CN115161245B - 纤维素降解兼臭味气体去除复合菌剂及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种纤维素降解兼臭味气体去除复合菌剂及其制备方法与应用，属于微生物发酵技术领域，本发明的纤维素降解兼臭味气体去除复合菌剂中各菌种之间合理配伍，共生协调、互不拮抗，能够在寡营养状态下，高效降解纤维素、快速升温、除臭，NH3、H2S等臭味气体去除率在75％以上，高效、快速腐熟农作物秸秆和畜禽粪便。本发明复合菌剂的制备方法简单易行，利于大量生产。同时本发明还能够利用复合菌剂制成生物有机肥，从而用于防治根腐病，促进植物生长，提高作物产量，实现农业废弃物无害化和资源化利用。

Description

纤维素降解兼臭味气体去除复合菌剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，尤其涉及一种纤维素降解兼臭味气体去除复合菌剂及其制备方法与应用。
背景技术
随着农业和畜牧养殖业的迅速发展，大量农作物秸秆和畜禽废弃物也急剧增加，对环境造成了巨大的压力。据统计，种植业秸秆产生量为8.05亿吨，可回收资源利用率为86.8％，每年约有30亿吨畜禽粪便产生，利用率却不足50％。农作物秸秆中主要成分为纤维素，同时含有磷、钾等多种作物生长所必需的微量元素，但自然条件下纤维素不易被降解，秸秆进入土壤后的有机酸积累、腐解缓慢以及对耕作与农艺操作等的不利影响限制了其推广。畜禽粪便富含作物所需的营养元素，但堆肥过程释放大量的热以及NH3、H2S等有害气体，因而不能被直接利用。
与此同时，随着长期以来农业用肥单一、偏使用化肥，虽然农产品产量有所提高，但长期过量施用化肥则会加剧农业面源污染，导致土壤酸化板结、盐渍化加重、机质含量降低、肥力下降、提高病虫害发病率、影响土壤微生物稳定性等问题。
因此，研制出能够耐高温、解磷解钾解纤维、降解恶臭气体，使粪便秸秆堆肥化无害化处理，并且能够在极少营养的状况下发挥出最大功能的多功能腐熟菌剂对解决上述问题具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种纤维素降解兼臭味气体去除复合菌剂及其制备方法与应用，本发明的复合菌剂中各菌种之间合理配伍，共生协调、互不拮抗，能够在寡营养状态下，高效降解纤维素、快速升温、除臭，从而高效、快速腐熟农作物秸秆和畜禽粪便。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种纤维素降解兼臭味气体去除复合菌剂，包括如下质量份的成分，枯草芽孢杆菌35～45份、地衣芽孢杆菌35～45份、黑曲霉10～30份；
所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis ACCC 60383；所述地衣芽孢杆菌为Bacillus licheniformis ACCC 19941；所述黑曲霉为Aspergillus ACCC 32504。
本发明还提供了一种上述复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
将所述枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和黑曲霉分别进行活化培养、种子培养后，进行固态发酵培养，干燥、粉碎，得到枯草芽孢杆菌菌粉、地衣芽孢杆菌菌粉和黑曲霉菌粉，混合后，制得纤维素降解兼臭味气体去除复合菌剂。
优选的，所述枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的发酵培养基包括如下质量份的成分：麸皮45～55份，小麦秸秆粉45～55份，Ca(OH)20.5～1.5份；所述黑曲霉的发酵培养基包括如下质量份的成分：麸皮35～45份，玉米粉5～15份，小麦秸秆粉45～55份，MnSO40.05～0.15份，ZnSO40.05～0.15份。
优选的，当枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌发酵时，发酵初始含水量为50～60％，发酵过程中的含水量为45～50％，发酵温度为33～42℃，发酵时间为30～40h；当黑曲霉发酵时，发酵初始含水量为45～55％，发酵过程中的含水量为40～50％，发酵温度为28～32℃，发酵时间为70～75h。
优选的，在所述枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和黑曲霉分别进行活化培养前，还包括对枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和黑曲霉驯化培养过程。
本发明还提供了上述复合菌剂或上述制备方法得到的复合菌剂在降解纤维素和/或去除臭味气体中的应用。
本发明还提供了上述复合菌剂或上述制备方法得到的复合菌剂在制备生物有机物料中的应用。
优选的，所述生物有机物料包括生物有机肥，所述生物有机肥的制备方法，包括如下步骤：
用所述复合菌剂与水混合得到复合菌液，将复合菌液喷洒在秸秆和粪肥混合后的混合物中后进行发酵，发酵温度升至50℃以上时，开始翻堆，之后每隔一天翻堆，直至温度下降到35～45℃，即得生物有机肥。
优选的，所述秸秆和粪肥的质量比为1:1～3；所述复合菌剂与水的质量体积比为1:190～210。
本发明还提供了上述生物有机肥在促进植物生长和/或防治根腐病中的应用。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种纤维素降解兼臭味气体去除复合菌剂及其制备方法与应用，本发明的纤维素降解兼臭味气体去除复合菌剂中各菌种之间合理配伍，共生协调、互不拮抗，能够在寡营养状态下，高效降解纤维素、快速升温、除臭，NH3、H2S等臭味气体去除率在75％以上，高效、快速腐熟农作物秸秆和畜禽粪便。本发明复合菌剂的制备方法简单易行，利于大量生产。同时本发明还能够利用复合菌剂制成生物有机肥，从而用于防治根腐病，促进植物生长，提高作物产量，实现农业废弃物无害化和资源化利用。
附图说明
图1为猪粪秸秆堆体腐熟过程中堆体NH3臭味气体释放量；
图2为猪粪秸秆堆体腐熟过程中堆体H2S臭味气体释放量；
图3为猪粪秸秆堆体在腐熟过程中温度的变化情况。
具体实施方式
本发明提供了一种纤维素降解兼臭味气体去除复合菌剂，包括如下质量份的成分，枯草芽孢杆菌35～45份、地衣芽孢杆菌35～45份、黑曲霉10～30份；
所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis ACCC 60383；所述地衣芽孢杆菌为Bacillus licheniformis ACCC 19941；所述黑曲霉为Aspergillus ACCC 32504。
在本发明中，所述复合菌剂优选的包括如下质量份的成分，枯草芽孢杆菌37～42份、地衣芽孢杆菌38～43份、黑曲霉15～25份。本发明复合菌剂中的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和黑曲霉各菌种之间合理配伍，共生协调、互不拮抗，能够在寡营养状态下，高效降解纤维素、快速升温、除臭，从而达到快速腐熟秸秆和畜禽粪肥的目的。本发明的草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和黑曲霉从中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)购买得到。
本发明还提供了一种上述复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
将所述枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和黑曲霉进行活化培养、种子培养后，进行固态发酵培养，干燥后粉碎，得到枯草芽孢杆菌菌粉、地衣芽孢杆菌菌粉和黑曲霉菌粉，混合后，制得纤维素降解兼臭味气体去除复合菌剂。
在本发明中，所述枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和黑曲霉分别进行活化培养、种子培养。所述枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌活化培养优选的包括如下步骤：将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌分别接种到LB培养基中，于35～40℃培养20～28h，即得活化后的枯草芽孢杆菌和活化后的地衣芽孢杆菌。所述枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌种子培养优选的包括如下步骤：将活化后的枯草芽孢杆菌和活化后的地衣芽孢杆菌分别接种于LB液体培养基中，于150～200r/min、35～40℃震荡培养20～28h，即得枯草芽孢杆菌种子液1和地衣芽孢杆菌的种子液1，然后将枯草芽孢杆菌种子液1和地衣芽孢杆菌的种子液1分别以3～7％的接种量接入LB液体培养基的发酵罐中，于180～220r/min，通风量5～10L/min，35～40℃震荡培养20～28h，即得枯草芽孢杆菌种子液2和地衣芽孢杆菌种子液2。本发明对LB培养基、LB液体培养基的来源没有特殊限定，采用本领域市售的LB培养基或按照常规的制备方法制备得到的培养基即可。在本发明中，所述黑曲霉活化培养优选的包括如下步骤：将黑曲霉接种至PDA培养基中，于25～30℃培养70～74h，即得活化后的黑曲霉。所述黑曲霉种子培养优选的包括如下步骤：将活化后的黑曲霉接种于PDA培养基中，于150～200r/min、25～30℃震荡培养44～52h，得到黑曲霉种子液1，将黑曲霉种子液1以3～7％的接种量接种至含PDA培养基的发酵罐中，于180～220r/min，通风量5～10L/min，25～30℃培养32～40h，得到黑曲霉种子液2。在本发明中，进行活化培养、种子培养后，进行固态发酵培养。所述枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的固态发酵优选的包括如下步骤：将枯草芽孢杆菌种子液2和地衣芽孢杆菌的种子液2以3～7％的接种量接种至发酵培养基中，发酵培养30～40h，发酵初始含水量为50～60％，发酵过程中控制温度33～42℃、含水量45～50％。本发明中所述枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的发酵培养基优选的包括如下质量份的成分：麸皮45～55份，小麦秸秆粉45～55份，Ca(OH)20.5～1.5份。所述黑曲霉的固态发酵优选的包括如下步骤：将黑曲霉种子液2以6～11％的接种量接种至发酵培养基，发酵初始含水量为45～55％，发酵过程中控制温度28～32℃，发酵过程中的含水量为40～50％，发酵培养70～75h。本发明对PDA培养基的来源没有特殊限定，采用本领域市售的产品或按照常规的制备方法制备得到即可。本发明所述黑曲霉的发酵培养基优选的包括如下质量份的成分：麸皮35～45份，玉米粉5～15份，小麦秸秆粉45～55份，MnSO40.05～0.15份，ZnSO40.05～0.15份。在本发明中，发酵结束后，干燥、粉碎，得到枯草芽孢杆菌菌粉、地衣芽孢杆菌菌粉和黑曲霉菌粉，混合后，制得纤维素降解兼臭味气体去除复合菌剂。本发明中所述的干燥方式优选的是将发酵后的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和黑曲霉于35～50℃下烘干。本发明粉碎后还优选的包括过80～100目筛，得到枯草芽孢杆菌菌粉、地衣芽孢杆菌菌粉和黑曲霉菌粉。本发明中，所述枯草芽孢杆菌菌粉、地衣芽孢杆菌菌粉和黑曲霉菌粉活菌含量优选为1～3×1010cfu/g。
在本发明中，在所述枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和黑曲霉分别进行活化培养前，还包括对枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和黑曲霉驯化培养过程。本发明中，所述的训化培养过程优选的包括以下步骤，将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和黑曲霉分别接种至寡营养细菌培养基，培养44～52h后，得到枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和黑曲霉寡营养菌液1，然后分别接种涂布至刚果红培养基中培养，再接种至寡营养细菌培养基培养44～52h后，得到枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和黑曲霉寡营养菌液2，将各个寡营养菌液2分别接种至NH3选择性培养基和H2S选择性培养基中培养3～5d，直至培养基混浊为止，将其在LB培养基上进行扩增划线保存，即得驯化后的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和黑曲霉。
本发明得到的含有枯草芽孢杆菌ACCC 60383、地衣芽孢杆菌ACCC 19941和黑曲霉ACCC32504的复合菌剂，在寡营养状态下，具有高效降解纤维素兼去除臭味气体的效果。
本发明还提供了上述复合菌剂或上述制备方法得到的复合菌剂在降解纤维素和/或去除臭味气体中的应用。
本发明还提供了上述复合菌剂或上述制备方法得到的复合菌剂在制备生物有机物料中的应用。
在本发明中，所述生物有机物料优选的包括生物有机肥，所述生物有机肥的制备方法，优选的包括如下步骤：
用所述复合菌剂与水混合得到复合菌液，将复合菌液喷洒在秸秆和粪肥混合后的混合物中进行发酵，发酵温度升至50℃以上时，开始翻堆，之后每隔一天翻堆，直至温度下降到35～45℃，即得生物有机肥。在本发明中，所述复合菌剂与水的质量体积比优选为1:190～210g/mL，所述秸秆和粪肥的质量比优选为1:1～3，所述的秸秆可为小麦秸秆、玉米秸秆、甘蔗秸秆、油菜秸秆、大豆秸秆、水稻秸秆中的一种或多种，所述粪肥为畜禽粪便，如猪、牛、羊、马、鸡、鸭、鹅等粪便。
本发明利用上述复合菌剂制备生物有机肥，腐熟1周后对臭味气体(NH3、H2S)的去除率均达到75％以上，腐熟5天温度即可达到58℃以上且能够持续15d，最高温度为65.0℃，本发明的复合菌剂促进粪便或秸秆的快速腐熟。
本发明还提供了上述生物有机肥在促进植物生长和/或防治根腐病中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
在以下的实施例中涉及的培养基如下：
LB培养基：蛋白胨20g、酵母提取物10g、NaCl 20g、琼脂20g、去离子水1000mL，121℃灭菌30min；
刚果红培养基：NaNO35g、Na2HPO32g、KH2PO32g、MgSO41g、KCl 1g、酸水解酪蛋白1g、刚果红0.44g、纤维素粉10g、琼脂20g、去离子水1000mL，121℃灭菌30min；
NH3选择性培养基：蔗糖50.0g、氨水10.0mL、KH2PO42.0g、NaCl 2.0g、MgSO4·7H2O0.5g、FeSO40.1g、1％ZnSO45.0mL、蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min。
H2S选择性培养基：葡萄糖5.0g、K2HPO40.5g、KNO31.0g、MgCl20.5g、NaCl 0.5g、NH4Cl 0.5g、Na2CO31.0g、FeCl20.01g、蒸馏水1000mL、PH自然，121℃灭菌20min。
PDA培养基：去皮的马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL、pH自然，121℃灭菌20min；固体：加入20g琼脂。
实施例1
一种纤维素降解兼臭味气体去除复合菌剂，由如下质量份的成分组成，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ACCC 60383 40份、地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis ACCC19941 40份、黑曲霉Aspergillus ACCC 32504 30份。
上述复合菌剂的制备方法，具体步骤如下：
(1)枯草芽孢杆菌ACCC60383、地衣芽孢杆菌ACCC19941和黑曲霉ACCC32504驯化培养：
以稀释100倍的LB液体培养基作为寡营养细菌培养基，将枯草芽孢杆菌ACCC60383或地衣芽孢杆菌ACCC19941分别接种至寡营养细菌培养基；培养48h后，将枯草芽孢杆菌ACCC 60383或地衣芽孢杆菌ACCC19941寡营养菌液接种涂布至稀释100倍的刚果红培养基中培养，用接种环刮取水解圈菌落接种至寡营养细菌培养基；培养48h后，将枯草芽孢杆菌ACCC 60383寡或地衣芽孢杆菌ACCC19941营养菌液分别接种至稀释100倍的NH3选择性培养基和H2S选择性培养基中培养4d，直至培养基混浊为止，将其在LB培养基上进行扩增划线保存，即得驯化后的枯草芽孢杆菌ACCC60383菌株和驯化后的地衣芽孢杆菌ACCC19941菌株；
以稀释100倍的PDA液体培养基作为寡营养真菌培养基，将黑曲霉ACCC32504接种至寡营养真菌培养基；培养48h后，将黑曲霉ACCC32504寡营养菌液接种涂布至稀释100倍的刚果红培养基中培养，用接种环刮取水解圈菌落接种至寡营养真菌培养基；培养48h后，将黑曲霉ACCC32504寡营养菌液分别接种至稀释100倍的NH3选择性培养基和H2S选择性培养基中培养4d，直至培养基混浊为止，将其在PDA培养基上进行扩增划线保存，即得驯化后的黑曲霉ACCC32504菌株；
(2)枯草芽孢杆菌菌粉和地衣芽孢杆菌菌粉的制备：
将枯草芽孢杆菌ACCC 60383和地衣芽孢杆菌ACCC 19941分别转接到LB培养基试管斜面，于37℃培养24h；用接菌环刮取菌落，接种于LB液体培养基中，与180r/min、37℃震荡培养24h，得到枯草芽孢杆菌ACCC 60383种子液1和地衣芽孢杆菌ACCC 19941种子液1；将枯草芽孢杆菌ACCC 60383种子液1和地衣芽孢杆菌ACCC 19941种子液1分别以5％的接种量接入LB液体培养基的发酵罐中，37℃培养24h，其中，所述种子罐体积为10L，装液量7L，搅拌转速200r/min，通风量7L/min；将枯草芽孢杆菌ACCC 60383种子液2和地衣芽孢杆菌ACCC19941种子液2分别以5％的接种量转接入发酵培养基，发酵培养36h，发酵过程中控制温度33～42℃，含水量45～50％；发酵结束后，培养物于45℃烘干，粉碎过90目筛，即为枯草芽孢杆菌菌粉和地衣芽孢杆菌菌粉，活菌含量为2×1010cfu/g。
固态发酵培养采用55cm×100cm的不锈钢浅盘，发酵培养基的配方质量比为麸皮：小麦秸秆粉：Ca(OH)2＝50:49:1，加水调整初始含水量55％。将培养基于121℃灭菌30min，冷却后平铺在预灭菌的浅盘中，料层厚度4cm。
(3)黑曲霉菌粉的制备
将黑曲霉ACCC 32504转接入PDA培养基试管斜面，于27℃培养72h进行活化；用接种环刮取菌落，接种于PDA液体培养基中，于180r/min、27℃震荡培养48h，得到黑曲霉种子液1；将黑曲霉种子液1以5％的接种量转接入含PDA液体培养基的发酵罐中，27℃培养36h，其中，所述发酵罐体积为10L，装液量为7L，搅拌转速200r/min，通风量为7L/min。将黑曲霉种子液2以8％的接种量转接入固体培养基，发酵培养72h；发酵过程中控制品温28～32℃。发酵结束后，培养物于40℃烘干，粉碎过90目筛，即为黑曲霉菌粉，活菌含量为2.0×1010cfu/g。
黑曲霉固态发酵培养采用55cm×100cm的不锈钢浅盘。发酵培养基的配方质量比为麸皮：玉米粉：小麦秸秆粉：MnSO4：ZnSO4＝40:10:49.8:0.1:0.1，加水调整初始含水量50％。将培养基于121℃灭菌30min，冷却后平铺在预灭菌的浅盘中，料层厚度4cm。
(4)将枯草芽孢杆菌菌粉40份、地衣芽孢杆菌菌粉40份、黑曲霉菌粉30份混合均匀，即为复合菌剂。
实施例2
一种纤维素降解兼臭味气体去除复合菌剂，由如下质量份的成分组成，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ACCC 60383 35份、地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis ACCC19941 45份、黑曲霉Aspergillus ACCC 32504 20份。
上述复合菌剂的制备方法，具体步骤如下：
(1)枯草芽孢杆菌ACCC60383、地衣芽孢杆菌ACCC19941和黑曲霉ACCC32504驯化培养：
以稀释100倍的LB液体培养基作为寡营养细菌培养基，将枯草芽孢杆菌ACCC60383或地衣芽孢杆菌ACCC19941分别接种至寡营养细菌培养基；培养44h后，将枯草芽孢杆菌ACCC 60383或地衣芽孢杆菌ACCC19941寡营养菌液接种涂布至稀释100倍的刚果红培养基中培养，用接种环刮取水解圈菌落接种至寡营养细菌培养基；培养44h后，将枯草芽孢杆菌ACCC 60383寡或地衣芽孢杆菌ACCC19941营养菌液分别接种至稀释100倍的NH3选择性培养基和H2S选择性培养基中培养5d，直至培养基混浊为止，将其在LB培养基上进行扩增划线保存，即得驯化后的枯草芽孢杆菌ACCC60383菌株和驯化后的地衣芽孢杆菌ACCC19941菌株；
以稀释100倍的PDA液体培养基作为寡营养真菌培养基，将黑曲霉ACCC32504接种至寡营养真菌培养基；培养44h后，将黑曲霉ACCC32504寡营养菌液接种涂布至稀释100倍的刚果红培养基中培养，用接种环刮取水解圈菌落接种至寡营养真菌培养基；培养44h后，将黑曲霉ACCC32504寡营养菌液分别接种至稀释100倍的NH3选择性培养基和H2S选择性培养基中培养5d，直至培养基混浊为止，将其在PDA培养基上进行扩增划线保存，即得驯化后的黑曲霉ACCC32504菌株；
(2)枯草芽孢杆菌菌粉和地衣芽孢杆菌菌粉的制备：
将枯草芽孢杆菌ACCC 60383和地衣芽孢杆菌ACCC 19941分别转接到LB培养基试管斜面，于40℃培养20h；用接菌环刮取菌落，接种于LB液体培养基中，与150r/min、40℃震荡培养20h，得到枯草芽孢杆菌ACCC 60383种子液1和地衣芽孢杆菌ACCC 19941种子液1；将枯草芽孢杆菌ACCC 60383种子液1和地衣芽孢杆菌ACCC 19941种子液1分别以3％的接种量接入LB液体培养基的发酵罐中，40℃培养20h，其中，所述种子罐体积为10L，装液量7L，搅拌转速180r/min，通风量10L/min；将枯草芽孢杆菌ACCC 60383种子液2和地衣芽孢杆菌ACCC19941种子液2分别以3％的接种量转接入发酵培养基，发酵培养30h，发酵过程中控制温度33～42℃，含水量45～50％；发酵结束后，培养物于45℃烘干，粉碎过80目筛，即为枯草芽孢杆菌菌粉和地衣芽孢杆菌菌粉，活菌含量为1×1010cfu/g。
固态发酵培养采用55cm×100cm的不锈钢浅盘，发酵培养基的配方质量比为麸皮：小麦秸秆粉：Ca(OH)2＝45:45:1.5，加水调整初始含水量50％。将培养基于121℃灭菌30min，冷却后平铺在预灭菌的浅盘中，料层厚度4cm。
(3)黑曲霉菌粉的制备
将黑曲霉ACCC 32504转接入PDA培养基试管斜面，于25℃培养74h进行活化；用接种环刮取菌落，接种于PDA液体培养基中，于180r/min、25℃震荡培养52h，得到黑曲霉种子液1；将黑曲霉种子液1以3％的接种量转接入含PDA液体培养基的发酵罐中，25℃培养40h，其中，所述发酵罐体积为10L，装液量为7L，搅拌转速180r/min，通风量为10L/min。将黑曲霉种子液2以6％的接种量转接入固体培养基，发酵培养75h；发酵过程中控制品温28～32℃。发酵结束后，培养物于40℃烘干，粉碎过80目筛，即为黑曲霉菌粉，活菌含量为1.0×1010cfu/g。
黑曲霉固态发酵培养采用55cm×100cm的不锈钢浅盘。发酵培养基的配方质量比为麸皮：玉米粉：小麦秸秆粉：MnSO4：ZnSO4＝35:5:45:0.05:0.05，加水调整初始含水量50％。将培养基于121℃灭菌30min，冷却后平铺在预灭菌的浅盘中，料层厚度4cm。
(4)将枯草芽孢杆菌菌粉35份、地衣芽孢杆菌菌粉45份、黑曲霉菌粉20份混合均匀，即为复合菌剂。
实施例3
一种纤维素降解兼臭味气体去除复合菌剂，由如下质量份的成分组成，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ACCC 60383 45份、地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis ACCC19941 35份、黑曲霉Aspergillus ACCC 32504 10份。
上述复合菌剂的制备方法，具体步骤如下：
(1)枯草芽孢杆菌ACCC60383、地衣芽孢杆菌ACCC19941和黑曲霉ACCC32504驯化培养：
以稀释100倍的LB液体培养基作为寡营养细菌培养基，将枯草芽孢杆菌ACCC60383或地衣芽孢杆菌ACCC19941分别接种至寡营养细菌培养基；培养52h后，将枯草芽孢杆菌ACCC 60383或地衣芽孢杆菌ACCC19941寡营养菌液接种涂布至稀释100倍的刚果红培养基中培养，用接种环刮取水解圈菌落接种至寡营养细菌培养基；培养52h后，将枯草芽孢杆菌ACCC 60383寡或地衣芽孢杆菌ACCC19941营养菌液分别接种至稀释100倍的NH3选择性培养基和H2S选择性培养基中培养3d，直至培养基混浊为止，将其在LB培养基上进行扩增划线保存，即得驯化后的枯草芽孢杆菌ACCC60383菌株和驯化后的地衣芽孢杆菌ACCC19941菌株；
以稀释100倍的PDA液体培养基作为寡营养真菌培养基，将黑曲霉ACCC32504接种至寡营养真菌培养基；培养52h后，将黑曲霉ACCC32504寡营养菌液接种涂布至稀释100倍的刚果红培养基中培养，用接种环刮取水解圈菌落接种至寡营养真菌培养基；培养52h后，将黑曲霉ACCC32504寡营养菌液分别接种至稀释100倍的NH3选择性培养基和H2S选择性培养基中培养3d，直至培养基混浊为止，将其在PDA培养基上进行扩增划线保存，即得驯化后的黑曲霉ACCC32504菌株；
(2)枯草芽孢杆菌菌粉和地衣芽孢杆菌菌粉的制备：
将枯草芽孢杆菌ACCC 60383和地衣芽孢杆菌ACCC 19941分别转接到LB培养基试管斜面，于35℃培养28h；用接菌环刮取菌落，接种于LB液体培养基中，与200r/min、35℃震荡培养28h，得到枯草芽孢杆菌ACCC 60383种子液1和地衣芽孢杆菌ACCC 19941种子液1；将枯草芽孢杆菌ACCC 60383种子液1和地衣芽孢杆菌ACCC 19941种子液1分别以7％的接种量接入LB液体培养基的发酵罐中，35℃培养28h，其中，所述种子罐体积为10L，装液量7L，搅拌转速220r/min，通风量5L/min；将枯草芽孢杆菌ACCC 60383种子液2和地衣芽孢杆菌ACCC19941种子液2分别以7％的接种量转接入发酵培养基，发酵培养40h，发酵过程中控制温度33～42℃，含水量45～50％；发酵结束后，培养物于45℃烘干，粉碎过100目筛，即为枯草芽孢杆菌菌粉和地衣芽孢杆菌菌粉，活菌含量为3×1010cfu/g。
固态发酵培养采用55cm×100cm的不锈钢浅盘，发酵培养基的配方质量比为麸皮：小麦秸秆粉：Ca(OH)2＝55:55:0.5，加水调整初始含水量60％。将培养基于121℃灭菌30min，冷却后平铺在预灭菌的浅盘中，料层厚度4cm。
(3)黑曲霉菌粉的制备
将黑曲霉ACCC 32504转接入PDA培养基试管斜面，于30℃培养70h进行活化；用接种环刮取菌落，接种于PDA液体培养基中，于220r/min、30℃震荡培养44h，得到黑曲霉种子液1；将黑曲霉种子液1以7％的接种量转接入含PDA液体培养基的发酵罐中，30℃培养32h，其中，所述发酵罐体积为10L，装液量为7L，搅拌转速220r/min，通风量为5L/min。将黑曲霉种子液2以11％的接种量转接入固体培养基，发酵培养70h；发酵过程中控制品温28～32℃。发酵结束后，培养物于40℃烘干，粉碎过100目筛，即为黑曲霉菌粉，活菌含量为3.0×1010cfu/g。
黑曲霉固态发酵培养采用55cm×100cm的不锈钢浅盘。发酵培养基的配方质量比为麸皮：玉米粉：小麦秸秆粉：MnSO4：ZnSO4＝45:15:55:0.15:0.15，加水调整初始含水量50％。将培养基于121℃灭菌30min，冷却后平铺在预灭菌的浅盘中，料层厚度4cm。
(4)将枯草芽孢杆菌菌粉45份、地衣芽孢杆菌菌粉35份、黑曲霉菌粉10份混合均匀，即为复合菌剂。
实施例4
实施例1制得的复合菌剂对作物秸秆无害化处理的腐熟检测
为考察本发明的复合菌剂对小麦等作物秸秆的腐解效果，在山东省德州市赵虎镇大吴村进行了腐熟试验。实验方法参照中华人民共和国农业行业标准NY/T2012-2015《秸秆腐熟菌剂腐解效果评价技术规程》进行。
处理1：称取本实施例1制得的复合菌剂和尿素，用水稀释50倍后浸润小麦秸秆；复合菌剂用量为秸秆重量的0.1％，尿素用量为秸秆重量的0.5％；充分浸润后，均匀撒施于本处理大田地表；
处理2试验方法与处理1不同之处在于仅使用含枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)ACCC 60383，即处理2中的菌剂中只含枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ACCC60383菌粉，其余方法与处理1相同。
CK试验方法同处理1，但不添加任何多功能寡营养复配腐熟菌剂。
表1添加复配菌剂、单一菌剂与不添加菌剂对秸秆感官影响
从表1可以看出：添加复配菌剂的秸秆颜色最先变黑，最先达到腐烂程度，而未添加菌剂或只加入单一菌剂的秸秆在各项感官程度中均表现缓慢。
实施例5
实施例1制得的复合菌剂对对畜禽粪便无害化处理的腐熟检测
1)利用实施例1制得的复合菌剂制备生物有机肥的方法
将80吨猪粪与40吨秸秆进行混合，混合后平均分成2堆，每堆60吨，堆成2米宽1.5米高，分别作为处理组和对照组，3次重复，其中CK组进行自然腐熟，处理组添加实施例1的复合菌剂进行腐熟，具体方法为：将1kg多功能寡营养复配腐熟菌剂均匀溶解在200L水中，使用喷枪将200L菌液均匀喷洒到粪肥中，喷洒过程中使用翻拋车对肥体进行多次翻拋，保证多功能寡营养复配腐熟菌剂均匀分散到堆肥中，在发酵过程中，温度升至50℃以上时，开始翻堆，之后每隔一天翻堆1次，直至温度下降到40℃左右时，结束发酵。
2)实验方法
(1)腐熟过程中粪肥恶臭气体(NH3、H2S)测定：在堆体上方和堆体前、后、左、右分别放置装有硼酸与锌胺络盐吸收液500mL烧杯各一只，每24h更换一次溶液，以2％硼酸吸收NH3，采用锌胺络盐吸收液吸收H2S，并检测NH3、H2S浓度；
(2)含水率检测：含水率的测定参照GB/T8576-2010《复合肥料中游离水含量的测定》；
(3)堆肥温度跟踪检测：试验开始每日检测堆肥肥体上层、中层和下层温度，并记录；
(4)pH值检测：参照中华人民共和国农业行业标准NY525-2012，准确称量粪肥样品10克，并用90mL PBS溶液进行溶解，并用pH酸度计测定样品pH值；
(5)有机碳含量检测：参照中华人民共和国农业行业标准NY525-2012，采用重铬酸钾容量法测定粪肥样品中的有机质含量；
(6)氮磷钾检测：参照中华人民共和国农业行业标准NY525-2012，将粪肥样品采用硫酸过氧化氢消煮，采用硼酸溶液吸收碱化蒸馏出来的氨，再用标准酸溶液滴定测定样品中氮含量；在一定酸度下，采用分光光度法测定样品中磷的含量；采用火焰光度法测定样品中钾的含量；
(7)种子发芽指数检测：参照国标GBT23486-2009，取20g鲜样，加入200mL蒸馏水，振荡20min，30℃下浸提1昼夜，上清液用慢速滤纸过滤，滤液待用；在9cm培养皿内铺入相应大小的滤纸一张，均匀放进20粒颗粒饱满大小接近的小青菜种子，用移液管取5.0mL堆肥浸提液于培养皿，并以蒸馏水作对照实验，每个处理作3次重复；将培养皿放置在(25±1)℃、80％湿度培养箱中培养24h；测种子发芽指数，并计算GI；若GI达到50％，则可认为堆肥基本腐熟，若GI达到80％～85％，则可认为堆肥已腐熟。
猪粪秸秆堆体腐熟过程中堆体NH3、H2S臭味气体释放量如图1和图2，腐熟过程中堆体温度的变化情况如图3，腐熟前后的指标变化情况如表2。
表2猪粪秸秆堆体腐熟前后指标变化
如图1和图2所示，添加多功能寡营养复配腐熟菌剂的处理组腐熟1周后对臭味气体(NH3、H2S)的去除率均达到75％以上；如图3所示，腐熟5天处理组温度即可达到58℃以上且能够持续15d，最高温度为65.0℃，而对照组腐熟5天温度达到50℃以上持续9天，最高温度为53.4℃，这表明处理组可提高堆温，提前和延长高温期，加快堆肥进程；如表2所示，腐熟过程中处理组氮含量波动较小，而对照组氮含量波动较大；处理组磷含量缓慢上升，而对照组先下降后上升；腐熟初期，处理组和对照组中钾含量均呈上升的趋势，腐熟后期，处理组钾含量为3.05g/kg，而对照组钾含量为2.89g/kg；4周后，处理组pH为7.43，C/N为19.73，种子发芽指数(GI)＞80％，而对照组C/N＞20，种子发芽指数(GI)＞50％，这说明处理组已达到完全腐熟获得微生物有机肥而对照组刚达到腐熟标准。
实施例6
生物有机肥在番茄盆栽促生防病中的应用
供试品种：小番茄幼苗。
供试肥料：根腐病发病土壤、实施例5中制备的生物有机肥和常规化肥(N∶P2O5∶K2O＝15∶15∶15)。
试验处理：
处理组1：在根腐病土壤中施加实施例5中制备的生物有机肥；
处理组2：在根腐病土壤中施加灭活后实施例5中制备的生物有机肥；
处理组3：在根腐病土壤中施加常规化肥；
对照组(CK)：只施加根腐病土壤。
试验所用花盆规格为长40cm、宽19.6cm、高15cm，装土4kg。
盆栽试验中，分别将处理1、处理组2和处理组3三组按照肥料与土壤质量百分比1％，每盆定植10株小番茄幼苗。混匀后，其他措施同常规管理。在植株长成后，测量并计算根系的生长长度，调查并记录植株生长状况及病情指数，计算防治效果。
表3生物有机肥对番茄植物学性状的影响及对根腐病的防治效果
试验结果如表3所示，在根腐病土壤中施加实施例5中制备的生物有机肥的番茄幼苗生长最快，发病率低。
结果表明，应用本发明复合菌剂制备的生物有机肥能够有效地促进植物根系生长茎基粗壮，单果净增明显，预防根腐病的发生。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种纤维素降解兼臭味气体去除复合菌剂，其特征在于，由如下质量份的成分组成，枯草芽孢杆菌35~45份、地衣芽孢杆菌35~45份、黑曲霉10~30份；
所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis ACCC 60383；所述地衣芽孢杆菌为Bacillus licheniformis ACCC 19941；所述黑曲霉为Aspergillus ACCC 32504；
所述复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
将所述枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和黑曲霉分别进行活化培养、种子培养后，进行固态发酵培养，干燥、粉碎，得到枯草芽孢杆菌菌粉、地衣芽孢杆菌菌粉和黑曲霉菌粉，混合后，制得纤维素降解兼臭味气体去除复合菌剂；
所述枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的发酵培养基包括如下质量份的成分：麸皮45~55份，小麦秸秆粉45~55份，Ca(OH)2 0.5~1.5份；所述黑曲霉的发酵培养基包括如下质量份的成分：麸皮35~45份，玉米粉5~15份，小麦秸秆粉45~55份，MnSO4 0.05~0.15份，ZnSO4 0.05~0.15份；
当枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌发酵时，发酵初始含水量为50~60%，发酵过程中的含水量为45~50%，发酵温度为33~42℃，发酵时间为30~40h；当黑曲霉发酵时，发酵初始含水量为45~55%，发酵过程中的含水量为40~50%，发酵温度为28~32℃，发酵时间为70~75h。
2.根据权利要求1所述复合菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将所述枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和黑曲霉分别进行活化培养、种子培养后，进行固态发酵培养，干燥、粉碎，得到枯草芽孢杆菌菌粉、地衣芽孢杆菌菌粉和黑曲霉菌粉，混合后，制得纤维素降解兼臭味气体去除复合菌剂；
所述枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的发酵培养基包括如下质量份的成分：麸皮45~55份，小麦秸秆粉45~55份，Ca(OH)2 0.5~1.5份；所述黑曲霉的发酵培养基包括如下质量份的成分：麸皮35~45份，玉米粉5~15份，小麦秸秆粉45~55份，MnSO4 0.05~0.15份，ZnSO4 0.05~0.15份；
当枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌发酵时，发酵初始含水量为50~60%，发酵过程中的含水量为45~50%，发酵温度为33~42℃，发酵时间为30~40h；当黑曲霉发酵时，发酵初始含水量为45~55%，发酵过程中的含水量为40~50%，发酵温度为28~32℃，发酵时间为70~75h。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在所述枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和黑曲霉分别进行活化培养前，还包括对枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和黑曲霉驯化培养过程。
4.根据权利要求1所述复合菌剂或权利要求2或3所述制备方法得到的复合菌剂在降解纤维素和/或去除臭味气体中的应用。
5.根据权利要求1所述复合菌剂或权利要求2或3所述制备方法得到的复合菌剂在制备生物有机物料中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述生物有机物料包括生物有机肥；所述生物有机肥的制备方法，包括如下步骤：
用所述复合菌剂与水混合得到复合菌液，将复合菌液喷洒在秸秆和粪肥混合后的混合物中后进行发酵，发酵温度升至50℃以上时，开始翻堆，之后每隔一天翻堆，直至温度下降到35~45℃，即得生物有机肥。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述秸秆和粪肥的质量比为1:1~3；所述复合菌剂与水的质量体积比为1:190~210。
8.根据权利要求6所述生物有机肥在促进植物生长和/或防治根腐病中的应用。
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