CN104195083A - 一株降解纤维素的地衣芽孢杆菌及其在低温环境中降解纤维素的用途 - Google Patents

Abstract

一株降解纤维素的地衣芽孢杆菌及其在低温环境中降解纤维素的用途，它涉及一株地衣芽孢杆菌及其在降解纤维素中的用途。它解决了目前生物法降解纤维素在低温条件下不适用的问题。本发明解纤维素的地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)J-048，保藏号为CGMCC No.9419。本发明地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)J-048能够产纤维素酶，可在低温环境中高效降解纤维素。利用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)J-048可实现低温降解纤维素，有利于纤维素的生物法在冬季或低温环境中的应用和推广。

Description

一株降解纤维素的地衣芽孢杆菌及其在低温环境中降解纤维素的用途

技术领域

本发明涉及一株地衣芽孢杆菌及其在降解纤维素中的用途。

背景技术

作为农业大国，我国每年产生的农作物秸秆的量居全世界首位，但农作物秸秆等纤维素的利用率却与发达国家有很大差距，所以纤维素资源的综合利用已经迫在眉睫。纤维素的前期处理是纤维素利用的关键，前期处理方法主要有酸化法、碱化法、氧化法、物理法和生物法等方法。与其它方法相比，生物法处理纤维素具有绿色环保、方法简便、处理成本低等优点，应用前景广阔。但同时生物法也因微生物的局限而受到诸多的制约，如在冬天或温度较低的条件下生物分解纤维素的速度大幅降低甚至停滞，严重的限制了生物法在低温条件下的应用。

发明内容

本发明是为了解决目前生物法降解纤维素在低温条件下不适用的问题，而提供的一株降解纤维素的地衣芽孢杆菌及其在低温环境中降解纤维素的用途。

本发明降解纤维素的地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)J-048，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2014年7月7日，保藏号为CGMCC No.9419。

上述的降解纤维素的地衣芽孢杆菌在低温环境中降解纤维素的用途。

将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)J-048活化后接种于含有纤维素的营养液中，在1～30℃的环境中降解。

本发明地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)J-048为革兰氏阳性菌，杆状，细胞大小为(0.3μm～0.4μm)×(1.5μm～2μm)，产芽孢，有鞭毛；在肉汁胨培养基上培养，菌落呈圆形，边缘锯齿状(如图1所示)。

本发明地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)J-048V-P反应呈阳性，可分解葡萄糖产酸，能够分解L-阿拉伯糖、甘油、麦芽糖、纤维二塘、D-木糖、蔗糖、果糖、葡萄糖、D-松二糖、甘露醇和山梨醇。

本发明地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)J-048通过16S rDNA序列比对分析，与地衣芽孢杆菌属(Bacillus licheniformis)的16S rDNA序列的同源性最高，保守区相似性为99％，再结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定该菌株为地衣芽孢杆菌。

本发明地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)J-048能够产纤维素酶，可在低温环境中高效降解纤维素。

利用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)J-048可实现低温降解纤维素，有利于纤维素的生物法在冬季或低温环境中的应用和推广。

本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)J-048属于地衣芽孢杆菌属(Bacilluslicheniformis)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2014年7月7日，保藏号为CGMCCNo.9419。

附图说明

图1为本发明地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)J-048的菌落形态照片；图2为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)J-048在刚果红纤维素鉴别培养基上生长的照片；图3为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)J-048随培养时间变化的产酶曲线图；图4为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)J-048随起始pH值变化的产酶曲线图；图5为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)J-048随培养基不同氮源变化的产酶曲线图；图6为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)J-048随接种量变化的产酶曲线图。图7为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)J-048随温度变化的产酶曲线图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式降解纤维素的地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)J-048，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2014年7月7日，保藏号为CGMCC No.9419。

本实施方式地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)J-048为革兰氏阳性菌，杆状，细胞大小为(0.3μm～0.4μm)×(1.5μm～2μm)，产芽孢，有鞭毛；在肉汁胨培养基上培养，菌落呈圆形，边缘锯齿状，颜色为乳白色。

参照《伯杰细菌鉴定手册》第八版和《常见细菌系统鉴定手册》对地衣芽孢杆菌J-048进行生理生化鉴定：本发明地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)J-048V-P反应呈阳性，可分解葡萄糖产酸，能够分解L-阿拉伯糖、甘油、麦芽糖、纤维二塘、D-木糖、蔗糖、果糖、葡萄糖、D-松二糖、甘露醇和山梨醇。

本实施方式地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)可在肉汁胨培养基上生长，肉汁胨培养基由3g牛肉膏、10g蛋白胨、5g NaCl和1000mL蒸馏水组成，pH为7.2～7.4。

本实施方式地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)J-048是由哈尔滨道里区太平镇农户养殖的牛粪中筛选得到。筛选步骤如下：

取5g牛粪，用无菌水稀释成10^-1～10^-9的各级浓度的稀释液，将装有初筛培养基的试管编号为1至9号，然后在每个试管中加入一张滤纸条(5×0.7cm或7×1cm)，使滤纸条贴于试管内壁，滤纸条的一半进入试管中的初筛培养基中，一半暴露于空气中，然后将试管于121℃灭菌20～30min。用无菌移液管各吸取lmL各级浓度的稀释液对号接种到装有初筛培养基的试管中，于5℃培养至滤纸条上出现溃烂斑，选择滤纸溃烂程度高的试管，从溃烂处挑取菌落于分离培养基平板上进行划线培养，分离至得到纯化的单菌落，将得到的单菌落点种于刚果红纤维素鉴别培养基，培养48h，测量分解纤维素的透明圈直径大小，进行初筛，将初筛得到的细菌菌株接入细菌液体发酵培养基中进行摇甁培养，采用3，5-二硝基水杨酸比色法(DNS法)分别测定菌株产纤维素酶的酶活，其中酶活最高达到523U，该菌株即为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)J-048。

所述初筛培养基由1g K₂HPO₄、0.1g FeC1₃·5H₂O、0.3g MgSO₄·7H₂O、0.1g CaCl₂、0.1gNaCl、2.5g NaNO₃和l000mL蒸馏水组成，pH为7.2～7.4。

所述分离培养基平板由质量浓度为0.5％的CMC-Na、100mL营养盐和质量浓度为2％的琼脂组成，pH为7.2；其中所述营养盐由0.5g(NH₄)H₂PO₄、2.5g MnSO₄·H₂O、2g K₂HPO₄、7.5mg FeSO₄·7H₂O、2g MgSO₄、0.3g NaCl和1000mL水组成。

所述刚果红纤维素鉴别培养基由0.5g K₂HPO₄、0.25g MgSO₄、0.24g刚果红、14.00g琼脂、l.88g纤维素粉、2.00g明胶、100mL土壤浸汁和900mL蒸馏水组成，pH为7.0。刚果红纤维素鉴别培养基在配制前应对纤维素粉进行预处理，纤维素粉放入浓度为l mol/L的HCL溶液浸泡12h，然后蒸馏水洗多次至pH值中性，烘干。所述土壤浸汁的制备方法为：取土壤50克，加水200毫升，15磅蒸煮1小时，经滤纸过滤后加水补足到200毫升。

所述细菌液体发酵培养基由0.3％蛋白胨、0.03％MgSO₄·7H₂O、0.05％酵母膏、0.03％CaC1₂·2H₂O、0.4％KH₂PO₄、0.5％CMC-Na和蒸馏水组成，pH为7.2～7.3(以上为质量百分含量)。

地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)J-048的16SrDNA序列长度为1464bp，测序结果与GenBank中的16S rDNA序列进行同源性比对。同源性分析结果表明，该序列与地衣芽孢杆菌属(Bacillus licheniformis)的16S rDNA序列的同源性最高，保守区相似性为99％，再结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定属于地衣芽孢杆菌属(Bacilluslicheniformis)。

鉴定用PCR引物购买自上海生工生物技术有限公司，其他试剂购自于大连宝生物工程有限公司。

将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)J-048接种到刚果红纤维素鉴别培养基上，在5℃温度条件下培养48h，在菌落周围形成透明水解圈，水解圈的直径如表1所示，照片如图2所示。

表1

菌株编号	菌落直径(cm)	透明圈直径(cm)
			地衣芽孢杆菌J-048	0.53	2.69

本实施方式地衣芽孢杆菌J-048随培养时间变化的产酶曲线图如图3所示，可以看出在48h的时候酶活达到最高值，为562U，因此培养48h为地衣芽孢杆菌J-048产酶的最适培养时间。

本实施方式地衣芽孢杆菌J-048随起始pH值变化的产酶曲线图如图4所示，可以看出起始pH值在6～8之间时菌株酶活比较稳定，在pH为7时酶活达到最高值，为567U，因此起始pH为7是地衣芽孢杆菌J-048产酶的最适起始pH值。

本实施方式地衣芽孢杆菌J-048随培养基不同氮源变化的产酶曲线图如图5所示(图5中1为牛肉膏，2为蛋白胨，3为酵母膏，4为硫酸铵，5为氯化铵，6为磷酸二氢铵)，可以看出有机氮源促进产酶的效果明显好于无机氮源，菌株酶活比较高，因为有机氮源相比于硫酸铵等无机氮源更容易被地衣芽孢杆菌J-048所利用来促进其产酶。其中以牛肉膏为氮源时，菌株酶活最高，酶活为539U，所以牛肉膏为地衣芽孢杆菌J-048产酶的最适培养基氮源。

本实施方式地衣芽孢杆菌J-048随接种量变化的产酶曲线图如图6所示，可以看出在接种量为3％时酶活达到最大值，酶活为537U，所以3％的接种量时为地衣芽孢杆菌J-048产酶的最适接种量。

本实施方式地衣芽孢杆菌J-048随温度变化的产酶曲线图如图7所示(分别将地衣芽孢杆菌J-048在0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃和30℃条件下培养48h，)，实验结果显示地衣芽孢杆菌J-048在0℃培养时酶活较低；在5℃培养时菌株酶活最高，达到575U；在10℃培养时，酶活有所下降，接种量在15℃～30℃之间，酶活基本稳定。由此可见地衣芽孢杆菌J-048在5℃下具有高纤维素降解酶活，非常适合在气温较低的地区应用。

根据以上五个单因子对地衣芽孢杆菌J-048产酶的影响分析。分别选择五个影响因子的三个水平(培养时间选取36h、48h、60h，培养基起始pH值选取6.5、7.0、7.5，氮源牛肉膏含量选取0.10％、0.15％、0.20％，接种量选取2.5％、3.0％、3.5％，培养温度选取5℃、10℃、15℃)做正交实验。最终确定地衣芽孢杆菌J-048的最佳产酶条件是培养时间48h、培养基起始pH值7.5、牛肉膏含量0.20％、接种量3.0％、培养温度5℃。用以上得出的最佳产酶条件进行验证试验，测得地衣芽孢杆菌J-048的酶活为575U，从而证实了上述正交实验结果的可靠性。

具体实施方式二：本实施方式降解纤维素的地衣芽孢杆菌在低温环境中降解纤维素的用途：将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)J-048活化后接种于含有纤维素的营养液中，在1～30℃的环境中降解。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二的不同点在于：营养液中牛肉膏含量为0.20％，营养液起始pH值为7.5。其他步骤及工艺参数与具体实施方式二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三的不同点在于：地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)J-048的接种量为3％。其他步骤及工艺参数与具体实施方式二或三相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二、三或四的不同点在于：在5℃的环境中降解。其他步骤及工艺参数与具体实施方式二、三或四相同。

Claims (6)

1.一株降解纤维素的地衣芽孢杆菌，其特征在于降解纤维素的地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)J-048，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9419。

2.如权利要求1所述的降解纤维素的地衣芽孢杆菌在低温环境中降解纤维素的用途。

3.根据权利要求2所述的降解纤维素的地衣芽孢杆菌在低温环境中降解纤维素的用途，其特征在于将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)J-048活化后接种于含有纤维素的营养液中，在1～30℃的环境中降解。

4.根据权利要求3所述的降解纤维素的地衣芽孢杆菌在低温环境中降解纤维素的用途，其特征在于营养液中牛肉膏含量为0.20％，营养液起始pH值为7.5。

5.根据权利要求3所述的降解纤维素的地衣芽孢杆菌在低温环境中降解纤维素的用途，其特征在于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)J-048的接种量为3％。

6.根据权利要求3所述的降解纤维素的地衣芽孢杆菌在低温环境中降解纤维素的用途，其特征在于在5℃的环境中降解。