CN109161489A

CN109161489A - 一种高产酸性蛋白酶的黑曲霉菌株

Info

Publication number: CN109161489A
Application number: CN201810793553.5A
Authority: CN
Inventors: 徐晓东; 徐娟; 刘文瑶; 黄亦钧
Original assignee: Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Current assignee: Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date: 2018-07-18
Filing date: 2018-07-18
Publication date: 2019-01-08
Anticipated expiration: 2038-07-18
Also published as: CN109161489B

Abstract

本发明提供了一株高产酸性蛋白酶的黑曲霉菌株及其应用，申请人首先构建得到重组表达酸性蛋白酶的黑曲霉工程菌株，然后通过紫外诱变的方法筛选获得一株酸性蛋白酶产量得到显著提高的突变菌株，其保藏编号为CCTCC NO:M2018388。所述突变菌能大幅度提高酸性蛋白酶的表达量，20L罐发酵160h后，其发酵上清液中酸性蛋白酶酶活高达17428u/ml，比出发菌提高了56％，取得了意料不到的技术效果。

Description

一种高产酸性蛋白酶的黑曲霉菌株

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体内容涉及一株高产酸性蛋白酶的黑曲霉菌株及其应用。

背景技术

酸性蛋白酶是一类最适作用pH值为2.5～5.0的天冬氨酸蛋白酶，相对分子质量为30 000～40 000，等电点为3.0～5.0，可广泛应用于食品、饲料加工以及医药等领域。酸性蛋白酶在白酒酿造中起着重要的作用。在以玉米为原料生产白酒时，发酵过程中添加一定量的酸性蛋白酶，使原料中的蛋白质降解，同时破坏原料细胞壁结构，有利于糖化酶的利用；使原料中糖含量增加，有利于提高出酒率。另一方面,通过酸性蛋白酶的作用，原料中的有机氮含量也增加了，有利于酵母的生长繁殖，从而有利于酵母菌的产酒能力，缩短发酵时间，降低成本。此外，添加酸性蛋白酶还可以增加白酒的香味，酸性蛋白酶在酿酒的酸性环境下，将原料中的蛋白质水解成氨基酸，氨基酸在酶的作用下进一步转化成醇、酯、酚等物质，使白酒具有特有的白酒香气。

此外，产业规模化养殖畜禽水产，尤其是养殖中的幼年饲养动物，因其消化器官分泌的酶系和酶量(内源酶)不足，对饲料蛋白质消化能力较差，极易引起消化不良、腹泻与消瘦等疾病。经研究发现，通过在饲料中添加酸性蛋白酶有利于提高蛋白质的可消化性，使蛋白质降解成利于幼年动物消化吸收的氨基酸和多肽，从而有利于动物的生长发育，缩短育肥时间。

目前酸性蛋白酶大都来源于微生物、动物和植物中也有不少。产酸性蛋白酶的微生物主要有黑曲霉、米曲霉、斋藤曲霉、泡盛酒曲霉、宇佐美曲霉、微小毛霉、青霉、根霉等以及它们的变异株、突变株。此外，中华根霉、陆生酵母中如酿酒酵母、白色假丝酵母、扣囊覆膜酵母等也分泌酸性蛋白酶。与动物蛋白酶和植物蛋白酶相比，微生物酸性蛋白酶的一个显著特点是具有多样性和复杂性，通常一株菌株可以分泌一种或多种酸性蛋白酶。

我国对酸性蛋白酶的研究相对较晚些。1970年上海工业微生物研究所首先从黑曲霉中筛选出一株产酸性蛋白酶菌株，并和上海酒精厂协作进行中试生产，填补了我国酸性蛋白酶制剂的空白。近年来国内在酸性蛋白酶上的研究大都致力于选育产酶活力高、抗逆性好的菌种，已经商品化的酸性蛋白酶生产菌主要是黑曲霉、宇佐美曲霉和米曲霉等为数不多的菌株。目前酸性蛋白酶生产菌株的产酶量仍不是很高，导致该酶的生产成本居高不下，也在一定程度上限制了酸性蛋白酶的广泛应用。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一株高产酸性蛋白酶的黑曲霉菌株及其应用。申请人首先构建得到重组表达酸性蛋白酶的黑曲霉工程菌株，然后通过紫外诱变的方法筛选获得一株酸性蛋白酶产量得到显著提高的突变菌株，可广泛应用于酸性蛋白酶的生产。

本发明一方面提供了一种黑曲霉工程菌株，所述菌株携带有用于重组表达酸性蛋白酶基因的重组质粒。

所述酸性蛋白酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

本发明一方面提供了一种突变菌株黑曲霉SuA5(Aspergillus niger SuA5)，已于2018年6月21日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2018388。

本发明还提供了所述黑曲霉突变菌株在生产酸性蛋白酶中的应用。

本发明将来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的酸性蛋白酶基因在黑曲霉宿主细胞中进行超表达，构建得到重组菌株黑曲霉Su12-ASP，20L罐发酵160h后，其发酵上清液中酸性蛋白酶酶活达到11133u/ml；申请人以黑曲霉Su12-ASP为出发菌株，通过多轮紫外诱变，最终筛选获得一株突变菌黑曲霉SuA5，能大幅度提高酸性蛋白酶的表达量，20L罐发酵160h后，其发酵上清液中酸性蛋白酶酶活高达17428u/ml，比出发菌提高了56％，取得了意料不到的技术效果。所述黑曲霉菌株可广泛应用于酸性蛋白酶的生产，从而有利于降低酸性蛋白酶的生产成本，促进其在酒精加工和饲料等领域中的推广与应用。

附图说明

图1为质粒pSU图谱；

图2为20L罐发酵进程曲线；

图3为SDS-PAGE蛋白电泳图：其中：M为蛋白分子量Marker，泳道1、2分别为突变菌黑曲霉SuA5、出发菌黑曲霉Su12-ASP发酵上清液；箭头所指42kDa处的蛋白条带即为酸性蛋白酶。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,3nd Ed.(Sambrook,2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。

下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述。

实施例1酸性蛋白酶基因的克隆

以黑曲霉(Aspergillus niger)基因组为模板，利用引物1和引物2扩增出酸性蛋白酶基因片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

PCR引物和反应条件如下：

引物1(F)：ATGGTCGTCTTCAGCAAAACC

引物2(R)：CTAAGCTTGAGCAGCGAAGCC

反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸80s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖电泳结果显示，扩增得到的酸性蛋白酶基因大小为1339bp。

实施例2重组载体的构建

PCR扩增上述酸性蛋白酶基因，引物两端引入XbaI位点。引物序列如下：

引物3(F)：GCTCTAGAATGGTCGTCTTCAGCAAAACC

引物4(R)：GCTCTAGACTAAGCTTGAGCAGCGAAGCC

PCR反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸80s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖凝胶电泳结果显示，酸性蛋白酶基因为大小1339bp的片段。

将上述获得的酸性蛋白酶基因片段与表达载体pSU分别进行限制性内切酶XbaI单酶切，酶切条件如下：

37℃水浴酶切处理2h，电泳后分别回收两个目的片段，溶于20ul ddH₂O。用T4DNA连接酶进行连接，连接体系如下：

22℃连接1h，转化大肠杆菌DH5a感受态，涂布LB+AAP平板，37℃培养过夜后长出单菌落，菌落PCR验证连接正确的转化子提取质粒送测序，测序正确后，即得到含有酸性蛋白酶基因的重组载体pSU-ASP。

实施例3黑曲霉重组菌株的构建

1、原生质体制备：

将宿主黑曲霉(Aspergillus niger)Su12接种于PDA+U(马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2％；Uridine 1％；琼脂粉1.5％)平板，30℃培养5-7d；割取2cm×2cm大小的菌块，接种100ml液体PDA+U(马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2％；Uridine 1％)培养基中，30℃培养16h生长菌丝体用于转化；将长好的菌丝体过滤后，用20ml 1.2M硫酸镁溶液重悬；加入0.2g溶菌酶，30℃、100rpm培养2-3h；将裂解好的菌丝用2层擦镜纸过滤，3000rpm离心10min获得原生质体；将裂解好的菌丝用擦镜纸过滤，离心获得原生质体；再用适量的山梨醇溶液重悬。

2、转化：

将上述获得的黑曲霉Su12原生质体用1.2M山梨醇溶液清洗2遍，再用适量的山梨醇溶液重悬，使原生质体浓度达到10⁸个/ml；每200ul原生质体中分别加入10ul准备好的重组载体pSU-ASP，加入50ul 25％的PEG6000，冰浴20min，再加入2ml 25％的PEG6000，室温放置5min；加入4ml山梨醇溶液颠倒混匀，倒入50ml转化上层培养基后，倾倒入4个转化下层平板中，待上层培养基凝固后，于30℃培养箱中倒置培养5d。3、转化子筛选：

培养5d后，挑取长出的菌落，点种到转化下层平板进行复筛，30℃培养3d。将正常生长的转化子分别接种到新鲜的PDA平板，30℃培养5-7d。每个转化子割取

2cm×2cvm大小的菌块，分别接种50ml液体摇瓶培养基(麦芽糖12％；玉米浆1.5％；硫酸铵0.5％；硫酸镁0.3％；硫酸钾0.37％；氯化钙0.1125％；微量元素0.1％)中发酵，30℃培养5d。培养5d后，离心菌体获得上清液即为粗酶液，进行SDS-PAGE蛋白电泳检测及酸性蛋白酶酶活力检测。

检测阳性转化子发酵上清液中酸性蛋白酶活力，筛选出酶活最高的阳性转化子，命名为黑曲霉Su12-ASP(Aspergillus niger Su12-ASP)。

实施例4诱变筛选

紫外诱变导致的突变随机性很强，突变产生的效果也是随机的，难以预测。因此，为了获得有效的正突变，技术人员通常需要进行多轮紫外诱变，筛选的工作量较大，而且存在无法获得有效正突变的可能性。但因为紫外诱变所需设备简单、费用少，并且可在短时间内获得大量突变体，因此，它现在仍是一种常用的诱变选育方法。

申请人以黑曲霉Su12-ASP为出发菌株，通过紫外诱变方法对其进行遗传学改造，进一步提高其酸性蛋白酶的产量。

1、确定致死率：

接种黑曲霉Su12-ASP于PDA平板，30℃培养5-7d。待菌落表面产生大量孢子时，吸取5ml无菌水洗脱，获得孢子液，离心后用无菌水重悬，用血球计数板计数。取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的孢子悬液(浓度为1×10⁷)，加入转子并在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，分别照射30s、45s、60s、75s、90s、105s、120s，取照射后的孢子液稀释10、100、1000倍，取100ul涂布PDA平板，30℃培养2-3d后计数，以未照射的孢子液为对照，计算致死率。其中照射90s时，致死率为95％，选取该照射时间进行后续诱变实验。

2、第一轮诱变筛选：

取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的孢子悬液(浓度为1×10⁷)，加入转子并在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，照射90s后稀释1000倍，取100ul涂布PDA平板，30℃培养2-3d。

共涂布300块PDA平板，30℃培养2-3d后，每个平板长出30-50个菌落，先通过菌落形态，筛选短分枝的突变体。申请人挑取出菌落形态较小、菌丝致密、菌落周围绒毛较短的突变菌共62个分别接种到PDA平板，30℃培养5-7d。每个突变菌割取2cm×2cm大小的菌块，分别接种50ml液体摇瓶培养基中发酵，30℃培养5d。培养5d后，离心菌体获得上清液即为粗酶液，分别进行蛋白电泳检测和酸性蛋白酶酶活力检测。

结果显示，第一轮紫外诱变筛选获得的62株突变菌中，没有一株突变菌发酵上清液酶中酸性蛋白酶的酶活高于出发菌；其中，43株突变菌的酶活与出发菌基本相当，其余19株突变菌的酶活甚至比出发菌普遍降低了10-16％。

申请人按照上述方法继续进行了6轮诱变筛选，最终获得5株酸性蛋白酶产量显著高于出发菌的突变菌株，分别命名为黑曲霉SuA1，SuA2，SuA3，SuA4和SuA5，其摇瓶发酵上清液中酸性蛋白酶的酶活分别为3586u/ml，4017u/ml，3265u/ml，4430u/ml，4238u/ml，比出发菌分别提高了42.6％，59.8％，29.9％，76.2％，68.6％。

(1)酸性蛋白酶酶活单位的定义

在40℃、pH值为3.0的条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg的酪氨酸的酶量，定义为一个酶活力单位U。

(2)酶活测定方法

酪蛋白溶液(10g/L)：秤取干酪素1.000g，用少量乳酸湿润后，加入适量pH3.0的乳酸钠缓冲液约80ml，在沸水浴中边加热边搅拌，煮沸30min至完全溶解，冷却后，转入100ml容量瓶中定容。

酶液：用pH3.0的乳酸钠缓冲液稀释至适当倍数，控制吸光值在0.25-0.4范围。

L-酪氨酸标准曲线的绘制：分别配好的100ug/ml的L-酪氨酸标准溶液0、1、2、3、4、5ml，用水定容至10ml，作为标准点溶液。取上述标准点溶液各1ml，加入0.4mol/L碳酸钠溶液5ml，福林试剂使用液1ml，振荡均匀，40℃水浴中显色20min，取出用分光光度计于波长680nm，以不含酪氨酸的0管为空白，分别测定其吸光度。以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度C为横坐标，绘制标准曲线。根据作图，计算出当吸光度为1时酪氨酸的量(ug)，即为吸光常数K值，其K值应在95-100范围内。

测定：先将酪素溶液置于40℃恒温水浴中，预热5min；试管中加入稀释好的酶液1ml，40℃平衡2min，加入酪素溶液1ml，混匀后40℃反应10min，加入三氯乙酸2ml混匀，取出静置10min后过滤；取1ml滤液，加0.4mol/L碳酸钠溶液5ml，加福林试剂使用液1ml，40℃水浴中显色20min，取出用分光光度计于波长680nm，以不含酪氨酸的0管为空白，分别测定其吸光度。

酶活计算公式：

式中：

X——样品的酶活力，单位为U/ml；

A——样品空白吸光值之差；

K——吸光常数；

4——反应试剂的总体积(ml)；

n——稀释倍数；

10——反应时间，10min；

申请人进一步将出发菌黑曲霉Su12-ASP和5株突变菌(黑曲霉SuA1，SuA2，SuA3，SuA4，SuA5)，分别在20L罐中进行发酵；发酵160h结束时，分别测定发酵上清液中酸性蛋白酶酶活。结果显示，出发菌黑曲霉Su12-ASP发酵上清液中酸性蛋白酶酶活达到11133u/ml，突变菌的发酵酶活比出发菌普遍提高了35-56.5％，其中突变菌黑曲霉SuA5发酵上清液中酸性蛋白酶酶活最高，达17428u/ml，比出发菌提高了56.5％。

出发菌黑曲霉Su12-ASP和突变菌黑曲霉SuA5的发酵进程曲线如图2所示，发酵200h后，突变菌黑曲霉SuA5的发酵酶活开始显著高于出发菌；发酵160h结束时，出发菌黑曲霉Su12-ASP发酵上清液中酸性蛋白酶酶活达到11133u/ml，而突变菌黑曲霉SuA5发酵上清液中酸性蛋白酶酶活高达17428u/ml。

同时，申请人将出发菌黑曲霉Su12-ASP和突变菌黑曲霉SuA5的发酵上清液进行SDS-PAGE电泳检测。结果如图3所示，箭头所指42kDa处的蛋白条带即为酸性蛋白酶，泳道1突变菌黑曲霉SuA5发酵上清液中酸性蛋白酶的含量显著高于泳道2出发菌黑曲霉Su12-ASP发酵上清液中酸性蛋白酶的含量，取得了意料不到的技术效果。

申请人已于2018年6月21日将上述突变菌株黑曲霉SuA5(Aspergillus nigerSuA5)保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2018388。

序列表

<110> 青岛蔚蓝生物集团有限公司

<120> 一种高产酸性蛋白酶的黑曲霉菌株

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 394

<212> PRT

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 1

Met Val Val Phe Ser Lys Thr Ala Ala Leu Val Leu Gly Leu Ser Thr

1 5 10 15

Ala Val Ser Ala Ala Pro Ala Pro Thr Arg Lys Gly Phe Thr Ile Asn

20 25 30

Gln Ile Ala Arg Pro Ala Asn Lys Thr Arg Thr Ile Asn Leu Pro Gly

35 40 45

Met Tyr Ala Arg Ser Leu Ala Lys Phe Gly Gly Ala Val Pro Gln Ser

50 55 60

Val Lys Glu Ala Ala Ser Lys Gly Ser Ala Val Thr Thr Pro Gln Asn

65 70 75 80

Asn Asp Glu Glu Tyr Leu Thr Pro Val Thr Val Gly Lys Ser Thr Leu

85 90 95

His Leu Asp Phe Asp Thr Gly Ser Ala Asp Leu Trp Val Phe Ser Asp

100 105 110

Glu Leu Pro Ser Ser Glu Arg Thr Gly His Asp Val Tyr Thr Pro Ser

115 120 125

Ser Ser Ala Thr Lys Leu Ser Gly Tyr Ser Trp Asp Ile Ser Tyr Gly

130 135 140

Asp Gly Ser Ser Ala Ser Gly Asp Val Tyr Arg Asp Thr Val Thr Val

145 150 155 160

Gly Gly Val Thr Thr Asn Lys Gln Ala Val Glu Ala Ala Ser Lys Ile

165 170 175

Ser Ser Glu Phe Val Gln Asp Thr Ala Asn Asp Gly Leu Leu Gly Leu

180 185 190

Ala Phe Ser Ser Ile Asn Thr Val Gln Pro Lys Ala Gln Thr Thr Phe

195 200 205

Phe Asp Thr Val Lys Ser Gln Leu Asp Ser Pro Leu Phe Ala Val Gln

210 215 220

Leu Lys His Asp Ala Pro Gly Val Tyr Asp Phe Gly Tyr Ile Asp Asp

225 230 235 240

Ser Lys Tyr Thr Gly Ser Ile Thr Tyr Thr Asp Ala Asp Ser Ser Gln

245 250 255

Gly Tyr Trp Gly Phe Asn Pro Asp Gly Tyr Ser Ile Gly Asp Ser Ser

260 265 270

Ser Ser Ser Ser Gly Phe Ser Ala Ile Ala Asp Thr Gly Thr Thr Leu

275 280 285

Ile Leu Leu Asp Asp Glu Ile Val Ser Ala Tyr Tyr Glu Gln Val Asp

290 295 300

Gly Ala Gln Glu Ser Asn Glu Ala Gly Gly Tyr Val Phe Ser Cys Ser

305 310 315 320

Thr Thr Pro Pro Asp Phe Thr Val Ile Ile Gly Asp Tyr Lys Ala Val

325 330 335

Val Pro Gly Lys Tyr Ile Asn Tyr Ala Pro Ile Ser Thr Gly Ser Ser

340 345 350

Thr Cys Phe Gly Gly Ile Gln Ser Asn Ser Gly Leu Gly Leu Ser Ile

355 360 365

Leu Gly Asp Val Phe Leu Lys Ser Gln Tyr Val Val Phe Asn Ser Glu

370 375 380

Gly Pro Lys Leu Gly Phe Ala Ala Gln Ala

385 390

<210> 2

<211> 1185

<212> DNA

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 2

atggtcgtct tcagcaaaac cgctgccctc gttctgggtc tgtccaccgc cgtctctgcg 60

gcaccggctc ccactcgcaa gggcttcacc atcaaccaga ttgcccggcc tgccaacaag 120

acccgcacta tcaacctgcc gggtatgtat gcccgctcct tggccaagtt tggcggtgcg 180

gtgccccaga gcgtgaagga ggctgccagc aagggtagtg ccgtgaccac gccccagaac 240

aatgatgagg agtacctgac tcccgtcact gtcggaaagt ccacccttca tctggacttt 300

gacaccggat ctgcagatct ctgggtcttc tcagacgagc tcccttcctc ggaacggacc 360

ggtcacgatg tgtacacgcc tagctccagc gcgaccaagc tgagcggcta ctcttgggac 420

atttcctacg gtgacggcag ctcggccagc ggagacgtgt accgggatac tgtcaccgtc 480

ggcggtgtca ccaccaacaa gcaggccgtt gaagctgcca gcaagatcag ctccgagttc 540

gttcaggaca cggccaatga tggtcttctg ggactagcct tcagctccat caacactgtc 600

cagcccaagg cgcagaccac cttcttcgac accgtcaagt ctcagctgga ctctcctctt 660

ttcgccgtgc agctgaagca cgacgccccc ggtgtctacg actttggcta catcgatgac 720

tccaagtaca ccggttccat cacctacaca gatgccgata gctcccaggg ctactggggc 780

ttcaatcccg atggctacag catcggcgac agcagctcca gctccagtgg attcagtgcc 840

attgctgaca ccggtaccac cctcatcctc ctcgacgacg agatcgtctc cgcctactat 900

gagcaggttg atggcgccca ggagagcaat gaagccggtg gctacgtttt ctcctgctcg 960

accacccctc ctgacttcac tgtcatcatc ggcgactaca aggccgtcgt tcctggaaag 1020

tacatcaact acgctcccat ttcgaccggc agctccacct gcttcggcgg tatccagagc 1080

aacagcggtc tgggactgtc catcctgggt gatgtgttcc tgaagagcca gtacgtggta 1140

ttcaactctg agggtcctaa gctgggcttc gctgctcaag cttag 1185

Claims

1.一种黑曲霉工程菌株，其特征在于，所述的黑曲霉工程菌株携带有用于重组表达酸性蛋白酶的重组质粒。

2.如权利要求1所述的黑曲霉工程菌株，其特征在于，所述的酸性蛋白酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

3.如权利要求1或2所述的黑曲霉工程菌株，其特征在于，所述的酸性蛋白酶，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

4.一种黑曲霉突变菌株，其特征在于，所述的黑曲霉突变菌株是对权利要求1所述的黑曲霉工程菌株进行紫外诱变后筛选获得的。

5.如权利要求4所述的黑曲霉突变菌株，其特征在于，所述的黑曲霉突变菌株的保藏编号为CCTCC NO:M2018388。

6.权利要求1所述的黑曲霉工程菌株在生产酸性蛋白酶中的应用。

7.权利要求4所述的黑曲霉突变菌株在生产酸性蛋白酶中的应用。

8.一种生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求1或4所述的菌株发酵生产酸性蛋白酶。