a 1488 de SEQ ID NO: 9.
Modificação de uma seqüência de nucleotídeo codificando umpolipeptídeo da presente invenção pode ser necessária para a síntese depolipeptídeos substancialmente similares para o polipeptídeo. O termo"substancialmente similar" para o polipeptídeo refere-se às formas não deocorrência natural do polipeptídeo. Estes polipeptídeos podem diferir emalgum modo engenheirado do polipeptídeo isolado de sua fonte nativa, porexemplo, variantes artificiais que diferem na atividade específica,termoestabilidade, pH ótimo, ou outros. A seqüência variante pode serconstruída com base na seqüência de nucleotídeos apresentada como a regiãode codificação de polipeptídeo de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ IDNO: 7, ou SEQ ID NO: 9, por exemplo, uma subseqüência do mesmo, e/oupor introdução de substituições de nucleotídeo que não dão lugar a outraseqüência de aminoácido do polipeptídeo codificado pela seqüência denucleotídeo, mas que corresponde ao uso de códon do organismo hospedeirodestinado para a produção da enzima, ou por introdução de substituições denucleotídeo que podem dar lugar a uma seqüência de aminoácido diferente.Para uma descrição geral de substituição de nucleotídeo, ver, por exemplo,Ford et al., 1991, Protein Expression andPurification 2: 95 - 107.
Será evidente para o versado na técnica que tais substituiçõespodem ser feitas fora das regiões críticas na função da molécula e assimresultar em um polipeptídeo ativo. Resíduos de aminoácido essenciais para aatividade do polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo isolado dainvenção, e assim preferivelmente não sujeitos à substituição, podem seridentificados de acordo com os procedimentos conhecidos na arte, comomutagênese sítio-dirigida ou mutagênese de varredura de alanina (ver, porexemplo, Cunningham e Wells, 1989, supra). Na última técnica, mutações sãointroduzidas em cada resíduo positivamente carregado na molécula, e asmoléculas mutantes resultantes são testadas para atividade de endoglucanasepara identificar os resíduos de aminoácido que são críticos para a atividade damolécula. Sítios de interação de substrato-enzima também podem serdeterminados por análise da estrutura tri-dimensional como determinado portais técnicas como análise de ressonância magnética nuclear, cristalografia ourotulação de fotoafinidade (ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, supra:Smith et al., 1992, supra; Wlodaver et al., 1992, supra).
A presente invenção também refere-se a polinucleotídeosisolados codificando um polipeptídeo da presente invenção, que hibridiza sobcondições de estringência muito baixa, preferivelmente condições deestringência baixa, mais preferivelmente condições de estringência média,mais preferivelmente condições de estringência média a alta, ainda maispreferivelmente condições de estringência alta, e o mais preferivelmentecondições de estringência muito alta com (i) a seqüência de codificação depolipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, ouSEQ ID NO: 9, (ii) a seqüência de cDNA contida em uma seqüência decodificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 9 ou aseqüência de DNA genômico compreendendo a seqüência de codificação depolipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7, ou (iii) umfilamento complementar de (i) ou (ii); ou variantes alélicas e subseqüênciasdos mesmos (Sambrook et al., 1989, supra), como definido aqui. Em umaspecto preferido, a seqüência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQID NO: 3 contêm os nucleotídeos 67 a 1185. Em outro aspecto preferido, aseqüência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5 contêmos nucleotídeos 84 a 1229. Em outro aspecto preferido a seqüência decodificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 7 contêm os nucleotídeos77 a 1300. Em outro aspecto preferido, a seqüência de codificação depolipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 9 contêm os nucleotídeos 73 a 1768.
A presente invenção também refere-se a polinucleotídeosisolados obtidos por (a) hibridizar uma população de DNA sob condições deestringência muito baixa, baixa, média, média a alta, alta, ou muito alta com(i) a seqüência de codificação de polipeptídeo maduro SEQ ID NO: 3, SEQID NO: 5, SEQ ID NO: 7, ou SEQ ID NO: 9, (ii) a seqüência de cDNAcontida em uma seqüência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ IDNO: 3 ou SEQ ID NO: 9 ou a seqüência de DNA genômico compreendendo aseqüência de codificação de polipeptídeo maduro SEQ ID NO: 5 ou SEQ IDNO: 7, ou (iii) um filamento complementar de (i) ou (ii); e (b) isolamento dopolinucleotídeo de hibridização, que codifica um polipeptídeo tendo atividadede endoglucanase. Em um aspecto preferido, a seqüência de codificação depolipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 contêm os nucleotídeos 67 a 1185. Emoutro aspecto preferido, a seqüência de codificação de polipeptídeo madurode SEQ ID NO: 5 contêm os nucleotídeos 84 a 1229. Em outro aspectopreferido, a seqüência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO:7 contêm os nucleotídeos 77 a 1300. Em outro aspecto preferido, a seqüênciade codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 9 contêm osnucleotídeos 73 a 1768.
Construções de Acido Nucleico
A presente invenção também refere-se a construções de ácidonucleico compreendendo um polinucleotídeo isolado da presente invençãoligado operativamente a uma ou mais seqüências de controle que dirigem aexpressão da seqüência de codificação em uma célula hospedeira apropriadasob condições compatíveis com as seqüências de controle.
Um polinucleotídeo isolado codificando um polipeptídeo dapresente invenção pode ser manipulado em uma variedade de modos paraprover a expressão do polipeptídeo. Manipulação da seqüência depolinucleotídeo antes de sua inserção em um vetor pode ser desejável ounecessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificar asseqüências de polinucleotídeos utilizando métodos de DNA recombinantessão bem conhecidas na arte.
A seqüência de controle pode ser uma seqüência promotoraapropriada, uma seqüência de nucleotídeo que é reconhecida por uma célulahospedeira para expressão de um polinucleotídeo codificando umpolipeptídeo da presente invenção. A seqüência promotora contém seqüênciasde controle transcripcional que mediam a expressão do polipeptídeo. Opromotor pode ser qualquer seqüência de nucleotídeo que mostra atividadetranscripcional na célula hospedeira de escolha incluindo promotoresmutantes, truncados, e híbridos, e pode ser obtido a partir de genescodificando polipeptídeos extracelulares ou intracelulares ou homólogos ouheterólogos na célula hospedeira.
Exemplos de promotores apropriados para dirigir a transcriçãodas construções de ácido nucleico da presente invenção, especialmente emuma célula bacteriana hospedeira, são os promotores obtidos a partir dooperon de E. coli lac, gene de agarase (dagA) de Streptomyces coelicolor,gene de levansucrase (sacB) de Bacillus subtilis, gene de alfa-amilase (amyL)de Bacillus lieheniformis, gene de amilase maltogênica (amyM) de Bacillusstearothermophilus, gene de alfa-amilase (amyQ) de Bacillusamyloliquefaeiens, gene de penicilinase (penP) de Bacillus lieheniformis,genes de xylA e xylB de Bacillus subtilis, e gene de beta-lactamaseprocariótica (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proeeedings of the NationalAeademy of Sciences USA 75: 3727 - 3731), assim como o promotor tac(DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA80: 21 - 25). Outros promotores são descritos em "Useful proteins fromrecombinant bactéria" in Scientific American, 1980, 242: 74 - 94; e emSambrook et al., 1989, supra.
Exemplos de promotores apropriados para dirigir a transcriçãodas construções de ácido nucleico da presente invenção em uma célulahospedeira de fungo filamentoso são promotores obtidos a partir dos genes deamilase TAKA de Aspergillus oryzae, proteinase aspártica de Rhizomucormiehei, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilase de ácido estávelde Aspergillus niger, glucoamilase (glaA) de Aspergillus niger ou Aspergillusawamori, lipase de Rhizomueor miehei, protease alcalina de Aspergillusoryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae, acetamidase deAspergillus nidulans, amiloglucosidase de Fusarium venenatum (WO00/56900), Daria de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Quinn deFusarium venenatum (WO 00/56900), protease de tipo tripsina de Fusariumoxysporum (WO 96/00787), beta-glucosidase de Trichoderma reesei,celobiohidrolase I de Trichoderma reesei, celobiohidrolase II de Trichodermareesei, endoglucanase I de Trichoderma reesei, endoglucanase II deTriehoderma reesei, endoglucanase III de Trichoderma reesei, endoglucanaseIV de Triehoderma reesei, endoglucanase V de Triehoderma reesei, xilanase Ide Triehoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, beta-xilosidase deTriehoderma reesei, assim como o promotor NA2-tpi (um híbrido dospromotores dos genes para alfa-amilase neutra de Aspergillus niger e triosefosfato isomerase de Aspergillus oryzae); e promotores mutante, truncados, ehíbridos dos mesmos.
Em um hospedeiro de levedura, promotores utilizáveis sãoobtidos a partir dos genes para enolase de Saceharomyces eerevisiae (ENO-1), galactoquinase (GALl) de Saccharomyees eerevisiae,dehidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato dehidrogenase de álcool deSaccharomyees eerevisiae (ADH1, ADH2/GAP), triose fosfato isomerase(TPI) de Saccharomyees eerevisiae, metalotioneína (CUPl) deSaccharomyees eerevisiae, e 3-fosfoglicerato quinase de Saccharomyceseerevisiae. Outros promotores utilizáveis para células hospedeiras de levedurasão descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423 - 488.
A seqüência de controle também pode ser uma seqüência determinador de transcrição apropriada, uma seqüência reconhecida por umacélula hospedeira para terminar a transcrição. A seqüência do terminador éligada operativamente no término 3' da seqüência de nucleotídeo codificandoo polipeptídeo. Qualquer terminador que é funcional na célula hospedeira deescolha pode ser usado na presente invenção.
Os terminadores preferidos para células hospedeiras de fungofilamentoso são obtidos dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae,glucoamilase de Aspergillus niger, antranilato sintase de Aspergillus nidulans,alfa-glucosidase de Aspergillus niger, e protease de tipo tripsina de Fusariumoxysporum.
Os terminadores preferidos para células hospedeiras delevedura são obtidos dos genes para enolase de Saccharomyces eerevisiae,citocromo C (CYCl) de Saccharomyees eerevisiae, e gliceraldeído-3-fosfatodehidrogenase de Saccharomyees eerevisiae. Outros terminadores utilizáveispara células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992,supra.
A seqüência de controle também pode ser uma seqüência líderapropriada, uma região não traduzida de um mRNA que é importante para atradução pela célula hospedeira. A seqüência líder é ligada operativamente notérmino 5' da seqüência de nucleotídeo codificando o polipeptídeo. Qualquerseqüência líder, isto é funcional na célula hospedeira de escolha, pode serusada na presente invenção.
Os líderes preferidos para células hospedeiras de fungofilamentoso são obtidos a partir dos genes para TAKA amilase de Aspergillusoryzae e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans.
Os líderes apropriados para células hospedeiras de levedurasão obtidos a partir dos genes para enolase de Saccharomyees eerevisiae(ENO-1), 3-fosfoglicerato quinase de Saccharomyees eerevisiae, alfa-fator deSaccharomyees eerevisiae, e dehidrogenase/gliceraldeído-3-fosfatodehidrogenase de álcool (ADH2/GAP) de Saccharomyces eerevisiae.
A seqüência de controle também pode ser uma seqüência depoliadenilação, uma seqüência ligada operativamente no término 3' daseqüência de nucleotídeo e que, quando transcrita, é reconhecida pela célulahospedeira como um sinal para adicionar resíduos poliadenosina para mRNAtranscrito. Qualquer seqüência de poliadenilação que é funcional na célulahospedeira de escolha pode ser usada na presente invenção.
As seqüências de poliadenilação preferidas para célulashospedeiras de fungos filamentosos são obtidas dos genes para TAKAamilase de Aspergillus oryzae, glucoamilase de Aspergillus niger, antranilatosintase de Aspergillus nidulans, protease de tipo tripsina de Fusariumoxysporum, e alfa-glucosidase de Aspergillus niger.
As seqüências de poliadenilação utilizáveis para célulashospedeiras de levedura são descritas por Guo e Sherman, 1995, MolecularCellularBiology 15: 5983 - 5990.
A seqüência de controle também pode ser uma região decodificação de peptídeo sinal que codifica para uma seqüência de aminoácidoligada no término amino de um polipeptídeo e dirige o polipeptídeocodificado na via secretória da célula. A extremidade 5' da seqüência decodificação da seqüência de nucleotídeo pode inerentemente conter umaregião de codificação de peptídeo sinal naturalmente ligado em uma matriz deleitura da tradução com o segmento da região de codificação que codifica opolipeptídeo secretado. Alternativamente, a extremidade 5' da seqüência decodificação pode conter uma região de codificação de peptídeo sinal que éestranho para a seqüência de codificação. A região de codificação de peptídeosinal estranho pode ser requerida onde a seqüência de codificação não contémnaturalmente uma região de codificação de peptídeo sinal. Alternativamente,a região de codificação de peptídeo sinal estranho pode simplesmentesubstituir a região de codificação de peptídeo sinal natural a fim de melhorar asecreção do polipeptídeo. No entanto, qualquer região de codificação depeptídeo sinal que dirige o polipeptídeo expresso na via secretória de umacélula hospedeira de escolha, isto é, secretado em um meio de cultura, podeser usado na presente invenção.
As regiões eficazes de codificação de peptídeo sinal paracélulas hospedeiras bacterianas são as regiões de codificação de peptídeo sinalobtidas dos genes para amilase maltogênica de Bacillus NCIB 11837, alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, subtilisina de Bacillus licheniformis,beta-lactamase de Bacillus licheniformis, proteases neutras de Bacillusstearothermophilus (nprT, nprS, nprM) e prsA de Bacillus subtilis. Outrospeptídeos de sinal são descritos por Simonen e Paiva, 1993, MicrobiologicalReviews 57: 109- 137.
As regiões eficazes de codificação de peptídeo sinal paracélulas hospedeiras de fungo filamentoso são as regiões de codificação depeptídeo sinal obtidas dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae,amilase neutra de Aspergillus niger, glucoamilase de Aspergillus niger,proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, celulase de Humicola insolens,endoglucanase V de Humicola insolens, e lípase de Humieola lanuginosa.
Peptídeos de sinal utilizáveis para células hospedeiras delevedura são obtidos dos genes para fator-alfa de Saccharomyees eerevisiae einvertase de Saccharomyces eerevisiae. Outras regiões de codificação depeptídeo de sinal utilizáveis são descritas por Romanos et al., 1992, supra.
Em um aspecto preferido, o peptídeo sinal compreende ouconsiste de aminoácidos 1 a 16 de SEQ ID NO: 4. Em outro aspectopreferido, a região de codificação de peptídeo sinal contêm os nucleotídeos 19a 69 de SEQ ID NO: 3.
Em outro aspecto preferido, o peptídeo sinal compreende ouconsiste de aminoácidos 1 a 15 de SEQ ID NO: 6. Em outro aspectopreferido, a região de codificação de peptídeo sinal compreende ou consistede nucleotídeos 39 a 83 de SEQ ID NO: 5.
Em outro aspecto preferido, o peptídeo sinal compreende ouconsiste de aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO: 8. Em outro aspectopreferido, a região de codificação de peptídeo sinal compreende ou consistede nucleotídeos 14 a 76 de SEQ ID NO: 7.
Em outro aspecto preferido, o peptídeo sinal compreende ouconsiste de aminoácidos 1 a 16 de SEQ ID NO: 10. Em outro aspectopreferido, a região de codificação de peptídeo sinal compreende ou consistede nucleotídeos 1 a 48 de SEQ ID NO: 9.
A seqüência de controle também pode ser uma região decodificação de pró-peptídeo que codifica para uma seqüência de aminoácidoposicionada no término amino de um polipeptídeo. O polipeptídeo resultanteé conhecido como uma pró-enzima ou pró-polipeptídeo (ou um zimogênio emalguns casos). Um pró-peptídeo geralmente é inativo e pode ser convertidopara um polipeptídeo ativo maduro por clivagem catalítica ou autocatalíca dopró-peptídeo do pró-polipeptídeo. A região codificada de pró-peptídeo podeser obtida a partir dos genes para protease alcalina de Bacillus subtilis (aprE),protease neutra de Bacillus subtilis (nprT), fator-alfa de Saccharomyceseerevisiae, proteinase aspártica de Rhizomueor miehei, e lacase deMyceliophthora thermophila (WO 95/33836).
Em um aspecto preferido, o pró-peptídeo compreende ouconsiste de aminoácidos 17 a 24 de SEQ ID NO: 10. Em outro aspectopreferido, a região de codificação de pró-peptídeo compreende ou consiste denucleotídeos 49 a 72 de SEQ ID NO: 9.
Onde ambas regiões de pró-peptídeo e peptídeo sinal sãoapresentadas no término amino de um polipeptídeo, a região de pró-peptídeoestá posicionada próximo ao término amino de um polipeptídeo e a região depeptídeo sinal está posicionada próximo ao término amino da região de pró-peptídeo.
Também pode ser desejável adicionar seqüências reguladorasque permitem a regulação da expressão do polipeptídeo relativo aocrescimento da célula hospedeira. Exemplos de sistemas reguladores são osque causam a expressão do gene a ser ligado e desligado em resposta a umestímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulador.Os sistemas reguladores em sistemas procarióticos incluem os sistemasoperadores Iae, tae, e trp. Em levedura, o sistema ADH2 ou sistema GALltambém pode ser usado. Em fungos filamentosos, o promotor TAKA alfa-amilase, promotor glucoamilase de Aspergillus niger, e promotorglucoamilase de Aspergillus oryzae também podem ser usados comoseqüências reguladoras. Outros exemplos de seqüências reguladoras são asque permitem a amplificação do gene. Em sistemas eucarióticos, estesincluem o gene redutase di-hidrofolato que é amplificado na presença demetotrexato, e os genes metalotioneina que são amplificados com metaispesados. Nestes casos, a seqüência de nucleotídeo codificando o polipeptídeodeve ser ligada operativamente com a seqüência reguladora.
Vetores de Expressão
A presente invenção também refere-se aos vetores deexpressão recombinante compreendendo um polinucleotídeo da presenteinvenção, um promotor, e sinais de parada de transcrição e translação. Osvários ácidos nucleicos e seqüências de controle descritos aqui podem serunidos juntos para produzir um vetor de expressão recombinante que podeincluir um ou mais sítios de restrição convenientes para permitir a inserção ousubstituição da seqüência de nucleotídeo codificando o polipeptídeo em taissítios. Alternativamente, uma seqüência de polinucleotídeo da presenteinvenção pode ser expressa ao inserir a seqüência de nucleotídeo ou umaconstrução de ácido nucleico compreendendo a seqüência em um vetorapropriado para expressão. Ao criar o vetor de expressão, a seqüência decodificação está localizada no vetor de modo que a seqüência de codificação éligada operativamente com as seqüências de controle apropriadas paraexpressão.
O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor(por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que pode ser convenientementesubmetido a procedimentos de DNA recombinantes e pode ocasionar aexpressão da seqüência de nucleotídeo. A escolha do vetor tipicamente irádepender da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira em que o vetordeve ser introduzido. Os vetores podem ser lineares ou plasmídeos circularesfechados.
O vetor pode ser um vetor autonomamente replicante, isto é,um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, cuja replicação éindependente da replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo, umelemento extracromossômico, um minicromossômico, ou um cromossomoartificial. O vetor pode conter qualquer meio para assegurar uma auto-replicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido nacélula hospedeira, é integrado no genoma e replicado junto com ocromossomo (s) em que ele foi integrado. Além disso, um vetor único ouplasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que juntos contém o DNAtotal a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transposonpode ser usado.
Os vetores da presente invenção preferivelmente contêm umou mais marcadores selecionáveis que permitem uma seleção fácil detransformadores, transfectados, transduzidos, ou células semelhantes. Ummarcador selecionável é um gene cujo produto provê resistência a biocidas ouviral, resistência a metais pesados, fototrofia a autotrofos, e semelhantes.
Exemplos de marcadores bacterianos selecionáveis são osgenes dal de Bacillus subtilis ou Bacillus Iieheniformis, ou marcadores queconferem resistência a antibióticos como ampicilina, canamicina,cloranfenicol, ou resistência a tetraciclina. Os marcadores apropriados paracélulas hospedeiras de levedura são ADE2, fflS3, LEU2, LYS2, MET3,TRP1, e URA3. Os marcadores selecionáveis para uso em uma célulahospedeira de fungo filamentoso incluem, mas não são limitados a, amdS(acetamidase), argB (ornitina carbamoiltransferase), bar (fosfinotricinaacetiltransferase), hph (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato redutase),pyrG (orotidina-5'- fosfato decarboxilase), sC (sulfato adenilransferase), etrpC (antranilato sintase), assim como equivalentes dos mesmos. Preferidospara uso em uma célula de Aspergillus são os genes amdS e pyrG deAspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae e o gene bar de Streptomyeeshygroseopieus.
Os vetores da presente invenção preferivelmente contêm umelemento (s) que permite a integração do vetor no genoma de célulahospedeira ou replicação autônoma do vetor na célula independente dogenoma.
Para integração no genoma de célula hospedeira, o vetor podese basear na seqüência de polinucleotídeo codificando o polipeptídeo ouqualquer outro elemento do vetor para integração no genoma porrecombinação homóloga ou não homóloga. Alternativamente, o vetor podeconter seqüências de nucleotídeos adicionais para dirigir a integração porrecombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em um local (s)preciso no (s) cromossomo (s). Para aumentar a probabilidade de integraçãoem um local preciso, os elementos integracionais devem conterpreferivelmente um número suficiente de ácidos nucleicos, como 100 a10.000 pares de base, preferivelmente 400 a 10.000 pares de base, e o maispreferivelmente 800 a 10.000 pares de base, tendo um grau elevado deidentidade com a seqüência de marcação correspondente para melhorar aprobabilidade de recombinação homóloga. Os elementos integracionaispodem ser qualquer seqüência, isto é, homóloga com a seqüência de marcaçãono genoma da célula hospedeira. Além disso, os elementos integracionaispodem ser as seqüências de nucleotídeo de não codificação e de codificação.Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira porrecombinação não homóloga.
Para replicação autônoma, o vetor pode ainda compreenderuma origem de replicação permitindo ao vetor replicar autonomamente nacélula hospedeira em questão. A origem de replicação pode ser qualquerreplicador de plasmídeo mediando a replicação autônoma que funciona emuma célula. O termo "origem de replicação " ou "replicador de plasmídeo" édefinido aqui como uma seqüência de nucleotídeo que permite a umplasmídeo ou vetor replicar in vivo.
Exemplos de origens bacterianas de replicação são as deorigens de replicação de plasmídeos pBR322, pUC19, pACYC177, epACYC184 permitindo a replicação em E. coli, e pUBl 10, pE194, pTA1060,e ρΑΜβΙ permitindo a replicação em Bacillus.
Exemplos de origens de replicação para uso em uma célulahospedeira de levedura são a origem de replicação de 2 mícrons, ARS1,ARS4, a combinação de ARSl e CEN3, e a combinação de ARS4 e CEN6.
Exemplos de origens de replicação utilizáveis em uma célulade fungo filamentoso são AMAI e ANSl (Gems et al., 1991, Gene 98: 61 -67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163 - 9175; WO00/24883). Isolamento do gene AMAI e construção de plasmídeo ou vetorescompreendendo o gene podem ser alcançados de acordo com os métodosdescritos em WO 00/24883.
Mais do que uma cópia de um polinucleotídeo da presenteinvenção pode ser inserida em uma célula hospedeira para aumentar aprodução do produto de gene. Um aumento no número de cópia dopolinucleotídeo pode ser obtido por integração de pelo menos uma cópiaadicional da seqüência no genoma de célula hospedeira ou por inclusão de umgene de marcador selecionável amplificável com o polinucleotídeo ondecélulas contendo cópias amplificadas do gene de marcador selecionável, eassim cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas porcultivo das células na presença do agente selecionável apropriado.
Os procedimentos usados para ligar os elementos descritosacima para construir os vetores de expressão recombinante da presenteinvenção são bem conhecidos do versado na técnica (ver, por exemplo,Sambrook et al., 1989, supra).
Células Hospedeiras
A célula hospedeira pode ser qualquer célula utilizável naprodução recombinante de um polipeptídeo da presente invenção, porexemplo, uma procariótica ou uma eucariótica.A célula hospedeira pró-cariótica pode ser qualquer bactériagram positiva ou uma bactéria gram negativa. Bactérias gram positivasincluem, mas não limitadas a Bacillus, Streptococcus, Streptomyces,Staphylococcus, Enteroeoeeus, Laetobaeillus, Laetocoeeus, Clostridium,Geobacilius, e Oceanobacillus. Bactérias gram negativas incluem, mas nãosão limitadas a, E. eoli, Pseudomonas, Salmonella, Campylobaeter,Helicobacter, Flavobacterium, Fusobaeterium, llyobaeter, Neisseria, eUreaplasma.
A célula bacteriana hospedeira pode ser qualquer célula deBacillus. As células de Bacillus utilizáveis na prática da presente invençãoincluem, mas não são limitadas a células de Bacillus alkalophilus, Bacillusamyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii,Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacilluslicheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus. Bacillusstearothermophilus, Bacillus subtilis, e Bacillus thuringiensis.
Em um aspecto preferido, a célula bacteriana hospedeira é umacélula de Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis,Bacillus stearothermophilus ou Bacillus subtilis. Em um aspecto maispreferido, a célula bacteriana hospedeira é uma célula de Bacillusamyloliquefaciens. Em outro aspecto mais preferido, a célula bacterianahospedeira é uma célula de Bacillus clausii. Em outro aspecto mais preferido,a célula bacteriana hospedeira é uma célula de Bacillus licheniformis. Emoutro aspecto mais preferido, a célula bacteriana hospedeira é uma célula deBacillus subtilis.
A célula bacteriana hospedeira também pode ser qualquercélula de Streptococcus. As células Streptococcus utilizáveis na prática dapresente invenção incluem, mas não são limitadas a, Streptococcusequisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, e Streptococcusequi subsp. Zooepidemicus.Em um aspecto preferido, a célula bacteriana hospedeira é umacélula de Streptococcus equisimilis. Em outro aspecto preferido, a célulabacteriana hospedeira é uma célula de Streptoeoceus pyogenes. Em outroaspecto preferido, a célula bacteriana hospedeira é uma célula deStreptoeoceus uberis. Em outro aspecto preferido, a célula bacterianahospedeira é uma célula de Streptoeoceus equi subsp. Célula Zooepidemicus.
A célula bacteriana hospedeira também pode ser qualquercélula de Streptomyces. As células de Streptomyces utilizáveis na prática dapresente invenção incluem, mas não são limitadas a, Streptomycesachromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces eoelicolor,Streptomyees griseus, e Streptomyees lividans.
Em um aspecto preferido, a célula bacteriana hospedeira é umacélula de Streptomyees achromogenes. Em outro aspecto preferido, a célulabacteriana hospedeira é uma célula de Streptomyces avermitilis. Em outroaspecto preferido, a célula bacteriana hospedeira é uma célula deStreptomyces eoelicolor. Em outro aspecto preferido, a célula bacterianahospedeira é uma célula de Streptomyces griseus. Em outro aspecto preferido,a célula bacteriana hospedeira é uma célula de Streptomyces lividans.
A introdução de DNA em uma célula de Bacillus pode, porexemplo, ser efetuada por transformação de protoplastos (ver, por exemplo,Chang e Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111 - 115), por usoem células competentes (ver, por exemplo, Young e Spizizen, 1961, Journalof Bacteriology 81: 823 - 829, ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, Journalof Molecular Biology 56: 209 - 221), por eletroporação (ver, por exemplo,Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742 - 751), ou por conjugação(ver, por exemplo, Koehler e Thome, 1987, Journal of Bacteriology 169;5271 - 5278). A introdução de DNA em uma célula de E coli pode, porexemplo, ser efetuada por transformação de protoplastos (ver, por exemplo,Hanahan, 1983, J. MoI. Biol. 166: 557 - 580) ou eletroporação (ver, porexemplo, Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127 - 6145). Aintrodução de DNA em uma célula de Streptomyees pode, por exemplo, serefetuada por transformação de protoplastos e eletroporação (ver, por exemplo,Gong et aí., 2004, Folia Mierobiol. (Praha) 49: 399 - 405), por conjugação(ver, por exemplo, Mazodier et al., 1989, J. Baeteriol. 171: 3583 - 3585), oupor transdução (ver, por exemplo, Burke et al., 2001, Proe. Natl. Aead. Sei.USA 98: 6289 - 6294). A introdução de DNA em uma célula de Pseudomonaspode, por exemplo, ser efetuada por eletroporação (ver, por exemplo, Choi etal., 2006, J. Mierobiol. Methods 64: 391 - 397) ou por conjugação (ver, porexemplo, Pinedo e Smets, 2005, Appl, Environ. Mierobiol. 71: 51 - 57). Aintrodução de DNA em uma célula de Streptococcus pode, por exemplo, serefetuada por competência natural (ver, por exemplo, Perry e Kuramitsu, 1981Infeet. Immun. 32: 1295 - 1297), por transformação de protoplastos (ver, porexemplo, Catt e Jollick, 1991, Mierobios, 68: 189 - 2070, por eletroporação(ver, por exemplo, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Mierobiol. 65: 3800 -3804) ou por conjugação (ver, por exemplo, Clewell, 1981, Mierobiol. Rev.45: 409 - 436). No entanto, qualquer método conhecido para introduzir DNAem uma célula hospedeira pode ser usado.
A célula hospedeira também pode ser uma eucariótica, comouma célula de mamífero, inseto, planta, ou fungo.
Em um aspecto preferido, a célula hospedeira é uma célula defungo. "Fungos", como usado aqui, incluem os filos Ascomycota,Basidiomycota, Chytridiomycota, e Zygomycota (como definidos porHawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dietionary of The Fungi, 8a.edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) assimcomo Oomycota (como citado em Hawksworth et al., 1995, supra, página171) e todos os fungos mitospóricos (Hawksworth et al., 1995, supra).
Em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira de fungo éuma célula de levedura. "Levedura" como usada aqui inclui leveduraascosporogenosa (Endomicetales), levedura basidiosporogenosa, e levedurapertencendo aos Fungi imperfecti (Blastomicetes). Porque a classificação delevedura pode mudar no futuro, para os fins desta invenção, levedura deve serdefinida como descrito em Biology and Activities of Yeast (Skinner, F. A.,Passmore, S. M., e Davenport, R. R., eds, Soe. App. Bacteriol. Symposiumsérie n°. 9, 1980).
Em um aspecto ainda mais preferido, a célula hospedeira delevedura é uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Piehia,Saccharomyees, Schizosaceharomyees, ou Yarrowia.
Em um aspecto o mais preferido, a célula hospedeira delevedura é uma célula de Saccharomyees earlsbergensis, Saccharomyeeseerevisiae, Saceharomyces diastatieus, Saccharomyees douglasii,Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, ou Saccharomycesoviformis. Em outro aspecto o mais preferido, a célula hospedeira de leveduraé uma célula de Kluyveromyces laetis. Em outro aspecto o mais preferido, acélula hospedeira de levedura é uma célula de Yarrowia lipolytiea.
Em outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira de fungoé uma célula de fungo filamentoso. "Fungos filamentosos" incluem todas asformas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota (como definido porHawksworth et al., 1995, supra). Os fungos filamentosos geralmente sãocaracterizados por uma parede miceliana composta de quitina, celulose,glucano, quitosana, manano, e outros polissacarídeos complexos. Crescimentovegetativo é por alongamento das hifas e catabolismo de carbono éobrigatoriamente aeróbico. Em contraste, crescimento vegetativo porleveduras como Saccharomyees eerevisiae é por formação de broto de umtalo unicelular e catabolismo de carbono pode ser fermentativo.
Em um aspecto ainda mais preferido, a célula hospedeira defungos filamentosos é uma célula de Aeremonium, Aspergillus,Aureobas idium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrys osporium, Coprinus,Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe,Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces,Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum,Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, ouTrichoderma.
Em um aspecto o mais preferido, a célula hospedeira de fungosfilamentosos é uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus,Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillusniger ou Aspergillus oryzae. Em outro aspecto o mais preferido, a célulahospedeira de fungos filamentosos é uma célula de Fusarium bactridioides,Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusariumgraminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusariumnegundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum,Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides,Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, ouFusarium venenatum. Em outro aspecto o mais preferido, a célula hospedeirade fungos filamentosos é uma célula de Bjerkandera adusta, Ceriporiopsisaneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsisgilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsissubrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium keratinophilum,Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium tropicum, Chrysosponummerdarium, Chrysosporium inops, Chrysosporium pannicola, Chrysosporiumqueenslandicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolushirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei,Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium brasilianum,Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata,Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes viliosa, Trametes versicolor,Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichodermalongibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.As células de fungo podem ser transformadas por um processoenvolvendo formação de protoplastos, transformação dos protoplastos, eregeneração da parede celular em um modo conhecido por si. Osprocedimentos apropriados para a transformação de células hospedeiras deAspergillus e Trichoderma são descritos em EP 238 023 e Yelton et ai., 1984,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470 - 1474. Osmétodos apropriados para transformar a espécie Fusarium são descritos porMalardier et al., 1989, Gene 78: 147 - 158, e WO 96/00787. A levedura podeser transformada usando os procedimentos descritos por Becker e Guarente,In Abelson, J. N. e Simon, Μ. I., editores, Guide to Yeast Genetics andMolecular Biology, Methods in Enzymology, volume 194, pp 182 - 187,Açademic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy ofSciences USA 75: 1920.
Métodos de Produção
A presente invenção também refere-se a métodos paraproduzir um polipeptídeo da presente invenção, compreendendo: (a) cultivaruma célula, que, em sua forma de tipo selvagem, é capaz de produzir opolipeptídeo, sob condições que conduzem para produção do polipeptídeo; e(b) recuperar o polipeptídeo. Em um aspecto preferido, a célula é do gêneroMyceliophthora. Em um aspecto mais preferido, a célula é Myceliophthorathermophila. Em um aspecto o mais preferido, a célula é Myceliophthorathermophila CBS 117.65. Em outro aspecto preferido, a célula ébasidiomicete CBS 494.95. Em outro aspecto preferido, a célula ébasidiomicete CBS 495.95. Em outro aspecto preferido, a célula é do gêneroPenicillium. Em outro aspecto mais preferido, a célula é Penicilliumbrasilianum. Em outro aspecto o mais preferido, a célula é Penicilliumbrasilianum IBT 20888.
A presente invenção também refere-se a métodos paraproduzir um polipeptídeo da presente invenção, compreendendo: (a) cultivaruma célula hospedeira sob condições que conduzem para produção dopolipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.
A presente invenção também refere-se a métodos paraproduzir um polipeptídeo da presente invenção, compreendendo: (a) cultivaruma célula hospedeira sob condições que conduzem para produção dopolipeptídeo, em que a célula hospedeira compreende uma seqüência mutantede nucleotídeos tendo pelo menos uma mutação em uma seqüência decodificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO; 5, SEQID NO: 7, ou SEQ ID NO: 9, em que a seqüência mutante de nucleotídeoscodifica um polipeptídeo que compreende ou consiste do polipeptídeo madurode SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, ou SEQ ID NO: 10, e (b)recuperar o polipeptídeo.
Em um aspecto preferido, o polipeptídeo maduro de SEQ IDNO: 4 contêm os aminoácidos 17 a 389. Em outro aspecto preferido, opolipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 6 contêm os aminoácidos 16 a 397. Emoutro aspecto preferido, o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 8 contêm osaminoácidos 22 a 429. Em outro aspecto preferido, o polipeptídeo maduro deSEQ ID NO: 10 contêm os aminoácidos 25 a 421. Em outro aspectopreferido, a seqüência de codificação de polipeptídeo maduro contêm osnucleotídeos 87 a 1185 de SEQ ID NO: 3. Em outro aspecto preferido, aseqüência de codificação de polipeptídeo maduro contêm os nucleotídeos 84 a1229 de SEQ ID NO: 5. Em outro aspecto preferido, a seqüência decodificação de polipeptídeo maduro contêm os nucleotídeos 77 a 1300 deSEQ ID NO: 7. Em outro aspecto preferido, a seqüência de codificação depolipeptídeo maduro contêm os nucleotídeos 73 a 1488 de SEQ ID NO: 9.
Nos métodos de produção da presente invenção, as células sãocultivadas em um meio nutriente apropriado para produção do polipeptídeousando métodos bem conhecidos na arte. Por exemplo, a célula pode sercultivada por cultivo em frasco de agitação, e fermentação em grande escalaou pequena escala (incluindo fermentações em estado contínuo, batelada,batelada alimentada, ou sólido) em laboratório ou fermentadores industriaisrealizada em um meio apropriado e sob condições permitindo ao polipeptídeoser expresso e/ou isolado. O cultivo ocorre em um meio nutriente apropriadocompreendendo carbono e fontes de nitrogênio e sais inorgânicos, usandoprocedimentos conhecidos na arte. Os meios apropriados são disponíveis defornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com ascomposições publicadas (por exemplo, em catálogos do American TypeCulture Collection). Se o polipeptídeo for secretado no meio nutriente, opolipeptídeo pode ser recuperado diretamente do meio. Se o polipeptídeo nãofor secretado no meio, ele pode ser recuperado dos lisados de células.
Os polipeptídeos podem ser detectados usando métodosconhecidos na técnica que são específicos para os polipeptídeos. Estesmétodos de detecção podem incluir uso de anticorpos específicos, formaçãode um produto de enzima, ou desaparecimento de um substrato de enzima.Por exemplo, um teste de enzima pode ser usado para determinar a atividadedo polipeptídeo como descrito aqui.
O polipeptídeo resultante pode ser recuperado usando métodosconhecidos na arte. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser recuperado do meionutriente por procedimentos convencionais incluindo, mas não limitados a,centrifugação, filtração, extração, secagem por pulverização, evaporação, ouprecipitação.
Os polipeptídeos da presente invenção podem ser purificadospor uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica incluindo, masnão limitados a, cromatografia (por exemplo, troca iônica, afinidade,hidrofóbico, cromatofocalização, e exclusão por tamanho), procedimentoseletroforéticos (por exemplo, focalização isoelétrica preparativa), solubilidadediferencial (por exemplo, precipitação por sulfato de amônio), SDS-PAGE, ouextração (ver, por exemplo, Protein Purification, J. -C, Janson e Lars Ryden,editores, VCH Publishers, New York, 1989) para obter polipeptídeossubstancialmente puros.
Plantas
A presente invenção também refere-se a plantas, por exemplo,uma planta transgênica, parte de planta, ou célula de planta, compreendendoum polinucleotídeo isolado codificando um polipeptídeo tendo atividade deendoglucanase da presente invenção de modo a expressar e produzir opolipeptídeo em quantidades recuperáveis. O polipeptídeo pode serrecuperado da planta ou parte de planta. Alternativamente, a planta ou partede planta contendo o polipeptídeo recombinante pode ser usada como tal paramelhorar a qualidade de um alimento ou ração, por exemplo, melhorando ovalor nutricional, palatabilidade, e propriedades reológicas, ou para destruirum fator antinutritivo.
A planta transgênica pode ser dicotiledônea (um dicótile) oumonocotiledônea (um monocótile). Exemplos de plantas monocotiledôneassão gramíneas, como gramas do prato (grama azul, Poa), forragens comoFestuca, Lolium, grama temperada, como Agrostis, e cereais, por exemplo,trigo, aveias, centeio, cevada, arroz, sorgo, e milho graúdo (milho).
Exemplos de plantas dicotiledôneas são tabaco, legumes, comotremoços, batata, beterraba, ervilha, feijão e soja, e plantas crucíferas (famíliaBrassicaceaé), como couve-flor, semente de colza, e o organismo de modelointimamente relacionado Arabidopsis thaliana.
Exemplos de parte de plantas incluem talo, calo, folhas, raiz,frutos, sementes, e tubérculos assim como os tecidos individuaiscompreendendo estas partes, por exemplo, epiderme, mesófilos, parênquima,tecidos vasculares, meristemas. Compartimentos de célula de plantaespecíficos, como cloroplastos, apoplastos, mitocôndrias, vacúolos,peroxissomas e citoplasma também são considerados como sendo uma partede planta. Além disso, qualquer célula de planta, qualquer que seja a origemdo tecido, é considerada para sendo uma parte de planta. Do mesmo modo,partes de planta como tecidos específicos e células isoladas para facilitar autilização da invenção também são consideradas partes de plantas, porexemplo, embriões, endospermas, aleurona e capas de sementes.
Também estão incluídas dentro do escopo da presenteinvenção as progênies de tais plantas, partes de plantas, e células de plantas.
A planta transgênica ou célula de planta expressando umpolipeptídeo da presente invenção pode ser construída de acordo com osmétodos conhecidos na arte. Em resumo, a planta ou célula de planta éconstruída por incorporação de uma ou mais construções de expressãocodificando um polipeptídeo da presente invenção no genoma hospedeiro deplanta ou genoma de cloroplasto e propagando a planta modificada resultanteou célula de planta em uma planta transgênica ou célula de planta.
A construção de expressão é convenientemente umaconstrução de ácido nucleico que compreende um polinucleotídeo codificandoum polipeptídeo da presente invenção ligado operativamente com seqüênciasreguladoras apropriadas requeridas para a expressão da seqüência denucleotídeos na planta ou parte de planta de escolha. Além disso, a construçãode expressão pode compreender um marcador selecionável utilizável paraidentificar as células hospedeiras em que a construção de expressão foiintegrada e seqüências de DNA necessárias para a introdução da construçãona planta em questão (a última depende do método de introdução de DNA aser usado).
A escolha de seqüências reguladoras, como promotor eseqüências de terminador e opcionalmente seqüências de sinal ou de transito édeterminada, por exemplo, com base em quando, onde, e como o se desejaque o polipeptídeo seja expresso. Por exemplo, a expressão do genecodificando um polipeptídeo da presente invenção pode ser constitutiva ouindutível, ou pode ser específica do desenvolvimento, estágio ou tecido, e oproduto de gene pode ser marcado em um tecido específico ou parte de plantacomo sementes ou folhas. As seqüências reguladoras são, por exemplo,descritas por Tague et al, 1988, Plant Physiology 86: 506.
Para expressão constitutiva, 3 5S-CaMV, a ubiquitina de milho1, e o promotor 1 actina de arroz podem ser usados (Franck et al., 1980, Cell21: 285 - 294, Christensen et al., 1992, Plant Mo. 'Biol 18: 675 - 689; Zhanget al., 1991, Plant Cell 3: 1155 - 1165), promotores de órgão específicospodem ser, por exemplo, um promotor de tecidos imersos em armazenamentocomo sementes, tubérculos de batata, e frutas (Edwards & Coruzzi, 1990,Ann, Rev. Genet. 24: 275 - 303), ou de tecidos de imersão metabólicos comomeristemas (Ito et al, 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863 -878 ), um promotorespecífico de semente como o promotor glutelina, prolamina, globulina, oualbumina de arroz (Wu et al, 1998, Plant and Cell Physiology 39: 885 - 889),um promotor de Vicia faba da legumina B4 e o gene de proteína de sementedesconhecida de Vicia faba (Conrad et al, 1998, Journal of Plant Physiology152: 708 - 711), um promotor de uma proteína do corpo oleoso da semente(Chen et al, 1998, Plant and Cell Physiology 39: 935 - 941), o promotornapA de proteína de armazenamento de Brassica napus, ou qualquer outropromotor específico de semente conhecido na arte, por exemplo, comodescrito em WO 91/14772. Além disso, o promotor pode ser um promotorespecífico de folha como o promotor rbcs de arroz ou tomate (Kyozuka et al,1993, Plant Physiology 102: 991 - 1000, o promotor de gene metiltransferaseadenina de vírus clorela (Mitra e Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26:85 - 93), ou o promotor de gene aldP de arroz (Kagaya et al, 1995,Molecular and General Genetics 248: 668 - 874), ou um promotor indutívelpor ferida como o promotor de batata pin2 (Xu et al, 1993, Plant MolecularBiology 22: 573 - 588). Do mesmo modo, o promotor pode ser indutível portratamentos abióticos como temperatura, seca, ou alterações em salinidade ouinduzido por substâncias aplicadas de modo exógeno que ativam o promotor,por exemplo, etanol, estrógenos, hormônios de planta como etileno, ácidoabscíssico, e ácido giberélico, e metais pesados.
Um elemento melhorador do promotor também pode ser usadopara obter uma maior expressão de um polipeptídeo da presente invenção naplanta. Por exemplo, o elemento melhorador do promotor pode ser um íntronque é colocado entre o promotor e a seqüência de nucleotídeos codificandoum polipeptídeo da presente invenção. Por exemplo, Xu et al., 1993, supra,descrevem o uso do primeiro íntron do gene actina 1 de arroz para melhorar aexpressão.
O gene marcador selecionável e quaisquer outras partes daconstrução de expressão podem ser escolhidos a partir dos disponíveis na arte.
A construção de ácido nucleico é incorporada no genoma deplanta de acordo com as técnicas convencionais conhecidas na arte, incluindotransformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada por vírus,microinjeção, bombardeio de partículas, transformação biolística, eeletroporação (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990,Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).
Atualmente, a transferência de gene mediada porAgrobacterium tumefaciens é o método de escolha para gerar dicotiledôneastransgênicas (para um estudo, ver Hooykas e Schilperoort, 1992, PlantMolecular Biology 19: 15 - 38) e também pode ser usado para transformarmonocotiledôneas, apesar de outros métodos de transformação serem usadoscom freqüência para estas plantas. Atualmente, o método de escolha paragerar monocotiledôneas transgênicas é bombardeio de partículas (partículasmicroscópicas de ouro ou de tungstênio revestidas com o DNA transformante)de calos embriônicos ou embriões em desenvolvimento (Christou, 1992, PlantJournal 2: 275 - 281; Shimamoto, 1994, Current Opinion Biotechnology 5:158 - 162; Vasil et ai, 1992, Bio/Technology 10: 667 - 674). Um métodoalternativo para transformação de monocotiledôneas é com base natransformação de protoplasto como descrito por Omirulleh et al., 1993, PlantMolecular Biology 21:415 - 428.
Após a transformação, os transformantes tendo incorporado aconstrução de expressão são selecionados e regenerados em todas as plantasde acordo com os métodos bem conhecidos na arte. Com freqüência, oprocedimento de transformação é projetado para a eliminação seletiva degenes de seleção ou durante a regeneração ou nas gerações seguintes por uso,por exemplo, de co-transformação com duas construções de T-DNAseparadas ou excisão específica de sítio do gene de seleção por umarecombinase específica.
A presente invenção também refere-se a métodos paraproduzir um polipeptídeo da presente invenção compreendendo: (a) cultivaruma planta transgênica ou uma célula de planta compreendendo umpolinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo atividade deendoglucanase da presente invenção sob condições que conduzem paraprodução do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.
Remoção ou Redução de Atividade de Endoglucanase
A presente invenção também refere-se a métodos paraproduzir um mutante de uma célula parental, que compreende desregular oudeletar uma seqüência de polinucleotídeo, ou uma porção do mesmo,codificando um polipeptídeo da presente invenção, que resulta na célulamutante produzir menos do polipeptídeo do que a célula parental quandocultivada sob as mesmas condições.
A célula mutante pode ser construída por redução oueliminação da expressão de uma seqüência de nucleotídeos codificando umpolipeptídeo da presente invenção usando métodos bem conhecidos na arte,por exemplo, inserções, desregulações, substituições, ou deleções. Em umaspecto preferido, a seqüência de nucleotídeos é inativa. A seqüência denucleotídeos a ser modificada ou inativada pode ser, por exemplo, a região decodificação ou uma parte da mesma essencial para atividade, ou um elementoregulador requerido para a expressão da região de codificação. Um exemplodesta seqüência de controle ou reguladora pode ser uma seqüência depromotor ou uma parte funcional da mesma, isto é, uma parte isto é suficientepara afetar a expressão da seqüência de nucleotídeo. Outras seqüências decontrole para possível modificação incluem, mas não são limitadas a, umlíder, seqüência de poliadenilação, seqüência de pró-peptídeo, seqüência depeptídeo sinal, terminador de transcrição, e ativador transcripcional.
Modificação ou inativação da seqüência de nucleotídeos podeser realizada ao se submeter a célula parental a mutagênese e selecionar paracélulas mutantes em que a expressão da seqüência de nucleotídeos foireduzida ou eliminada. A mutagênese, que pode ser específica ou aleatória,pode ser realizada, por exemplo, pelo uso de um agente mutagenizantequímico ou físico, pelo uso de um oligonucleotídeo apropriado, ousubmetendo a seqüência de DNA a mutagênese gerada por PCR. Além disso,a mutagênese pode ser realizada pelo uso de qualquer combinação destesagentes mutagenizante.
Exemplos de um agente mutagenizante químico ou físicoapropriado para o presente fim incluem irradiação ultravioleta (UV),hidroxilamina, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), O-metilhidroxilamina, ácido nitroso, sulfonato de etil metano (EMS), bissulfito desódio, ácido fórmico, e análogos de nucleotídeos.
Quando tais agentes são usados, a mutagênese é tipicamenterealizada por incubação da célula parental a ser mutagenizada na presença doagente mutagenizante de escolha sob condições apropriadas, e triando e/ouselecionando as células mutantes demonstrando reduzida ou nenhumaexpressão do gene.
Modificação ou inativação da seqüência de nucleotídeos podeser efetuada por introdução, substituição, ou remoção de um ou maisnucleotídeos no gene ou um elemento regulador requerido para a transcriçãoou tradução do mesmo. Por exemplo, nucleotídeos podem ser inseridos ouremovidos de modo a resultar na introdução de um códon de parada, aremoção do códon de partida, ou uma mudança na matriz de leitura aberta.Tal modificação ou inativação pode ser efetuada por mutagênese sítio-dirigidaou mutagênese PCR gerada de acordo com os métodos conhecidos na arte.Apesar de, em princípio, a modificação poder ser realizada in vivo, isto é,diretamente na célula expressando a seqüência de nucleotídeos a sermodificada, prefere-se que modificação seja realizada in vitro comoexemplificado abaixo.
Um exemplo de um modo conveniente para eliminar oureduzir a expressão de uma seqüência de nucleotídeos por uma célula é combase nas técnicas de substituição de gene, deleção de gene, ou desregulaçãode gene. Por exemplo, no método de desregulação de gene, uma seqüência deácido nucleico correspondente na seqüência de nucleotídeos endógeno émutagenizada in vitro para produzir uma seqüência de ácido nucleicodefeituosa que é então transformada na célula parental para produzir um genedefeituoso. Por recombinação homóloga, a seqüência de ácido nucleicodefeituosa substitui a seqüência de nucleotídeo endógena. Pode ser desejávelque a seqüência de nucleotídeos defeituosa também codifica um marcador quepode ser usado para seleção de transformantes em que a seqüência denucleotídeos foi modificada ou destruída. Em um aspecto particularmentepreferido, a seqüência de nucleotídeos é desregulada com um marcadorselecionável como o descrito aqui.
Alternativamente, a modificação ou inativação da seqüência denucleotídeo pode ser realizada por técnicas de RNAi ou anti-sentidoestabelecidas ou usando uma seqüência complementar na seqüência denucleotídeo. Mais especificamente, a expressão da seqüência de nucleotídeospor uma célula pode ser reduzida ou eliminada por introdução de umaseqüência complementar para seqüência de nucleotídeos do gene que pode sertranscrito na célula e é capaz de hibridizar no mRNA produzido na célula.Sob condições permitindo à seqüência de nucleotídeos anti-sentidocomplementar hibridizar em mRNA, a quantidade de proteína traduzida éassim reduzida ou eliminada.
A presente invenção ainda refere-se a uma célula mutante deuma célula parental que compreende uma desregulação ou deleção de umaseqüência de nucleotídeos codificando o polipeptídeo ou uma seqüência decontrole do mesmo, que resulta na célula mutante produzir menos dopolipeptídeo ou nenhum polipeptídeo comparado na célula parental.
As células mutantes deficientes em polipeptídeos assim criadassão particularmente utilizáveis como células hospedeiras para a expressão depolipeptídeos homólogos e/ou heterólogos. Assim, a presente invenção aindarefere-se a métodos para produzir um polipeptídeo homólogo ou heterólogocompreendendo: (a) cultivar célula mutante sob condições que conduzem paraprodução do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo. O termo"polipeptídeo heterólogo" é definido aqui como polipeptídeos que não sãonativos na célula hospedeira, uma proteína nativa em que as modificaçõesforam feitas para alterar a seqüência nativa, ou uma proteína nativa cujaexpressão é quantitativamente alterada como um resultado de umamanipulação da célula hospedeira por técnicas de DNA recombinantes.
Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a ummétodo para produzir um produto de proteína essencialmente livre deatividade de endoglucanase por fermentação de uma célula que produz tantoum polipeptídeo da presente invenção assim como o produto de proteína de
interesse por adição de uma quantidade eficaz de um agentecapaz de inibir a atividade de endoglucanase no caldo de fermentação antes,durante, ou depois da fermentação estar completada, recuperar o produto deinteresse do caldo de fermentação, e opcionalmente submeter o produtorecuperado a outra purificação.
Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a ummétodo para produzir um produto de proteína essencialmente livre deatividade de endoglucanase por cultivo da célula sob condições permitindo aexpressão do produto, submetendo o caldo de cultura resultante a umtratamento de pH e de temperatura combinado de modo a reduzirsubstancialmente a atividade de endoglucanase, e recuperar o produto docaldo de cultura. Alternativamente, o tratamento combinado de pH e detemperatura pode ser realizado na preparação de enzima recuperada do caldode cultura. O tratamento combinado de pH e de temperatura opcionalmentepode ser usado em combinação com um tratamento com um inibidor deendoglucanase.
De acordo com este aspecto da invenção, é possível removerpelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 75%, mais preferivelmente pelomenos 85%, ainda mais preferivelmente pelo menos 95%, e o maispreferivelmente pelo menos 99% da atividade de endoglucanase. Remoçãocompleta de atividade de endoglucanase pode ser obtida pelo uso destemétodo.
O tratamento combinado de pH e de temperatura épreferivelmente realizado em um pH na faixa de 2-3 ou 10-11 e umatemperatura na faixa de pelo menos 75-85°C durante um período suficiente detempo para atingir o feito desejado, onde tipicamente, 1 a 3 horas sãosuficientes.
Os métodos usados para cultivo e purificação do produto deinteresse podem ser realizados por métodos conhecidos na arte.
Os métodos da presente invenção para produzir um produtoessencialmente livre de endoglucanase são de particular interesse na produçãode polipeptídeos eucarióticos, em particular, proteínas de fungo como asenzimas. A enzima pode ser selecionada dentre, por exemplo, uma enzimaamilolítica, enzima lipolítica, enzima proteolítica, enzima celulítica,oxidoredutase, ou enzima degradando a parede da célula de planta. Exemplosde tais enzimas incluem aminopeptidase, amilase, amiloglucosidase,carbohidrase, carboxipeptidase, catalase, celulase, quitinase, cutinase,ciclodextrina glicosiltransferase, deoxiribonuclease, esterase, galactosidase,beta-galactosidase, glucoamilase, glicose oxidase, glucosidase,haloperoxidase, hemicelulase, invertase, isomerase, lacase, ligase, lipase,liase, manosidase, oxidase, enzima pectinolítica, peroxidase, fitase,fenoloxidase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transferase,transglutaminase, ou xilanase. As células deficientes em endoglucanasetambém podem ser usadas para expressar proteínas heterólogas de interessefarmacêutico como hormônios, fatores de crescimento, receptores, e outros.
Deve-se entender que o termo "polipeptídeos eucarióticos"inclui não somente polipeptídeos nativos, mas também os polipeptídeos, porexemplo, enzimas, que foram modificadas por substituições de aminoácido,deleções ou adições, ou outras tais modificações para aumentar a atividade,termoestabilidade, tolerância a pH e outros.
Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a umproduto de proteína essencialmente livre de atividade de endoglucanase que éproduzido por um método da presente invenção.
Métodos de Inibir a Expressão de um PoIipeptideo
A presente invenção também refere-se aos métodos de inibir aexpressão de um polipeptídeo em uma célula, compreendendo administrar àcélula ou expressar na célula uma molécula de RNA (dsRNA) de filamentoduplo, em que o dsRNA compreende uma subseqüência ou porção de umpolinucleotídeo da presente invenção. Em um aspecto preferido, o dsRNA éde cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeosduplex em comprimento. Em outro aspecto preferido, o polipeptídeo tematividade de endoglucanase.
O dsRNA é preferivelmente um RNA interferência pequeno(siRNA) ou um RNA micro (miRNA). Em um aspecto preferido, o dsRNA éRNA interferência pequeno (siRNAs) para inibir a transcrição. Em outroaspecto preferido, o dsRNA é RNA micro (miRNAs) para inibir a tradução.
A presente invenção também refere-se a tais moléculas deRNA filamento duplo (dsRNA) para inibir a expressão de um polipeptídeo emuma célula, em que o dsRNA compreende uma subseqüência ou porção deum polinucleotídeo codificando o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4,SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, ou SEQ ID NO: 10. Apesar da presenteinvenção não ser limitada por qualquer mecanismo particular de ação, odsRNA pode entrar em uma célula e causar a degradação de um RNAfilamento único (ssRNA) de seqüências similares ou idênticas, incluindomRNAs endógenos. Quando uma célula é exposta a dsRNA, mRNA do genehomólogo é seletivamente degradado por um processo chamado RNAinterferência (RNAi).
Os dsRNAs da presente invenção podem ser usados emterapêuticas de silenciamento de genes. Em um aspecto, a invenção provêmétodos para seletivamente degradar o RNA usando os dsRNAis da presenteinvenção. O processo pode ser praticado in vitro, ex vivo ou in vivo. Em umaspecto, as moléculas de dsRNA podem ser usadas para gerar uma mutaçãode perda de função em uma célula, um órgão ou um animal. Métodos parafabricar e usar moléculas de dsRNA para degradar seletivamente RNA sãobem conhecidos na arte, ver, por exemplo, patente U.S. 6.506.559; patenteU.S. 6.511.824; patente U.S. 6.515.109; e patente U.S. 6.489.127.
Composições
A presente invenção também refere-se às composiçõescompreendendo um polipeptídeo da presente invenção. Preferivelmente, ascomposições são enriquecidas em tal polipeptídeo. O termo "enriquecido"indica que a atividade de endoglucanase da composição foi aumentada, porexemplo, com um fator de enriquecimento de pelo menos 1.1.
A composição pode compreender um polipeptídeo da presenteinvenção como o componente enzimático principal, por exemplo, umacomposição mono-componente. Alternativamente, a composição podecompreender atividades enzimáticas múltiplas, como um aminopeptidase,amilase, carbohidrase, carboxipeptidase, catalase, celulase, quitinase,cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, deoxiribonuclease, esterase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, glucoamilase, alfa-glucosidase, beta-glucosidase, haloperoxidase, invertase, lacase, lipase, manosidase, oxidase,enzima pectinolítica, peptidoglutaminase, peroxidase, fitase, polifenoloxidase,enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase, ou xilanoase. A(s)enzima (s) adicional(ais) pode(m) ser produzida(s), por exemplo, por ummicroorganismo pertencendo no gênero Aspergillus, preferivelmenteAspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus,Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillusniger, ou Aspergillus oryzae; Fusarium, preferivelmente Fusariumbactridioides, Fusarivm cerealis, Fusarium crookwellense, Fusariumculmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusariumheterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusariumreticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusariumsarcochroum, Fusarium sulphureum, Fusarium toruloseum, Fusariumtrichothecioides, ou Fusarium venenatum; Humicola, preferivelmenteHumicola insolens ou Humicola lanuginosa; ou Trichoderma,preferivelmente Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichodermalongibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.
As composições de polipeptídeo podem ser preparadas deacordo com os métodos conhecidos na técnica e podem estar na forma de umlíquido ou uma composição em pó. Por exemplo, a composição depolipeptídeo pode estar na forma de um granulado ou um microgranulado. Opolipeptídeo a ser incluído na composição pode ser estabilizado de acordocom os métodos conhecidos na arte.
Exemplos são dados abaixo de usos preferidos dascomposições de polipeptídeo da invenção. A dosagem da composição depolipeptídeo da invenção e outras condições sob as quais a composição éusada podem ser determinadas com base em métodos conhecidos na arte.
Usos
A presente invenção também refere-se a métodos para adegradação ou conversão de um material celulósico, compreendendo: tratar omaterial celulósico com uma composição compreendendo uma quantidadeeficaz de um polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase da presenteinvenção. Em um aspecto preferido, o método ainda compreende arecuperação do material celulósico degradado ou convertido.
Os polipeptídeos e as células hospedeiras da presente invenção
podem ser usados na produção de monossacarídeos, dissacarídeos, epolissacarídeos como cargas de alimentação de fermentação ou químicas apartir de biomassa celulósica para a produção de etanol, plásticos, outrosprodutos ou intermediários. A composição compreendendo o polipeptídeotendo atividade de endoglucanase pode estar na forma de um caldo defermentação bruto com ou sem as células removidas ou na forma de umapreparação de enzima purificada ou semi-purificada. A composição tambémpode compreender outras proteínas e enzimas utilizáveis no processamento debiomassa, por exemplo, celobiohidrolase, beta-glucosidase, enzimashemicelulolíticas, melhoradores (WO 2005/074647, WO 2005/074656), etc.Alternativamente, a composição pode compreender uma célula hospedeira dapresente invenção como uma fonte do polipeptídeo tendo atividade deendoglucanase em um processo de fermentação com a biomassa. Emparticular, os polipeptídeos e as células hospedeiras da presente invençãopodem ser usados para aumentar o valor de resíduos de processamento (grãossecos de destiladores, grãos gastos de cervejaria, bagaço de cana de açúcar,etc.) por degradação completa ou parcial de celulose ou hemicelulose. Acélula hospedeira também pode conter genes heterólogos ou nativos quecodificam outras proteínas e enzimas, mencionadas acima, utilizáveis noprocessamento de biomassa.
Nos métodos da presente invenção, qualquer materialcelulósico, como biomassa, pode ser usado. Deve-se entender aqui que otermo "material celulósico" engloba lignocelulose. Biomassa pode incluir,mas não é limitada a recursos de madeira, refugo sólido municipal, papelusado, colheitas, e resíduos de colheitas (ver, por exemplo, Wiselogel et al.,1995, in Handbook on Bioethanol (Charles E. Wyman, editor), pp. 105-118,Taylor & Francis, Washington D. C.; Wyman, 1994, Bioresource Technology50: 3-16; Lynd, 1990, Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25: 695 -719; Mosier et al., 1999, Recent Progress in Bioconversion ofLignocellulosics, in Advances in Bioehemical EngineeringlBiotechnology, T.Scheper, editor responsável, volume 65, pp. 23 - 40, Springer-Verlag, NewYork).
O polissacarídeo predominante na parede celular primária debiomassa é celulose, o segundo o mais abundante é hemicelulose, e o terceiroé pectina. A parede celular secundária, produzida depois da célula ter paradode crescer, também contém polissacarídeos e é reforçada por ligninapolimérica covalentemente reticulada em hemicelulose. Celulose é umhomopolímero de anidrocelobiose e assim um beta-(l-4)-D-glucano linear,enquanto hemiceluloses incluem uma variedade de compostos, como xilanos,xiloglucanos, arabinoxilanos, e mananos em estruturas ramificadas complexascom um espectro de substituintes. Apesar de geralmente polimorfa, celulose éencontrada em tecido de planta primariamente como uma matriz cristalinainsolúvel de cadeias glucano paralelas. Hemiceluloses geralmente ligam porponte hidrogênio a celulose, assim como a outras hemiceluloses, que ajudama estabilizar a matriz da parede celular.
Três classes maiores de enzimas são usadas para a ruptura dabiomassa celulósica:
(1) As "endo-l,4-beta-glucanases" ou 1,4-beta-D-glucano-4-glucano-hidrolases (EC 3.2.1.4), que atuam aleatoriamente em substratos 1,4-beta- glucano insolúvel e solúvel.
(2) As "exo-l,4-beta-D-glucanases" incluindo tanto as 1,4-beta-D-glucano glucohidrolases (EC 3.2.1.74), que liberam D-glicose de 1,4-beta-D-glucanos e lentamente hidrolisam D-celobiose, comocelobiohidrolases (1,4-beta-D-glucano celobiohidrolases, EC 3.2.1.91), queliberam D-celobiose de 1,4-beta-glucanos.
(3) As "beta-D-glucosidases" ou beta-D-glucosídeoglucohidrolases (EC 3.2.1.21), que atuam para a liberação de unidades de D-glicose de celobiose e celodextrinas solúveis, assim como um arranjo deglicosídeos.
Os polipeptídeos tendo atividade de endoglucanase da presenteinvenção são preferivelmente usados em conjunto com outras proteínascelulolíticas, por exemplo, exo-l,4-beta-D-glucanases e beta-D-glucosidases,para degradar o componente de celulose do substrato de biomassa, (ver, porexemplo, Brigham et al., 1995, in Handbook on Bioethanol (Charles E.Wyman, editor), PP. 119 - 141, Taylor & Francis, Washington D. C; Lee,1997, Journal of Biotechnology 56: 1 - 24).
As exo-l,4-beta-D-glucanases e beta-D-glucosidases podemser produzidas por qualquer método conhecido na técnica (ver, por exemplo,Bennett, J. W. e LaSure, L. (eds.), More Gene Manipulations in Fungi,Academic Press, CA, 1991).
As quantidades ótimas de um polipeptídeo tendo atividade deendoglucanase e outras proteínas celulolíticas dependem de vários fatoresincluindo, mas não limitados a mistura de proteínas de componentescelulolíticos, o substrato celulósico, a concentração de substrato celulósico, opré-tratamento (s) do substrato celulósico, temperatura, tempo, pH, e inclusãode organismo de fermentação (por exemplo, levedura para sacarificação efermentação simultâneas). O termo "proteína celulolíticas" é definido aquicomo as proteínas ou misturas de proteínas mostradas como sendo capazes dehidrolisar ou converter ou degradar celulose sob as condições testadas.
Em um aspecto preferido, a quantidade de polipeptídeo tendoatividade de endoglucanase por g de material celulósico é de cerca de 0,5 acerca de 50 mg, preferivelmente de cerca de 0,5 a cerca de 40 mg, maispreferivelmente de cerca de 0,5 a cerca de 25 mg, mais preferivelmente decerca de 0,75 a cerca de 20 mg, mais preferivelmente de cerca de 0,75 a cercade 15 mg, ainda mais preferivelmente de cerca de 0,5 a cerca de 10 mg, e omais preferivelmente de cerca de 2,5 a cerca de 10 mg por g de materialcelulósico.
Em outro aspecto preferido, a quantidade de proteínascelulolíticas por g de material celulósico é de cerca de 0,5 a cerca de 50 mg,preferivelmente de cerca de 0,5 a cerca de 40 mg, mais preferivelmente decerca de 0,5 a cerca de 25 mg, mais preferivelmente de cerca de 0,75 a cercade 20 mg, mais preferivelmente de cerca de 0,75 a cerca de 15 mg, ainda maispreferivelmente de cerca de 0,5 a cerca de 10 mg, e o mais preferivelmente decerca de 2,5 a cerca de 10 mg por g de material celulósico.
Nos métodos da presente invenção, a composição pode sersuplementada por uma ou mais atividades de enzima adicionais para melhorara degradação do material celulósico. As enzimas adicionais preferidas sãohemicelulases, esterases (por exemplo, lipases, fosfolipases, e/ou cutinases),proteases, lacases, peroxidases, ou misturas dos mesmos.
Nos métodos da presente invenção, a(s) enzima (s)adicional(ais) podem ser adicionada(s) antes de ou durante a fermentação,incluindo durante ou após a propagação do(s) microorganismo (s) defermentação.
As enzimas podem ser derivadas ou obtidas de qualquerorigem apropriada, incluindo, origem de bactérias, fungos, leveduras oumamíferos. O termo "obtido" significa aqui que a enzima pode ter sidoisolada de um organismo que naturalmente produz a enzima como umaenzima nativa. O termo "obtido" também significa aqui que a enzima pode tersido produzida recombinantemente em um organismo hospedeiro, em que aenzima recombinantemente produzida é ou nativa ou estranha para oorganismo hospedeiro ou tem uma seqüência de aminoácido modificada, porexemplo, tendo um ou mais aminoácidos que são deletados, inseridos e/ousubstituídos, isto é, uma enzima recombinantemente produzida que é ummutante e/ou um fragmento de uma seqüência de aminoácido nativa ou umaenzima produzida por processos de embaralhamento de ácido nucleicoconhecidos na arte. Estão englobadas dentro do significado de uma enzimanativa as variantes naturais e dentro do significado de uma enzima estranha asvariantes recombinantemente obtidas, como por mutagênese sítio-dirigido ouembaralhamento.
As enzimas também podem ser purificadas. O termo"purificado" como usado aqui cobre as enzimas livres de outros componentesdo organismo das quais ele é derivado. O termo "purificado" também cobre asenzimas livres de componentes do organismo nativo a partir das quais ele éobtido. As enzimas podem ser purificadas, com somente quantidades menoresde outras proteínas estando presentes. A expressão "outras proteínas" refere-se em particular a outras enzimas. O termo "purificado" como usado aquitambém refere-se à remoção de outros componentes, particularmente outrasproteínas e o mais particularmente outras enzimas presentes na célula deorigem da enzima da invenção. A enzima pode ser "substancialmente pura,"isto é, livre de outros componentes do organismo em que é produzida, isto é,por exemplo, um organismo hospedeiro para enzimas recombinantementeproduzidas. Em um aspecto preferido, as enzimas são pelo menos 75% (p/p),preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%,mais preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos95%, mais preferivelmente pelo menos 96%, mais preferivelmente pelomenos 97%, ainda mais preferivelmente pelo menos 98%, ou o maispreferivelmente pelo menos 99% puras. Em outro aspecto preferido, a enzimaé 100% pura.
As enzimas usadas na presente invenção podem estar emqualquer forma apropriada para uso nos processos descritos aqui, como, porexemplo, um caldo de fermentação bruto com ou sem células, um pó seco ougranulado, um granulado não pulverulento, um líquido, um líquidoestabilizado, ou uma enzima protegida. Granulados podem ser produzidos,por exemplo, como descrito na patente U.S. 4.106.991 e 4.661.452, eopcionalmente podem ser revestidos por processos conhecidos na arte.Preparações de enzima líquida podem, por exemplo, ser estabilizadas poradição de estabilizadores como um açúcar, um álcool de açúcar ou outropoliol, e/ou ácido láctico ou outro ácido orgânico de acordo com o processoestabelecido. As enzimas protegidas podem ser preparadas de acordo com oprocesso descrito em EP 238.216.
Os métodos da presente invenção podem ser usados paraprocessar um material celulósico para muitos produtos orgânicos, químicos ecombustíveis utilizáveis. Além disso, para etanol, algumas mercadorias eespecialmente produtos químicos que podem ser produzidos a partir decelulose incluem xilose, acetona, acetato, glicina, lisina, ácidos orgânicos (porexemplo, ácido láctico), 1,3-propanodiol, butanodiol, glicerol, etileno glicol,furfurai, poli-hidroxialcanoatos, eis, ácido cis-mucônico, e ração animal(Lynd, L. R., Wyman, C. E., e Gerngross, T. U., 1999, BiocommodityEngineering, Biotechnol, Prog., 15: 777 - 793; Philippidis, G. P., 1996,Cellulose bioconversion technology, in Handbook on Bioethanol: Productionand Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC5 179 -212, e Ryu, D. D. Y., e Mandeis, M., 1980, Cellulases: biosynthesis andapplications, Enz. Microb. Technol., 2: 91 - 102). Benefícios de co-produçãopotenciais se estendem além da síntese de produtos orgânicos múltiplos decarboidrato fermentável. Resíduos ricos em lignina restantes apósprocessamento biológico podem ser convertidos em produtos químicosderivados de lignina, ou usados para a produção de energia.
Métodos convencionais usados para processar o materialcelulósico de acordo com os métodos da presente invenção são bementendidos pelo versado na técnica. Os métodos da presente invenção podemser implementados usando qualquer aparelho de processamento de biomassaconvencional configurado para operar de acordo com a invenção.
Este aparelho pode incluir um reator agitado de batelada, umreator agitado de fluxo contínuo com ultrafiltração, um reator de coluna defluxo tampão contínuo (Gusakov, Α. V., e Sinitsyn, A. P., 1985, Kinetics ofthe enzymatic hydrolysis of cellulose: 1. A mathematical model for a batchreactor process, Enz. Microb. Technol. 7: 346 - 352), um reator por atrito(Ryu, S. K., e Lee, J. M., 1983, Biconversion of waste cellulose by using anattrition bioreactor, Bioteehnol Bioeng. 25: 53 - 65), ou um reator comagitação intensiva induzida por um campo eletromagnético (Gusakov, Α. V.,Sinitsyn, A. P., Davydkin, I. Y., Davydkin, V. Y., Protas, O. V., 1996,Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type ofbioreactor with intensive stirring induced by electromagnetic field, Appl.Biochem. Biotechnol 56: 141 - 153).
Os métodos convencionais incluem, mas não são limitados a,sacarificação, fermentação, hidrólise e fermentação separadas (SHF),sacarificação e fermentação simultâneas (SSF), sacarificação e co-fermentação simultâneas (SSCF), hidrólise e fermentação híbridas (HHF), econversão microbiana direta (DMC).
SHF usa etapas de processo separadas para primeiro hidrolisarenzimaticamente a celulose em glicose e então fermentar a glicose em etanol.Em SSF, a hidrólise enzimática de celulose e a fermentação de glicose emetanol é combinada em uma etapa (Philippidis, G. P., 1996, Cellulosebioconversion technology, in Handbook on Bioethanol: Production andUtilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179 -212). SSCF inclui a co-fermentação de açúcares múltiplos (Sheehan, J., eHimmel, M., 1999, Enzymes, energy and the environment: A strategicperspective on the U.S. Department of Energy's research and developmentactivities for bioethanol, Biotechnol. Prog. 15: 817 - 827). HHF inclui duasetapas separadas realizadas no mesmo reator mas em temperaturas diferentes,isto é, sacarificação enzimática de temperatura elevada seguido por SSF emuma temperatura inferior que a cepa de fermentação pode tolerar. DMCcombina todos os três processos (produção de celulase, hidrólise de celulose,e fermentação) em uma etapa (Lynd, L. R., Weimer, P. J., van Zyl, W. H., ePretorius, I. S., 2002, Microbial cellulose utilization: Fundamentais andbiotechnology, Microbiol. Mol. Biol. Reviews 66: 506 - 577).
"Fermentação" ou "processo de fermentação" refere-se aqualquer processo de fermentação ou qualquer processo compreendendo umaetapa de fermentação. Um processo de fermentação inclui, sem limitação,processos de fermentação usados para produzir produtos de fermentaçãoincluindo álcoois (por exemplo, arabinitol, butanol, etanol, glicerol, metanol,1,3-propanodiol, sorbitol, e xilitol); ácidos orgânicos (por exemplo, ácidoacético, ácido acetônico, ácido adípico, ácido ascórbico, ácido cítrico, ácido2,5-diceto-D-glucônico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido glucárico, ácidoglucônico, ácido glucurônico, ácido glutárico, ácido 3-hidroxipropiônico,ácido itacônico, ácido láctico, ácido málico, ácido malônico, ácido oxálico,ácido propiônico, ácido succínico, e ácido xilônico); cetonas (por exemplo,acetona); aminoácidos (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico,glicina, lisina, serina, e treonina); gases (por exemplo, metano, hidrogênio(H2), dióxido de carbono (CO2), e monóxido de carbono (CO)). Processos defermentação também incluem processos de fermentação usados na indústriade álcool consumível (por exemplo, cerveja e vinho), indústria de laticínios(por exemplo, laticínios fermentados), indústria de couro, e indústria de fumo.
A presente invenção ainda refere-se a métodos de produziruma substância, compreendendo: (a) sacarificar um material celulósico comuma composição compreendendo uma quantidade eficaz de um polipeptídeotendo atividade de endoglucanase; (b) fermentar o material celulósicosacarificado de etapa (a) com um ou mais microorganismos de fermentação; e(c) recuperar a substância da fermentação. A composição compreendendo opolipeptídeo tendo atividade de endoglucanase pode estar na forma de umcaldo de fermentação bruto com ou sem as células removidas ou na forma deuma preparação de enzima semi-purificada ou purificada ou a composiçãopode compreender uma célula hospedeira da presente invenção como umafonte do polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase em um processo defermentação com a biomassa.
A substância pode ser qualquer substância derivada dafermentação. Em uma forma de realização preferida, a substância é um álcool.Deve-se entender que o termo "álcool" engloba uma substância que contémuma ou mais porções de hidroxila. Em uma forma de realização maispreferida, o álcool é arabinitol. Em outra forma de realização mais preferida,o álcool é butanol. Em outra forma de realização mais preferida, o álcool éetanol. Em outra forma de realização mais preferida, o álcool é glicerol. Emoutra forma de realização mais preferida, o álcool é metanol. Em outra formade realização mais preferida, o álcool é 1,3-propanodiol. Em outra forma derealização mais preferida, o álcool é sorbitol. Em outra forma de realizaçãomais preferida, o álcool é xilitol. Ver, por exemplo, Gong, C. S., Cao, N, J.,Du, J., e Tsao, G, T., 1999, Ethanol production from renewable resources, inAdvances in Biochemieal Engineering/Bioteehnology, Scheper, T., ed.,Springer-Verlag Berlin Heideiberg, Alemanha, 65: 207 - 241; Silveira, M. M.,e Jonas, R., 2002, The biotechnological production of sorbitol, Appl.Mierobiol. Bioteehnol 59: 400 - 408; Nigam, P., e Singh, D., 1995, Processesfor fermentative production of xylitol - a sugar substitute, ProeessBioehemistry 30 (2): 117 - 124; Ezeji, T. C., Qureshi, N. e Blaschek, H. P.,2003, Production of acetone, butanol and ethanol by Clostridium beijerinekiiBAlOl and in situ recovery by gas stripping, World Journal of Mierobiologyand Bioteehnology 19 (6): 595 - 603.
Em outra forma de realização preferida, a substância é umácido orgânico. Em outra forma de realização mais preferida, o ácidoorgânico é ácido acético. Em outra forma de realização mais preferida, oácido orgânico é ácido acetônico. Em outra forma de realização maispreferida, o ácido orgânico é ácido adípico. Em outra forma de realizaçãomais preferida, o ácido orgânico é ácido ascórbico. Em outra forma derealização mais preferida, o ácido orgânico é ácido cítrico. Em outra forma derealização mais preferida, o ácido orgânico é ácido 2,5-diceto-D-glucônico.Em outra forma de realização mais preferida, o ácido orgânico é ácidofórmico. Em outra forma de realização mais preferida, o ácido orgânico éácido fumárico. Em outra forma de realização mais preferida, o ácidoorgânico é ácido glucárico. Em outra forma de realização mais preferida, oácido orgânico é ácido glucônico. Em outra forma de realização maispreferida, o ácido orgânico é ácido glucurônico. Em outra forma de realizaçãomais preferida, o ácido orgânico é ácido glutárico. Em outra forma derealização preferida, o ácido orgânico é ácido 3-hidroxipropiônico. Em outraforma de realização mais preferida, o ácido orgânico é ácido itacônico. Emoutra forma de realização mais preferida, o ácido orgânico é ácido láctico. Emoutra forma de realização mais preferida, o ácido orgânico é ácido málico. Emoutra forma de realização mais preferida, o ácido orgânico é ácido malônico.Em outra forma de realização mais preferida, o ácido orgânico é ácidooxálico. Em outra forma de realização mais preferida, o ácido orgânico éácido propiônico. Em outra forma de realização mais preferida, o ácidoorgânico é ácido succínico. Em outra forma de realização mais preferida, oácido orgânico é ácido xilônico. Ver, por exemplo, Chen, R., e Lee, Y. Y.,1997, Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acid productionfrom cellulosic biomass, Appl. Biochem, Biotechnol. 63-65: 435 - 448.
Em outra forma de realização preferida, a substância é umacetona. Deve-se entender que o termo "cetona" engloba uma substância quecontém uma ou mais porções de cetona. Em outra forma de realização maispreferida, a cetona é acetona. Ver, por exemplo, Qureshi e Blaschek, 2003,supra.
Em outra forma de realização preferida, a substância é umaminoácido. Em outra forma de realização mais preferida, o ácido orgânico éácido aspártico. Em outra forma de realização mais preferida, o aminoácido éácido glutâmico. Em outra forma de realização mais preferida, o aminoácido églicina. Em outra forma de realização mais preferida, o aminoácido é lisina.Em outra forma de realização mais preferida, o aminoácido é serina. Em outraforma de realização mais preferida, o aminoácido é treonina. Ver, porexemplo, Richard, A., e Margaritis, A., 2004, Empirical modeling of batchfermentation kinetics for poly (glutamic acid) production and other microbialbiopolymers, Biotechnology andBioenginnering 87 (4): 501 - 515.
Em outra forma de realização preferida, a substância é um gás.Em outra forma de realização mais preferida, o gás é metano. Em outra formade realização mais preferida, o gás é H2. Em outra forma de realização maispreferida, o gás é CO2. Em outra forma de realização mais preferida, o gás éCO. Ver, por exemplo, Kataoka, N., A. Miya, e K. Kiriyama, 1997, Studieson hydrogen production by continuous culture system of hydrogen-producinganaerobic bactéria, Water Science and Technology 38 (6-7): 41 - 47; eGunaseelan V. N. in Biomass and Bioenergy, vol. 13 (1-2), pp. 83 - 114,1997, Anaerobic digestion of biomass for methane production: A review.
Produção de uma substância de material celulósico tipicamenterequer quatro etapas principais. Estas quatro etapas são pré-tratamento,hidrólise enzimática, fermentação, e recuperação. Exemplificado abaixo é umprocesso para produzir etanol, mas deve-se entender que processos similarespodem ser usados para produzir outras substâncias, por exemplo, assubstâncias descritas acima.
Pré-tratamento. No pré-tratamento ou etapa de pré-hidrólise, omaterial celulósico é aquecido para romper a lignina e estrutura decarboidrato, solubilizar a maior parte da hemicelulose, e tornar a fração decelulose accessível para enzimas celulolíticas. O aquecimento é realizado oudiretamente com vapor ou em suspensão onde um catalisador também podeser adicionado no material para acelerar as reações. Os catalisadores incluemácidos fortes, como ácido sulfurico e SO2, ou alcalino, como hidróxido desódio. O propósito do estágio de pré-tratamento é para facilitar a penetraçãodas enzimas e microorganismos. A biomassa celulósica também pode sersubmetida a um pré-tratamento de explosão a vapor hidrotérmico (ver pedidode patente 20020164730).
Sacarificação. Na etapa de hidrólise enzimática, tambémconhecida como sacarificação, as enzimas como descrito aqui são adicionadasno material pré-tratado para converter a fração de celulose para glicose e/ououtros açúcares. A sacarificação geralmente é realizada em reatores detanques agitados ou fermentadores sob condições controladas de pH,temperatura, e mistura. Uma etapa de sacarificação pode durar 200 horas. Asacarificação pode ser realizada em temperaturas de cerca de 3 O0C a cerca de65°C, em particular, em torno de 50°C, e a um pH na faixa entre cerca de 4 acerca de 5, especialmente em torno de pH 4,5. Para produzir glicose que podeser metabolizada por levedura, a hidrólise é tipicamente realizada na presençade uma beta-glucosidase.
Fermentação. Na etapa de fermentação, açúcares, liberados domaterial celulósico como um resultado das etapas de hidrólise enzimática epré-tratamento, são fermentados em etanol por um organismo de fermentação,como levedura. A fermentação também pode ser realizada simultaneamentecom a hidrólise enzimática no mesmo vaso, novamente sob condiçõescontroladas de pH, temperatura, e mistura. Quando a sacarificação efermentação são realizadas simultaneamente no mesmo vaso, o processogeralmente é chamado sacarificação e fermentação simultâneas ou SSF.
Qualquer substrato apropriado celulósico ou matéria primapode ser usado em um processo de fermentação da presente invenção. Osubstrato geralmente é selecionado com base no produto de fermentaçãodesejado, isto é, a substância a ser obtida da fermentação, e o processoempregado, como é bem conhecido na arte. Exemplos de substratosapropriados para usar nos métodos da presente invenção incluem materiaiscontendo celulose, como resíduos de madeira ou planta ou açúcares de baixopeso molecular DP1-3 obtidos a partir de material celulósico processado quepode ser metabolizado pelo microorganismo de fermentação, e que pode serfornecido por adição direta ao meio de fermentação.
O termo "meio de fermentação" será entendido como fazendoreferência a um meio antes do(s) microorganismo (s) de fermentação seradicionado(s), como, um meio resultante de um processo de sacarificação,assim como um meio usado em um processo de sacarificação e fermentaçãosimultâneas (SSF).
"Microorganismo de fermentação" refere-se a qualquermicroorganismo apropriado para uso em um processo de fermentaçãodesejado. Os microorganismos de fermentação apropriados de acordo com ainvenção são capazes de fermentar, isto é, converter, açúcares, como glicose,xilose, arabinose, manose, galactose, ou oligossacarídeos diretamente ouindiretamente no produto de fermentação desejado. Exemplos demicroorganismos de fermentação incluem organismos de fungos, comoleveduras. As leveduras preferidas incluem cepas de Saccharomyces spp., eem particular, Saceharomyces eerevisiae. A levedura comercialmentedisponível inclui, por exemplo, Red Star®/™/Lesaffre Ethanol Red(disponível de Red Star/Lesaffre, USA) FALI (disponível de Fleischmann'sYeast, a division of Burns Philp Food Inc., USA), SUPERSTART (disponívelde Alltech), GERT STRAND (disponível de Gert Strand AB, Suécia) eFERMIOL (disponível de DSM Specialties).
Em uma forma de realização preferida, a levedura éSaccharomyees spp. Em uma forma de realização mais preferida, a levedura éSaccharomyees eerevisiae. Em outra forma de realização mais preferida, alevedura é Saccharomyees distaticus. Em outra forma de realização maispreferida, a levedura é Saccharomyces uvarum. Em outra forma de realizaçãopreferida, a levedura é Kluyveromyces. Em outra forma de realização maispreferida, a levedura é Kluyveromyces marxianus. Em outra forma derealização mais preferida, a levedura é Kluyveromyces fragilis. Em outraforma de realização preferida, a levedura é Candida. Em outra forma derealização mais preferida, a levedura é Candida pseudotropiealis. Em outraforma de realização mais preferida, a levedura é Candida brassieae. Em outraforma de realização preferida, a levedura é uma Clavispora. Em outra formade realização mais preferida, a levedura é Clavispora lusitaniae. Em outraforma de realização mais preferida, a levedura é Clavispora opuntiae. Emoutra forma de realização preferida, a levedura é Paehysolen. Em outra formade realização mais preferida, a levedura é Paehysolen tannophilus. Em outraforma de realização preferida, a levedura é Bretannomyees. Em outra formade realização mais preferida, a levedura é Bretannomyees elausenii(Philippidis, G. P., 1996, Cellulose bioconversion technology, in Handbookon Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor &Francis, Washington, DC, 179-212).
Bactérias que podem eficientemente fermentar glicose emetanol incluem, por exemplo, Zymomonas mobilis e Clostridiumthermocellum (Philippidis, 1996, supra).
E bem conhecido na técnica que os organismos descritosacima também podem ser usados para produzir outras substâncias, comodescrito aqui.
A clonagem de genes heterólogos em Saccharomyceseerevisiae (Chen, Z., Ho, N. W. Y., 1993, Cloning and improving theexpression of Piehia stipitis xylose redutase gene in Saccharomyeeseerevisiae, Appl. Bioehem. Bioteehnol. 39 - 40: 135 - 147; Ho, N. W. Y.,Chen, Z, Brainard, A. P., 1998, Genetically engineered Saccharomyees yeastcapable of effectively co-fermenting glicose and xylose, Appl. Environ.Mierobiol. 64: 1852 - 1859), ou em bactérias como Eseheriehia eoli (Beall, D.S., Qhta, K., Ingram, L. O., 1991, Parametric studies of ethanol productionfrom xylose and other sugars by recombinant Eseheriehia eoli, Bioteeh.Bioeng, 38: 296 - 303), Klebsiella oxytoea (Ingram, L. O., Gomes, P. F., Lai,X., Moniruzzaman, M., Wood, B. E., Yomano, L. P., York, S. W., 1998,Metabolic engineering of bactéria for ethanol production, Bioteehnol. Bioeng.58: 204 - 214), e Zymomonas mobilis (Zhang, M., Eddy, C., Deanda, K.,Finkelstein, M., e Picataggio, S., 1995, Metabolic engineering of a pentosemetabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobitis, Science 267: 240 -243; Deanda, K., Zhang, M., Eddy, C., e Picataggio, S., 1996, Developmentof an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathwayengineering, Appl. Environ. Mierobiol, 62: 4465 - 4470) tem levado àconstrução de organismos capazes de converter hexoses e pentoses em etanol(co-fermentação).
Levedura ou outro microorganismo tipicamente é adicionado àcelulose ou hidrolisado degradado e a fermentação prossegue durante cerca de24 a cerca de 96 horas, como cerca de 35 e a cerca de 60 horas. A temperaturaé tipicamente entre cerca de 26°C a cerca de 40°C, em particular de cerca de32°C, a cerca de pH 3 a cerca de pH 6, em particular em torno de pH 4-5.
Em uma forma de realização preferida, levedura ou outromicroorganismo é aplicado na celulose degradada ou hidrolisada e afermentação prossegue durante cerca de 24 a cerca de 96 horas, comotipicamente 35-60 horas. Em uma forma de realização preferida, atemperatura geralmente é entre cerca de 26 a cerca de 40°C, em particular decerca de 32°C, e o pH geralmente é de cerca de pH 3 a cerca de pH 6,preferivelmente em torno de pH 4-5. Levedura ou outro microorganismo épreferivelmente aplicado em quantidades de aproximadamente IO5 a IO12,preferivelmente de aproximadamente IO7 a IO10, especialmenteaproximadamente 5x10 contagem viável por ml de caldo de fermentação.Durante uma fase de produção de etanol, a contagem de célula de leveduradeve preferivelmente estar na faixa de aproximadamente IO7 a IO10,especialmente em torno de aproximadamente 2 χ IO8. Outra diretriz comrelação ao uso de levedura para fermentação pode ser encontrada em, porexemplo, "The Alcohol Textbook" (Editores K. Jacques, Τ. P. Lyons e D. R.Kelsall, Nottingham University Press, United Kingdom 1999), que éincorporado aqui por referência.
O processo na técnica mais amplamente usado é o processo desacarificação e fermentação simultâneas (SSF) onde não se tem um estágio demanutenção para a sacarificação, significando que a levedura e a enzima sãoadicionadas juntas.
Para a produção de etanol, após a fermentação, a massa édestilada para extrair o etanol. O etanol obtido de acordo com o processo dainvenção pode ser usado como, por exemplo, etanol de combustível; etanolpara bebidas, isto é, álcool neutro potável, ou etanol industrial.Um estimulador de fermentação pode ser usado emcombinação com qualquer um dos processos enzimáticos descritos aqui paraainda melhorar o processo de fermentação, e em particular, o desempenho domicroorganismo de fermentação, como, melhora da taxa e rendimento deetanol. Um "estimulador de fermentação" refere-se a estimuladores paracrescimento dos microorganismos de fermentação, em particular, levedura.Estimuladores de fermentação preferidos para crescimento incluem vitaminase minerais. Exemplos de vitaminas incluem multivitaminas, biotina,pantotenato, ácido nicotínico, meso-inositol, tiamina, piridoxina, ácido para-aminobenzóico, ácido fólico, riboflavina, e vitaminas A, B, C, D, e E. Ver,por exemplo, Alfenore et ai., Improving ethanol production and viability ofSaccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batchprocess, Springer-Verlag (2002), que é incorporado aqui por referência.
Exemplos de minerais incluem minerais e sais minerais que podem suprirnutrientes compreendendo Ρ, K, Mg, S, Ca, Fe, Zn, Mn, e Cu.
Recuperação. O álcool é separado do material celulósicofermentado e purificado por métodos convencionais de destilação. Etanol comuma pureza de até cerca de 96% em volume de etanol pode ser obtido, quepode ser usado como, por exemplo, etanol combustível, etanol para bebidas,isto é, álcool neutro potável, ou etanol industrial.
Para outras substâncias, qualquer método conhecido na técnicapode ser usado incluindo, mas não limitado a, cromatografia (por exemplo,troca iônica, afinidade, hidrofóbico, cromatofocalização, e exclusão portamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focalização isoelétricopreparativa), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação com sulfatode amônio), SDS-PAGE, destilação, ou extração.
Nos métodos da presente invenção, o polipeptídeo tendoatividade de endoglucanase e outra proteína (s) celulolítica (s) pode sersuplementado por uma ou mais atividades de enzima adicionais para melhorara degradação do material celulósico. As enzimas adicionais preferidas sãohemicelulases, esterases (por exemplo, lipases, fosfolipases, e/ou cutinases),proteases, lacases, peroxidases, ou misturas dos mesmos.
Nos métodos da presente invenção, a (s) enzima (s) adicional(ais) pode (m) ser adicionada (s) antes ou durante a fermentação, incluindodurante ou após a propagação do (s) microorganismo (s) de fermentação.Pró-peptídeos e Peptídeos de Sinal
A presente invenção também refere-se às construções de ácidonucleico compreendendo um gene codificando uma proteína, em que o gene éligado operativamente a uma ou ambas dentre uma primeira seqüência denucleotídeos codificando um peptídeo de sinal compreendendo ou consistindode aminoácidos 1 a 16 de SEQ ID NO: 4, aminoácidos 1 a 15 de SEQ ID NO:6, aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO: 8, ou aminoácidos 1 a 16 de SEQ IDNO: 10 e uma segunda seqüência de nucleotídeos codificando um pró-peptídeo compreendendo ou consistindo de aminoácidos 17 a 24 de SEQ IDNO: 10, em que um gene é estranho para uma primeira e segunda seqüênciade nucleotídeos.
Em um aspecto preferido, a primeira seqüência denucleotídeos compreende ou consiste de nucleotídeos 19 a 69 de SEQ ID NO:3. Em outro aspecto preferido, a primeira seqüência de nucleotídeoscompreende ou consiste de nucleotídeos 39 a 83 de SEQ ID NO: 5. Em outroaspecto preferido, a primeira seqüência de nucleotídeos compreende ouconsiste de nucleotídeos 14 a 76 de SEQ ID NO: 7. Em outro aspectopreferido, a primeira seqüência de nucleotídeos compreende ou consiste denucleotídeos 1 a 48 de SEQ ID NO: 9. Em outro aspecto preferido, a segundaseqüência de nucleotídeos compreende ou consiste de nucleotídeos 49 a 72 deSEQ ID NO: 9.
A presente invenção também refere-se a vetores de expressãorecombinantes e células hospedeiras recombinantes compreendendo taisconstruções de ácido nucleico.
A presente invenção também refere-se a métodos paraproduzir uma proteína compreendendo (a) cultivar esta célula hospedeirarecombinante sob condições apropriadas para produção da proteína; e (b)recuperar a proteína.
A proteína pode ser nativa ou heteróloga para uma célulahospedeira. O termo "proteína" não se destina aqui a fazer referência a umcomprimento específico do produto codificado e, assim, engloba peptídeos,oligopeptídeos, e proteínas. O termo "proteína" também engloba dois ou maispolipeptídeos combinados para formar o produto codificado. As proteínastambém incluem polipeptídeos híbridos que compreendem uma combinaçãode seqüências de polipeptídeo completa ou parcial obtidas dentre pelo menosduas proteínas diferentes em que uma ou mais pode ser heteróloga ou nativana célula hospedeira. Proteínas ainda incluem variações alélicas de ocorrêncianatural e engenheiradas das proteínas e proteínas híbridas mencionadas acima.
Preferivelmente, a proteína é um hormônio ou variante domesmo, enzima, receptor ou porção do mesmo, anticorpo ou porção domesmo, ou repórter. Em um aspecto mais preferido, a proteína é umoxidoredutase, transferase, hidrolase, liase, isomerase, ou ligase. Em umaspecto ainda mais preferido, a proteína é um aminopeptidase, amilase,carbohidrase, carboxipeptidase, catalase, celulase, quitinase, cutinase,ciclodextrina glicosilfransferase, deoxiribonuclease, esterase, alfa-galactosidase, beta- galactosidase, glucoamilase, alfa-glucosidase, beta-glucosidase, invertase, lacase, outro lipase, manosidase, mutanase, oxidase,enzima pectinolítica, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica,ribonuclease, transglutaminase ou xilanoase.
O gene pode ser obtido a partir de qualquer procariótico,eucariótico, ou outra fonte.
A presente invenção é ainda descrita pelos seguintes exemplosque não devem ser considerados como limitando o escopo da invenção.
Exemplos
Materiais
Os produtos químicos usados como tampões e substratosforam produtos comerciais de pelo menos um tipo reagente.
Cepas
Myceliophthora thermophila CBS 117.65, basidiomicete CBS494.95, basidiomicete CBS 495.95, e Penieillium brasilianum cepa IBT20888 (IBT Culture Collection of Fungi, Technical University of Dinamarca,Copenhagen, Dinamarca) foram usadas como fontes dos genes deendoglucanase. Saccharomyees eerevisiae Cepa W3124 (MATa; ura 3-52; leu2-3, 112; his 3-D200; pep 4-1137; prcl::HIS3; prbl:: LEU2; cir+) foi usadapara a triagem de bibliotecas de expressão de Myceliophthora thermophilaCBS 117.65 para a atividade de endoglucanase. Aspergillus oryzae HowB 104(alfa-amilase-negativa) foi usada para expressão dos genes eel5a.
Meios de Cultura e Soluções
Meio LB foi composto, por litro, de 10 g de triptona, 5 g deextrato de levedura, e 5 g de cloreto de sódio.
Meio de ampicilina LB foi composto, por litro, de 10 g detriptona, 5 g de extrato de levedura, 5 g de cloreto de sódio, e 50 μg deampicilina por ml (filtro esterilizado, adicionado após autoclavagem).
Placas de ampicilina LB foram compostas, por litro, de meiode ampicilina LB e 15 g de ágar bacto.
Meio YPD foi composto de extrato de levedura a 1%, peptonaa 2%, e glicose a 2% de filtro esterilizado adicionado após autoclavagem.
Meio YPM foi composto de 1% extrato de levedura, peptona a2%, e maltodextrina a 2% de filtro esterilizado adicionado apósautoclavagem.
Meio SC-URA com galactose foi composto, por litro, de 100ml de 10X sais Basal, 28 ml de ácidos casamino a 20% sem vitaminas* 10 mlde 1% triptofano, 3,6 ml de treonina a 5% (filtro esterilizado, adicionado apósautoclavagem), e 100 ml de galactose a 20% (filtro esterilizado, adicionadoapós autoclavagem).
Meio SC-URA com glicose foi composto, por litro, de 100 mlde 10X solução de sais Basal, 28 ml de ácidos casamino a 20% semvitaminas, 10 ml de triptofano a 1%, 3,6 ml de treonina a 5% (filtroesterilizado, adicionado após autoclavagem), e 100 ml de glicose a 20% (filtroesterilizado, adicionado após autoclavagem).
Solução 10X de sais Basal foi composta, por litro, de 75 g debase de nitrogênio de levedura, 113 g de ácido succínico, e 68 g de NaOH.
SC-ágar foi composto, por litro, de meio SC-URA (comglicose ou galactose como indicado) e 20 g de ágar.
Placas de agar SC de celulose AZCL HE a 0,1% comgalactose foram compostas, por litro, de meio SC-URA com galactose, 20 gde ágar, e celulose AZCL HE a 0,1% (Megazyme, Wicklow, Irlanda).
Meio BA foi composto, por litro, de 10 g de material seco delicor de milho, 10 g de NH4NO3, 10 g de KH2PO4, 0,75 g de MgS04-7H20,0,1 ml de plurônico, e 0,5 g de CaCO3. O pH foi ajustado para 6,5 antes daautoclavagem.
Placas COVE foram compostas, por litro, de 342,3 g desacarose, 25 g de ágar Noble, 20 ml de solução de sais COVE, 10 mM deacetamida, e 20 mM de CsCI. A solução foi ajustada a pH 7,0 antes daautoclavagem.
Solução de sais COVE foi composta, por litro, de 26 g de KCl,26 g de MgSO4-7H20, 76 g de KH2PO4, e 50 ml de metais de traço COVE.
Solução de metais de traço COVE foi composta, por litro, de0,04 g de NaB407·IOH2O, 0,4 g de CuS04-5H20, 1,2 g de FeS04-7H20, 0,7 gde MnSO4 H2O, 0,8 g de Na2Mo02-2H20, e 10 g de ZnS04-7H20.TE foi composto de 10 mM de Tris pH 7,4 e 0,1 mM deEDTA.
Exemplo 1: Construção de bibliotecas de expressão de cDNA deMyceliophthora thermophila CBS 117.65 em Saccharomyees eerevisiae
Myceliophthora thermofila CBS 117.65 foi cultivado em 200ml de meio BA a 30° C durante cinco dias a 200 rpm. Micélios da cultura dofrasco de agitação foram coletadas por filtração dos conteúdos através de umfunil forrado com Miracloth™ (CalBiochem, San Diego, CA, USA). Micéliosforam então ensaduichadas entre dois pedaços de Miracloth™ e secadas comtoalhas de papel absorvente. A massa miceliana foi então transferida paratubos plásticos de centrífuga Falcon 1059 e congelada em nitrogênio líquido.Micélios congeladas foram armazenadas em um congelador a -80°C até usar.
A extração de RNA total foi realizada com tiocianato deguanidina seguido por ultracentrifiigação através de uma almofada 5,7 M deCsCl, e isolamento de poli(A)+RNA foi realizado por cromatografia deafinidade de oligo(dT)-celulose, usando os procedimentos descritos em WO94/14953.
cDNA filamento duplo foi sintetizado a partir de 5 μg depoli(A)+ RNA pelo método RNase H (Gubler e Hoffman, 1983, Gene 25: 263- 289, Sambrook et aL, 1989, Molecular eloning: A laboratory manual, ColdSpring Harbor Iab., Cold Spring Harbor, NY, USA). O poli(A)+ RNA (5 μgem 5 μl de água tratada com DEPC (0,1% de dietilpirocarbonato)) foiaquecido a 70°C durante 8 minutos em um pré-siliconizado, tubo Eppendorfisento de RNase-, resinado bruscamente em gelo, e combinado em umvolume final de 50 μl com tampão transcriptase reverso composto de 50 mMde Tris-HCI, pH 8,3, 75 mM de KCl, 3 mM de MgCl2, 10 mM de ditiotreitol(DTT) (Bethesda Research Laboratories, Bethesda, MD, USA), 1 mM dedATP, dGTP e dTTP, e 0,5 mM de 5-metil-dCTP (Pharmacia, Uppsala,Suécia), 40 unidades de inibidor de ribonuclease placental humano (RNasin,Promega, Madison, WI, USA), 1,45 de iniciador oligo(dT),8-Mtf /(Pharmacia), e 1000 unidades de transcriptase reversa de SuperScript IIRNase H (Bethesda Research Laboratories). cDNA de primeiro filamento foisintetizado por incubação da mistura de reação a 45 0C durante 1 hora. Apóssíntese, a mistura híbrida de mRNA:cDNA foi filtrada em gel através de umacoluna giratória MicroSpin S-400 HR (Pharmacia) de acordo com asinstruções dos fabricantes.
Após a filtração em gel, os híbridos foram diluídos em 250 μΐde tampão do segundo de filamento (20 mM de Tris-HCl, pH 7,4, 90 mM deKCl, 4,6 mM de MgCl2, 10 mM (NH4)2SO4, 0,16 mM de NAD) contendo 200μΜ de cada dNTP, 60 unidades de E. coli DNA polimerase I (Pharmacia),5,25 unidades de RNase H (Promega), e 15 unidades de E. coli DNA ligase(Boehringer Mannheim, Manheim, Alemanha). A síntese de cDNA desegundo filamento foi realizada por incubação do tubo de reação a 16 0Cdurante 2 horas e um adicional de 15 minutos a 25 0C. A reação foi parada poradição de EDTA em uma concentração final de 20 mM seguido por extraçõescom fenol e clorofórmio.
O cDNA filamento duplo foi precipitado a -20°C durante 12horas por adição de 2 volumes de 96% de etanol e 0,2 volume de 10 M deacetato de amônio, recuperado por centrifugação a 13.000 χ g, lavado em70% de etanol, secado, e recolocado em suspensão em 30 μΐ de tampãonuclease de feijão Mung (30 mM de acetato de sódio pH 4,6, 300 mM deNaCl, 1 mM de ZnSO4, 0,35 mM de DTT, 2% de glicerol) contendo 25unidades de nuclease de feijão Mung (Pharmacia). O DNA de filamento único"grampo de cabelo" foi preso por incubação da reação a 30°C durante 30minutos, seguido por adição de 70 μΐ de 10 mM de Tris-HCl-I mM EDTA pH7,5, extração por fenol, e precipitação com 2 volumes de 96% de etanol e 0,1volume de 3 M de acetato de sódio pH 5,2 em gelo durante 30 minutos.
Os cDNAs filamento duplo foram recuperados porcentrifugação a 13.000 χ g e terminados de modo obtuso em 30 μl de tampãoT4 DNA polimerase (20 mM de Tris -acetato, pH 7,9, 10 mM de acetato demagnésio, 50 mM de acetato de potássio, 1 mM de DTT) contendo 0,5 mMde cada dNTP e 5 unidades de T4 DNA polimerase (New England Biolabs,Ipswich, MA, USA) por incubação da mistura de reação a 16°C durante 1hora. A reação foi parada por adição de EDTA em uma concentração final de20 mM, seguido por extrações com fenol e clorofórmio, e precipitaçãodurante 12 horas a -20°C por adição de 2 volumes de etanol a 96% e 0,1volume de 3 M de acetato de sódio pH 5,2.
Após a reação de suprimento, os cDNAs foram recuperadospor centrifugação a 13.000 χ g, lavados em 70% de etanol, e secados. Ogrânulo de cDNA foi recolocado em suspensão em 25 μl de tampão deligação (30 mM de Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM de MgCl2, 10 mM de DTT, 0,5mM de ATP) contendo 2,5 μg de adaptadores não palindrômicos Bst XI(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), mostrados abaixo, e 30 unidades de T4ligase (Promega), e então incubados a 16°C durante 12 horas. A reação foiparada por aquecimento a 65°C durante 20 minutos e então resfiriada em gelodurante 5 minutos.
5'-CTTTCCAGCACA-3' (SEQ ID NO: 1)
3'-GAAAGGTC-5' (SEQ ID NO. 2)
O cDNA adaptado foi digerido com Not I, seguido porincubação durante 2,5 horas a 37 0C. A reação foi parada por aquecimento a65°C durante 10 minutos. Os cDNAs foram fracionados em tamanho poreletroforese gel em um agarose gel a 0,8% SeaPlaque GTG de temperatura defusão baixa (Cambrex Corporation, East Rutherford, NJ, USA) em 44 mM deTris Base, 44 mM de ácido bórico, 0,5 mM de tampão EDTA (TBE) paraseparar adaptadores não ligados e cDNAs pequenos. O cDNA foi selecionadopor tamanho com um corte a 0,7 kb e resgatado do por uso de β-Agarase(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) de acordo com as instruções dosfabricantes e precipitado durante 12 horas a -20°C por adição de doisvolumes de etanol a 96% e 0,1 volume de acetato de sódio 3 M pH 5,2.
O cDNA direcional, selecionado por tamanho, foi recuperadopor centrifugação a 13.000 χ g, lavado em 70% de etanol, secado, e entãorecolocado em suspensão em 30 μΐ de 10 mM de Tris-HCl-I mM de EDTApH 7,5. Os cDNAs foram dessalinizadas por filtração em gel através de umacoluna giratória MicroSpin S-300 HR de acordo com as instruções dosfabricantes. Três ligações de teste foram realizadas em 10 μΐ de tampão deligação (30 mM de Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM de MgCl2, 10 mM de DTT, 0,5mM de ATP) contendo 5 μΐ de cDNA filamento duplo (tubos de reação #1 e#2), 15 unidades de T4 ligase (Promega), e 30 ng (tubo #1), 40 ng (tubo #2), e40 ng (tubo #3, controle de fundo de vetor) de vetor Bst XI-Not I clivadopYES2,0 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). As reações de ligação foramrealizadas por incubação a 16 0C durante 12 horas, então aquecimento a 70°Cdurante 20 minutos, e finalmente adição de 10 μΐ de água em cada tubo. UmμL de cada mistura de ligação foi electroporado em 40 μΐ de célulaseletrocompetentes de E. coli DH 10B (Bethesda Research Laboratories) comodescrito por Sambrook et ai., 1989, supra.
A biblioteca de cDNA de Myceliophthora thermophila CBS117.65 foi estabelecida em E. coli DH 10B consistindo de massas. Cadamassa foi feita por espalhamento de E. coli transformado em placas deampicilina LB, dando 15.000 - 30.000 colônias/placa após incubação a 37 0Cdurante 24 horas. Vinte ml de meio de ampicilina LB foram adicionados naplaca e as células foram colocadas em suspensão dentro da mesma. Asuspensão de célula foi agitada a 100 rpm em um tubo de 50 ml durante 1hora a 37 0C.
A biblioteca de cDNA de Myceliophthora thermophila CBS117,65 resultante consistia de aproximadamente IO6 clones individuais, comum vetor de fiando de 1%. DNA de plasmídeo de algumas das massas dabiblioteca foi isolado usando um kit de Plasmídeo Midi (QIAGEN Inc.,Valencia, CA, USA), de acordo com as instruções dos fabricantes, earmazenado a -20°C.
Exemplo 2: Triagem de bibliotecas de expressão de Myceliophthorathermophila CBS 117.65 para atividade de endoglucanase
Alíquotas de 1 ml de plasmídeo de DNA purificado (100ng/ml) de algumas das massas da biblioteca (exemplo 1) foram transformadasem Saccharomyces eerevisiae W3124 por eletroporação (Becker e Guarante,1991, Methods Enzymol. 194: 182 - 187) e os transformantes foram colocadosem ágar SC contendo 2% de glicose e incubados a 30°C . No total, 50 - 100placas contendo 250 - 400 colônias de levedura foram obtidas de cada massa.
Após 3-5 dias de incubação, as placas de ágar SC foramcolocadas em placas de réplica obre um conjunto de placas de agar decelulose SC de AZCL URA a 0,1% com galactose. As placas foram incubadasdurante 2-4 dias a 30°C e colônias positivas de endoglucanase foramidentificadas como colônias circundadas por um halo azul.
Exemplo 3: Caracterização do gene Myceliophthora thermophila CBS117.65 eelSa
Colônias de levedura expressando endoglucanase foraminoculadas em 20 ml de meio YPD em 50 ml de tubos de teste de vidro. Ostubos foram agitados a 200 rpm durante 2 dias a 3 O0C . As células foramcoletadas por centrifugação durante 10 minutos a 3000 rpm em umacentrífuga Heraeus Megafuge 1,0R com um rotor de 75002252 (Hanau,Alemanha).
O DNA foi isolado de acordo com WO 94/14953 e dissolvidoem 50 de água deionizada. O DNA foi transformado em células de E. eoliDH10B por procedimentos padrões de acordo com Sambrook et ai., 1989,supra. Um transformante de E. eoli mostra subseqüentemente conter o geneMyceliophthora thermophila CBS 117.65 cel5a foi designado pCIC161(figura 1) e usado como o material para depósito de material biológico. Acepa de E. coli pCIClól foi depositada como E. coli NRRL B-30902 em 23de fevereiro de 2006.
O DNA plasmídeo foi isolado dos transformantes de E. coliusando procedimentos padrões de acordo com Sambrook et al., 1989, supra.A seqüência de cDNA de comprimento completo do gene cel5a deMyceliophthora thermophila CBS 117.65 foi seqüenciada com um Kit TaqDyeDeoxy Terminator Cycle Seqüencing (Perkin Elmer, Wellesley, MA,USA) e iniciadores de oligonucleotídeo sintético usando um seqüenciador deDNA da Applied Biosystems ABI PRISM ™ 377 (ABI, Foster City, CA,USA) de acordo com as instruções dos fabricantes.
A seqüência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 3) e seqüência deaminoácido deduzida (SEQ ID NO: 4) do gene cel5a de Myceliophthorathermophila são mostrados na figura 2. A seqüência de codificação tem 1170bp incluindo o códon de parado. A proteína prevista da codificação contém389 aminoácidos. O %G+C da região de codificação do gene é 63,6% e aregião de codificação de polipeptídeo maduro é 63,6%. Usando o programaSignalP, versão 3 (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), umpeptídeo de sinal de 16 resíduos foi previsto A proteína madura previstacontém 373 aminoácidos com uma massa molecular de 40,9 kDa.
Análise da seqüência de aminoácido deduzida do gene cel5acom o programa Interproscan (Zdobnov e Apweiler, 2001, Bioinformatics 17:847 - 848) mostrou que a proteína CEL5A continha a seqüência de núcleotípica de uma família 5 da glicosil hidrolase, se estendendo deaproximadamente resíduo 77 de aminoácido a resíduo 350 do polipeptídeomaduro previsto. A proteína CEL5A também continha a assinatura deseqüência de um domínio de ligação de celulose de fungo tipo I (CBMI). Estaassinatura de seqüência conhecida como Prosite padrão PS00562 (Sigrist etat., 2002, Brief Bioinform. 3: 265 - 274) estava presente do resíduo 8 deaminoácido a resíduo 35 do polipeptídeo maduro previsto.
Um alinhamento global à feição de pares comparativos deseqüências de aminoácidos foi determinado usando o algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman e Wunscn, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443 - 453) comoimplementado no programa de Needle de EMBOSS com penalidade deabertura de espaço de 10, penalidade de extensão de espaço de 0,5, e a matrizEBLOSUM62. O alinhamento mostrou que a seqüência de aminoácidodeduzida do gene de Myceliophthora thermophila codificando o polipeptídeomaduro CEL5A compartilhou 75% e 72% de identidade (excluindo osespaços) para as seqüências de aminoácidos deduzidas de duas proteínas deFamília 5 da glicosil hidrolase de Neurospora crassa e Humicola insolens,respectivamente (números de acesso Q7SDR1 e G12624, respectivamente).
Exemplo 4: Expressão de gene cel5a de Myceliophthora thermophila CBS117.65 em Aspergillus oryzae
O gene cel5a de Myceliophthora thermophila CBS 117.65 foiexcisado do vetor pYES2.0 usando Hind III e Xba I, e ligado no vetor deexpressão de Aspergillus pHD414 (EP 238 023, WO 93/11249) usandométodos padrões (Sambrook et al, 1989, supra). O vetor de expressão deAspergillus pHD414 é um derivado de p775 (EP 238 023). O plasmídeoresultante foi designado pA2Cl81 (figura 3).
Protoplastos de Aspergillus oryzae HowB 104 forampreparados como descrito em WO 95/02043. Cem microlitros de suspensãode protoplastos foram misturados com 5-25 μg do vetor de expressão deAspergillus pA2C161 em 10 μΐ de composto STC de 1,2 M de sorbitol, 10mM de Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM de CaCl2) e ainda misturado com 5-25 μgde p3SR2, um plasmídeo transportando um gene amdS de Aspergillusnidulans (Christensen et al, 1988, Bio/Technology 6: 1419 - 1422). A misturafoi deixada em temperatura ambiente durante 25 minutos. Duzentosmicrolitros de PEG 4000 a 80% (BDH, Poole, England) (polietileno glicol,peso molecular 4.000), 10 mM de CaCl2, e 10 mM de Tris-HCl pH 7,5 foramadicionados e suavemente misturados e finalmente 0,85 ml da mesma soluçãofoi adicionado e suavemente misturado. A mistura foi deixada em temperaturaambiente durante 25 minutos, centrifugada a 2.500 χ g durante 15 minutos, eo grânulo foi recolocado em suspensão em 2 ml de 1,2 M de sorbitol. Esteprocesso de sedimentação foi repetido, e os protoplastos foram espalhados emplacas COVE. Após incubação durante 4-7 dias a 37 0C esporos foramtomados e espalhados a fim de isolar as colônias únicas. Este procedimentofoi repetido e esporos de uma colônia única após o segundo reisolamentoforam armazenados.
Cada um dos transformantes foi inoculado em 10 ml de meioYPM. Após 2-5 dias de incubação a 30°C , 200 rpm, o sobrenadante foiremovido. A atividade de endoglucanase foi identificada por aplicação de 20μΐ de caldo de cultura de orifícios de 4 mm de diâmetro perfurados em umaplaca de SC-ágar de celulose AZCL HE a 0,1% e incubação durante a noite a30°C . A atividade de endoglucanase foi então identificada por um halo azulem torno de uma colônia. Vários caldos transformantes tem atividade deendoglucanase significantemente maior do que o caldo de um fundo decontrole de Aspergillus oryzae não transformado, que demonstrou expressão eficiente da CEL5A endoglucanase de Myceliophthora thermophila CBS
117.65 em Aspergillus oryzae.
Exemplo 5: Construção de uma biblioteca de expressão de cDNA debasidiomicete CBS 495.95 em Saccharomyces eerevisiae
Uma biblioteca de cDNA de basidiomicete' CBS 495.95,consistindo de aproximadamente IO6 clones individuais foi construída em E.eoli como descrito no exemplo 1, com um fundo de vetor de 1%.Exemplo 6: Triagem de bibliotecas de expressão de cDNA debasidiomicete CBS 495,95 para atividade de endoglucanase
Triagem da biblioteca de cDNA (exemplo 5) foi realizadacomo descrito no exemplo 2.
Exemplo 7: Caracterização de um gene codificando CEL5A debasidiomicete CBS 495.95
Clonagem do gene cel5a de basidiomicete CBS 495.95 foirealizada como descrito no exemplo 3. Um transformante E. colisubseqüentemente mostrado como contendo um gene cel5a foi designadopCIC453 (figura 4) e usado como o material para depósito de materialbiológico. A cepa pCIC453 de E. coli foi depositada como E. coli NRRL B-30903 em 23 de fevereiro de 2006.
O gene cel5a de basidiomicete CBS 495.95 foi excisado depCIC453 usando Hind III e Xba I e ligado no vetor de expressão pHD414 deAspergillus. O plasmídeo resultante foi designado pA2C453 (figura 5).
A seqüência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 5) e a seqüência deaminoácido deduzida (SEQ ID NO: 6) do gene cel5a CBS 495.95 sãomostradas na figura 6. A seqüência de codificação é 1194 bp incluindo ocódon de parada. A %G+C da região de codificação do gene é de 59,8% e aregião de codificação de polipeptídeo maduro é de 60,1%. A proteína previstade codificação contém 397 aminoácidos. Usando o programa SignalP, versão3 (Nielsen et al., 1997, supra), um peptídeo de sinal de 15 resíduos foiprevisto. A proteína madura prevista contém 382 aminoácidos com umamassa molecular de 40,1 kDa.
Análise da seqüência de aminoácido deduzida do gene cel5acom o programa Interproscan (Zdobnov e Apweiler, 2001, supra) mostrouque a proteína CEL5A continha a seqüência de núcleo típica de uma Família5 da glicosil hidrolase, se estendendo a partir de aproximadamente resíduos81 a 359 do polipeptídeo maduro previsto. A proteína CEL5A tambémcontida uma assinatura de seqüência de um domínio de ligação de celulose defungo de tipo I (CBMI). Esta assinatura de seqüência conhecida como PrositePS00562 padrão (Sigrist et al., 2002, supra) estava presente do resíduo deaminoácido 8 a resíduo 36 do polipeptídeo maduro previsto.
Um alinhamento global à feição de pares comparativos deseqüências de aminoácidos foi determinado usando o algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra) como implementado noprograma de Needle EMBOSS com penalidade de abertura de espaço de 10,penalidade de extensão de espaço de 0,5, e a matriz EBLOSUM62. Oalinhamento mostrou que a seqüência de aminoácido deduzida do gene CBS495.95 codificando o polipeptídeo maduro CEL5A compartilhou 82% e 79%de identidade (excluindo espaços ) para as seqüências de aminoácidosdeduzidas de duas proteínas de Família 5 da glicosil hidrolase de Irpex lacteuse Trametes hirsuta, respectivamente (números de acesso Q5W7K4 eQ75UV6, respectivamente).
Exemplo 8: Expressão de gene eelSa de basidiomicete CBS 495.95 emAspergillus oryzae
Expressão do gene cel5a de basidiomicete CBS 495.95, eanálise de atividade de endoglucanase foi realizada como descrito no exemplo4.
Exemplo 9: Construção de uma biblioteca de expressão de cDNA debasidiomicete CBS 494.95 em Saccharomyces eerevisiae
Uma biblioteca de cDNA de basidiomicete CBS 494.95,consistindo de aproximadamente IO6 clones individuais foi construída em E.colí como descrito no exemplo 1, com um fundo de vetor de 1%.Exemplo 10: Triagem de bibliotecas de expressão de cDNA debasidiomicete CBS 494.95 para atividade de endoglucanase
Triagem da biblioteca de cDNA (exemplo 9) foi realizadacomo descrito no exemplo 2.
Exemplo 11: Caracterização de um gene de codificação de CEL5B debasidiomicete CBS 494.95
Clonagem do gene cel5b de basidiomicete CBS 494.95 foirealizada como descrito no exemplo 3. Um transformante de E. colisubseqüentemente mostrado como contendo o gene CBS 494.95 cel5b foidesignado pCIC486 (figura 7) e usada como o material para depósito dematerial biológico. A cepa E. coli pCIC486 foi depositada como E. coliNRRL B-30904 23 de fevereiro de 2006.
O gene cel5b de basidiomicete CBS 494.95 foi excisado dovetor pYES2.0 usando Kpn I e Xho I e ligado no vetor de expressão deAspergillus pHD423 (Lassen et al., 2001, Appl Environ Microbiol 67: 4701 -4707), um derivado de pHD414 com um sítio Kpn I no poliligador. Oplasmídeo resultante foi designado pA2C486 (figura 8). A seqüência denucleotídeos (SEQ ID NO: 7) e seqüência de aminoácido deduzidas (SEQ IDNO: 8) do gene cel5b de CBS 494.95 são mostradas na figura 9. A seqüênciade codificação é 1290 bp incluindo o códon de parada. %G+C da região decodificação do gene é de 56,0% G+C e a região de codificação depolipeptídeo maduro é de 58,1%. A proteína prevista de codificação contém429 aminoácidos. Usando o programa SignalP, versão 3 (Nieisen et al., 1997,supra), um peptídeo de sinal de 21 resíduos foi previsto. A proteína maduraprevista contém 408 aminoácidos com uma massa molecular de 43,1 kDa.
Análise da seqüência de aminoácido deduzida do gene cel5bcom o programa Interproscan (Zdobnov e Apweiler, 2001, supra) mostrouque a proteína CEL5B contida a seqüência de núcleo típica de uma Família 5da glicosil hidrolase, se estendendo de aproximadamente resíduo deaminoácido 106 a resíduo 385 do polipeptídeo maduro previsto. A proteínaCEL5A também continha a assinatura de seqüência de um domínio de ligaçãode celulose de fungo de tipo I (CBMS). Esta assinatura de seqüênciaconhecida como Prosife PS00562 padrão (Sigrist et al., 2002, supra) estavapresente do resíduo de aminoácido 7 ao resíduo 34 do polipeptídeo maduroprevisto.
Um alinhamento global à feição de pares comparativos deseqüências de aminoácido foi determinado usando o algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra) como implementado noprograma Needle de EMBOSS com penalidade de abertura de espaço de 10,penalidade de extensão de espaço de 0,5, e a matriz EBLOSUM62. Oalinhamento mostrou que a seqüência de aminoácido deduzida do gene CBS495.95 codificando o polipeptídeo maduro CEL5A compartilhou 69% e 67%de identidade (excluindo espaços ) para as seqüências de aminoácidodeduzidas de duas proteínas de Família 5 da glicosil hidrolase de Irpex lacteuse Trametes hirsuta, respectivamente (números de acesso Q5W7K4 eQ75UV6, respectivamente).
Exemplo 12: Expressão de CEL5B de basidiomicete CBS 494.95 emAspergillus oryzae
Expressão do gene cel5B de basidiomicete CBS 494.95, eanálise de atividade de endoglucanase foi realizada como descrito no exemplo4.
Exemplo 13: Purificação de endoglucanases recombinantes deMyceliophthora íhermophila CBS 117.65, basidiomicete CBS 494.95, ebasidiomicete CBS 495.95
As endoglucanases de Myceliophthora íhermophila CBS117.65, basidiomicete CBS 494.95, e basidiomicete CBS 495.95, produziramrecombinantemente em Aspergillus oryzae como descrito nos exemplos 4, 8, e12, foram purificadas até homogeneidade usando um protocoloessencialmente como descrito por Otzen et al., 1999, Protein Sei. 8: 1878 -87.
A concentração de proteína nas preparações de enzima foideterminada usando o teste de microplaca com ácido bicinconínico (BCA) deacordo com as instruções dos fabricantes para um kit de reagente de teste deProteína BCA (Pierce Chemical Co., Rockford, IL. USA).
Diluições de enzima foram preparadas logo antes de cadaexperimento de soluções de enzima de carga, que foram armazenadas a -20°C.
Exemplo 14: Isolamento de DNA genômico de Penicillium brasilianumIBT 20888
Esporos de cepa Penicillium brasilianum IBT 20888 forampropagados em arroz de acordo com Carlsen, 1994, Ph. D. thesis, Departmentof Biotechnology, The Technical University of Dinamarca. Os esporos foramrecuperados com 20 ml de 0,1% de Tween 20 e inoculados em umaconcentração de IxlO6 esporos por ml em 100 ml de meio Mandeis e Weber(Mandeis e Weber, 1969, Adv. Chem. Ser. 95: 394 - 414) contendo 1% deglicose suplementada por litro com 0,25 g of extrato de levedura e 0,75 g deBactopeptona em um frasco de agitação com anteparos de 500 ml. Micéliosde fungo foram colhidos após 24 horas de crescimento aeróbico a 3O0C , 150rpm.
Micélios foram coletados por filtração através de um filtroNalgene DS0281-5000 (Nalge Nunc International Corporation, Rochester,NY, USA) até secura e congelados em nitrogênio líquido. Os micélioscongelados foram triturados um pó em um almofariz resfriado com gelo secoe distribuídos em um tubo com tampa de rosca. O pó foi colocado emsuspensão em um volume total de 40 ml de 50 mM de tampão CAPS (ácido3-(ciclo-hexilamino)-l-propanossulfônico)-NaQH pH 11 contendo 0,5% desulfato de dodecil de lítio e 0,5 mM de EDTA. A suspensão foi colocada a60°C durante 2 horas e periodicamente recolocada em suspensão porinversão. A suspensão foi adicionado um volume igual de fenolxlorofórmio(1:1 v/v) neutralizado com 0,1 M Tris base, e o tubo foi misturado em umaroda girando a 37 0C durante 2 horas. Após centrifiigação a 2500 rpm durante10 minutos em um rotor Sorvall H1000B, a fase aquosa (fase de topo) foi re-extraída novamente com fenohclorofórmio (1:1 v/v) e centrifugada a 15.000 χg durante 5 minutos. A fase aquosa da segunda extração foi levada a 2,5 M deacetato de amônio (carga 10 M) e colocada a -20°C até congelar. Apósdescongelar, o extrato foi centrifugado a 15.000 χ g durante 20 minutos emum rotor frio. O grânulo (primariamente rRNA) foi descartado e os ácidosnucleicos no sobrenadante foram precipitados por adição de 0,7 volumes deisopropanol. Após centrifugação a 15.000 χ g durante 15 minutos, o grânulofoi enxaguado três vezes com 5 ml de 70% de etanol (sem recolocação emsuspensão), secado ao ar quase que completamente, e dissolvido em 1,0 ml de0,1 X TE. O grânulo dissolvido foi transferido para dois tubos demicrocentrífugas de 1,5 ml. Os ácidos nucleicos foram precipitados poradição de acetato de amônio (0,125 ml) para 2,0 M e etanol a 63% (1,07 ml) ecentrifugados a velocidade máxima durante 10 minutos em umamicrocentrífiiga Sorvall MC 12V (Kendro Laboratory Products, Asheville,NC, USA). O grânulo foi enxaguado duas vezes com 70% de etanol, secadoao ar completamente, e dissolvido em 500 μΐ de 0,1 X TE.Exemplo 15: Preparação de uma biblioteca de DNA genômico dePenicillium brasilianum IBT 20888
Bibliotecas genômicas foram construídas usando um KitTOPO Shotgun Subcloning (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Brevemente,DNA celular total foi cisalhado por nebulização sob 0,703 kg/cm2 denitrogênio durante 15 segundos e fracionado em tamanho em géis agarose a1% usando 40 mM de tampão Tris base-20 mM de acetato de sódio-1 mMdissódico EDTA (TAE). Fragmentos de DNA migrando na faixa de tamanho3-6 kb foram excisados e eluídos usando um Kit de extração com gelMiniElute™ (QIAGEN Inc. Valencia, CA, USA). Os fragmentos eluídosforam de fracionados em tamanho novamente usando um agarose gel a 1%como acima e fragmentos de DNA migrando na faixa de tamanho 3-6 kbforam excisados e eluídos usando um Kit de extração com gel MiniElute™.
Os fragmentos de DNA eluídos foram reparados naextremidade obtusa e desfosforilados usando fosfatase alcalina de camarão(Roche Applied Science, Manheim, Alemanha). Os fragmentos de DNA deextremidade obtusa foram clonados no vetor pCR4Blunt-TOPO (Invitrogen,Carlsbad, CA, USA) de acordo com as instruções dos fabricantes,transformados em células de E. coli TOPlO eletrocompetentes poreletroporação, e colocados em placas de ampicilina LB. A eletroporaçãoresultou em 15.300 clones.
Exemplo 16: Purificação de endoglucanase CEL5C nativa de Penicilliumbrasilianum IBT 20888
A endoglucanase foi purificada e testada como descrito emJergensen et ai, 2003 ÇEnzyme Microb. Technol. 32: 851 - 861). O substratofoi azo-carboximetil celulose (Megazyme International Ireland Ltd., Bray,Irlanda) e o tempo de incubação foi de 15 minutos. A enzima purificada foiarmazenada congelada a -20°C .
Exemplo 17: Seqüenciamento N-terminal de endoglucanase CEL5C dePenicillium brasilianum IBT 20888
A amostra purificada de endoglucanase CEL5C de Penieiliumbrasilianum (exemplo 16) foi descongelada. Uma alíquota de 100 μl daamostra foi adicionada a 100 μl de tampão de amostra SDS-PAGE (4 ml de0,5 M de TRIS-HCI, pH 6,8, 20 ml de 10% de SDS, 20 ml de glicerol (87%),56 ml de água ultrapura Milli-Q®, e 15 grão de azul de bromofenol) em umtubo Eppendorf e aquecida a 95°C durante 4 minutos. Após o aquecimento,quatro alíquotas de 20 μΐ de da amostra diluída foram aplicadasseparadamente a um gel SDS poliacrilamida a 4-20% pré-moldado(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Além das quatro trilhas contendo aamostra, uma mistura padrão de proteína Mark 12 (Invitrogen, Carlsbad, CA,USA) foi aplicada ao gel.
O gel foi colocado em um aparelho de gel Xcell SureLock™(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) durante 90 minutos com um ajuste depotência de 40 mA no máximo 135 V. Após a eletroforese, o gel foi incubadodurante 5 minutos em uma solução de blotting consistindo de 10 mM deCAPS pH 11 contendo 6% de metanol. Uma membrana ProBlott (AppliedBiosystems, Foster City, CA, USA) foi umedecida durante 1 minuto emmetanol puro antes de ser colocada na solução de blotting durante 5 minutos afim de saturar a membrana com 10 mM de CAPS pH 11 contendo 6% demetanol.
Electroblotting foi realizado em um aparelho Semi Dry BlotterII (KemEnTec, Copenhagen, DK) como a seguir. Seis pedaços de papelWhatman no. 1 umedecido na solução de blotting foram colocados noelétrodo positivo do aparelho de blotting seguido pela membrana ProBlott, ogel poliacrilamida, e seis pedaços de papel Whatman no. 1 umedecido nasolução de blotting. O aparelho de blotting foi montado, assim colocando oelétrodo negativo em contato com a pilha superior de papel Whatman no. 1.Um peso de 11,3 kg foi colocado no topo do aparelho de blotting.Electroblotting foi realizado em uma corrente de 175 mA durante 180minutos.
Após electroblotting, a membrana ProBlott foi coloridadurante 1 minuto em 0,1% (p/v) Azul Brilhante Coomassie R-250 dissolvidoem 60% de metanol, 1% de ácido acético, 39% de H2O. A des-coloração damembrana ProBlott foi realizada em 40% de metanol aquoso durante 5minutos antes da membrana ser enxaguada em água deionizada. Finalmente amembrana ProBlott foi secada ao ar.
Para seqüenciar o aminoácido N-terminal, dois pedaços damembrana ProBlott consistindo de uma banda de 65 kDa foram cortados ecolocados no cartucho de blotting de um seqüenciador de proteína Procise daApplied Biosystems (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Oseqüenciamento N-terminal foi realizado usando o método "run file! paraamostras de membrana PVDF (PVDF de líquido pulsado) de acordo com asinstruções dos fabricantes.A seqüência de aminoácido N-terminal foi deduzida doscromatogramas resultantes por comparação do tempo de retenção dos picosnos cromatogramas nos tempos de retenção dos aminoácidos - PTH nocromatograma padrão.
A seqüência de aminoácido N-terminal da endoglucanase dePenicillium brasilianum CEL5C purificada foi determinada diretamenteusando um sistema de seqüenciamento Procise 494 HT (Applied Biosystems,Foster City, CA, USA). A seqüência N-terminal foi determinada como sendoAla-Ser-Ser-Phe-Val-Tφ-Phe-Gly-Thr-Ser-Glu-Ser-Gly-Ala-Glu-Phe-Gly-Asn-Gln-Asn (aminoácidos 25 a 44 em SEQ ID NO: 10).
Exemplo 18: Amplificação PCR do gene endoglucanase cel5c dePenicillium brasilianum IBT 20888
Com base na seqüência de aminoácido N-terminal daendoglucanase de Penicillium brasilianum purificada, um iniciador dianteirofoi designado usando a estratégia CODEHOP (Rose et al., 1998, NueleicAeids Res. 26: 1628 - 35). A partir do banco de dados, a informação sobreoutras endoglucanases, dois iniciadores reversos foram designados comomostrado abaixo usando a estratégia CODEHOP.Iniciador dianteiro, Fwd:5'-TTCGGTACCTCTGAGTCTGGNGCNGARTT-3' (SEQ ID NO: 11)Iniciador reverso, Revl:
5'-TGATCCATATCGTGGTACTCGTTRTTNGTRTCRAA-3' (SEQ ID NO:12)
Iniciador reverso, Rev2:5'-CCGTTGTAGCGACCGTARTTRTGNGGRTC-3' (SEQ ID NO: 13)onde R=A ou G, Y = C ou Τ, K = G ou T e N = A, C, G ou T
Reações de amplificação (30 μΐ) foram preparadas usandoaproximadamente 1 μg de DNA genômico de Penieillium brasilianum comogabarito. Além disso, cada reação continha os seguintes componentes: 30pmol do iniciador dianteiro, 30 pmol do iniciador reverso, 200 μΜ cada dedATP, dCTP, dGTP, e dTTP, tampão IX AmpliTaq polimerase (AppliedBiosystems, Foster City, CA, USA), e 0,5 unidade de AmpliTaq polimerase(5,0 U/μΙ, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). As reações foramincubadas em um Robocycler (Stratagene, La Jolla, CA, USA) programadopara 1 ciclo a 96 0C durante 3 minutos e a 72 0C durante 3 minutos; 34 cicloscada a 95 0C durante 0,5 minuto, 56 0C durante 0,5 minutos, e 72 0C durante1,5 minutos; 1 ciclo a 72 0C durante 7 minutos; e um ciclo de embebimento a6 0C. Taq polimerase foi adicionado a 72 0C no primeiro ciclo.
Produtos de reação PCR foram separados em um gel agarose a2% (Amresco, Solon, OH, USA) usando o tampão TAE. Uma banda deaproximadamente 650 bp (iniciadores Fwd e Revi) e bandas deaproximadamente 320 e 380 bp (iniciadores Fwd e Rev2) foram excisadas dogel e purificadas usando um Kit de extração de gel MiniElute™ (QIAGENInc., Valencia, CA, USA) de acordo com as instruções dos fabricantes. Osprodutos PCR purificados foram subseqüentemente analisados porseqüenciamento de DNA. O produto 320 bp foi verificado como codificandouma porção de um polipeptídeo de Família 5 da glicosil hidrolase que foidesignado CEL5C.
Exemplo 19: Triagem de biblioteca genômica de Penicillium brasilianumIBT 20888
Retiradas da colônia da biblioteca descrita no exemplo 15foram realizadas (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York) e o DNAfoi reticulado sobre membranas Hybond N+ (Amersham, Arlington Heights,IL, USA) durante 2 horas a 80°C . A membranas das retiradas das colôniasforam pré-umedecidas usando 0,2X de SSC (30 mM de NaCl, 3 mM decitrato de sódio), 0,2% de SDS. Os filtros pré-umedecidos foram colocadosem um béquer com 7,5 ml de 6X de SSPE (0,9 M de NaCl, 0,06 M deNaH2PO4, e 6 mM de EDTA), 7% de SDS) por filtro a 68 0C em um banho deágua agitando durante 30 minutos.
Aproximadamente 40 ng do produto PCR descrito no exemplo18 foram rotulados com iniciador aleatório usando um kit de iniciador-It IIStratagene (Stratagene, La Jolla, CA) de acordo com as instruções dosfabricantes. O fragmento de gene radio-rotulado foi separado de nucleotídeonão incorporado usando um kit de purificação MinElute PCR (QIAGEN Inc.,Valencia, CA, USA).
A sonda radioativa foi desnaturada por adição de 5,0 M deNaOH em uma concentração final de 0,5 M, e adicionada na solução dehibridização em uma atividade de aproximadamente 0,5 χ IO6 cpm por ml desolução de hibridização. A mistura foi incubada durante 10 horas a 68 0C emum banho de água com agitação. Após a incubação, as membranas foramlavadas três vezes em 0,2X de SSC, 0,2% de SDS a 68 °C. As membranasforam então secadas em papel blotting durante 15 minutos, enroladas emSaranWrap™, e expostas em filme de raio X durante a noite a -80°C comtelas intensificadoras (Kodak, Rochester, NY, USA).
Colônias produzindo sinais de hibridização com a sonda foraminoculadas em 1 ml de meio de ampicilina LB e cultivadas durante a noite a37 0C. Diluições de cada solução foram feitas e 100 μΐ foram colocadas sobreplacas de ampicilina LB. A diluição para cada positivo que produziu cerca de40 colônias por placa foi escolhida para retiradas secundárias. As retiradasforam preparadas, hibridizadas e sondadas como acima. Duas colônias decada placa positiva foram inoculadas em 3 ml de meio de ampicilina LB ecultivadas durante a noite a 37 0C.
Miniprep DNA foi preparado em cada colônia usando um BioRobot 9600 (QIAGEN Inc, Valencia, CA, USA) de acordo com o protocolodos fabricantes. O tamanho de cada inserto foi determinado por restrição EcoRI de eletroforese de gel agarose. Dois clones continham cada um inserto deaproximadamente 5,5 kb. O seqüenciamento revelou que os clones eramidênticos, e eles são a seguir referidos como pKKAHl (ver exemplo 20).
Exemplo 20: Caracterização da seqüência genômica de celSc codificandoa endoglucanase CEL5C de Penicillium brasilianum IBT 20888
Seqüenciamento de DNA do gene de endoglucanase dePenicillium brasilianum de pKKAHl foi realizado com um Seqüenciador deDNA automatizado Applied Biosystems Modelo 3700 (Applied Biosystems,Foster City, CA, USA) usando uma técnica walking de iniciador com químicade terminado de corante (Giesecke et ai., 1992, J. Virol. Methods 38: 47- 60).
A seqüência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 9) e seqüência deaminoácido deduzida (SEQ ID NO: 10) do gene cel5c de Penicilliumbrasilianum são mostradas nas figuras 10A e 10B. A seqüência de codificaçãogenômica de 1471 bp (incluindo códon de parada) codifica um polipeptídeode 421 aminoácidos, interrompido por 4 íntrons de 51 bp (89-139 bp), 47 bp(352-398 bp), 55 bp (464-518 bp), e 52 bp (617-668 bp). O teor em %G+C daregião de codificação do gene é 51,2% e a região de codificação depolipeptídeo maduro é 50,8%. Usando o programa SignalP (Nielsen et al.,1997, Protein Engineering 10: 1-6), um peptídeo de sinal de 16 resíduos foiprevisto. Com base na seqüência N-terminal da endoglucanase, resíduos 17 a24 parecem constituir uma pró-região isto é proteoliticamente clivada durantea maturação. A proteína madura prevista contém 397 aminoácidos e tem umamassa prevista de 42,6 kDa.
Análise da seqüência de aminoácido deduzida do gene celSccom o programa Interproscan (Zdobnov e Apweiler, 2001, supra) mostrouque a proteína CEL5C continha a seqüência de núcleo típica de Família 5 daglicosil hidrolase, se estendendo aproximadamente de resíduos 32 a 307 dopolipeptídeo de comprimento completo previsto. A proteína CEL5C tambémcontinha a assinatura de seqüência de um domínio de ligação de celulose defungo de tipo I (CBMI). Esta assinatura de seqüência conhecida como padrãoProsite PS00562 (Sigrist et al., 2002, supra) estava presente de resíduo deaminoácido 393 a resíduo 420 do polipeptídeo previsto.
Um alinhamento global à feição de pares comparativos deseqüências de aminoácido em banco de dados público foi determinado usandoo algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra)como implementado no programa de Needle EMBOSS com penalidade deabertura de espaço de 10, penalidade de extensão de espaço de 0,5, e a matrizEBLOSUM62. O alinhamento mostrou que a seqüência de aminoácidodeduzida do gene cel5c de Penicillium brasilianum codificando opolipeptídeo maduro CEL5C compartilhava 74,9% e 74,5% de identidade(excluindo espaços) para as seqüências de aminoácido deduzida de duasproteínas da Família 5 da glicosil hidrolase prevista de Neosartorya fischeri eAspergillus fumigatus, respectivamente (números de acesso A1DAP7 eQ4WM09, respectivamente).
Exemplo 21: Construção de um plasmídeo de expressão Aspergillusotyzae para o gene cel5c de endoglucanase de Penicillium brasilianumIBT 20888
O plasmídeo de expressão Aspergillus pJaL721 (WO03/008575) consiste de um cassete de expressão com base no promotor deamilase II neutra de Aspergillus niger fusionado na seqüência líder nãotraduzida de triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans (NA2-tpi) e oterminador de amiloglicosidade de Aspergillus niger. Também está presenteno plasmídeo o marcador seletivo amdS de Aspergillus nidulans permitindo ocrescimento em acetamida como a única fonte de nitrogênio e o marcadorURA3 de Saccharomyces cerevisiae permitindo o crescimento da cepa pyrFdefeituosa de Eseherichia eoli DB6507 (ATCC 35673). Transformação em E.coli DB6507 foi realizada usando o gene URA3 de Saccharomyces cerevisiaecomo marcador seletivo como descrito abaixo.
E. coli DB6507 foi tornado competente pelo método deMandei e Higa, 1970, J. Mol. Biol. 45: 154. Os transformantes foramselecionados em meio M9 sólido (J. Sambrook, E. F. Fritsch, e T. Maniatis,1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edição, ColdSpring Harbor, New York) suplementados por litro com 1 g de ácidoscasamino, 500 μg de tiamina, e 10 mg de canamicina.
O gene endoglucanase foi clonado em pJaL721 como descritoabaixo. O gene cel5c de endoglucanase de Penicillium brasilianum foiamplificado por PCR usando os seguintes dois iniciadores deoligonucleotídeo:
PCR Dianteiro: 5'-AATTGGATCCACCAT GAAATACCCT CTACTCCTGGCAAC-3' (SEQ ID NO: 14)PCR reverso:
5' -TTAACTCG AGTTAC AGAC ACTGCGAATAATACGCATTC-3' (SEQID NO: 15)
Para facilitar a clonagem, um sítio de enzima de restrição foiinserido na extremidade 5' de cada iniciador onde o iniciador dianteirocontinha um sítio Bam HI e o iniciador reverso continha um sítio Xho I.
O DNA genômico preparado como no exemplo 14 foi usadocomo gabarito na reação PCR. A reação foi realizada em um volume de 50 μΐcontendo 1,0 unidade de Phusion (Finnzymes Oy5 Espoo, Finlândia), tampãoIX Phusion HF (Finnzymes Oy, Espoo, Finlândia), 500 ng de genômico, 250μΜ de cada dNTP, e 50 pmol de cada dos dois iniciadores descritos acima. Aamplificação foi realizada em um ciclador térmico PTC-220 DNA EngineDyad Peltier (MJ Research, Inc., Waltham, MA, USA) programado para 1ciclo a 95 0C durante 5 minutos; 24 ciclos cada a 94 0C durante 0,5 minuto, 580C durante 0,5 minuto, e 68 0C durante 4,0 minutos; e 1 ciclo a 68 0C durante15 minutos. A técnica PCR de partida rápida (Chou et al., 1992, NueleicAeids Res. 20: 1717) foi usada e Phusion polimerase foi adicionada após 1minuto do primeiro ciclo.A reação PCR produziu um fragmento de DNA único deaproximadamente 1500 bp em comprimento. O fragmento foi digerido comBam HI e Xho I e isolado por eletroforese agarose gel, purificado, e clonadoem pJaL721 digerido com Bam HI e Xho I, resultando em um plasmídeodesignado pKBK03 (figura 11). A seqüência do gene de endoglucanase empKBK03 foi verificada por seqüenciamento com um analisador de DNA3730x1 da Applied Biosystems.
A fim de criar um plasmídeo para depósito de materialbiológico, pKBK03 foi digerido com Bam HI e Xho I e purificado. Ofragmento foi reparado na terminação obtusa usando enzima Klenow (RocheApplied Science, Manheim, Alemanha) durante 30 minutos a 25 0C. Oplasmídeo pUC13 foi digerido com Sma I e desfosforilado com ProteaseIntestinal de bezerro (Roche Applied Science, Manheim, Alemanha; CIP)durante 1 hora a 37 0C e o CIP foi inativado por aquecimento da amostra a80°C durante 15 minutos.
O fragmento reparado na extremidade obtusa e o fragmentopUC13 desfosforilado foram ligados durante a noite a 16 0C usando T4 DNAligase (Roche Applied Science, Manheim, Alemanha). Uma amostra de 0,25μg do produto ligado foi transformada em DH5a Escherichia coli (Invitrogen,Carlsbad, CA, USA). Após incubação durante a noite a 37 0C em placas deampicilina LB, os transformantes foram transferidos para 2 ml de meio LB eincubados a 37 0C. Um plasmídeo designado pPBCel5C (figura 12) foipurificado usando Jetquick Plasmid Miniprep (Genomed, Lõhne, Alemanha).
A seqüência do gene de endoglucanase foi verificada por seqüenciamentocom um analisador de DNA 3730x1 de Applied Biosystems. As células de E.coli TOPlO (Invitrogen, Carlsbad, CA) contendo plasmídeo pPBCel5C (cepade designação PBCel5C) foram depositadas junto ao Agricultural ResearchService Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center, 1815University Street, Peoria, Illinois, 61604, como NRRL B-30900N, com umadata de depósito de 23 de fevereiro de 2006.
Exemplo 22: Expressão de endoglucanase CEL5C de Penicilliumbrasilianum IBT 20888 em Aspergillus oryzae
Aspergillus oryzae BECh2 (WO 00/30322) foi transformadocom 5 μg de pKBK03 como descrito por Christensen et ai., 1988,Biotechnology 6:1419- 1422.
Os transformantes foram cultivados em 50 ml de tubos durante4 dias a 30°C em 10 ml de meio YPM. Os caldos completos foramcentrifugados a 12.100 χ g e os sobrenadantes removidos. Os sobrenadantesforam analisados por SDS-PAGE usando um gel pré-moldado Criterion XT,10% gel Bis-Tris em um tampão XT MES (BioRad Laboratories, Hercules,CA, USA) de acordo com as instruções dos fabricantes. Um volume de 10 μlde sobrenadante foi misturado com 9 μl de tampão de amostra (0,125 M deTris-HCl pH 6,8, 20% de glicerol, e 4,6% de SDS), e 1 μl de 1 M deditiotreitol, e aquecido a 96°C durante 5 minutos. Em 16 dentre os 20sobrenadantes, uma banda de aproximadamente 65 kDa foi visível na faixados padrões 35 kDa a 150 kDa por SDS-PAGE. Os sobrenadantes resultantesem uma banda visível após SDS-PAGE também continham atividade deendoglucanase, testados como descrito no exemplo 3. Quanto maior aintensidade da banda, maior a atividade de endoglucanase medida no mesmosobrenadante.
Um transformante foi designado Aspergillus oryzae KBK03.
Exemplo 23: Produção e purificação de endoglucanase CEL5CPenicillium brasilianum IBT 20888 recombinante
O transformante de Aspergillus oryzae KBK03 foi cultivadoem vinte frascos de agitação de 500 ml com 200 ml de meio YPM.
A biomassa foi removida de 4,0 litros de caldo de fermentaçãopor centrifugação e filtração. Análise SDS-PAGE foi realizada como descritono exemplo 9. A solução endoglucanase foi carregada sobre uma coluna XK50 (Amersham Biosciences, Uppsala, Suécia) contendo 110 g de Avicel Ph101 (Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha) pré-equilibrada com 25 mM deTris pH 7,5, antes a carga e a enzima ligada foram eluídas com 25 mM deTris, 1% de trietanolamina a pH 11,6. Eluição da endoglucanase foimonitorada a 280 nm. A proteína eluída contendo frações foram reunidasimediatamente e o pH ajustado a 7,5. Frações contendo a endoglucanaseforam reunidas.
O teor de proteína foi determinado da absorbância a 280 nm eo coeficiente de extinção calculado da estrutura primária da endoglucanase.
A purificação foi seguida por SDS-PAGE. As amostras foramfervidas durante 2 minutos com um volume igual de 2X tampão de amostra e1/5 volume de 1% de PMSF e carregadas sobre um gel a 4-20% de tris-glicina(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). O gel foi colorido com reagente decoloração GelCode Blue (Pierce, Rockford, IL, USA) e descolorido comágua. SDS-PAGE revelou uma banda de aproximadamente 65 kDa.Exemplo 24: Caracterização de endoglucanase CEL5C de Penicilliumbrasilianum IBT 20888 recombinante purificado
A endoglucanase CEL5C de Penicillium brasilianumrecombinante purificada como descrito no exemplo 23 foi caracterizada comrelação a pH ótimo, temperatura ótima e estabilidade da temperatura. Aatividade de endoglucanase foi medida como descrito no exemplo 16 emtemperaturas de 20°C a 80°C e em valores pH de 3,0 a 10,0. Aendoglucanase purificada foi diluída em água Milli-Q® ultrapura (Millipore,Billerica, MA, USA) para assegurar que a atividade estava na curva padrão.Para o pH ótimo, o substrato foi dissolvido em tampão Britton-Robinson (50mM de ácido bórico, 50 mM de ácido acético, 50 mM de ácido fosfórico)ajustado no pH desejado. A estabilidade da temperatura foi determinadadurante 20 horas a 50°C no pH na faixa de 4,0 a 6,0. Todos testesexperimentais foram realizados em duplicata.Os resultados da determinação do pH ótimo são mostrados nafigura 13. O pH ótimo estava próximo de 4,0 a 50°C com atividade muitapequena a pH 3,0 e aproximadamente 80% de atividade de pico a pH 5,0.
Os resultados da determinação ótima de temperatura sãomostrados na figura 14. A temperatura ótima a pH 4,8 foi deaproximadamente 70°C com mais que 75% de atividade de pico de 60°C a 80°C.
Os resultados da determinação da estabilidade da temperaturasão mostrados na figura 15. Quando pré-incubada na ausência de substratodurante 20 horas a 25 0C e 50°C na faixa de pH de 4,0 a 6,0, a endoglucanasereteve mais que 80% de sua atividade de partida.
Exemplo 25: Preparação de substratos
Forragem de milho pré-tratada (PCS) foi preparada pelo U.S.Department of Energy National Renewable Energy Laboratory (NREL)usando ácido sulfurico diluído. As seguintes condições foram usadas para opré-tratamento: 1,4% em peso de ácido sulfurico a 165 0C e 7,5 kg/cm2durante 8 minutos. Análise da composição foi realizada pelo NREL. Celulosee hemicelulose foram determinadas por uma hidrólise de ácido sulfurico deestágio dois com análise subseqüente de açúcares por cromatografia delíquido de desempenho elevado (HPLC) usando Procedimento AnalíticoPadrão do NREL #002. Lignina foi determinada gravimetricamente apóshidrolisar as frações de celulose e hemicelulose com ácido sulfurico(Procedimento Analítico Padrão do NREL #003). Sólidos insolúveis em águano pré-tratado com a forragem (PCS) foram determinados para serem 56,5%de celulose, 4,6% de hemicelulose, e 28,4% de lignina.
A PCS foi lavada com um volume grande de água deionizadaem um funil Kimax com um filtro de vidro de porosidade grossa (FisherScientific, Pittsburg, PA, USA). PCS lavada em água foi moída moedor decafé e adicionalmente lavado com água deionizada em um filtro Millipore de22 μιη com uma membrana expressa 6P (Millipore, Bedford, MA, USA).Peso seco do PCS moído foi de 32,4%.
Uma suspensão de carga de 10 mg/ml de celulose intumescidaem ácido fosfórico PASC) em água deionizada foi preparada usando oseguinte procedimento. Cento e cinqüenta ml de ácido o-fosfórico a 85%resfriado em gelo foram adicionados a 5 g de Avicel PHlOl (FMC Corp.,Philadelphia, PA, USA) umedecido com água. A suspensão foi agitadalentamente em um banho de gelo durante uma hora, e 100 ml de acetonaresfriada com gelo foram adicionados na suspensão com agitação constante.A suspensão foi transferida em um funil Kimax com um filtro de vidro deporosidade grossa, lavada três vezes com 100 ml de acetona resfriada comgelo, e drenada tão completamente como possível após cada lavagem.Finalmente, a suspensão foi lavada duas vezes com 500 ml de água, enovamente drenada tão completamente como possível após cada lavagem. OPASC foi misturado com água em um volume total de 500 ml. Azida sódicafoi adicionada em uma concentração final de 0,02% para evitar crescimentomicrobiano. A suspensão foi homogeneizada usando um misturador earmazenada a 4 0C durante até um mês.
Carboximetilcelulose (CMC, sal de sódio, tipo 7L2) com umgrau médio de substituição (DS) de 0,7 foi obtido de Aqualon Division ofHercules Inc., Wilmington, DE, USA. Uma solução de 6,25 mg/ml de CMCem 50 mM de acetato de sódio pH 5,0 foi preparada por adição lentamente deCMC ao tampão vigorosamente agitado. A suspensão foi aquecida aaproximadamente 60°C sob agitação contínua até o CMC estarcompletamente dissolvido.
Celulose bacteriana (BC) foi preparada de "Nata de Coco",uma celulose comercial de tipo alimentício (Fujicco Co., Kobe, Japão), comodescrito em Boisset et al., 1999, Biochemical Journal, 340: 829 - 835. Umasuspensão de 1 mg/ml de celulose bacteriana em água deionizada com 0,01%(p/v) de azida de sódio foi armazenada a 4 0C.
Avicel PHlOl foi obtido de FMC Corporation, Philadelphia,PA, USA.
Xilano de bétula foi obtido de Sigma, St. Louis, MO, USA.
Xiloglucano de semente de tamarindo (amilóide, lote 00401), arabinoxilanode trigo (viscosidade média, 27 cSt, lote 90601), 1,4-beta-D-manano(boroidreto reduzido, Man:Gal=97:3, grau de polimerização DP ~ 15, lote90302), e galactomanano caroba (viscosidade baixa, boroidreto reduzido, lote90301) foram obtidos de Megazyme, Bray, Irlanda.
Exemplo 26: Teste de hidrazida de ácido p-hidroxibenzóico paradeterminação de açúcares redutores
Açúcares redutores (RS) foram determinados por um teste dehidrazida de ácido p-hidroxibenzóico (PHBAH) (Lever, 1972, Anal. Biochem.47: 273 - 279), que foi adaptado em um formato de microplaca 96 cavidades.
Uma alíquota de 90-μ1 da amostra diluída foi colocada emcada cavidades de uma microplaca 96-cavidades de fundo cônico (Costar,policarbonato transparente, Corning Inc., Acton, MA, USA). O teste foiiniciado por adição de 60 μΐ de 1,25% de PHBAH em 2% de hidróxido desódio em cada cavidade. A placa não coberta foi aquecida em um bloco deaquecimento feito de acordo com o pedido, durante 10 minutos a 95 0C. Apóso aquecimento, a microplaca foi resfriada em temperatura ambiente, e 35 μΐde água deionizada foi adicionada em cada cavidade. Uma alíquota de 100 μΐfoi removida de cada cavidade e transferida para uma placa de fundo plano de96-cavidades (Costar, poliestireno de ligação média, Corning Inc., Acton,MA, USA). A absorbância a 410 nm (A4I0) foi medida usando uma leitora demicroplaca SpectraMAX (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). O valorA410 foi traduzido em equivalentes de glicose usando uma curva padrão.
A curva padrão foi obtida com seis padrões de glicose (0,005,0,010, 0,025, 0,050, 0,075, e 0,100 mg/ml), que foram tratados similarmentenas amostras. Padrões de glicose foram preparados por diluição de 10 mg/mlde solução de glicose de carga com água deionizada.
Para todos os substratos exceto para xilano e arabinoxilano, ograu de conversão (%) foi calculado usando a seguinte equação:Conversão (o/o) = RS (mg/mi) x 100 χ 162 / (concentração de substrato inicial(mg/mi) x 180) = RS (mg/mi) x 100 / (concentração de substrato inicial (mg/mi) x1,111)
Para xilano e arabinoxilano, porcentagem de substratohidrolisado para RS foi calculado usando a seguinte equação:Conversão (o/o) = RS (mg/mi) x 100 χ 132 / (concentração de substrato inicial(mg/mi) x 150) = RS (mg/mi) x 100 / (concentração de substrato inicial (mg/mi) x1,136)
Nestas equações, RS é a concentração de açúcares redutoresem solução medida em equivalentes de glicose (mg/ml), e os fatores 1,111 e1,136 refletem o ganho de peso na conversão de polissacarídeoscorrespondentes em açúcares hexose (MW 180) ou pentose (MW 150).Exemplo 27: Atividade relativa de endoglucanases em carboximetil-celulose a 50°C
Tabela 1 mostra a atividade relativa das endoglucanasespurificadas de Myceliophthora thermophila CBS 117.85, basidiomicete CBS494.95, e basidiomicete CBS 495.95 para o sal de sódio solúvel decarboximetilcelulose (CMC). A atividade relativa é mostrada como apercentagem da atividade de endoglucanase de basidiomicete CBS 495.95. Aatividade foi determinada por medida da concentração de açúcares redutores(RS) produzidos de CMC (5 mg/ml) após 30 minutos de hidrólise em 50 mMde acetato de sódio pH 5,0 a 50°C . A hidrólise foi realizada sem agitação napresença de 0,5 mg/ml de albumina de soro bovino (BSA, Sigma, St. Louis,MO, USA). Açúcares redutores foram determinados usando teste de hidrazidade ácido p-hidroxibenzóico (PHBAH) descrito no exemplo 26.Tabela 1. Atividade relativa de endoglucanases em carboximetilcelulose(5 mg/ml) a pH 5,0 e 50°C
<table>table see original document page 125</column></row><table>
Exemplo 28: Estabilidade térmica de endoglucanases a 40°C - 80°C
A estabilidade térmica das endoglucanases purificadas deMyceliophthora thermophila CBS 117.65, basidiomicete CBS 494.95, ebasidiomicete CBS 495.95 foi determinada por incubação de soluções deenzima em cinco temperaturas (40°C , 50°C , 60°C , 70°C , e 80°C ), emedindo a atividade residual de enzimas em carboximetilcelulose (CMC).
As enzimas foram diluídas em 50 mM de acetato de sódio pH5,0, que continham 3,0 mg/ml de BSA, e incubadas durante 3 horas emmicrotubos de 1,1 ml ImmunoWare dispostos em um formato de microplacade 8x12 (Pierce, Rockford, IL, USA). BSA foi adicionado a fim de evitarpossível absorção de enzima sobre as paredes plásticas de microtubos. Aconcentração de proteína nas misturas de incubação foi escolhida de modoque cada enzima deve dar menos que 1% de conversão de CMC em testesubseqüente para atividade CMCase.
Após uma incubação de 3 horas, alíquotas de 15 μΐ foramremovidas usando um pipetador de 8 canais, e adicionadas a 75 μΐ de soluçãode CMC (6 mg/ml em 50 mM de acetato de sódio pH 5,0) em uma microplacade 36 cavidades de fundo cônico (Costar, policarbonato transparente, CorningInc., Acton, MA, USA). A atividade de CMCase residual foi então medidacomo descrito no exemplo 27, e expressa como uma percentagem da atividadeCMCase inicial (tabela 2).
A 40°C e 50°C , todas as três endoglucanases eram estáveis eretinham 98-100% da atividade de CMCase inicial após 3 horas de incubação.A 60°C e 70°C, Cel5A de Myceliophthora thermophila mostrou melhorestabilidade do que as duas outras endoglucanases, e reteve 100% e 49,3% daatividade CMCase inicial após uma incubação de 3 horas, respectivamente.Nenhuma das endoglucanases eram estáveis a 80°C .
Tabela 2. Atividade de CMCase residual de endoglucanases apósincubação durante três horas a pH 5,0 e 40-80°C
<table>table see original document page 126</column></row><table>
Exemplo 29: Atividade relativa de endoglucanases em celuloseintumescida em ácido fosfórico a 40 - 70°C
A atividade das endoglucanases purificadas de basidiomiceteCBS 494.95 e basidiomicete CBS 495.95 em celulose intumescida com ácidofosfórico (PASC) foi determinada por medida da concentração dos açúcaresreduzidos (RS) liberados durante a hidrólise inicial de PASC (2 mg/ml) em 50mM de acetato de sódio pH 5,0. A hidrólise foi realizada sem agitação napresença de 0,5 mg/ml de albumina de soro bovino (BSA, Sigma, St Louis,MO, USA). As enzimas foram diluídas de modo que uma concentração de RSiria aumentar linearmente durante o início de 30 a 90 minutos de hidrólise, e ograu de conversão PASC não devendo exceder 2% durante este tempo. Osaçúcares reduzidos foram determinados usando o teste de hidrazida de ácidop-hidroxibenzóico (PHBAH) como descrito no exemplo 26.
A atividade relativa como uma função de temperatura dasendoglucanases de basidiomicete CBS 494.95 e basidiomicete CBS 495.95 émostrada na figura 16. A atividade é mostrada como a percentagem daatividade da endoglucanase de basidiomicete CBS 495.95 a 60°C . Paraambas endoglucanases, a atividade em PASC atingiu o valor máximo a Topt. = 60°C.
Exemplo 30: Hidrólise a longo prazo de celulose intumescida com ácidofosfórico a 40 - 70°C
Hidrólise de celulose intumescida com ácido fosfórico (PASC,2 mg/ml) pelas endoglucanases purificadas de basidiomicete CBS 494.95 ebasidiomicete CBS 495.95 foi realizada durante 45 horas em 50 mM deacetato de sódio pH 5,0 contendo 0,5 mg/ml de BSA a quatro temperaturas,40°C , 50°C , 60°C , e 70°C . As endoglucanases foram usadas em três cargasde proteínas, 0,056, 0,167, ou 0,5 mg por g de PASC. As reações com ovolume inicial de 1 ml foram cicladas sem agitação em microtubos de 1,1-mlImmunoWare dispostos em um formato de microplaca 8x12 (Pierce,Rockford. IL. USA).
Cem alíquotas de microlitro foram removidas das reações empontos de tempo diferentes (1, 1,5, 3, 6, 21, 27, e 45 horas) usando umpipetador de 8 canais, e adicionado a 25 μl de 2% de NaOH em uma placa defiltração MultiScreen HV de 96 cavidades (Millipore, Bedford, MA, USA).As amostras coletadas foram filtradas a vácuo em uma microplaca de fundoplano para remover o resíduo PASC. Os filtrados foram analisados parareduzir os açúcares pelo teste de hidrazida de ácido p-hidroxibenzóico(PHBAH) como descrito no exemplo 26.
Figura 17 mostra a conversão relativa de PASC após 45 horasde incubação com as endoglucanases de basidiomicete CBS 494.95 ebasidiomicete CBS 495.95 (0,5 mg de proteína por g de PASC) como umafunção de temperatura. A conversão relativa é mostrada como umapercentagem da conversão obtida após 45 horas de incubação combasidiomicete CBS 495.95 a 50°C . Perfis de temperatura obtidos em duasoutras cargas de proteína, 0,056 e 0,167 mg de proteína por g de PASC, temformas similares. Para ambas as endoglucanases, a temperatura ótima parahidrólise a longo prazo de PASC foi de 50 °C.
Exemplo 31: Caracterização de endoglucanases em vários substratos depolissacarídeo a 50°CAs endoglucanases purificadas de Myceliophthora thermophilaCBS 117.65, basidiomicete CBS 494.95, e basidiomicete CBS 495.95 foramavaliadas na hidrólise de vários polissacarídeos a pH 5,0 (50 mM de tampãode acetato de sódio) e 5 0°C . Os resultados foram comparados com os paraendoglucanase de Triehoderma reesei Cel7B recombinante (EGI).Endoglucanase Triehoderma reesei Cel7B recombinante (EGI) produzida porAspergillus oryzae pode ser preparada de acordo com Takashima et at., 1998,Journal of Baeteriology 65: 163 - 171.
Os polissacarídeos incluíam forragem de milho pré-tratada(PCS), celulose intumescida com ácido fosfórico (PASC),carboximetilcelulose (CMC), celulose bacteriana (BC), Avicel, xilano,xiloglucano, arabinoxilano, manano e galactomanano. Todos os substratosforam usados a 5 mg/ml, com a exceção de celulose bacteriana, que foi usadaa 0,9 mg/ml.
Reações com um volume inicial de 1 ml foram realizadasdurante 24 horas com agitação intermitente em placas Eppendorf 96DeepWell (1,2 ml, VWR Scientific, West Chester, PA, USA) tampadas comesteiras Eppendorf 96 DeepWell (VWR Scientific, West Chester, PA, USA).Salvo indicado em contrário, as enzimas foram carregadas a 5 mg de proteínapor g de sólidos.
Após 24 horas, alíquotas de 20 μΐ foram removidas das reaçõesde hidrólise usando um pipetador de 8 canais, e adicionadas a 180 μΐ deNa2CO3 102 mM - de NaHCO3) 58 mM em uma placa de filtraçãoMultiScreen HV de 96 cavidades (Millipore, Bedford, MA, USA) paraterminar a hidrólise. As amostras foram filtradas a vácuo em uma microplacade fiando plano. Após a diluição apropriada, os filtrados foram analisados paraaçúcares redutores usando o teste de hidrazida de ácido p-hidroxibenzóico(PHBAH) como descrito no exemplo 26.
Tabela 3 mostra a conversão relativa de vários polissacarídeospelas endoglucanases após 24 horas de incubação. A conversão relativa foicalculada como uma percentagem de conversão obtida após 24 horas dehidrólise de 1,4-p-D-manano por endoglucanase Cel5A de basidiomicete CBS495.95. Endoglucanases de família 5 glicosídeo hidrolase (GH) tem atividaderelativamente elevada em manano e galactomanano, mas atividade baixa emxilano, xiloglucano e arabinoxilano. Em contraste, Cel7B de Trichodermareesei tem atividade relativamente elevada em xilano, xiloglucano earabinoxilano, mas atividade baixa em manano e galactomanano. Osendoglucanases GH5 mostraram melhor hidrólise de PASC (celulose amorfanão substituída insolúvel) do que CMC (derivado de celulose substituídosolúvel). As endoglucanases GH5 tem atividade baixa em substratosinsolúveis com grau elevado de cristalinidade:celulose bacteriana, Avicel, e PCS.
Tabela 3. Conversão relativa de vários substratos de polissacarídeo (5mg/ml) por endoglucanases (5 mg de proteína por g de sólidos); pH 5,0,50°C, 24 horas
<table>table see original document page 129</column></row><table>
* Concentração inicial de celulose bacteriana foi de 0,9 mg/ml
** Todas as endoglucanases foram usados a 0,25 mg de proteína por g desólidos para hidrólise de PASC e CMC
Exemplo 32: Hidrólise de beta-glucano solúvel de cevada porendoglucanases a 60°C
A atividade das endoglucanases de Myceliophthorathermophila CBS 117.65, basidiomicete CBS 494.95, e basidiomicete CBS495.95 em beta-glucano solúvel de cevada (viscosidade do meio de cultura,230 kDa, Megazyme International Ireland Ltd., Bray, Irlanda) foi determinadaa pH 5,5 (50 mM de acetato de sódio com 0,02% de azida sódica) e 60°C. Osresultados foram comparados com os para endoglucanase Cel7B deTriehoderma reesei (EGI). Endoglucanase Cel7B de Triehoderma reeseirecombinante (EGI) pode ser preparada como descrito no exemplo 31.
A concentração inicial de beta-glucano nas reações dehidrólise foi de 1,0% (p/v). Um ml de reações foi ciclado sem agitação emplacas Eppendorf 96 DeepWell (1,2 ml, VWR Scientific, West Chester, PA,USA). As enzimas foram usadas em três cargas de proteína, 0,05, 0,1, e 0,2mg por g de glucano. Em um controle de tampão, as endoglucanases foramsubstituídas com 50 mM de acetato de sódio pH 5,5 contendo 0,02% de azidade sódio.
As alíquotas foram removidas das reações de hidrólise em 2horas e 24 horas, diluídas com água deionizada, e analisadas para açúcaresredutores usando o teste de hidrazida de ácido p-hidroxibenzóico (PHBAH)como descrito no exemplo 28. A conversão relativa de beta-glucano comouma função de carga de proteína em dois tempos de incubação, 2 horas e 24horas, como mostrado nas figuras 18 e 19, respectivamente. A conversãorelativa é mostrada como uma percentagem de conversão obtida após 24horas de hidrólise de beta-glucano por endoglucanase Cel5A deMyeeliophthora thermophila CBS 117.65 (0,2 mg de proteína por g deglucano).
As endoglucanases de basidiomicete CBS 494,95 ebasidiomicete CBS 495.95 mostraram desempenho similar em hidrólise debeta-glucano, e não produziram um aumento adicional na redução daconcentração de açúcar após 2 horas de hidrólise. Em contraste, asendoglucanases de Myceliophthora thermophila e Triehoderma reeseicontinuaram a produzir novos grupos terminais redutores além do tempo deincubação de 2 horas. A endoglucanase de Myceliophthora thermophilamostrou melhor desempenho em hidrólise de beta-glucano do que aendoglucanase Cel5B de basidiomicete CBS 494.95 e endoglucanase Cel5Ade basidiomicete CBS 495.95.
Depósito de Material Biológico
Os seguintes materiais biológicos foram depositados sob ostermos do Tratado de Budapeste junto ao Agricultural Research ServicePatent Culture Collection, Northern Regional Research Center, 1815University Street, Peoria, Illinois, 61604, e receberam os seguintes númerosde acesso:
<table>table see original document page 131</column></row><table>
As cepas foram depositadas sob condições que asseguram queo acesso às culturas será disponível durante a pendência deste pedido depatente para uma pessoa determinada pelo Comissariado de Patentes e MarcasRegistradas a ser intitulado sob 37 C.F.R. §1,14 e 35 U.S.C. §122. Osdepósitos representam culturas substancialmente puras das cepas depositadas.Os depósitos são disponíveis como requerido por leis de patentes noestrangeiro em países em que as contrapartes do presente pedido, ou suadescendência, são depositadas. No entanto, será entendido que adisponibilidade de um depósito não constitui uma licença para praticar ainvenção em questão em derrogação aos direitos de patentes concedidos pelaação governamental.A invenção descrita e reivindicada aqui não deve ser limitadaem escopo aos aspectos específicos aqui descritos, porque estes aspectos sãodestinados como ilustrações dos vários aspectos da invenção. Quaisqueraspectos equivalentes são destinados a estarem dentro do escopo destainvenção. De fato, várias modificações da invenção além das mostradas e aquidescritas se tornarão evidentes aos versados na arte a partir da descriçãoacima. Estas modificações também se destinam a estar dentro do escopo dasreivindicações anexas. No caso de conflito, a presente descrição, incluindo asdefinições, irá gerenciar o controle.
Várias referências são citadas aqui, cujas descrições sãoincorporadas por referência em suas totalidades.<ιιο>
<120>
<130><150><151><160><170><210><211><212><213><4 00>
<211><212><213><400>
LISTAGEM DE SEOUENCIA
Novozymes, Inc.Novozymes A/SLassen, S0ren FHarris, PaulVlasenko, ElenaPolipeptideos tendo atividade de endoglucanasecodificando os mesmos10890.204-W0607840882006-03-2015
PatentIn version 3.4112DNA
Myceliophthora thermophila1
ctttccagca ca<210> 2<211> 8<212> DNA
<213> Myceliophthora thermophila<4 00> 2gaaaggtc<210> 3
1188DNA
Myceliophthora thermophila3
cgacttgaaa cgccccaaat gaagtcctcc atcctcgcca gcgtcttcgcgtggctcaaa gtggtccgtg gcagcaatgt ggtggcatcg gatggcaaggtgtgtgtcgg gctaccactg cgtctaccag aacgattggt acagccagtggcggcgtcga caacgctgca gacatcgacc acgtccaggc ccaccgccaccctccgtcgt ccaccacctc gcctagcaag ggcaagctga agtggctcggtcgggcgccg agttcgggga gggcaattac cccggcctct ggggcaagcaccgtcgactt cggcgattca gacgctcatc aatgatggat acaacatcttttctcgatgg agcgtctggt gcccaaccag ttgacgtcgt ccttcgaccacgcaacctga ccgaggtggt caacttcgtg acgaacgcgg gcaagtacgcccgcacaact acggccggta ctacggcaac atcatcacgg acacgaacgcttctggacca acctggccaa gcagttcgcc tccaactcgc tcgtcatcttaacgagtaca acacgatgga ccagaccctg gtgctcaacc tcaaccaggcggcatccggg ccgccggcgc gacctcgcag tacatcttcg tcgagggcaaggggcctgga gctggaacac gaccaacacc aacatggccg ccctgacggaaagatcgtgt acgagatgca ccagtacctc gactcggaca gctcgggcactgcgtcagca gcaccatcgg cgcccagcgc gtcgtcggag ccacccagtgaacggcaagc tcggcgtcct cggcgagttc gccggcggcg ccaacgccgtgccgtcaccg gcctcctcga ccacctccag gacaacagcg acgtctggcttggtgggccg ccggtccctg gtggggcgac tacatgtact cgttcgagccaccggctatg tcaactacaa ctcgatcttg aagaagtact tgccgtaa<210> 4<211> 389<212> PRT
<213> Myceliophthora thermophila<4 00> 4
Met Lys Ser Ser Ile Leu Ala Ser Val Phe Ala Thr Gly Ala15 10
Gln Ser Gly Pro Trp Gln Gln Cys Gly Gly Ile Gly Trp Gln
20 25 30
Thr Asp Cys Val Ser Gly Tyr His Cys Val Tyr Gln Asn Asp35 40 45
e polinucleotideos
cacgggcgccatcgaccgaccgtgcctggccagcaccgcccagcaacgagcttcatcttcccggatcgacgggttacctccgtcctggacgttccggacccgacaccaaccgccatcgaccgcgtggagccccgcagaacccacgccgaggctccgcgccctgccagcaggggtgccctctccttcgggc
Val Ala15
Gly SerTrp Tyr
12
601201802403003604204805406006607207808409009601020108011401188Ser Gln Cys Val Pro Gly Ala Ala Ser Thr Thr Leu Gln Thr Ser Thr 50 55 60 Thr Ser Arg Pro Thr Ala Thr Ser Thr Ala Pro Pro Ser Ser Thr Thr65 70 75 80Ser Pro Ser Lys Gly Lys Leu Lys Trp Leu Gly Ser Asn Glu Ser Gly 85 90 95 Ala Glu Phe Gly Glu Gly Asn Tyr Pro Gly Leu Trp Gly Lys His Phe 100 105 110 Ile Phe Pro Ser Thr Ser Ala Ile Gln Thr Leu Ile Asn Asp Gly Tyr 115 120 125 Asn Ile Phe Arg Ile Asp Phe Ser Met Glu Arg Leu Val Pro Asn Gln 130 135 140 Leu Thr Ser Ser Phe Asp Gln Gly Tyr Leu Arg Asn Leu Thr Glu Val145 150 155 160Val Asn Phe Val Thr Asn Ala Gly Lys Tyr Ala Val Leu Asp Pro His 165 170 175 Asn Tyr Gly Arg Tyr Tyr Gly Asn Ile Ile Thr Asp Thr Asn Ala Phe 180 185 190 Arg Thr Phe Trp Thr Asn Leu Ala Lys Gln Phe Ala Ser Asn Ser Leu 195 200 205 Val Ile Phe Asp Thr Asn Asn Glu Tyr Asn Thr Met Asp Gln Thr Leu 210 215 220 Val Leu Asn Leu Asn Gln Ala Ala Ile Asp Gly Ile Arg Ala Ala Gly225 230 235 240Ala Thr Ser Gln Tyr Ile Phe Val Glu Gly Asn Ala Trp Ser Gly Ala 245 250 255 Trp Ser Trp Asn Thr Thr Asn Thr Asn Met Ala Ala Leu Thr Asp Pro 260 265 270 Gln Asn Lys Ile Val Tyr Glu Met His Gln Tyr Leu Asp Ser Asp Ser 275 280 285 Ser Gly Thr His Ala Glu Cys Val Ser Ser Thr Ile Gly Ala Gln Arg 290 295 300 Val Val Gly Ala Thr Gln Trp Leu Arg Ala Asn Gly Lys Leu Gly Val305 310 315 320Leu Gly Glu Phe Ala Gly Gly Ala Asn Ala Val Cys Gln Gln Ala Val 325 330 335 Thr Gly Leu Leu Asp His Leu Gln Asp Asn Ser Asp Val Trp Leu Gly 340 345 350 Ala Leu Trp Trp Ala Ala Gly Pro Trp Trp Gly Asp Tyr Met Tyr Ser 355 360 365 Phe Glu Pro Pro Ser Gly Thr Gly Tyr Val Asn Tyr Asn Ser Ile Leu 370 375 380 Lys Lys Tyr Leu Pro
385
<210> 5<211> 1232<212> DNA
<213> BASIDIOMYCETE CBS 4 95.95<4 00> 5
ggatccactt agtaacggcc gccagtg.tgc tggaaagcat gaagtctctc ttcctgtcac 60
ttgtagcgac cgtcgcgctc agctcgccag tattctctgt cgcagtctgg gggcaatgcg 120
gcggcattgg cttcagcgga agcaccgtct gtgatgcagg cgccggctgt gtgaagctca 180
acgactatta ctctcaatgc caacccggcg ctcccactgc tacatccgcg gcgccaagta 240
gcaacgcacc gtccggcact tcgacggcct cggccccctc ctccagcctt tgctctggca 300
gccgcacgcc gttccagttc ttcggtgtca acgaatccgg cgcggagttc ggcaacctga 360
acatccccgg tgttctgggc accgactaca cctggccgtc gccatccagc attgacttct 420
tcatgggcaa gggaatgaat accttccgta ttccgttcct catggagcgt cttgtccccc 480
ctgccactgg catcacagga cctctcgacc agacgtactt gggcggcctg cagacgattg 540
tcaactacat caccggcaaa ggcggctttg ctctcattga cccgcacaac tttatgatct 600
acaatggcca gacgatctcc agtaccagcg acttccagaa gttctggcag aacctcgcag 660
gagtgtttaa atcgaacagt cacgtcatct tcgatgttat gaacgagcct cacgatattc 720
ccgcccagac cgtgttccaa ctgaaccaag ccgctgtcaa tggcatccgt gcgagcggtg 780
cgacgtcgca gctcattctg gtcgagggca caagctggac tggagcctgg acctggacga 840cctctggcaa cagcgatgca ttcggtgcca ttaaggatcc caacaacaac gtcgcgatcc 900agatgcatca gtacctggat agcgatggct ctggcacttc gcagacctgc gtgtctccca 960ccatcggtgc cgagcggttg caggctgcga ctcaatggtt gaagcagaac aacctcaagg 1020gcttcctggg cgagatcggc gccggctcta actccgcttg catcagcgct gtgcagggtg 1080cgttgtgttc gatgcagcaa tctggtgtgt ggctcggcgc tctctggtgg gctgcgggcc 1140cgtggtgggg cgactactac cagtccatcg agccgccctc tggcccggcg gtgtccgcga 1200tcctcccgca ggccctgctg ccgttcgcgt aa 1232
<210> 6<211> 397<212> PRT
<213> BASIDIOMYCETE CBS 4 95.95<400> 6
Met Lys Ser Leu Phe Leu Ser Leu Val Ala Thr Val Ala Leu Ser Ser1 5 10 15 Pro Val Phe Ser Val Ala Val Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Phe 20 25 30 Ser Gly Ser Thr Val Cys Asp Ala Gly Ala Gly Cys Val Lys Leu Asn 35 40 45 Asp Tyr Tyr Ser Gln Cys Gln Pro Gly Ala Pro Thr Ala Thr Ser Ala 50 55 60 Ala Pro Ser Ser Asn Ala Pro Ser Gly Thr Ser Thr Ala Ser Ala Pro65 70 75 80Ser Ser Ser Leu Cys Ser Gly Ser Arg Thr Pro Phe Gln Phe Phe Gly 85 90 95 Val Asn Glu Ser Gly Ala Glu Phe Gly Asn Leu Asn Ile Pro Gly Val 100 105 110 Leu Gly Thr Asp Tyr Thr Trp Pro Ser Pro Ser Ser Ile Asp Phe Phe 115 120 125 Met Gly Lys Gly Met Asn Thr Phe Arg Ile Pro Phe Leu Met Glu Arg 130 135 140 Leu Val Pro Pro Ala Thr Gly Ile Thr Gly Pro Leu Asp Gln Thr Tyr145 150 155 160Leu Gly Gly Leu Gln Thr Ile Val Asn Tyr Ile Thr Gly Lys Gly Gly 165 170 175 Phe Ala Leu Ile Asp Pro His Asn Phe Met Ile Tyr Asn Gly Gln Thr 180 185 190 Ile Ser Ser Thr Ser Asp Phe Gln Lys Phe Trp Gln Asn Leu Ala Gly 195 200 205 Val Phe Lys Ser Asn Ser His Val Ile Phe Asp Val Met Asn Glu Pro 210 215 220 His Asp Ile Pro Ala Gln Thr Val Phe Gln Leu Asn Gln Ala Ala Val225 230 235 240Asn Gly Ile Arg Ala Ser Gly Ala Thr Ser Gln Leu Ile Leu Val Glu 245 250 255 Gly Thr Ser Trp Thr Gly Ala Trp Thr Trp Thr Thr Ser Gly Asn Ser 260 265 270 Asp Ala Phe Gly Ala Ile Lys Asp Pro Asn Asn Asn Val Ala Ile Gln 275 280 285 Met His Gln Tyr Leu Asp Ser Asp Gly Ser Gly Thr Ser Gln Thr Cys 290 295 300 Val Ser Pro Thr Ile Gly Ala Glu Arg Leu Gln Ala Ala Thr Gln Trp305 310 315 320Leu Lys Gln Asn Asn Leu Lys Gly Phe Leu Gly Glu Ile Gly Ala Gly 325 330 335 Ser Asn Ser Ala Cys Ile Ser Ala Val Gln Gly Ala Leu Cys Ser Met 340 345 350 Gln Gln Ser Gly Val Trp Leu Gly Ala Leu Trp Trp Ala Ala Gly Pro 355 360 365 Trp Trp Gly Asp Tyr Tyr Gln Ser Ile Glu Pro Pro Ser Gly Pro Ala 370 375 380 Val Ser Ala Ile Leu Pro Gln Ala Leu Leu Pro Phe Ala 385 390 395 <210> 7<211> 1303<212> DNA
<213> BASIDIOMYCETE CBS 494.95<400> 7
ggaaagcgtc agtatggtga aatttgcgct tgtggcaactttctgcggcc aatgcggctt ctatctacca gcaatgtggacactgtttgc gacgccggtc tcgcttgcgt tatcctcaatgacgcccgcc gcgggccaga caacgacggg ctcgggcgcatcactcaacg gtcactacgg ggagctcaca ctcaacaaccaactaccact ccgtcgacca ccacgaccct acccgccatcctctggctcc aggacgaagt tcaagttctt cggtgtgaatgaacactgct tggccagggc agctcgggaa agactatacaggactacttc atgggggctg gattcaatac attccgtatcgagccctccg gctaccggac tcactggccc attcaaccagcaccattgtc gactacatca cgaacaaagg aggatacgctcatgcgttac aacaacggca taatcagcag cacatctgactttggccact gtattcaaat ccacgaagaa cgccatcttccggaatcgat gcgcagaccg tatacgaact gaatcaagctcgctggcgct acgtcacagt tgattctggt tgaaggaacggtgggtctcg tccggaaacg gagctgcttt cgcggccgttggcaattgaa atgcaccaat acctcgacag cgacggttctctcctccacc attgggtcgc aacgtctcca agctgccactactcaaggga ttcctcggag agacgggtgc tgggtcgaatgttcgatgaa ctttgctata tgcaacagca aggcggctccggctgcgggt ccctggtggg gcacgtacat ttactcgatttatcccagaa gtccttcctc agggtctcgc tccattcctc<210> 8<211> 429<212> PRT
<213> BASIDIOMYCETE CBS 4 94.95<400> 8
Met Val Lys Phe Ala Leu Val Ala Thr Val Gly15 10
Ser Ala Ala Asn Ala Ala Ser Ile Tyr Gln Gln
20 25
Trp Ser Gly Ser Thr Val Cys Asp Ala Gly Leu
35 40
Asn Ala Tyr Tyr Phe Gln Cys Leu Thr Pro Ala
50 55
Thr Gly Ser Gly Ala Pro Ala Ser Thr Ser Thr
70
gtcggcgcaaggcattggatgcgtactactccggcgtcaagggacgacggtctgtgtctggaaagcggcgtggccttcgcaccttcttgaacgtacctgtcttattgaccttcgcgacttgacatccagagccatcaatttcatacactgacggatccttgggacaaacggcgtggctgctcccagtgcatggatcggtggaacctccgatag
tcttgagcgcggtctgggtcttcagtgcttcatcaacctccgacgaaaacgtcgcgtctgccgaattcggctagcagcgttggagcgtatcgggcctcaccccacaacttggtggagcaaacgagccgtacgatccgcgcgagcttggacacaacaacacaagactgtgtaacaaacaggtcgacgccgtcactctggtggcggtgccgc
Ala Ile Leu
Cys Gly Gly30
Ala Cys Val45
Ala Gly Gln60
Ser His Ser
65
75
Ser Ala15
Ile Gly
Ile Leu
Thr Thr
Thr Val80
Thr Thr Gly Ser Ser 85 His Ser Thr Thr Gly 90 Thr Thr Ala Thr Lys 95 ThrThr Thr Thr Pro 100 Ser Thr Thr Thr Thr 105 Leu Pro Ala Ile Ser 110 Val SerGly Arg Val Cys Ser Gly Ser Arg Thr Lys Phe Lys Phe Phe Gly Val 115 120 125 Asn Glu Ser Gly Ala Glu Phe Gly Asn Thr Ala Trp Pro Gly Gln Leu 130 135 140 Gly Lys Asp Tyr Thr Trp Pro Ser Pro Ser Ser Val Asp Tyr Phe Met145 150 155 160Gly Ala Gly Phe Asn Thr Phe Arg Ile Thr Phe Leu Met Glu Arg Met 165 170 175 Ser Pro Pro Ala 180 Thr Gly Leu Thr Gly 185 Pro Phe Asn Gln Thr 190 Tyr LeuSer Gly Leu 195 Thr Thr Ile Val Asp 200 Tyr Ile Thr Asn Lys 205 Gly Gly TyrAla Leu 210 Ile Asp Pro His Asn 215 Phe Met Arg Tyr Asn 220 Asn Gly Ile IleSer Ser Thr Ser Asp Phe Ala Thr Trp Trp Ser Asn Leu Ala Thr Val225 230 235 240Phe Lys Ser Thr Lys 245 Asn Ala Ile Phe Asp 250 Ile Gln Asn Glu Pro 255 Tyr
60120180240300360420480540600660720780840900960102010801140120012601303Gly Ile Asp Ala Gln Thr Val Tyr Glu Leu Asn
260 265
Ser Ile Arg Ala Ala Gly Ala Thr Ser Gln Leu
275 280
Thr Ser Tyr Thr Gly Ala Trp Thr Trp Val Ser
290 295
Ala Phe Ala Ala Val Thr Asp Pro Tyr Asn Asn305 310 315
His Gln Tyr Leu Asp Ser Asp Gly Ser Gly Thr
325 330
Ser Ser Thr Ile Gly Ser Gln Arg Leu Gln Ala
340 345
Gln Gln Thr Gly Leu Lys Gly Phe Leu Gly Glu
355 360
Asn Ser Gln Cys Ile Asp Ala Val Phe Asp Glu
370 375
Gln Gln Gly Gly Ser Trp Ile Gly Ala Leu Trp385 390 395
Trp Trp Gly Thr Tyr Ile Tyr Ser Ile Glu Pro
405 410
Ile Pro Glu Val Leu Pro Gln Gly Leu Ala Pro420 425
<210> 9<211> 1488<212> DNA
<213> PENICILLIUM BRASILIANUM<4 00> 9
atgaaatacc ctctactcct ggcaaccagc gctgccctggttctccaagc gagcctcttc ttttgtttgt atgtgtagagaactgacctg aatttttagg gtttggtacc agcgagtctgaacattccgg gtgttttggg gacggactac atttggcccgctacgcaacg cgggtatgaa catctttcgg gtggcattttaccacattga cctcaactcc ggattcgacg tatctgcaagcctcgtcaac aatgcaaccc gtgctaaacg atctccagacccggcgcata tgctattgtg gacccccata actttggacgtctaaccaat attgaaaatc tcctcacggg tgtattagctacaagtgact ttgctgcatt ttggaccacc gtcgcaaagcgtcatctttg acacgagtga gcatcactac ttcactaactatctgcagac aacgaattca acacagagga ccaaacgcttggccattaat gccatccgag ctgccggagc cacctctcagttcgtggagt ggtgcctgga cgtggacgtc ggtcaataccccccaacaac aagatagtct acgagatgca ccagtatcttatccgacaca tgtgtcagct cgaccatcgg ccaggagcgtgctgaaaagc aatggcaaac ttggattctt gggcgaatttctgtcagagc gccgtgactg gaatgctgga ctatatgcaacggcgcatcc tggtgggcag caggaccatg gtggggaaccgccatcgggg actgcttatt cttactatct caacatcttgctcgggaagt tccacaacca caactacctc cactaccacctacagtatcc accacaaaat caacaagcac cactacaagccacgacaagc accaccagca ccgggtctac tgctactgcagtgtggcggc attggctgga cgggggcgac gacgtgtgccccagaatgcg tattattcgc agtgtctgta atgcagaagt<210> 10<211> 421<212> PRT
<213> PENICILLIUM BRASILIANUM<4 00> 10
Met Lys Tyr Pro Leu Leu Leu Ala Thr Ser Ala15 10
Gly Pro Gln Gly Phe Ser Lys Arg Ala Ser Ser
20 25
Thr Ser Glu Ser Gly Ala Glu Phe Gly Asn Gln35 40
Gln Ala Ala270
Ile Leu Val
285Ser Gly Asn300
Thr Ala Ile
Asn Glu Asp
Ala Thr Ala350
Thr Gly Ala
365Leu Cys Tyr380
Trp Ala AlaPro Ser GlyPhe Leu
Ile Asn
Glu Gly
Gly Ala
Glu Met320Cys Val335
Trp Leu
Gly Ser
Met Gln
Gly Pro400Ala Ala415
ctcttgctggcccataagaagggcggagttacacttcagctgatggagcgacctgaagagagttgactacatagtaagttatggcaatatagtttgcatcttgttcccccgtactgaacctatatctttgaatctcgtcagactcggatggtacaatcgggcgggcggtggcgaatagtgtatatatatttctgcctactcgctctacatgccacgaaatacagcatctcagcccgtataatcagaaa
gcctcaaggctaagagctggtggcaatcagcattcaaacgattggttccctgtacgttatatcacgtcgagaacctttcaaatcaactccgaatgacaagactaactgactcaatcaagctggaagggaagcttgacggagatctggcaccgaccgagtgctaactcggtacgtctggctcgattgagcctcccctccagcgacaagcaccgacaagcacactgggcacacctgccaggt
60120180240300360420480540600660720780840900960102010801140120012601320138014401488
Ala Leu Ala Leu Ala15
Phe Val Trp Phe Gly30
Asn Ile Pro Gly Val45Leu Gly Thr Asp Tyr Ile Trp Pro Asp Thr Ser Ala
50 55 60
Arg Asn Ala Gly Met Asn Ile Phe Arg Val Ala Phe65 70 75
Leu Val Pro Thr Thr Leu Thr Ser Thr Pro Asp Ser
85 90
Asp Leu Lys Ser Val Leu Asp Tyr Ile Thr Ser Thr
100 105
Ile Val Asp Pro His Asn Phe Gly Arg Tyr Tyr Gly
115 120
Ser Thr Ser Asp Phe Ala Ala Phe Trp Thr Thr Val130 135 140
Ala Ser Asn Asp Lys Val Ile Phe Asp Thr Asn Asn145 150 155
Glu Asp Gln Thr Leu Val Leu Asn Leu Asn Gln Ala
165 170
Ile Arg Ala Ala Gly Ala Thr Ser Gln Tyr Ile Phe
180 185
Ser Trp Ser Gly Ala Trp Thr Trp Thr Ser Val Asn
195 200
Ser Leu Thr Asp Pro Asn Asn Lys Ile Val Tyr Glu210 215 220
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Gly Thr Ser Asp Thr Cys225 230 235
Ile Gly Gln Glu Arg Val Gln Ser Ala Thr Glu Trp
245 250
Gly Lys Leu Gly Phe Leu Gly Glu Phe Ala Gly Gly
260 265
Cys Gln Ser Ala Val Thr Gly Met Leu Asp Tyr Met
275 280
Asp Val Trp Leu Gly Ala Ser Trp Trp Ala Ala Gly290 295 300
Thr Tyr Ile Tyr Ser Ile Glu Pro Pro Ser Gly Thr305 310 315
Tyr Leu Asn Ile Leu Ser Ala Tyr Phe Pro Ser Ser
325 330
Thr Thr Thr Thr Thr Ser Thr Thr Thr Arg Ser Thr
340 345
Thr Val Ser Thr Thr Lys Ser Thr Ser Thr Thr Thr
355 360
Ser Thr Ser Thr Thr Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly370 375 380
Ala Thr Ala Ser His Trp Ala Gln Cys Gly Gly Ile385 390 395
Ala Thr Thr Cys Ala Ser Pro Tyr Thr Cys Gln Val
405 410
Tyr Ser Gln Cys Leu420
1129DNA
PENICILLIUM BRASILIANUM
Ile Gln Thr Leu
Leu Met Glu Arg80
Thr Tyr Leu Gln95
Gly Ala Tyr Ala110
Asn Ile Ile Asn125
Ala Lys Gln Phe
Glu Phe Asn Thr160
Ala Ile Asn Ala175
Val Glu Gly Asn190
Thr Asn Leu Val205
Met His Gln Tyr
Val Ser Ser Thr240
Leu Lys Ser Asn255
Ala Asn Ser Val270
Gln Ala Asn Ser285
Pro Trp Trp Gly
Ala Tyr Ser Tyr320
Ser Gly Ser Ser335
Ser Thr Ser Thr350
Ser Ala Thr Lys365
Ser Thr Ala Thr
Gly Trp Thr Gly400
Gln Asn Ala Tyr415
<210><211><212><213><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222>
misc_feature(21)..(21)N= A,C,G,OR T
misc_feature(24) .. (24)N= A, C, G, OR T
mi sc_feature(27)..(27)<223> R= A OR G<400> 11
ttcggtacct ctgagtctgg ngcngartt
<210> 12<211> 35<212> DNA<213> PENICILLIUM<220> <221> misc feature<222> (24)..(24)<223> R=A OR G<220> <221> misc feature<222> (27)..(27)<223> N=A,C,G, OR 1<220> <221> misc feature<222> (30)..(30)<223> R=A OR G<220> <221> misc feature<222> (33)..(33)<223> R=A OR G<4 00> 12
tgatccatat cgtggtactc gttrttngtr tcraa
<210> 13<211> 29<212> DNA<213> PENICILLIUM<220> <221> misc feature<222> (18)..(18)<223> R=A OR G<220> <221> misc feature<222> (21)..(21)<223> R=A OR G<220> <221> misc feature<222> (24) .. (24)<223> N=A,C,G, OR '<220> <221> misc feature<222> (27)..(27)<223> R=A OR G<400> 13
ccgttgtagc gaccgtartt rtgnggrtc<210> 14<211> 39<212> DNA
<213> PENICILLIUM BRASILIANUM<400> 14
aattggatcc accatgaaat accctctact cctggcaac<210> 15<211> 38<212> DNA
<213> PENICILLIUM BRASILIANUM<400> 15
ttaactcgag ttacagacac tgcgaataat acgcattc

Claims (55)

1. Polipeptídeo isolado tendo atividade endoglucanase,caracterizado pelo fato de ser selecionado dentre o grupo consistindo de.(a) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência deaminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade com o polipeptídeomaduro de SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 10, pelo menos 85% de identidadecom o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 6, ou pelo menos 75% deidentidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 8;(b) um polipeptídeo que é codificado por um polinucleotídeoque hibridiza sob condições pelo menos de alta estringência com (i) aseqüência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, SEQ IDNO: 5, SEQ ID NO: 7, ou SEQ ID NO: 9, (ii) a seqüência de cDNA contidaem uma seqüência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3ou SEQ ID NO: 9 ou a seqüência de DNA genômico compreendendo aseqüência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5 ou SEQID NO: 7, ou (iii) um filamento complementar de comprimento completo de(i) ou (ii);(c) um polipeptídeo que é codificado por um polinucleotídeotendo pelo menos 80%) de identidade com a seqüência de codificação depolipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 9, pelo menos 85%de identidade com a seqüência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQID NO: 5, ou pelo menos 75% de identidade com a seqüência de codificaçãode polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 7; e(d) uma variante compreendendo uma substituição, deleção,e/ou inserção de um ou mais aminoácidos do polipeptídeo maduro de SEQ IDNO: 4 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, ou SEQ ID NO: 10.
2. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de compreender uma seqüência de aminoácidos que tempreferivelmente pelo menos 80% de identidade, mais preferivelmente pelomenos 85% de identidade, ainda mais preferivelmente pelo menos 90% deidentidade, e o mais preferivelmente pelo menos 95% de identidade com opolipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4; uma seqüência de aminoácidos quetem preferivelmente pelo menos 85% de identidade, mais preferivelmentepelo menos 90% de identidade, e o mais preferivelmente pelo menos 95% deidentidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 6; uma seqüência deaminoácidos que tem preferivelmente pelo menos 75% de identidade, maispreferivelmente pelo menos 80% de identidade, ainda mais preferivelmentepelo menos 85% de identidade, o mais preferivelmente pelo menos 90% deidentidade, e ainda o mais preferivelmente pelo menos 95% de identidadecom o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 8; ou uma seqüência deaminoácidos que tem preferivelmente pelo menos 80% de identidade, maispreferivelmente pelo menos 85% de identidade, ainda mais preferivelmentepelo menos 90% de identidade, e o mais preferivelmente pelo menos 95% deidentidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 10.
3. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de compreender ou consistir de seqüência de aminoácido de SEQ IDNO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 8, ou SEQ ID NO: 10; ou um fragmentoda mesma tendo atividade endoglucanase.
4. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 3, caracterizadopelo fato de compreender ou consistir de seqüência de aminoácido de SEQ IDNO: 4: SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, ou SEQ ID NO: 10.
5. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 3, caracterizadopelo fato de compreender ou consistir de polipeptídeo maduro de SEQ IDNO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, ou SEQ ID NO: 10.
6. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de ser codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sobcondições pelo menos de alta estringência com (i) a seqüência de codificaçãode polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, ouSEQ ID NO: 9, (ii) a seqüência de cDNA contida em uma seqüência decodificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 9 ou aseqüência de DNA genômico compreendendo a seqüência de codificação depolipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7, ou (iii) umfilamento complementar de (i) ou (ii).
7. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de ser codificado por um polinucleotídeo tendo preferivelmente pelomenos 80% de identidade, mais preferivelmente pelo menos 85% deidentidade, ainda mais preferivelmente pelo menos 90% de identidade, e omais preferivelmente pelo menos 95% de identidade com a seqüência decodificação de polipeptídeo maduro SEQ ID NO: 3; um polinucleotídeo tendopreferivelmente pelo menos 85% de identidade, mais preferivelmente pelomenos 90% de identidade, e o mais preferivelmente pelo menos 95% deidentidade com a seqüência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQID NO: 5; um polinucleotídeo tendo preferivelmente pelo menos 75% deidentidade, mais preferivelmente pelo menos 80% de identidade, ainda maispreferivelmente pelo menos 85% de identidade, o mais preferivelmente pelomenos 90% de identidade, e ainda o mais preferivelmente pelo menos 95% deidentidade com a seqüência de codificação de polipeptídeo maduro SEQ IDNO: 7; ou um polinucleotídeo tendo preferivelmente pelo menos 80% deidentidade, mais preferivelmente pelo menos 85% de identidade, ainda maispreferivelmente pelo menos 90% de identidade, e o mais preferivelmente pelomenos 95% de identidade com a seqüência de codificação de polipeptídeomaduro de SEQ ID NO: 9.
8. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de ser codificado por um polinucleotídeo compreendendo ouconsistindo de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO; 7, ou SEQ IDNO: 9; ou uma subseqüência do mesmo que codifica um fragmento depolipeptídeo tendo atividade endoglucanase.
9. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato de ser codificado por um polinucleotídeo compreendendo ouconsistindo de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, ou SEQ IDNO: 9.
10. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 8,caracterizado pelo fato de ser codificado por um polinucleotídeocompreendendo ou consistindo de uma seqüência de codificação depolipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, ouSEQ ID NO: 9.
11. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é uma variante compreendendouma substituição, deleção, e/ou inserção de um ou mais aminoácidos dopolipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, ouSEQ ID NO: 10.
12. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de ser codificado pelo polinucleotídeo contido emplasmídeo pCIClól que está contido em E. coli NRRL B-30902, pCIC453que está contido em E. coli NRRL B-30903, pCIC486 que está contido em E.coli NRRL B- 30904, ou pPBCel5C que está contido em E. coli NRRL B-30900N.
13. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, 2, 5 ou 11,caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo maduro são os aminoácidos 17a- 389 de SEQ ID NO: 4, aminoácidos 16 a 397 de SEQ ID NO: 6, aminoácidos- 22 a 429 de SEQ ID NO: 8, ou aminoácidos 25 a 421 de SEQ ID NO: 10.
14. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, 6, 7 ou 10,caracterizado pelo fato de que a seqüência de codificação de polipeptídeomaduro são os nucleotídeos 67 a 1185 de SEQ ID NO: 3, nucleotídeos 84 a- 1229 de SEQ ID NO: 5, nucleotídeos 77 a 1300 de SEQ ID NO: 7, ounucleotídeos 73 a 1488 de SEQ ID NO: 9.
15. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1-14, caracterizado pelo fato de ainda ter atividade de enzimapara um ou mais substratos selecionados dentre o grupo consistindo de xilano,xiloglucano, arabinoxilano. 1,4-beta-D-mannano, e galactomannano.
16. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato decompreender uma seqüência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeocomo definido em qualquer uma das reivindicações 1-15.
17. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato de compreender pelo menos uma mutação em umaseqüência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, SEQ DDNO: 5, SEQ ID NO: 7, ou SEQ ID NO: 9, em que a seqüência mutante denucleotídeos codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:-6, SEQ ID NO: 8, ou SEQ ID NO: 10, respectivamente.
18. Construção de ácido nucleico, caracterizada pelo fato decompreender o polinucleotídeo como definido na reivindicação 16 ou 17ligado operativamente a uma ou mais seqüências de controle que dirigem aprodução do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão.
19. Vetor de expressão recombinante, caracterizado pelo fatode compreender a construção de ácido nucleico como definida nareivindicação 18.
20. Célula hospedeira recombinante, caracterizada pelo fato decompreender a construção de ácido nucleico como definida na reivindicação 18.
21. Método para produzir o polipeptídeo como definido emqualquer uma das reivindicações 1-15 caracterizado pelo fato decompreender: (a) cultivar uma célula, que em sua forma de tipo selvagem écapaz de produzir o polipeptídeo, sob condições que conduzem para produçãodo polipeptídeo; e (b) recuperação do polipeptídeo.
22. Método para produzir o polipeptídeo como definido emqualquer uma das reivindicações 1-15 caracterizado pelo fato decompreender: (a) cultivar uma célula hospedeira compreendendo a construçãode ácido nucleico compreendendo uma seqüência de nucleotídeos codificandoo polipeptídeo sob condições que conduzem para produção do polipeptídeo; e(b) recuperação do polipeptídeo.
23. Método para produzir um mutante de uma célula deorigem, caracterizado pelo fato de que compreende romper ou deletar umaseqüência de nucleotídeos codificando o polipeptídeo como definido emqualquer uma das reivindicações 1-15, que resulta no mutante produzir menosdo polipeptídeo do que a célula de origem.
24. Célula mutante, caracterizada pelo fato de ser produzidapelo método como definido na reivindicação 23.
25. Célula mutante de acordo com a reivindicação 24,caracterizada pelo fato de ainda compreender um gene codificando umaproteína nativa ou heteróloga.
26. Método para produzir uma proteína, caracterizado pelofato de compreender; (a) cultivar a célula mutante como definida nareivindicação 25 sob condições que conduzem para produção da proteína; e(b) recuperação da proteína.
27. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de serobtido por (a) hibridização de uma população de DNA sob condições pelomenos de alta estringência com (i) a seqüência de codificação de polipeptídeomaduro de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, ou SEQ ID NO: 9,(ii) a seqüência de cDNA contida em uma seqüência de codificação depolipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 9 ou a seqüência deDNA genômico compreendendo a seqüência de codificação de polipeptídeomaduro de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7, ou (iii) um filamentocomplementar de (i) ou (ii); e (b) isolamento do polinucleotídeo dehibridização, que codifica um polipeptídeo tendo atividade endoglucanase.
28. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 27,caracterizado pelo fato de que a seqüência de codificação de polipeptídeomaduro são os nucleotídeos 67 a 1185 de SEQ ID NO: 3, nucleotídeos 84 a-1229 de SEQ ID NO: 5, nucleotídeos 77 a 1300 de SEQ ID NO: 7, ounucleotídeos 73 a 1468 de SEQ ID NO: 9.
29. Método para produzir um polinucleotídeo compreendendouma seqüência de nucleotídeo mutante, caracterizado pelo fato decompreender: (a) introduzir pelo menos uma mutação em uma seqüência decodificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQID NO: 7, ou SEQ ID NO: 9, em que a seqüência mutante de nucleotídeoscodifica um polipeptídeo consistindo do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO:-4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, ou SEQ ID NO: 10; e (b) recuperar opolinucleotídeo compreendendo a seqüência mutante de nucleotídeo.
30. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizadopelo fato de que a seqüência de codificação de polipeptídeo maduro são osnucleotídeos 67 a 1185 de SEQ ID NO: 3, nucleotídeos 84 a 1229 de SEQ IDNO: 5, nucleotídeos 77 a 1300 de SEQ ID NO: 7, ou nucleotídeos 73 a 1468de SEQ ID NO: 9.
31. Polinucleotídeo mutante, caracterizado pelo fato de serproduzido pelo método como definido na reivindicação 29 ou 30.
32. Método para produzir um polipeptídeo, caracterizado pelofato de compreender: (a) cultivar uma célula compreendendo opolinucleotídeo mutante como definido na reivindicação 31 codificando opolipeptídeo sob condições que conduzem para a produção do polipeptídeo; e(b) recuperar o polipeptídeo.
33. Construção de ácido nucleico, caracterizada pelo fato decompreender um gene codificando uma proteína ligada operativamente a umaou ambas dentre uma primeira seqüência de nucleotídeos codificando umpeptídeo de sinal compreendendo ou consistindo de aminoácidos 1 a 17 deSEQ ID NO: 4, aminoácidos 1 a 15 de SEQ ID NO: 6, aminoácidos 1 a 21 deSEQ ID NO: 8, ou aminoácidos 1 a 16 de SEQ ID NO: 10, e a segundaseqüência de nucleotídeos codificando um pró-peptídeo compreendendo ouconsistindo de aminoácidos 17 a 24 de SEQ ID NO: 10, em que um gene éestranho para a seqüência de nucleotídeo.
34. Vetor de expressão recombinante, caracterizado pelo fatode compreender a construção de ácido nucleico como definido nareivindicação 33.
35. Célula hospedeira recombinante, caracterizada pelo fato decompreender a construção de ácido nucleico como definido na reivindicação 33.
36. Método para produzir uma proteína, caracterizado pelofato de compreender: (a) cultivar a célula hospedeira recombinante comodefinida na reivindicação 35 sob condições que conduzem para produção daproteína; e (b) recuperar a proteína.
37. Método para produzir o polipeptídeo como definido emqualquer uma das reivindicações 1-15, caracterizado pelo fato decompreender: (a) cultivar uma planta transgênica ou uma célula de plantacompreendendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendoatividade endoglucanase sob condições que conduzem para produção dopolipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.
38. Planta transgênica, parte de planta ou célula de planta,caracterizada pelo fato de que foi transformada com um polinucleotídeocodificando o polipeptídeo como definido em qualquer uma dasreivindicações 1-15.
39. Método para degradar ou converter um material celulósico,caracterizado pelo fato de compreender: tratar o material celulósico com umacomposição compreendendo uma quantidade eficaz de um polipeptídeo tendoatividade endoglucanase como definido em qualquer uma das reivindicações-1-15.
40. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizadopelo fato de que a composição ainda compreende uma quantidade eficaz deuma endo-l,4-beta-glucanase, exo-l,4-beta-D-glucanase, e/ou beta-D-glucosidase.
41. Método de acordo com a reivindicação 39 ou 40,caracterizado pelo fato de que a composição ainda compreende umaquantidade eficaz de uma ou mais enzimas selecionadas dentre o grupoconsistindo de uma hemicelulase, esterase, protease, laccase, e peroxidase.
42. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-39-41 caracterizado pelo fato de que o método é um processo de pré-tratamento: uma etapa em um processo de sacarificação e fermentaçãosimultâneas (SSF); ou uma etapa em uma hidrólise de híbrido e processo defermentação (HHF).
43. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-39-42, caracterizado pelo fato de ainda compreender a recuperação domaterial celulósico degradado ou convertido.
44. Método para degradar ou converter um material celulósico,caracterizado pelo fato de compreender: tratar a biomassa com umacomposição compreendendo a célula hospedeira como definida nareivindicação 20.
45. Método de acordo com a reivindicação 44, caracterizadopelo fato de que a composição ainda compreende uma quantidade eficaz deuma endo-l,4-beta-glucanase, exo-l,4-beta-D-glucanase, e/ou beta-D-glucosidase.
46. Método de acordo com a reivindicação 44 ou 45,caracterizado pelo fato de que a composição ainda compreende umaquantidade eficaz de uma ou mais enzimas selecionadas dentre o grupoconsistindo de uma hemicelulase, esterase, protease, laccase, e peroxidase.
47. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 44-46, caracterizado pelo fato de ainda compreender a recuperação domaterial celulósico degradado ou convertido.
48. Método para produzir uma substância, caracterizado pelofato de compreender: (a) sacarificar um material celulósico com a composiçãocompreendendo uma quantidade eficaz de um polipeptídeo tendo atividadeendoglucanase como definida em qualquer uma das reivindicações 1-15, (b)fermentar o material celulósico sacarificado de etapa (a) com um ou maismicroorganismos de fermentação; e (c) recuperar a substância dafermentação.
49. Método de acordo com a reivindicação 48, caracterizadopelo fato de que a composição ainda compreende uma quantidade eficaz deendo-l,4-beta-glucanase, exo-l,4-beta-D-glucanase e/ou beta-D- glucosidase.
50. Método de acordo com a reivindicação 48 ou 49,caracterizado pelo fato de que a composição ainda compreende umaquantidade eficaz de uma ou mais enzimas selecionadas dentre o grupoconsistindo de uma hemicelulase, esterase, protease, laccase, e peroxidase.
51. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 48-50, caracterizado pelo fato de que as etapas (a) e (b) são realizadassimultaneamente em uma sacarificação e fermentação simultâneas.
52. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 48-51, caracterizado pelo fato de que a substância é um álcool, ácidoorgânico, cetona, aminoácido, ou gás.
53. Método para inibir a expressão de um polipeptídeo em umacélula, caracterizado pelo fato de compreender a administração à célula ouexpressão na célula de uma molécula de RNA de filamento duplo (dsRNA),em que um dsRNA compreende uma subseqüência ou porção de umpolinucleotídeo codificando o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4, SEQID NO: 8, SEQ ID NO: 8, ou SEQ ID NO: 10.
54. Método de acordo com a reivindicação 53, caracterizadopelo fato de que um dsRNA tem cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,-24, 25 ou mais nucleotídeos duplex em comprimento.
55. Molécula de RNA de filamento duplo (dsRNA) para inibira expressão de um polipeptídeo em uma célula, caracterizada pelo fato de queo dsRNA compreende uma subseqüência ou porção de um polinucleotídeocodificando o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQID NO: 8, ou SEQ ID NO: 10.
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