CN111235207A - 一种提高鼠尾藻合成岩藻甾醇效率的工艺 - Google Patents
一种提高鼠尾藻合成岩藻甾醇效率的工艺 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于藻类生物培养技术领域，公开了一种提高鼠尾藻合成岩藻甾醇效率的工艺，其包括如下步骤：将鼠尾藻接种到鼠尾藻培养液中进行培养，收集藻体；所述鼠尾藻培养液是在f/2培养基的基础上，额外添加九水偏硅酸钠和磷酸三铵制得。本发明在鼠尾藻幼苗的培育过程中，对培育环境的营养物质和光照条件进行有目的性的调控，设置适宜的营养盐浓度及配比，可以实现较高的岩藻甾醇合成速率。
Description
技术领域
本发明属于藻类生物培养技术领域，具体涉及一种提高鼠尾藻合成岩藻甾醇效率的工艺。
背景技术
甾类化合物在医药领域的市场需求仅次于抗生素，全球总产值已达百亿美元规模，有几百种甾类药物在流通，而且未来的需求还会递增。甾类化合物是重要的生命元素，具有重要的生理医药功能。甾类药物最初是从动物肾上腺提取的，但是实际应用意义并不大。后来也有研究者尝试以有机小分子为原料出发通过化学方法全合成工艺的探索，虽然理论上可行，但是由于合成路线太长、收率低、反应性差且副产物处理困难，加之环境污染问题，严重缺乏工业生产应用价值。
岩藻甾醇（Fucosterol）广泛存在于褐藻、海带类生物中，白色粉末，溶于非极性有机溶剂，难溶于乙醇，丙酮，不溶于水。岩藻甾醇具有十分重要的生理功能，如保持生物内环境稳定、控制糖原和矿物质的代谢、调节应激反应、防治癌症、明显降低血中胆固醇等。因此，岩藻甾醇的作用已引起各国科学家的注意。同时，岩藻甾醇可作为生产重要的医药甾药化合物中间体，如雌激素、雄激素、氢化可的松等，可调节人的生长、生殖、发育，并具有消炎、止痛等功效。
甾醇类物质的合成方法主要包括生物法和化学法。化学法以有机小分子为原料出发通过化学方法全合成工艺的探索，虽然理论上可行，但是由于合成路线太长、收率低、反应性差且副产物处理困难，加之环境污染问题，严重缺乏工业生产应用价值。生物法主要是从微生物、藻类中分离提取纯化获得，具备较好的环境友好性，而且不会产生毒副作用。
岩藻甾醇生物转化合成是利用生物细胞酶系进行化学反应产生新的产物。岩藻甾醇生物转化主要基于几个方面特性：生物体表现为快速生产、易于培养增殖；含有转化合成岩藻甾醇的酶系，对底物进行主动摄取。岩藻甾醇大多来源于海洋藻类，但是由于海洋藻类中岩藻甾醇含量较少，提取工艺复杂，导致岩藻甾醇价格昂贵。而现有技术对岩藻甾醇生物合成调控机制的研究较少，无法对岩藻甾醇的规模化生产带来借鉴和指导意义。
鼠尾藻属褐藻门、圆子纲、墨角藻目、马尾藻科、马尾藻属，是我国沿海常见的野生种。鼠尾藻在我国分布范围比较广，其踪迹遍布辽宁、山东、江苏、浙江、福建、广东等省。鼠尾藻是海参、鲍鱼的优质饵料，营养丰富，还能够作为医药原料或中间体的来源。近年来，随着海参、鲍鱼养殖业的发展，自然生长的鼠尾藻被大量采收利用，资源几近枯竭。鼠尾藻含有甾醇和多糖类物质，但是含量较低，如何通过优化鼠尾藻的培养条件来提高有用物质的含量是我们需要解决的技术问题。
发明内容
针对现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种提高鼠尾藻合成岩藻甾醇效率的工艺，本发明在鼠尾藻幼苗的培育过程中，对培育环境的营养物质和光照条件进行有目的性的调控，设置适宜的营养盐浓度及配比，可以实现较高的岩藻甾醇合成速率。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
一种提高鼠尾藻合成岩藻甾醇效率的工艺，其包括如下步骤：将鼠尾藻接种到鼠尾藻培养液中进行培养，收集藻体；
所述鼠尾藻培养液是在f/2培养基的基础上，额外添加九水偏硅酸钠和磷酸三铵制得。
优选地，所述鼠尾藻培养液为：f/2培养基+九水偏硅酸钠20-300mg/L+磷酸三铵10-200mg/L。
优选地，所述培养的条件为：光照强度3000lux，温度为22-23℃，光暗比为12-14:10-12，通气量为10-20ml/min·L。
优选地，所述工艺进一步包括制备藻粉的步骤。
具体地，所述工艺包括如下步骤：
选择健康的鼠尾藻幼苗，接种到含有鼠尾藻培养液的小型反应池中，接种密度为60-80株/㎡，反应池中培养液的深度为30-50cm，每4d更换1次鼠尾藻培养液，培养时间为24d；培养条件为：光照强度3000lux，温度为22℃，光暗比为12:12，通气量为10-20ml/min·L；采收鼠尾藻藻体，通风处自然干燥 5d，然后置于粉碎机粉碎，过50目筛，得到鼠尾藻藻粉。
优选地，所述鼠尾藻培养液为：f/2培养基+九水偏硅酸钠50-200mg/L+磷酸三铵20-120mg/L。
更优选地，所述鼠尾藻培养液为：f/2培养基+九水偏硅酸钠200mg/L+磷酸三铵120mg/L。
另一方面，本发明还提供了岩藻甾醇生产和粗提工艺，其特征在于，所述工艺包括如下步骤：
1）选择健康的鼠尾藻幼苗，接种到含有鼠尾藻培养液的小型反应池中，接种密度为80株/㎡，反应池中培养液的深度为30cm，每4d更换1次培养液，培养时间为24d；培养条件为：光照强度3000lux，温度为22℃，光暗比为12:12，通气量为15ml/min·L；采收鼠尾藻藻体，通风处自然干燥 5d，然后置于粉碎机粉碎，过50目筛，得到鼠尾藻藻粉；
2）将鼠尾藻藻粉添加到醇提罐中，藻粉和85%乙醇的比例为1g：5ml，升温至50℃，保温条件下，超声波辅助醇提30min，停止超声波处理，继续保温9h；然后真空抽滤，收集滤渣和滤液，将滤液置于65℃条件下减压浓缩回收乙醇，直到浓缩至原体积的五分之一，硅胶柱层析，采用体积比为5:1的乙酸乙酯-石油醚混合液进行洗脱，收集岩藻甾醇洗脱液，将岩藻甾醇洗脱液进行减压浓缩蒸干，即得岩藻甾醇粗品。
优选地，所述鼠尾藻培养液为：f/2培养基+九水偏硅酸钠200mg/L+磷酸三铵120mg/L。
优选地，所述超声波的功率为300W，频率为25kHZ。
与现有技术相比，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：
本发明将先进的藻类生物制造理念引进岩藻甾醇药物生产工业，从而提高资源利用率，降低能耗，实现绿色制造可持续发展。
营养控制是最为简便最为有效的调控代谢途径的方式；在鼠尾藻培育合成岩藻甾醇的过程中，对培育环境的营养物质进行有目的性的调控，设置适宜的营养盐浓度及配比，可以实现较高的岩藻甾醇生产速率。
藻类通过二氧化碳固定以及光合作用来合成脂肪酸、生育酚、甾醇等化合物的合成。鼠尾藻合成岩藻甾醇过程中，二价镁离子是酶促激动剂，适量添加镁离子能够激活酶活力，从而促进甾醇类物质的合成，而本发明选用f/2培养基，海水作为溶剂含有大量的镁离子。
高强度的光照能够促进藻类细胞快速合成脂肪酸，申请人尝试通过降低光强度的方式来减少脂肪酸合成途径的代谢流，以验证是否能够提高甾醇类物质的合成。为了平衡岩藻甾醇合成和藻类生长的关系，选择3000lux的光照强度最为合适。
硅是藻类细胞壁的主要组分，在藻类合成脂肪酸的过程中，有研究发现，硅缺乏会激活乙酸辅酶A羧化酶的活力，从而促使脂肪酸的合成，还可以促进非脂类物质转化为脂类物质；而甾醇代谢和脂肪酸合成之间存在着协同作用机制，通过抑制甾醇类物质的合成可显著提高胞内的脂肪酸含量，反之亦然。本研究尝试通过添加过量的硅来调整甾醇类物质和脂肪酸的合成平衡，通过调控脂肪酸的合成来优化岩藻甾醇合成路径，使得更多的碳源流向甾醇类物质的合成，而对藻体的生产量并没有明显影响。
低氮胁迫会影响鼠尾藻生长增殖，但是对脂肪酸的合成并没有不利影响，而氮源选择中，较为适合藻类脂肪酸积累的硝酸盐和尿素，在满足藻类生长需求的前提下，可考虑添加硝酸盐和尿素之外的氮源来弱化脂肪酸合成途径。磷缺乏会导致光合作用受阻从而使得代谢更多地流向脂肪酸合成，磷浓度的提高有利于鼠尾藻的增殖，但是不利于脂类物质的合成，通过适当提高磷浓度，对鼠尾藻增殖有一定的促进作用，还能够通过调控脂类物质合成来促进甾醇类化合物的合成。
附图说明
图1：光照强度对岩藻甾醇提取率的影响；
图2：光照强度对鼠尾藻藻粉产量的影响；
图3：不同氮源营养因子对岩藻甾醇合成效率的影响；
图4：九水偏硅酸钠添加量对岩藻甾醇合成效率的影响。
具体实施方式
本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
一种提高鼠尾藻合成岩藻甾醇效率的工艺，其包括如下步骤：
试验用鼠尾藻来自浙江宁波沿海, 采集成熟的雌雄藻体，人工培育至幼苗长度为1cm左右。选择健康的鼠尾藻幼苗，接种到含有鼠尾藻培养液的小型反应池中，接种密度为80株/㎡，反应池中培养液的深度为30cm，每4d更换1次培养液，培养时间为24d；培养条件为：光照强度3000lux，温度为22℃，光暗比为12:12，通气量为15ml/min·L；采收鼠尾藻藻体，通风处自然干燥 5d，然后置于粉碎机粉碎，过50目筛，得到鼠尾藻藻粉。
所述鼠尾藻培养液是在f/2培养基的配方上进行改进获得，具体为：f/2培养基+九水偏硅酸钠200mg/L+磷酸三铵120mg/L。
实施例2
一种提高鼠尾藻合成岩藻甾醇效率的工艺，其包括如下步骤：
试验用鼠尾藻来自浙江宁波沿海, 采集成熟的雌雄藻体，人工培育至幼苗长度为2cm左右。选择健康的鼠尾藻幼苗，接种到含有鼠尾藻培养液的小型反应池中，接种密度为70株/㎡，反应池中培养液的深度为40cm，每4d更换1次培养液，培养时间为24d；培养条件为：光照强度3000lux，温度为23℃，光暗比为14:10，通气量为20ml/min·L；采收鼠尾藻藻体，通风处自然干燥 5d，然后置于粉碎机粉碎，过50目筛，得到鼠尾藻藻粉。
所述鼠尾藻培养液是在f/2培养基的配方上进行改进获得，具体为：f/2培养基+九水偏硅酸钠150mg/L+磷酸三铵80mg/L。
对比例1
一种提高鼠尾藻合成岩藻甾醇效率的工艺，其包括如下步骤：
试验用鼠尾藻来自浙江宁波沿海, 采集成熟的雌雄藻体，人工培育至幼苗长度为1cm左右。选择健康的鼠尾藻幼苗，接种到含有f/2培养基的小型反应池中，接种密度为80株/㎡，反应池中培养液的深度为30cm，每4d更换1次培养液，培养时间为24d；培养条件为：光照强度范围控制在2000-10000lux，温度为22℃，光暗比为12:12，通气量为15ml/min·L；采收鼠尾藻藻体，通风处自然干燥 5d，然后置于粉碎机粉碎，过50目筛，得到鼠尾藻藻粉。
实施例3
各培养因素对鼠尾藻合成岩藻甾醇的影响。
在对比例1的基础上，验证不同光照强度对鼠尾藻合成岩藻甾醇的影响。
设置光照强度分别为：2000，3000,4000,5000,6000,7000,8000,9000,10000，单位为lux。
岩藻甾醇粗提和检测方法：
将鼠尾藻藻粉添加到醇提罐中，藻粉和85%乙醇的比例为1g：5ml，升温至50℃，保温条件下，超声波（功率为300W，频率为25kHZ）辅助醇提30min，停止超声波处理，继续保温醇提9h；然后真空抽滤，收集滤渣和滤液，将滤液置于65℃条件下减压浓缩回收乙醇，直到浓缩至原体积的五分之一，上样硅胶柱，采用体积比为5:1的乙酸乙酯-石油醚混合液进行洗脱，收集洗脱液，硫酸显色法检测甾醇组分，收集发生显色的组分，其中第一甾醇峰即岩藻甾醇部分，将岩藻甾醇洗脱液进行减压浓缩蒸干，即得岩藻甾醇粗品。
岩藻甾醇含量测定检测方法采用硫酸显色法，其中，岩藻甾醇提取率=（岩藻甾醇粗品质量／藻粉质量）×100%；岩藻甾醇纯度=（岩藻甾醇质量／岩藻甾醇粗品质量）×100%。经检测，上述提取方法获得岩藻甾醇粗品的纯度为69.7%。
1、如图1所示，随着光强度的增加，岩藻甾醇提取率有所降低，可能原因是降低光强度的方式能够减少脂肪酸合成途径的代谢流，从而提高甾醇类物质的合成；如图2所示，低强度的光照不利于藻体的生长增殖，随着光强度的增大，藻体生长速度加快，达到4000lux后，藻体增长不再明显增加。针对图1-2，综合岩藻甾醇提取率和藻体产量的情况，选择3000lux为最适的光照强度，此时，岩藻甾醇提取率为0.53%，藻粉产量为1.49kg/㎡，通过计算可知，岩藻甾醇提取量较4000lux光强能够提高24.1%，较5000lux光强能够提高28.5%。
2、选择3000lux光照强度时岩藻甾醇生产效率最高。在此条件下，申请人继续尝试不同营养因子对岩藻甾醇合成效率的影响，岩藻甾醇合成效率的衡量方式为：藻粉重量×岩藻甾醇提取率×纯度，单位为g/㎡。选择硝酸钠、尿素、氯化铵以及磷酸三铵，浓度分别为10,20,40,80,120,160,200,240，单位为mg/L；如图3所示，硝酸钠和尿素对岩藻甾醇合成效率几乎没有影响，氯化铵增大到120mg/L后，对岩藻甾醇合成效率有约为5%左右的小幅提升作用，继续增大氯化铵浓度，对岩藻甾醇合成效率并没有影响；磷酸三铵浓度的增加与岩藻甾醇合成效率呈正相关，增大到80mg/L时，增幅较快，继续增大浓度，也有一定提升，但是影响明显变弱，添加浓度为120mg/L时达到峰值，较不添加组，增幅可达到20%。
分析：低氮胁迫会影响鼠尾藻生长增殖，但是对脂肪酸的合成并没有不利影响，而氮源选择中，较为适合藻类脂肪酸积累的硝酸盐，其次是尿素，在满足藻类生长需求的前提下，添加硝酸盐和尿素之外的氮源来可以弱化脂肪酸合成途径，以增强甾醇合成途径；磷缺乏会导致光合作用受阻从而使得代谢更多地流向脂肪酸合成，磷浓度的提高有利于藻类增殖，但是不利于脂类物质的合成，通过适当提高磷浓度，对藻类增殖有一定的促进作用，还能够通过调控脂类物质合成来促进甾醇的合成。可能原因是，磷酸三铵既提供了足够浓度的铵，又增加了磷的供应，从而提高了岩藻甾醇合成效率。
3、选择磷酸三铵的添加量为120mg/L，验证九水偏硅酸钠添加量对岩藻甾醇合成效率的影响，设置九水偏硅酸钠的浓度为0,10,25,50,100,150,200,250,300，单位为mg/L。如图4所示，低添加量的九水偏硅酸钠对岩藻甾醇合成效率影响不大，可能是由于f/2培养基本身含有本底水平的20mg/L的九水偏硅酸钠，已经基本满足了藻体正常生长的需求，当九水偏硅酸钠的添加量增大到50mg/L时，岩藻甾醇合成效率有明显的提高，较不添加九水偏硅酸钠时增加了33%，继续增大九水偏硅酸钠的添加量，岩藻甾醇合成效率也随之提升，在添加浓度为150mg/L时，岩藻甾醇合成效率较不添加九水偏硅酸钠时增加了97%，200mg/L添加量可达到102%的增幅比例。
需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种提高鼠尾藻合成岩藻甾醇效率的工艺，其包括如下步骤：将鼠尾藻接种到鼠尾藻培养液中进行培养，收集藻体；
所述鼠尾藻培养液是在f/2培养基的基础上，额外添加一定量的九水偏硅酸钠和磷酸三铵制得。
2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述鼠尾藻培养液为：f/2培养基+九水偏硅酸钠20-300mg/L+磷酸三铵10-200mg/L。
3.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述培养的条件为：光照强度3000lux，温度为22-23℃，光暗比为12-14:10-12，通气量为10-20ml/min·L。
4.根据权利要求1-3任其一所述的工艺，其特征在于，所述工艺进一步包括制备藻粉的步骤。
5.根据权利要求1-3任其一所述的工艺，其特征在于，所述工艺包括如下步骤：
选择健康的鼠尾藻幼苗，接种到含有鼠尾藻培养液的反应池中，接种密度为60-80株/㎡，反应池中培养液的深度为30-50cm，每4d更换1次鼠尾藻培养液，培养时间为24-40d；培养条件为：光照强度3000lux，温度为22℃，光暗比为12:12，通气量为10-20ml/min·L；采收鼠尾藻藻体，通风处自然干燥 5d，然后置于粉碎机粉碎，过50目筛，得到鼠尾藻藻粉。
6.根据权利要求2所述的工艺，其特征在于，所述鼠尾藻培养液为：f/2培养基+九水偏硅酸钠50-200mg/L+磷酸三铵20-120mg/L。
7.根据权利要求6所述的工艺，其特征在于，所述鼠尾藻培养液为：f/2培养基+九水偏硅酸钠200mg/L+磷酸三铵120mg/L。
8.一种提高鼠尾藻合成岩藻甾醇效率的工艺，其特征在于，所述工艺包括如下步骤：
1）选择健康的鼠尾藻幼苗，接种到含有鼠尾藻培养液的小型反应池中，接种密度为80株/㎡，反应池中培养液的深度为30cm，每4d更换1次培养液，培养时间为24d；培养条件为：光照强度3000lux，温度为22℃，光暗比为12:12，通气量为15ml/min·L；采收鼠尾藻藻体，通风处自然干燥 5d，然后置于粉碎机粉碎，过50目筛，得到鼠尾藻藻粉；
2）将鼠尾藻藻粉添加到醇提罐中，藻粉和85%乙醇的比例为1g：5ml，升温至50℃，保温条件下，超声波辅助醇提30min，停止超声波处理，继续保温9h；然后真空抽滤，收集滤渣和滤液，将滤液置于65℃条件下减压浓缩回收乙醇，直到浓缩至原体积的五分之一，硅胶柱层析，采用体积比为5:1的乙酸乙酯-石油醚混合液进行洗脱，收集岩藻甾醇洗脱液，将岩藻甾醇洗脱液进行减压浓缩蒸干，即得岩藻甾醇粗品。
9.根据权利要求8所述的工艺，其特征在于，所述鼠尾藻培养液为：f/2培养基+九水偏硅酸钠200mg/L+磷酸三铵120mg/L。
10.根据权利要求8所述的工艺，其特征在于，所述超声波的功率为300W，频率为25kHZ。
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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