CN115299594B - 一种抗疲劳沙蚕运动饮料及其制备方法 - Google Patents
一种抗疲劳沙蚕运动饮料及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗疲劳沙蚕运动饮料及其制备方法，以重量计含有以下成分：分子量小于5kDa的超滤沙蚕酶解产物35～50％、酵母0.06～1％、罗汉果多糖0.02～0.05％、白砂糖4～7％、柠檬汁0.6～1.2％、氯化钠0.05％、磷酸二氢钾0.05％、磷酸二氢钠0.1％和水补足余量。本发明利用双齿围沙蚕作为原料制备得到一种抗疲劳运动饮料，其可显著提高机体肝糖原储存量，减少运动过程中乳酸的产生和积累，抑制运动时体内尿素氮的产生，具有良好的抗氧化活性及抗疲劳功效，符合运动饮料的要求。同时进一步提高了沙蚕的经济价值，有很大的应用价值，值得广泛推广。
Description
技术领域
本发明涉及功能性食品技术领域，更具体地，涉及一种抗疲劳沙蚕运动饮料及其制备方法
背景技术
功能性食品是当今食品加工热门研究的领域之一，而功能性运动饮料的研发是功能性食品研究的重要方向。功能性运动饮料是一类含有一些特殊的营养强化剂的运动饮料，使用这类运动饮料的个体能够承受更大的运动负荷，运动后机体体能恢复更快。目前，在全民运动及竞技体育水平不断提高，运动员训练强度不断加大的环境下，功能性运动饮料使用的范围十分广泛，而功能性运动饮料调节运动机体体能的功效主要依赖于饮料中营养强化剂的生理功效。抗氧化剂是功能性运动饮料中一类十分重要的营养强化剂，它可以保护机体组织不被氧自由基损伤，防止或延缓疲劳的产生，促进疲劳消除，提高运动机体的运动能力。因此寻找健康无毒的具有抗氧化活性的天然食品提取物作为功能性运动饮料的抗氧化剂将会是制备功能性运动饮料的未来趋势。
双齿围沙蚕(Perinereis anibuhiteensis)属于环节动物门(Annelida)多毛纲(Poly chaeta)、沙蚕科(Nereidae)、围沙蚕属动物,又称海蚯蚓、海蜈蚣、海百脚等。沙蚕的氨基酸组成基本齐全，蛋白质含量大于50％，其营养丰富，味道鲜美，在我国南方及国外一些地区也因为沙蚕味道鲜美而作为一种海产美味食品；沙蚕同时是一种食疗兼优的药膳，可以治疗胸闷、痰多和各种潮热、阴虚盗汗、牙龈肿痛等疾病；清代赵学敏著《本草纲目拾遗》中也记载：沙蚕“补脾胃，生血利湿，行小便；”沙蚕是鱼、虾、蟹和许多海鸟的重要食物来源，由于沙蚕的氨基酸组成独特，对鱼、虾、蟹类有强烈的诱食作用，是鱼、虾和蟹类的食饵，素有“万能钓饵”之称；用双齿围沙蚕培育海水鱼、虾、蟹的亲体，不仅能显著提高亲体的成活率，促进亲体的性腺发育，而且可增加产卵量，并有利于卵的孵化和幼体的发育变态。
由于沙蚕在食用、水产养殖及垂钓等方面的多种用途，因而具有较高的经济价值，国内外市场需求量非常大，加之自然野生沙蚕日趋枯竭，近年来常常出现有价无货、供不应求的现象。为了弥补自然资源的不足，一些地方已开展了沙蚕的人工养殖试验，并取得了较好的经济效益。但沙蚕目前多用作饲料、饵料和直接食用等低值化利用，为高值化利用沙蚕，提高沙蚕的经济价值，需对沙蚕营养成分及其功效机制作进一步的研究，国内外对沙蚕的研究主要集中在沙蚕富集重金属及其他污染物、提取纤溶酶、沙蚕生态修复、沙蚕毒素及沙蚕养殖等方面，对沙蚕生物活性功能方面研究较少，利用沙蚕进行功能性食品研发未见报道。
沙蚕在耐受重金属及有机质污染时呈现出强大的抗氧化活性，国内外学者研究沙蚕耐受重金属及有机质污染机制时从侧面印证了沙蚕具有强大的抗氧化活性，而且沙蚕蛋白质含量高，氨基酸组成齐全，但是沙蚕是否能够用于制备高抗氧化活性功能性运动饮料还尚未有相关研究。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种抗疲劳沙蚕运动饮料及其制备方法。
本发明的第一目的是提供一种沙蚕酶解产物的制备方法。
本发明的第二目的是提供上述制备方法制备得到的沙蚕酶解产物。
本发明的第三目的是提供上述沙蚕酶解产物在制备功能性食品中的应用。
本发明的第四目的是提供一种沙蚕运动饮料。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
本发明以沙蚕酶解产物为原料，参考市场运动饮料配方以及国标要求，确定了沙蚕运动饮料的配方，沙蚕运动饮料的最适灭菌条件为高压蒸汽灭菌，在含沙蚕酶解产物浓度为2.25mg/mL时对DPPH自由基的清除率达到94.1％，IC50值为0.8mg/mL，具有很强的抗氧化活性。通过动物试验模型验证沙蚕运动饮料不影响小鼠体重变化，对机体无毒副作用。运动前30min灌喂沙蚕沙蚕运动饮料与阴性对照组相比小鼠力竭游泳时间显著延长，低剂量组、中剂量组、高剂量组游泳时间分别比阴性对照组的平均游泳时间长26％、130％、150％，小鼠负重游泳试验结果为阳性。在小鼠各项生理生化指标中，沙蚕运动饮料各组肝糖元含量显著高于阴性对照组，分别高出56.6％、42.4％、71.3％，血乳酸和血清尿素氮的含量均低于阴性对照组，说明沙蚕运动饮料可以提高机体肝糖原储存量，减少运动过程中乳酸的产生和积累，抑制小鼠运动时体内尿素氮的产生。当小鼠负重游泳结果呈阳性，血乳酸、血清尿素氮、肝糖原生化指标中任两项指标呈阳性，则可判断受试样品具有缓解体力疲劳功能的作用，因此可判断沙蚕运动饮料具有良好的抗氧化活性及抗疲劳功效，符合运动饮料的要求。
因此本发明要求保护一种沙蚕酶解产物的制备方法，包括以下步骤：
S1.新鲜沙蚕匀浆后加水，沙蚕匀浆与水的体积比为1：4～1：6；
S2.加入碱性蛋白酶后调节pH至7.5～9.5；
S3.40～60℃反应6～8h，之后高温灭酶；
S4.固液分离，之后依次通过8kDa与5kDa的分子量超滤膜，保留小于等于5kDa的沙蚕酶解产物，得到沙蚕酶解产物。
优选地，步骤S1中，沙蚕匀浆与水的体积比为1：5。
优选地，步骤S2中，加入碱性蛋白酶后调节pH至8.5。
优选地，步骤S3中，50℃水温反应7h。
优选地，步骤S3中，所述反应为水浴恒温振荡器进行反应。
优选地，步骤S3中，所述高温灭酶具体为：沸水浴灭酶10～20min。
优选地，步骤S3中，所述高温灭酶具体为：沸水浴灭酶10min。
优选地，步骤S4中，所述固液分离具体为：7000～9000r/min转速离心5～15min以固液分离。
更优选地，步骤S4中，所述固液分离具体为：8000r/min转速离心10min以固液分离。
本发明还请求保护以上任一所述制备方法制备得到的沙蚕酶解产物。
本发明还请求保护上述沙蚕酶解产物在制备功能性食品中的应用。
优选地，所述功能性食品为饮料。
更优选地，所述饮料为运动饮料。
进一步更优选地，所述运动饮料为抗疲劳运动饮料。
进一步，本发明要求保护一种沙蚕饮料，以重量计含有以下成分：分子量小于5kDa的超滤沙蚕酶解产物35～50％、酵母0.06～0.1％、罗汉果多糖0.02～0.05％、白砂糖4～7％、柠檬汁0.6～1.2％、氯化钠0.05％、磷酸二氢钾0.05％、磷酸二氢钠0.1％和水补足余量。
优选地，酵母的质量是超滤沙蚕酶解产物质量的0.15～0.25％
更优选地，酵母的质量是超滤沙蚕酶解产物质量的0.2％。
优选地，以重量计含有以下成分：分子量小于5kDa的超滤沙蚕酶解产物40％、酵母0.08％、罗汉果多糖0.02％、白砂糖5％、柠檬汁1.2％、氯化钠0.05％、磷酸二氢钾0.05％、磷酸二氢钠0.1％和水补足余量。
优选地，所述分子量小于5kDa的超滤沙蚕酶解产物为上述沙蚕酶解产物。
优选地，所述沙蚕饮料的杀菌条件为高压蒸汽灭菌。
更优选地，所述高压蒸汽灭菌的条件为121℃，15min。
运动饮料的基本辅料包括糖、酸、电解质，饮料中通常是以蔗糖(白砂糖)作为甜味物质，罗汉果多糖是由罗汉果中提取的一种罗汉果糖苷，是较好的活性物质，因此确定白砂糖与罗汉果多糖为本运动饮料的甜味来源；柠檬酸酸是常用的酸性物质，但是口感与自然酸味相比较突出、不柔和，柠檬汁具有的酸味比较自然，具有一定的抗氧化活性，还可以起到去腥的作用，因此选用柠檬汁为酸味物质来源；运动饮料中的电解质通常是钾盐与钠盐，参照其他运动饮料配方与国标，选用0.05％磷酸二氢钾、0.1％磷酸二氢钠与0.05％的NaCl作为电解质的主要来源，另外酵母可以脱去水产品中的腥味，加入沙蚕酶解产物0.2％的酵母于37℃发酵30min去除其中腥味。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明利用双齿围沙蚕作为原料制备得到一种抗疲劳运动饮料，其能显著提高机体内肝糖原储存量，减少运动过程中乳酸的产生和积累，抑制运动时体内尿素氮的产生，具有良好的抗氧化活性及抗疲劳功效，符合运动饮料的要求。同时进一步提高了沙蚕的经济价值，有很大的应用价值，值得广泛推广。
附图说明
图1为不同灭菌条件对沙蚕运动饮料DPPH自由基清除率的影响。
图2为不同灭菌条件下沙蚕运动饮料IC50值的比较。
图3为沙蚕运动饮料对小鼠力竭游泳时间的影响。
图4为沙蚕运动饮料对小鼠血乳酸含量的影响。
图5为沙蚕运动饮料对小鼠肝糖元含量的影响。
图6为沙蚕运动饮料对小鼠血液尿素氮含量的影响。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
试验原料
新鲜双齿围沙蚕：由遂溪腾飞生物科技有限公司提供
罗汉果多糖：河南天宸生物科技有限公司；
昆明小鼠：SPF级初始体重22～25g每只，购于南方医科大学；
安琪酵母：安琪酵母发展有限公司；
白砂糖：购于广东海洋大学商业中心小卖部；
柠檬：购于沃尔玛超市。
实施例1沙蚕酶解产物的制备
(1)称取适量的新鲜沙蚕，匀浆后以料水比为1：5的比例加水；
(2)加入碱性蛋白酶后调节pH至8.5；
(3)于数显水浴恒温振荡器中50℃水温反应7h，沸水浴灭酶10min；
(4)使用高速离心机以8000r/min转速离心10min；
(5)离心后的沙蚕上清液依次过8kDa与5kDa的分子量超滤膜，保留小于等于5kDa的沙蚕酶解产物。
实施例2沙蚕酶解产物的制备
(1)称取适量的新鲜沙蚕，匀浆后以料水比为1：4的比例加水；
(2)加入碱性蛋白酶后调节pH至7.5；
(3)于数显水浴恒温振荡器中40℃水温反应6h，沸水浴灭酶5min；
(4)使用高速离心机以7000r/min转速离心5min；
(5)离心后的沙蚕上清液依次过8kDa与5kDa的分子量超滤膜，保留小于等于5kDa的沙蚕酶解产物。
实施例3沙蚕酶解产物的制备
(1)称取适量的新鲜沙蚕，匀浆后以料水比为1：6的比例加水；
(2)加入碱性蛋白酶后调节pH至9.5；
(3)于数显水浴恒温振荡器中60℃水温反应8h，沸水浴灭酶15min；
(4)使用高速离心机以9000r/min转速离心15min；
(5)离心后的沙蚕上清液依次过8kDa与5kDa的分子量超滤膜，保留小于等于5kDa的沙蚕酶解产物。
实施例4辅料对清除DPPH自由基作用的影响
一、实验方法
配制实验组饮料，以重量计含有以下成分：分子量小于5kDa的超滤沙蚕酶解产物50％、酵母0.08％、罗汉果多糖0.02％、白砂糖5％、柠檬汁1.2％、氯化钠0.05％、磷酸二氢钾0.05％、磷酸二氢钠0.1％和水补足余量。
对照组1的饮料同实验组的区别在于以重量计含有以下成分：分子量小于5kDa的超滤沙蚕酶解产物50％和水补足余量。
对照组2的饮料同实验组的区别在于以重量计含有以下成分：分子量小于5kDa的超滤沙蚕酶解产物50％、罗汉果多糖0.02％和水补足余量。
按0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL分别将实验组、对照组1和对照组2的饮料添加到试管后分别加入3mL DPPH溶液，超纯水定容至4mL后摇匀静置20min；转速8000r/min离心10min后517nm波长处测吸光度值。
二、实验结果
实验组的IC50值为1.24mg/mL，对照组1的IC50值为1.42mg/mL，对照组2的IC50值为1.29mg/mL。
结果表明添加辅料并不会抑制沙蚕原料清除DPPH自由基的活性，反而增强了清除自由基的能力，同时也证明了罗汉果多糖是辅料中的活性物质之一。
实施例5沙蚕酶解产物添加量对清除DPPH自由基作用的影响
一、实验方法
配制实验组1饮料，以重量计含有以下成分：分子量小于5kDa的超滤沙蚕酶解产物35％、酵母0.08％、罗汉果多糖0.02％、白砂糖5％、柠檬汁1.2％、氯化钠0.05％、磷酸二氢钾0.05％、磷酸二氢钠0.1％和水补足余量。
配制实验组2饮料，以重量计含有以下成分：分子量小于5kDa的超滤沙蚕酶解产物40％、酵母0.08％、罗汉果多糖0.02％、白砂糖5％、柠檬汁1.2％、氯化钠0.05％、磷酸二氢钾0.05％、磷酸二氢钠0.1％和水补足余量。
配制实验组3饮料，以重量计含有以下成分：分子量小于5kDa的超滤沙蚕酶解产物45％、酵母0.08％、罗汉果多糖0.02％、白砂糖5％、柠檬汁1.2％、氯化钠0.05％、磷酸二氢钾0.05％、磷酸二氢钠0.1％和水补足余量。
按0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL分别将实验组1、实验组2和实验组3的饮料添加到试管后分别加入3mL DPPH溶液，超纯水定容至4mL后摇匀静置20min；转速8000r/min离心10min后517nm波长处测吸光度值。
二、实验结果
当运动饮料中超滤后小分子量(＜5kDa)沙蚕酶解产物(实施例1制备得到)的添加量分别为35％、40％和45％，实验组1清除DPPH自由基IC50值为0.91mg/mL，实验组2清除DPPH自由基IC50值为0.84mg/mL，实验组3清除DPPH自由基IC50值为0.79mg/mL，呈现出随浓度的增加而变小的趋势。
结果说明沙蚕酶解产物能有效的清除DPPH自由基。
实施例6杀菌条件对清除DPPH自由基作用的影响
一、实验方法
饮料的配制具体为，以重量计含有以下成分：分子量小于5kDa的超滤沙蚕酶解产物40％、酵母0.08％、罗汉果多糖0.02％、白砂糖5％、柠檬汁1.2％、氯化钠0.05％、磷酸二氢钾0.05％、磷酸二氢钠0.1％和水补足余量。
将配制好的饮料灌装排气后分别采用三种杀菌方法进行饮料杀菌((1)巴氏杀菌：温度为80℃—85℃，杀菌时间30min；(2)煮沸杀菌：温度为95℃—100℃，杀菌时间为20min；(3)高压蒸汽灭菌：压力121kPa，温度为121℃，杀菌时间为15min)，对杀菌后的饮料检测其对DPPH自由基的清除能力，具体方法为：
按0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL将不同杀菌方法杀菌的饮料添加到试管后分别加入3mL DPPH溶液，超纯水定容至4mL后摇匀静置20min；转速8000r/min离心10min后517nm波长处测吸光度值。
二、实验结果
当选用不同条件杀菌时DPPH自由基清除率如图1所示，IC50值如图2所示。结果表明，相同浓度条件下杀菌后沙蚕饮料的DPPH自由基清除率明显提高，IC50值较低，且高压蒸汽灭菌(121℃，15min)条件下效果最好。由此可确定沙蚕运动饮料的灭菌条件为高压蒸汽灭菌(121℃，15min)，当沙蚕饮料添加量为1mL(沙蚕酶解产物浓度为2.25mg/mL)时的DPPH自由基清除率为94.1％，IC50值为0.8mg/mL。
实施例7饮料调试正交试验
一、实验方法
依照表1所示正交试验因素水平表进行沙蚕运动饮料各成分正交试验，得到各成分正交实验的感官评分。
表1正交试验因素水平表
通过选取来自不同人群的15个试验者对饮料进行调试得到对应的感官评分，感官评分标准如表2所示。
表2感官评分标准
二、实验结果
结果如表3所示。从表3可直观看出最佳组合水平为6号，即A2 B2 C1 D4。通过计算各因素水平K值及平均值分析得出理论最佳组合水平与实际相符合，从Rj值可看出影响该产品感官的因素主要为白砂糖，其次是沙蚕酶解产物，最后是酸。
表3正交试验结果
实施例8沙蚕运动饮料的稳定性研究
一、实验方法
饮料的配制具体为，以重量计含有以下成分：分子量小于5kDa的超滤沙蚕酶解产物40％、酵母0.08％、罗汉果多糖0.02％、白砂糖5％、柠檬汁1.2％、氯化钠0.05％、磷酸二氢钾0.05％、磷酸二氢钠0.1％和水补足余量。
平行配制十份饮料，将其中三份饮料分别加入添加量为0.05％、0.10％和0.15％的黄原胶稳定剂；再取另外三份饮料分别加入添加量为0.05％、0.10％和0.15％的果胶稳定剂；再取另外三份饮料分别加入添加量为0.05％、0.10％和0.15％的CMC-Na稳定剂；剩余1份不作处理。
将十份饮料常温放置，三个月后观察饮料稳定性，具体为观察饮料是否有沉淀，是否清澈。
二、实验结果
将添加稳定剂的沙蚕运动饮料常温放置，三个月后发现饮料稳定性的结果如表4所示。结果显示沙蚕运动饮料在无稳定剂作用情况下仍能保持良好稳定性，虽然CMC-Na组个别情况较好，但CMC-Na在水溶液中较难溶解，因此沙蚕运动饮料无需添加稳定剂。
表4稳定剂对沙蚕运动饮料稳定性的影响
实施例9一种具有抗疲劳功效的沙蚕运动饮料
确定沙蚕运动饮料配方，以重量计含有以下成分：超滤沙蚕酶解产物(以实施例1制备的沙蚕酶解产物为例)40％、酵母0.08％(超滤沙蚕酶解产物的0.2％)、罗汉果多糖0.02％、白砂糖5％、柠檬汁1.2％、氯化钠0.05％、磷酸二氢钾0.05％、磷酸二氢钠0.1％和水53.5％。
其制备方法为：将40mL的超滤沙蚕酶解产物(分子量小于5kDa)加入100mL的饮料瓶中，然后分别添加0.08g的酵母、0.02g的罗汉果多糖、5g的白砂糖、1.2mL的柠檬汁、0.05gNaCl，0.05g磷酸二氢钾和0.1g的磷酸二氢钠，然后加入53.5mL的超纯水，将配制好的饮料灌装排气后采用高压蒸汽灭菌(121℃，15min)进行饮料杀菌，罐装，得到沙蚕运动饮料。
实施例10具有抗疲劳功效的沙蚕运动饮料的感官评价
一、实验方法
选取实施例9制备得到的沙蚕运动饮料，将其在室温放置6个月后观察饮料的色泽，察看饮料是否澄清、有列沉淀及异物，打开饮料闻其气味，确定饮料是否有异味，并品尝饮料，确认饮料的滋味。
二、实验结果
运动饮料的要求及指标如表5所示，其色泽与超滤后的沙蚕酶解产物一致，呈黄色；滋味适口，无异味；澄清透明，状态均匀无异物，符合饮料感官要求。
表5沙蚕运动饮料感官指标：
实施例13具有抗疲劳功效的沙蚕运动的理化性质的测定
一、实验方法
可溶性固形物含量的测定：根据GB/T 12143规定的可溶性固形物含量的测定方法进行测定：将实施例9得到的沙蚕运动饮料充分混匀，在20℃下用折光计测量方法饮料的折光率，折光计目镜读数标尺上显示的百分数即为饮料可溶性固形物的百分含量。
钾、钠含量的测定：通过火焰原子吸收分光光度法进行测定。实验方法如下：取实施例9得到的沙蚕运动饮料10mL于50mL的容量瓶中，加入3mL的硝酸铯溶液，再用水稀释至标线，摇匀后上样至火焰原子吸收分光光度计进行检测，其中钠的空心阴极灯的灵敏吸收线为589nm，钾的空心阴极灯的灵敏吸收线为766.5nm。
二、实验结果
结果如表6所述，配制好的沙蚕运动饮料经折光计法测得其可溶性固形物含量为6.0％，通过火焰原子吸收分光光度法测定以后确定钠含量与钾含量分别为749mg/L和196mg/L，符合运动饮料理化指标。
表6沙蚕运动饮料理化指标：
实施例14具有抗疲劳功效的沙蚕运动的微生物指标测定
一、实验方法
分别测定菌落总数、大肠菌群总数和霉菌、酵母总数，均采用平板计数法测定，具体方法如下：
菌落总数测定：用1mL无菌吸管吸取实施例9得到的沙蚕运动饮料及已稀释10倍的运动饮料1mL，于无菌平皿内，同时，吸取1mL生理盐水加入另一个无菌平皿内作空白对照。
将15mL～20mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。待琼脂凝固后，将平板翻转，于36±1℃的生化培养箱中培养48±2h。
培养结束后肉眼观察菌落数，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位(colony-formingunits，CFU)表示。选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
大肠菌群测定：用1mL无菌吸管吸取实施例9得到的沙蚕运动饮料及已稀释10倍的运动饮料1mL，于无菌平皿内，同时，吸取1mL生理盐水加入另一个无菌平皿内作空白对照。
将15mL～20mL融化并恒温至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。待琼脂凝固后，再加3mL～4mL的VRBA覆盖平板表层。
将平板翻转，于36±1℃的生化培养箱中培养18～24h。培养结束后选取菌落数在15CFU～150CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落(如菌落直径较典型菌落小)。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大，最低稀释度平板低于15CFU的记录具体菌落数。
典型和可疑菌落需用煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)管产气实验证实，具体为：从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，少于10个菌落的挑取全部典型和可疑菌落。分别移种于BGLB肉汤管内，36±1℃培养24～48h，观察产气情况。当BGLB肉汤管产气时，报告为大肠菌群阳性。
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以平板计数的菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g(mL)样品中大肠菌群数。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
霉菌、酵母计数：用1mL无菌吸管吸取实施例9得到的沙蚕运动饮料及已稀释10倍的运动饮料1mL，于无菌平皿内，同时，吸取1mL生理盐水加入另一个无菌平皿内作空白对照。
将15mL～20mL冷却至46℃的马铃薯葡萄糖琼脂倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。待琼脂凝固后，正置平板置28±1℃的培养箱中培养，观察并记录培养至第5天的结果。肉眼观察菌落数，必要时用放大镜或低倍镜，记录稀释倍数和相应的霉菌和酵母菌落数量，以菌落形成单位(colony-formingunits，CFU)表示。选取菌落数在10CFU～150CFU之间的平板，根据菌落形态分别计算霉菌和酵母，霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为菌落蔓延。低于10CFU的记录具体菌落数，若所有平板上的菌落数均大于150CFU，可记录为多不可计。
二、实验结果
GB 7101-2015中明确规定饮料微生物检测限量如表7所示，其中N表示同一批次产品采取的样品件数，c表示最大允许超出m值的样品，m表示微生物指标可接受水平的限量值，M表示微生物指标的最高安全限量值。
通过微生物试验检测出抽取的5个样品中各微生物含量表8所示。
结果表明本发明研制的沙蚕饮料中微生物含量符合国家标准。
表7沙蚕运动饮料微生物检出限量：
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表8沙蚕运动饮料中微生物含量：
实施例15具有抗疲劳功效的沙蚕运动的抗疲劳作用
一、饮料摄入量对小鼠体重变化的影响
1、实验方法
小鼠购买后静养10天，随机分组，分组后称其体重作为0天的体重，每天灌喂样品一次，阴性对照组以蒸馏水灌喂，每次灌喂剂量为0.3mL/10g体重；阳性对照组以红牛饮料灌喂，每次灌喂剂量为0.3mL/10g；低剂量组、中剂量组、高剂量组均以实施例9得到的沙蚕运动饮料进行灌喂，灌喂剂量分别为0.2mL/10g体重、0.3mL/10g体重、0.4mL/10g体重，连续灌喂30天，分别于第10天、第20天及第30天测每组小鼠的体重。
2、实验结果
沙蚕饮料对小鼠体重的影响如表9所示。结果显示，小鼠在灌喂周期内体重均呈平稳增长趋势，各组间小鼠体重增加状况不存在显著性差异。
结果表明沙蚕运动饮料与小鼠体重变化无直接联系，说明沙蚕饮料中不存在影响小鼠生长状况的特殊成分，对机体无毒副作用。
表9小鼠体重变化：
二、沙蚕运动饮料对小鼠力竭游泳时间的影响
1、实验方法
小鼠购买后静养10天，随机分组，阴性对照组以蒸馏水灌喂，每次灌喂剂量为0.3mL/10g体重；阳性对照组以红牛饮料灌喂，每次灌喂剂量为0.3mL/10g；低剂量组、中剂量组、高剂量组均以实施例9得到的沙蚕运动饮料进行灌喂，灌喂剂量分别为0.2mL/10g体重、0.3mL/10g体重、0.4mL/10g体重。
称量每组小鼠的体重。
每组小鼠的小鼠尾尖绑上小鼠体重5％的铅坠，在灌喂运动饮料30min后放入游泳箱中并驱使小鼠不停的游动，水温保持在30℃，直至小鼠沉入水中10s不能浮出水面即可判断为小鼠力竭，记录小鼠游泳力竭的时间。
2、实验结果
沙蚕运动饮料对小鼠力竭游泳时间影响如图3所示，通过数据显示，除低剂量组以外，各组小鼠力竭游泳时间在均值上均与阴性对照存在显著性差异。其中阳性对照组与阴性对照组力竭游泳平均时间相比，阳性对照组约是阴性对照组长的1.5倍。低剂量、中剂量和高剂量组三组间游泳平均时间与阴性对照组相比除低剂量组外均存在极显著性差异，低剂量组与阴性对照组差异较小。低剂量组游泳时间比阴性对照组长26％，中剂量组、高剂量组游泳时间分别是阴性对照组的1.3倍和1.8倍。
结果表明沙蚕运动饮料具有明显延长小鼠力竭游泳时间的功效并且与灌喂剂量成正相关关系。
三、沙蚕运动饮料对小鼠生理生化指标的影响
1、实验方法
小鼠购买后静养10天，随机分组，阴性对照组以蒸馏水灌喂，每次灌喂剂量为0.3mL/10g体重；阳性对照组以红牛饮料灌喂，每次灌喂剂量为0.3mL/10g；低剂量组、中剂量组、高剂量组均以实施例9得到的沙蚕运动饮料进行灌喂，灌喂剂量分别为0.2mL/10g体重、0.3mL/10g体重、0.4mL/10g体重。
连续饲喂各组小鼠30天，并在30天后灌喂样品30min后放入游泳池中并驱赶使小鼠不停的游泳，水温保持在25℃，游泳90min后将小鼠身体擦干。
BUN含量的测定：对各组小鼠使用眼球取血法进行血液的采集，3000r/min离心15min分离血清，利用日立7180全自动生化仪测定血清中BUN的含量。
血乳酸与肝糖原含量测定样品采集：对各组小鼠使用眼球取血法采集血液，3000r/min离心15min分离血清用于血乳酸的测定，断劲椎处死老鼠后解剖采集完整肝脏用生理盐水漂洗，用滤纸吸去表面水分，称量肝脏重量并记录数据，然后用锡纸包裹肝脏放入-70℃超低温冰箱保存备用。血乳酸与肝糖原含量的测定按照试剂盒(南京建成)提供的方法执行。
2、实验结果
(1)沙蚕运动饮料对小鼠血液乳酸含量的影响
机体剧烈运动时会消耗糖元并产生大量乳酸堆积在体内，使人体pH值下降，酶的活性受到抑制，从而导致糖酵解和脂肪代谢减缓或中断，供能系统被破坏产生疲劳感。
沙蚕运动饮料对小鼠血液中乳酸含量的影响如图4所示。数据显示：阳性对照组与阴性对照组之间不存在显著性差异，阳性对照组乳酸含量比阴性对照组乳酸含量低1.8％。
低剂量组和阴性对照组之间存在显著性差异，中剂量组和高剂量组与阴性对照组之间不存在显著性差异，但中、高剂量组的乳酸含量也均比阴性对照组低。其乳酸含量分别比阴性对照组低12.2％、1.4％、5.9％。
结果说明沙蚕运动饮料可以抑制小鼠运动时乳酸的产生或清除乳酸，减少乳酸在体内的积累量，起到一定的抗疲劳作用。
(2)沙蚕运动饮料对小鼠肝糖元含量的影响
肝糖元是提供机体运动能量的物质之一，肝糖原的储存量是会直接影响运动的持续时间，若肝糖原的储存量较少会导致供能不足，容易使机体产生疲劳感。
沙蚕运动饮料对小鼠肝糖元含量的影响如图5所示。数据显示：阳性对照组与阴性对照组之间存在极显著性差异，阳性对照组肝糖元含量比阴性对照组高56.2％。低剂量组、中剂量组和高剂量组与阴性对照组之间也存在极显著性差异，低剂量组、中剂量组、高剂量组的肝糖元含量分别比阴性对照组高56.6％、42.4％、71.3％。
结果说明沙蚕运动饮料可以通过提高机体内肝糖元的储存量的途径使机体达到抗疲劳功效。
(3)沙蚕运动饮料对小鼠血液尿素氮含量的影响
研究表明血尿素氮可以反映出机体蛋白质的代谢情况，运动时蛋白质及氨基酸的分解代谢能力增强，使血尿素氮含量增多。尿素氮含量与运动耐受力呈负相关关系，可通过机体中尿素氮含量的高低评价机体运动耐受能力。
沙蚕运动饮料对小鼠尿素氮含量的影响如图6所示，数据显示：阳性对照组与阴性对照组之间存在极显著性差异，阳性对照组尿素氮含量比阴性对照组低8.5％。低剂量组、中剂量组和高剂量组与阴性对照组之间均存在极显著性差异，低剂量组、中剂量组和高剂量组中尿素氮含量分别比阴性对照组低15.0％、11.0％、12.2％。
结果说明：沙蚕运动饮料可以通过在运动过程中减缓小鼠运动时蛋白质的分解，抑制尿素氮的产生提高机体运动耐受能力，从而达到抗疲劳的目的。
Claims (1)
1.一种沙蚕抗疲劳运动饮料，其特征在于，以重量计含有以下成分：分子量小于5kDa的超滤沙蚕酶解产物40％、酵母0.06～0.1％、罗汉果多糖0.02％、白砂糖5％、柠檬汁1.2％、氯化钠0.05％、磷酸二氢钾0.05％、磷酸二氢钠0.1％和水补足余量；所述沙蚕抗疲劳运动饮料的杀菌条件为高压蒸汽灭菌，所述高压蒸汽灭菌的条件为121℃，15min；
所述沙蚕酶解产物的制备方法包括以下步骤：
S1.新鲜沙蚕匀浆后加水，沙蚕匀浆与水的体积比为1:5；
S2.加入碱性蛋白酶后调节pH至8.5；
S3.50℃反应7h，之后高温灭酶，沸水浴灭酶10min；
S4.固液分离，之后依次通过8kDa与5kDa的分子量超滤膜，保留小于等于5kDa的沙蚕酶解产物，得到沙蚕酶解产物。
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