CN106479912A - 一株产纤维素酶的地衣芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株产纤维素酶的地衣芽孢杆菌，以及包含该地衣芽孢杆菌的微生态制剂、该微生态制剂在促进秸秆腐熟中的应用，属于微生物技术领域。该菌种已于2016年4月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号是CCTCC No.M 2016202，其采用液态发酵、离心、喷雾干燥工艺获得单菌粉，与枯草芽孢杆菌CCTCC No.M 2011443、凝结芽孢杆菌CCTCC No.M 2015273、黑曲霉按一定比例混合，并添加辅料从而制得秸秆腐熟剂。本发明添加了地衣芽孢杆菌CCTCC No.M 2016202的秸秆腐熟剂能原位降解农作物秸秆、促进秸秆还田，尤其在秋冬季节温度较低的条件下仍能发挥作用。

Description

一株产纤维素酶的地衣芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株产纤维素酶的地衣芽孢杆菌，以及包含该地衣芽孢杆菌的微生态制剂、该微生态制剂在促进秸秆腐熟中的应用，属于微生物技术领域。
背景技术
国内每年农作物秸秆生成量在7亿吨以上，仅有小部分用于饲料、建材、发电、燃料乙醇等领域；大部分就地焚烧，既造成火灾隐患、又污染空气环境。
事实上，秸秆含有丰富的有机质和氮、磷、钾等有效养分，秸秆还田可增加土壤有机质、增强土壤保水能力、防止土壤侵蚀。已有大量研究表明秸秆还田后，土质明显改善，作物增产，化肥、农药用量减少。但在自然条件下，秸秆腐熟速度慢，直接影响到农作物的播种、出苗、生长。
通过添加微生物菌剂可加速秸秆腐熟、促进秸秆还田。ZL200810180290.7公布了一种适用于小麦、玉米秸秆还田的土传病害生防菌剂及其制备方法，该菌剂由枯草芽孢杆菌CGMCC No.2752采用固态发酵所得，有效微生物含量2×108个/g以上。ZL201010574304.0公布了一种由地衣芽孢杆菌CGMCC No.4392、添加剂和微量元素制成的菌剂，该菌剂高效降解秸秆，可促进作物秸秆田间原位降解还田、提高土壤有机质和腐殖质。ZL201210518981.X公布了一种秸秆降解效果明显、兼具广谱抑菌性能的枯草芽孢杆菌CGMCC No.6497。ZL201310613667.4公布了由解木聚糖梭菌DSM No.6555T、解纤维素木聚糖单胞菌DSMNo.15894、假单胞菌ACCC No.11691和枯草芽孢杆菌ACCC No.03189复配而成的秸秆原位腐解菌剂，可用于秸秆还田和木质纤维素原料降解。ZL201310096493.9公布了由枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪地芽孢杆菌、米曲霉、细黄链霉菌、硅藻土复配的秸秆腐熟剂，具有提高腐熟效率、缩短腐熟时间、节约生产成本等作用。由此可见，微生物秸秆腐熟菌剂有助于实现农作物秸秆的综合利用、实现资源循环利用，对于农业可持续发展具有重要意义。
目前，秸秆还田的主要方式是将秸秆收集、粉碎之后堆积在田间，适当补充尿素等物质，拌入微生物菌剂，适时搅拌，采用这种方式，需要投入大量的人工，影响农民积极性。最直接的方式是秸秆不经加工、原位处理，然而秸秆还田一般多在秋冬季节，由于温度较低，现有的各种微生物菌剂处理效果并不显著。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的旨在提供一种能原位降解农作物秸秆、促进秸秆还田的微生物秸秆腐熟剂及其制备方法，该微生物秸秆腐熟剂在秋冬季节仍能发挥良好的加速秸秆腐熟的作用。
本发明的技术方案如下所述：
本发明提供了一株产纤维素酶的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，该菌种已于2016年4月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC No.M2016202。
本发明还提供了上述的地衣芽孢杆菌CCTCC No.M 2016202在促进秸秆腐熟中的应用，具体而言，是将地衣芽孢杆菌CCTCC No.M 2016202制成微生物秸秆腐熟剂。
所述微生物秸秆腐熟剂由多种微生物单菌粉及辅料复配而成，所述微生物单菌粉为地衣芽孢杆菌CCTCC No.M 2016202、枯草芽孢杆菌CCTCC No.M 2011443、凝结芽孢杆菌CCTCC No.M 2015273与黑曲霉。其中，枯草芽孢杆菌CCTCC No.M 2011443菌粉、凝结芽孢杆菌CCTCC No.M 2015273菌粉均采购自泰州绿圣元生物科技有限公司；黑曲霉单菌粉采购自山东长泰生物科技有限公司。
所述微生物秸秆腐熟剂中各微生物的含量如下：地衣芽孢杆菌CCTCC No.M2016202 10-20亿cfu/g、枯草芽孢杆菌CCTCC No.M 2011443 10-20亿cfu/g、凝结芽孢杆菌CCTCC No.M 2015273 5-10亿cfu/g、黑曲霉5-10亿cfu/g。
优选地，所述微生物秸秆腐熟剂中各微生物的含量如下：地衣芽孢杆菌CCTCCNo.M 2016202 15亿cfu/g、枯草芽孢杆菌CCTCC No.M 2011443 15亿cfu/g、凝结芽孢杆菌CCTCC No.M 2015273 7亿cfu/g、黑曲霉7亿cfu/g。
较优选地，所述微生物秸秆腐熟剂中的辅料包括石粉、麦麸、葡萄糖、硫酸钠中的一种或几种，所述辅料均为市售，主要发挥分散单菌粉、使其分布更加均匀、腐熟效果更好的作用。
所述微生物秸秆腐熟剂中的地衣芽孢杆菌CCTCC No.M 2016202通过液态发酵、离心、喷雾干燥工艺获得干菌粉，所述干菌粉与辅料混合后得到地衣芽孢杆菌CCTCC No.M2016202的单菌粉。
优选地，所述地衣芽孢杆菌CCTCC No.M 2016202的干菌粉中活菌数为7.5×1011cfu/g以上。
更优选地，所述喷雾干燥的操作条件为：进风温度190℃，出风温度90℃。
本发明有益的技术效果在于：
(1)微生物秸秆腐熟剂中所选用的各种微生物均属于农业部微生物饲料添加剂目录内的品种，生物安全性好；
(2)所选用的地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和黑曲霉各菌株之间的互补性强，通过相互的协同作用降解秸秆，共同发挥促进秸秆还田、腐熟的功能；
(3)秸秆腐熟剂中的微生物多以芽孢、孢子的状态存在，抗逆性强、货架周期长、易于运输和储存；
(4)本发明所提供的微生物秸秆腐熟剂在秋冬季节温度较低的条件下仍能发挥作用，利于秸秆还田，具有极为广阔的市场应用前景。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明作进一步说明。
实施例1 地衣芽孢杆菌CCTCC No.M 2016202的筛选
从江苏无锡某水稻田采集土样1g，加入99ml无菌生理盐水中，于37℃在摇床振荡10min，摇床转速150rpm；吸取1ml液体加入以CMC(羧甲基纤维素钠)为唯一碳源的液体培养基中，于37℃、150rpm的条件下继续振荡培养；24hr后，吸取1ml液体加入以CMC(羧甲基纤维素钠)为唯一碳源的液体培养基中，于37℃、150rpm的条件下继续振荡培养24hr；24hr后，吸取1ml液体加入以CMC(羧甲基纤维素钠)为唯一碳源的液体培养基中，于37℃、150rpm的条件下继续振荡培养24hr。如此反复三次进行富集培养。最后，取培养液梯度稀释后，涂布于以CMC(羧甲基纤维素钠)为唯一碳源的平板培养基，并于37℃下培养48hr。根据平板培养基上菌落所产生的透明圈大小，筛选出一株能较好利用CMC的菌株，透明圈越大说明菌株产纤维素酶的能力越强。
液体培养基组成(g/L)：CMC 5，酵母膏0.5，蛋白胨0.5，KH2PO40.1。
平板培养基组成(g/L)：CMC 5，酵母膏0.5，蛋白胨0.5，KH2PO4 0.1，琼脂30；1％浓度的刚果红水溶液2mL，刚果红水溶液为市售产品。
实施例2 地衣芽孢杆菌CCTCC No.M 2016202的鉴定
1、菌落形态
将菌株在LB培养基上于37℃培养24hr后，形成圆形菌落，边缘不整齐；革兰氏染色阳性；光学显微镜观察，菌体形态为长杆状，单个、成对或者链状排列。
2、生理生化鉴定
对实施例1中所筛菌株进行生理生化鉴定，结果如表1所示：
表1产纤维素酶菌株生理生化鉴定结果
项目 结果 项目 结果
运动型 + 氧化酶 +
芽孢 + 甲基红 +
37℃生长 + V-P测定 +
厌氧生长 + 吲哚产生 -
葡萄糖 + 过氧化氢酶 +
柠檬酸盐利用 + 丙酸盐利用 +
松三糖 - 硝酸盐还原 +
甘露醇 + 明胶水解 -
阿拉伯糖 + pH5.5 +
木糖 + pH9.5 -
肌醇 + 2％NaCl +
山梨醇 + 5％NaCl +
甘露醇 + 7％NaCl +
3、16s rDNA鉴定
采用16s rDNA测序进行分子生物学鉴定。利用PCR技术扩增上述菌株的16s rDNA，其中，上游引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，下游引物：5’-AAGGAGGTGATCCGACCGC-3’。PCR扩增产物测序分析可知，该菌株16s rDNA与地衣芽孢杆菌标准株Bacilluslicheniformis DSM13同源性99％。
结合菌落形态、生理生化鉴定、16s rDNA鉴定，可鉴定该菌株为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis。该菌株已于2016年4月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC No.M 2016202。
实施例3 地衣芽孢杆菌CCTCC No.M 2016202产纤维素酶能力的测定
产纤维素酶测试培养基(g/L)：麦芽糖40，蛋白胨10，NaCl 5，K2HPO4 2。微生物培养条件：装液量15mL/250mL三角瓶，摇床控温37℃，转速180rpm，培养时间48hr。用CMC法(吴文韬、鞠美庭、刘金鹏等，一株纤维素降解菌的分离、鉴定及对玉米秸秆的降解特性。微生物学通报，2013，40(4)：712-719)测定纤维素酶活。地衣芽孢杆菌CCTCC No.M 2016202作为试验菌，地衣芽孢杆菌CCTCC No.M 2012458作为对照菌。
经测定，地衣芽孢杆菌CCTCC No.M 2016202发酵液的酶活为98.5U/mL，对照菌株地衣芽孢杆菌CCTCC No.M 2012458发酵液的酶活为54.6U/mL，可见，本发明所筛选的地衣芽孢杆菌CCTCC No.M 2016202具有较强的产纤维素酶的能力，可将其制成单菌粉，用于多种产品的研发。
实施例4 地衣芽孢杆菌CCTCC No.M 2016202单菌粉的制备
1、菌种活化
将地衣芽孢杆菌接种至营养琼脂斜面培养基上，37℃下培养24hr；然后划线转接于营养琼脂茄子瓶斜面，37℃下培养24hr。
营养琼脂斜面培养基及营养琼脂茄子瓶的组成(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏3，氯化钠5，琼脂15-20，pH7.2-7.4。
2、摇瓶培养
将活化好的菌种接种至摇瓶中，振荡培养24hr。
摇瓶培养基组成(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏3，氯化钠5，pH7.2-7.4。250mL摇瓶装液量为20mL，500mL摇瓶装液量为50mL。
培养条件：摇瓶转速180r/min，温度37℃。
3、种子罐扩培
种子罐培养基组成(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏3，氯化钠5，pH7.2-7.4。种子罐体积10-100L，装液量70-80％。
培养条件：搅拌转速180-250r/min，通气量0.5-1.0vvm，温度30-37℃，培养时间18-24hr。
4、发酵罐发酵
以0.1％-10％(v/v)的接种量将种子液接入发酵罐，发酵培养基组成(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨20，酵母粉15，磷酸二氢钾1.5，硫酸镁1.0，初始pH7.0。
发酵罐体积1-10m3，装液量70-80％。
培养条件：搅拌转速150-200r/min，通气量0.7-1.0vvm，温度30-37℃，培养时间24-48hr。
5、干菌粉制备
发酵结束后，发酵液离心后收集湿菌泥，采用喷雾干燥工艺得到干菌粉。喷雾干燥操作条件为：进风温度190℃，出风温度90℃。干菌粉中活菌数可达到7.5×1011cfu/g以上，干菌粉与麦麸、石粉、葡萄糖、硫酸钠等辅料混合，得到各种规格的地衣芽孢杆菌菌粉。
实施例5 含地衣芽孢杆菌CCTCC No.M 2016202的微生物秸秆腐熟剂的制备与腐熟效果评价
微生物秸秆腐熟剂由多种微生物单菌粉及辅料复配而成，微生物单菌粉为地衣芽孢杆菌CCTCC No.M 2016202、枯草芽孢杆菌CCTCC No.M 2011443、凝结芽孢杆菌CCTCCNo.M 2015273、黑曲霉；辅料采用石粉、麦麸、葡萄糖、硫酸钠，均为市售。
其中，各微生物含量如下：地衣芽孢杆菌CCTCC No.M 2016202 10亿cfu/g、枯草芽孢杆菌CCTCC No.M 2011443 10亿cfu/g、凝结芽孢杆菌CCTCC No.M 2015273 5亿cfu/g、黑曲霉5亿cfu/g。
实施例6-13按照实施例5的方法制备得到各微生物含量不同的腐熟剂，其中各微生物的含量见下表2，并采用失重率法(NYT 2722-2015《秸秆腐熟菌剂腐解效果评价技术规程》)评估秸秆腐熟度。
试验地点：江苏无锡马山
试验时间：2015年10月10日至2015年11月30日
试验方法：在水稻收割后进行进行秸秆原位处理试验，以1亩地为试验用地。将1kg微生物秸秆腐熟剂拌土10kg后，均匀撒到秸秆上，使其充分吸收水分。经常到试验田间进行观察并补充水分，使稻草秸秆保持湿润。
在第25天的时候，测定失重率，微生物的添加比例和失重率如下表2所示。
表2实施例5-13的腐熟剂中微生物添加含量及失重率(单位：亿cfu/g)
实施例14 微生物秸秆腐熟菌剂的应用
设置以下4组进行微生物秸秆腐熟剂的应用试验：
试验组1为空白，即不使用任何微生物秸秆腐熟菌剂，在自然状态下观察秸秆的腐熟情况；
试验组2-4使用不同的微生物秸秆腐熟剂：
试验组2所用的微生物秸秆腐熟剂，含枯草芽孢杆菌CCTCC No.M 2011443 15亿cfu/g、凝结芽孢杆菌CCTCC No.M 2015273 7亿cfu/g、黑曲霉7亿cfu/g。
试验组3所用微生物秸秆腐熟剂，含地衣芽孢杆菌CCTCC No.M 2016202 15亿cfu/g、枯草芽孢杆菌CCTCC No.M 2011443 15亿cfu/g、凝结芽孢杆菌CCTCC No.M 2015273 7亿cfu/g、黑曲霉7亿cfu/g。
试验组4所用微生物秸秆腐熟剂，含地衣芽孢杆菌CCTCC No.M 2012458 15亿cfu/g、枯草芽孢杆菌CCTCC No.M 2011443 15亿cfu/g、凝结芽孢杆菌CCTCC No.M 2015273 7亿cfu/g、黑曲霉7亿cfu/g，其中，地衣芽孢杆菌CCTCC No.M 2012458菌粉采购自泰州绿圣元生物科技有限公司。
试验地点：江苏无锡马山
试验时间：2015年10月10日至2015年11月30日
试验方法：在水稻收割后进行进行秸秆原位处理试验，试验1-试验4均以1亩地为试验用地。其中：试验1不使用任何微生物秸秆腐熟剂，试验2-试验4使用不同的微生物秸秆腐熟剂，1kg微生物秸秆腐熟剂拌土10kg后，均匀撒到秸秆上，使其充分吸收水分。经常到试验田间进行观察并补充水分，使稻草秸秆保持湿润。
试验结果：
1、试验组1在第20天开始有所变化，至试验结束仅部分腐烂。
2、试验组2-4从第8天开始变黑，用手拉秸秆容易断裂。其中，试验组2在第40天基本腐烂；试验组3在第25天基本腐烂；试验组4在第30天基本腐烂。试验组3腐烂速度最快，试验组3的微生物秸秆腐熟剂能更好地加速秸秆腐熟。
3、采用失重率法(NYT 2722-2015《秸秆腐熟菌剂腐解效果评价技术规程》)评估秸秆腐熟度，试验组1在试验结束时的失重率为13.2％；试验组2在第25天、30天、40天的失重率分别为38.7％、51.6％、62.8％；试验组3在第25天、30天、40天的失重率分别为63.7％、64.1％、64.1％；试验组4在第25天、30天、40天的失重率为52.3％、60.9％、63.2％。
可见，本发明专利所提供的微生物秸秆腐熟菌剂在秋冬季节使用时，即使环境温度较低仍能发挥作用，对于秸秆还田具有极为重要的意义。
以上已经详细描述了本发明的实施方案，对于本领域技术人员来说，很显然可以做出很多改进和变化而不背离本发明的基本精神，所有这些改进和变化都在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一株产纤维素酶的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)CCTCC No.M 2016202，该菌株已于2016年4月18日保藏于中国典型培养物保藏中心。
2.根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌在促进秸秆腐熟中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，具体是将地衣芽孢杆菌CCTCC No.M2016202制成微生物秸秆腐熟剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述微生物秸秆腐熟剂由多种微生物单菌粉及辅料复配而成，所述微生物单菌粉包括地衣芽孢杆菌CCTCC No.M 2016202、枯草芽孢杆菌CCTCC No.M 2011443、凝结芽孢杆菌CCTCC No.M 2015273、黑曲霉。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述微生物秸秆腐熟剂中各微生物的含量如下：地衣芽孢杆菌CCTCC No.M 2016202 10-20亿cfu/g、枯草芽孢杆菌CCTCC No.M2011443 10-20亿cfu/g、凝结芽孢杆菌CCTCC No.M 2015273 5-10亿cfu/g、黑曲霉5-10亿cfu/g。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，优选地，各微生物的含量如下：地衣芽孢杆菌CCTCC No.M 2016202 15亿cfu/g、枯草芽孢杆菌CCTCC No.M 2011443 15亿cfu/g、凝结芽孢杆菌CCTCC No.M 2015273 7亿cfu/g、黑曲霉7亿cfu/g。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述辅料包括石粉、麦麸、葡萄糖、硫酸钠中的一种或几种。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌CCTCC No.M 2016202通过液态发酵、离心、喷雾干燥工艺获得干菌粉，所述干菌粉与辅料混合后得到地衣芽孢杆菌CCTCC No.M 2016202的单菌粉。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌CCTCC No.M 2016202的干菌粉中活菌数为7.5×1011cfu/g以上。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述喷雾干燥的操作条件为：进风温度190℃，出风温度90℃。
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