CN110257486A - 一种基于纤维素酶基因表征堆肥腐熟度的方法 - Google Patents

一种基于纤维素酶基因表征堆肥腐熟度的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于纤维素酶基因表征堆肥腐熟度的方法，属于环境微生物技术领域。具体步骤是：分别提取堆肥原料和堆肥产物的DNA，利用荧光定量PCR分别扩增其16 S DNA和纤维素酶基因，以16 S DNA作为内参，根据溶解曲线法计算堆肥产物中纤维素酶基因的相对含量，当纤维素酶基因的相对含量大于5时，堆肥产物基本完全腐熟。该方法操作简单、结果稳定、省时且可靠，在富含纤维素的有机废弃物的堆肥资源化方面具有广阔的应用前景。

Description

一种基于纤维素酶基因表征堆肥腐熟度的方法
技术领域
本发明涉及环境微生物技术领域，特别涉及一种基于纤维素酶基因表征堆肥腐熟度的方法。
背景技术
堆肥化处理，是指在人工控制的条件下，依靠自然界中广泛分布的细菌、放线菌、真菌等微生物，人为地促进可生物降解的有机物向稳定的腐殖质转化的微生物学过程。畜禽粪污经过好氧堆肥处理后：1）有机质分解转化为腐殖质，更利于植物吸收利用；2）畜禽粪污中的致病菌、寄生虫等会被杀死。用畜禽粪污做原料生产有机肥具有成本小、质量稳定、市场销售空间大等优势。因此，堆肥化已成为当前畜禽粪污无害化、资源化处理最常用的方法。
腐熟度是指堆肥产品的腐熟程度。堆肥产品的腐熟度直接关系到堆肥的质量，这是因为，如果堆肥未经完全腐熟，那么：1）堆肥产品中的微生物活性相对较高，这些微生物会与农作物竞争土壤中的营养元素（如氮元素、钾元素等），影响农作物的生长；2）植物毒性物质（如有机酸、NH3、和乙烯氧化物等）的含量相对较高，这些物质会严重抑制植物的生长；3）施入农田后易发生“二次发酵”，进而造成烧根烧苗现象。因此，对堆肥产品腐熟度评价方法的研究一直以来都是堆肥化处理的热点问题。目前已有多种堆肥产品腐熟度的评价指标，大致可将其分为三类，即物理指标（如气味、颜色、温度、颗粒度等）、化学指标（如pH、EC、C/N、NH4 +-N/NO3-N等）和生物指标（如ATP含量、N硝化程度、发芽指数等）。然而，这些评价指标测定起来比较复杂，严重制约了其在企业中的推广和应用，尤其对于中、小型企业。此外，堆肥原料多种多样，其理化性质和生物指标差别较大，这就使得当前评价指标中的任意单个指标均不能有效判断堆肥产品的腐熟与否，必须两个或多个指标相结合（Bemal等，2009）。
在堆肥化过程中，微生物首先利用堆肥原料本身已经存在的水溶性有机碳，当其不足以支持微生物的生长时，纤维素、半纤维素等不溶性有机质就会被利用。随着纤维素、半纤维素的消耗，微生物开始利用难以被分解的木质纤维素等。基于此以及微生物是堆肥化处理的关键影响因素，本发明提供一种依据堆体堆肥前后纤维素酶基因相对含量的变化表征纤维素降解菌的变化，进而评价堆肥产品腐熟度的方法，在堆肥化处理领域具有潜在的应用价值，尤其适用于畜禽粪污等富含纤维素的有机废弃物的堆肥化产品腐熟度的评价。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于纤维素酶基因表征堆肥腐熟度的方法。依据堆体堆肥前后纤维素酶基因相对含量的变化表征纤维素降解菌的变化，进而评价堆肥产品腐熟度的方法，在堆肥化处理领域具有潜在的应用价值，尤其适用于畜禽粪污等富含纤维素的有机废弃物的堆肥化产品腐熟度的评价。
本发明可通过以下技术方案实现。
一种基于纤维素酶基因表征堆肥产物腐熟度的方法，包括以下步骤：
（1）分别提取堆肥原料和堆肥产物的DNA，利用分光光度仪和琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的浓度和质量；
（2）利用荧光定量PCR扩增两种样品的16 S DNA和纤维素酶基因，PCR扩增时，要求两种引物扩增条件下所用DNA模板的量相同，扩增循环数一致或具有相同的PCR扩增条件；
（3）堆肥原料和堆肥产物16 S DNA的CT值分别定义为CT1a和CT1b，纤维素酶基因的CT值分别定义为CT2a和CT2b，以16 S DNA作为内参，根据溶解曲线法计算堆肥产物中纤维素酶基因的相对含量，计算公式为。
（4）当计算结果大于时5，则堆肥产物达到腐熟状态。
本发明的优点在于：操作简单、结果稳定、省时且可靠，在有机废弃物堆肥资源化方面具有广阔的应用前景，尤其适用于畜禽粪污等富含纤维素的有机废弃物的堆肥化处理方面。
具体实施方式
下面描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1：基于纤维素酶基因表征堆肥产物腐熟度的方法及其在堆肥中的应用效果。
1. 实施例中所用LB培养基组成为：胰蛋白胨（10 g/L），酵母提取物（5 g/L），NaCl（10 g/L），pH调为7.0，也可向其中加入20 g/L琼脂粉，制成固体LB培养基。
2. 实施例中所涉及的引物：
16S DNA扩增引物：27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）；纤维素酶扩增基因选自熊小龙同学的硕士论文《应用于宏基因组纤维素酶基因钓取的新PCR方法的构建》，位于第60页，即GHF9E1F（5'-GGACGTGACCGGCGGNTGGTAYGA-3'）和GHF9E1R（5'- GGCCATCCACACCAGAGGNGCRTTCCA-3'）。
3. 实施例中所涉及的菌株：
特基拉芽孢杆菌菌株为在CGMCC编号为5935的菌株（见CN102719379A）；坚强芽孢杆菌菌株为在CGMCC编号为4772的菌株（见CN102337236A）。
4. 菌种活化：特基拉芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌分别接种于固体LB培养基，37℃培养24 h，挑取单菌落至液体LB培养基中，37℃培养12 h，12000 rpm，1 min，去除上清液后用1 mL无菌水悬浮，稀释106倍后用血球计数板计数并调整菌体浓度约l×108个/mL。
5. 按照表1配制堆肥接种液（A：特基拉芽孢杆菌；B：坚强芽孢杆菌）。
表1各菌株接种液体积比
6. 堆肥实验：堆肥原料中的牛粪采集于长富乳业第二十七牧场奶牛牧场，将水稻秸秆和新鲜牛粪按体积比4:6混合制堆，调整含水量约为65%。将堆肥原料平均分成4份，标记为T1、T2、T3、T4，依次施加步骤5中所配制的液体菌剂，添加比例为0.025%（以原始物料质量百分比计），获得发酵原料。堆肥进行20 d，分别在堆肥当天和第20 d取样，测定其温度、pH、含水率、有机质、凯氏氮、无机氮、DOM含量等参数。整个堆肥过程只在堆肥当天接种菌剂一次，在第3、6、9、12 d堆体翻堆。
7. 实验结果
（1）从温度变化分析，添加菌剂与不添加菌剂的堆体在温度方面变化不大，第20 d时，所有堆体温度均已降至室温，说明各堆体的堆肥化处理均以完成（表2）。
表2 温度检测结果 (℃)
（2）从pH和含水率变化分析，添加菌剂的堆体比不添加菌剂堆体的pH升得更高，水分降得更快；添加混合菌剂的堆体温度比添加单一菌剂堆体的pH升得更高，水分降得更快（表3和表4）。
表3 pH检测结果
表4 含水率检测结果（%）
（3）从有机质（OM）降解率分析，添加混合菌剂的OM降解率比只添加单一菌剂堆体的OM降解率更高；添加菌剂的比不添加菌剂的OM降解率更高（表5）。
表5 有机质检测结果（%）
（4）从凯氏氮和无机氮变化分析，添加混合菌剂的堆体与只添加单一菌剂堆体的凯氏氮含量无明显变化，然而，添加菌剂堆体的凯氏氮含量比不添加菌剂的凯氏氮含量更高（表6），同时，无机氮含量在所有处理中均变化不明显（表7和表8）
表6 凯氏氮检测结果 (%)
表7 NH4 +-N检测结果 (mk/Kg)
表8 NO3 --N检测结果 (mg/Kg)
（5）从可溶性有机物（DOM）的含量变化分析, 添加混合菌剂的DOM降解率比只添加单一菌剂堆体的DOM降解率略高；只添加单一菌剂堆体比不添加菌剂堆体的DOM降解率略高（表9）。
表9 DOM检测结果 (mg/g)
8. 堆肥产物对小白菜种子发芽率影响
利用小白菜种子发芽率测定堆肥产物的肥效，具体为：取5 g鲜样加水50 mL，浸提30min，室温200 rpm振荡30 min，用定性滤纸过滤，滤液用于种子发芽率的测定。在已灭菌的培养皿内垫3张滤纸，加入堆肥提取液8 mL，以去离子水作为对照，均匀放入20粒籽粒饱满，大小均匀一致小白菜种子， 25℃培养24 h后测定发芽率。结果显示，添加菌剂的堆肥产品更利于小白菜种子的发芽（表10），说明添加菌剂是的堆肥产品的腐熟度更好，更利于作物生长。
表10堆肥产物对小白菜种子发芽率影响
9. 纤维素酶基因相对含量的变化
（1）分别提取堆肥原料和堆肥产物的DNA，利用分光光度仪和琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的浓度和质量；
（2）利用荧光定量PCR扩增两种样品的16 S DNA和纤维素酶基因；反应体系是按照荧光定量PCR检测试剂使用说明书添加，20μl总反应体系，其中，DNA模板2μl，一对引物各0.5μl，荧光定量PCR检测试剂10μl，无菌水7μl；
（3）堆肥原料和堆肥产物16 S DNA的CT值分别定义为CT1a和CT1b，纤维素酶基因的CT值分别定义为CT2a和CT2b，以16 S DNA作为内参，根据溶解曲线法计算堆肥产物中纤维素酶基因的相对含量，计算公式为。
根据本发明的计算方法，T1组所得值小于5，说明堆肥未腐熟，添加菌剂的三种处理组均大于5，说明堆肥成熟（表11）。
表11堆肥前后纤维素酶基因相对含量的变化
综上所述，通过比较堆肥前后温度、pH、含水率、有机质、凯氏氮、无机氮、DOM含量等参数，以及堆肥产物的提取液对小白菜种子发芽率的影响可见，T2、T3和T4处理均已达到腐熟。利用本发明的表征方法，也得到相同的结果，验证了本发明方法的可靠性。除此之外，对于T2、T3和T4处理，本发明的结果与种子发芽率相比，数值之间的差异更大，说明本发明方法所得结果的精确度相对更高。总之，本发明可以用于表征牛粪堆肥产物的腐熟度。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省致青生态环保有限公司
<120> 一种基于纤维素酶基因表征堆肥腐熟度的方法
<130> 4
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agagtttgat cmtggctcag 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tacggytacc ttgttacgac tt 22
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 3
ggacgtgacc ggcggntggt ayga 24
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 4
ggccatccac accagaggng crttcca 27

Claims (8)

1.一种基于纤维素酶基因表征堆肥腐熟度的方法，其特征在于，以16 S DNA作为内参，比较堆肥前后堆体中纤维素酶基因含量的变化，以此判定牛粪堆肥产物的腐熟度。
2.根据权利要求1所述的一种基于纤维素酶基因表征堆肥腐熟度的方法，其特征在于，分别提取堆肥原料和堆肥产物的DNA，以16 S DNA作为内参，利用荧光定量PCR检测堆肥产物中纤维素酶基因的相对含量。
3.根据权利要求2所述的一种基于纤维素酶基因表征堆肥腐熟度的方法，其特征在于，16 S DNA扩增引物为常用的通用引物。
4.根据权利要求2所述的一种基于纤维素酶基因表征堆肥腐熟度的方法，其特征在于，纤维素酶基因扩增引物为适用于可分泌纤维素酶的细菌的简并引物。
5.根据权利要求2所述的一种基于纤维素酶基因表征堆肥腐熟度的方法，其特征在于，扩增16 S DNA和纤维素酶基因的两对引物具有相同的PCR扩增条件或PCR扩增时，所用DNA模板的量相同，扩增循环数一致。
6.根据权利要求2所述的一种基于纤维素酶基因表征堆肥腐熟度的方法，其特征在于，堆肥原料和堆肥产物16 S DNA的CT值分别定义为CT1a和CT1b，纤维素酶基因的CT值分别定义为CT2a和CT2b，其计算公式为。
7.根据权利要求1所述的一种基于纤维素酶基因表征堆肥腐熟度的方法，其特征在于，当纤维素酶基因的相对含量所得值大于5时，堆肥产物达到腐熟状态。
8.如权利要求1~7所述的评价堆肥腐熟度的方法在畜禽粪污堆肥处理中的应用。
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