CN101665775B - 一株纤维素降解菌株lcd51 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种纤维素降解微生物。一株纤维素降解菌株LCD51，其特征在于：所述的菌株为水氏黄杆菌(Flavobacterium mizutaii)LCD51 CCTCC NO：M 209100。菌落形态为：菌落呈橘红色、不透明、圆形、表面光滑，中心凸出、边缘整齐；生理特征：细菌呈规则的直杆状，单个或成对排列，常呈V形排列，革兰氏阴性，运动，兼性厌氧，不产生氧化酶和接触酶；最适生长pH值：6.5～7.5，最适生长温度：25～35℃。本发明有良好的去除畜禽养殖废水中纤维素的能力。

Description

一株纤维素降解菌株LCD51

技术领域

本发明涉及一种纤维素降解微生物。 

背景技术

纤维素是自然界中最丰富的碳水化合物，是一类可再生的重要资源和能源。纤维素不溶于水，在环境中结构稳定、难降解，并广泛存在于农作物秸秆、城市固体废物、畜禽养殖废弃物和造纸废水中，是难降解污染物之一。目前，从环境中分离和选育纤维素酶高产菌株，挖掘纤维素酶产生菌的资源，利用微生物的酶解作用，解决环境污染问题，甚至转化为能源已成为国内外研究热点之一。 

发明内容

本发明的目的在于提供一株纤维素降解菌株LCD51，它能去除畜禽养殖废水中的纤维素。 

本发明所提供的一株纤维素降解菌株LCD51，为水氏黄杆菌(Flavobacterium mizutaii)LCD51 CCTCC NO：M 209100，已于2009年5月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号：CCTCC NO：M 209100。 

菌株LCD51的菌落形态为：菌落呈橘红色、不透明、圆形、表面光滑，中心凸出、边缘整齐；生理特征：细菌呈规则的直杆状，单个或成对排列，常呈V形排列，革兰氏阴性，运动，兼性厌氧，不产生氧化酶和接触酶；最适生长pH值：6.5～7.5，最适生长温度：25～35℃。 

所述的畜禽主要有猪、牛、羊、驴、兔、鸡、鸭、鹅等。 

本发明的有益效果是：从畜禽养殖场排污口的池底污泥中(取自湖北省鄂州市市郊某种猪养殖场排污口的池底污泥)筛选到一株在纤维素条件下具有一定生长能力的新菌株。一株纤维素降解菌株LCD51有良好的去除畜禽养殖废水中纤维素的能力，该菌株能在72小时之内去除废水中的纤维素21-28mg/L。 

附图说明

图1是纤维素降解菌株LCD51的PCR产物琼脂糖电泳图(1：核DNA，2：扩增产物，3：Marker)。 

图2是纤维素降解菌株LCD51的电镜图片。 

图3是纤维素降解菌株LCD51的纤维素酶活数据图。 

具体实施方式

一、一株纤维素降解菌株LCD51的筛选方法： 

(一)、材料准备： 

1、实验废水和池底污泥取自湖北省鄂州市市郊某种猪养殖场排污口。 

2、培养基： 

筛选培养基(g/L)：Na₂HPO₄ 3.0，NH₄NO₃ 0.8，MgSO₄·7H₂O 0.1，CaCl₂ 0.1，CMC-Na 2.0，微晶纤维素粉1.0，滤纸2.0，稻草2.0，pH值7.0～7.2。 

产酶培养基(g/L)：Na₂HPO₄ 3.0，NH₄NO₃ 0.8，MgSO₄·7H₂O 0.5，CaCl₂ 0.5，FeSO₄·7H₂O0.01，MnSO₄·H₂O 0.01，ZnSO₄ 0.01，CMC-Na 10.0(或微晶纤维素粉5.0或纤维二糖5.0)，蛋白胨1.0，酵母提取物0.5，pH值7.0～7.2。 

LB液体培养基(g/L)为：蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0。 

LB固体培养基(g/L)为：蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10.0g，蒸馏水1000mL，琼脂15g，pH7.0。 

LB斜面培养基(g/L)为：蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10.0g，蒸馏水1000mL，琼脂20g(固)，pH7.0。 

3、实验仪器和设备： 

国华SHA-B恒温振荡器， 

SHH150G光照生物培养箱， 

卧式压力蒸汽灭菌器------上海医用核子仪器厂， 

光学显微镜-----Olympus有限公司， 

pH计等-----Hana有限公司， 

超净工作台， 

鼓风干燥箱， 

KYKY-1000B扫描电子显微镜， 

PTC200型PCR仪， 

电泳仪及电泳槽， 

UVP凝胶紫外观测仪， 

微量生化鉴定管购自杭州微生物试剂厂，DNA提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒购自美国Promega公司、Taq酶、dNTP、DNAMarker、Rnase酶均购自日本Takara公司。 

(二)、菌株的筛选分离与纯化： 

1)、初筛：①称取1克畜禽养殖场排污口的池底污泥样品(样品为池底污泥，取自湖北省鄂州市市郊某种猪养殖场排污口)，用20mL无菌水水洗，8000rpm离心5min，弃上清，再加20mL水，重悬土样；重悬后再加20mL水离心(8000rpm离心5min)，弃上清，重悬土样，此步骤重复操作3次，得到泥水混合物，备用； 

②将泥水混合物转入装有100mL筛选培养基的500mL锥形瓶中，30℃恒温静至培养至培养基浑浊，得到菌悬液A； 

③取5mL菌悬液A于装100mL新鲜的筛选培养基的500mL锥形瓶中培养一周；将培养一周后的菌悬液取5mL于装100mL新鲜的筛选培养基的500mL锥形瓶中培养一周，重复操作5-6次，最后得到的菌悬液B； 

④将最后得到的菌悬液B中取20μL于LB平板上涂布；置30℃下恒温培养1-3天，挑取长势良好、菌落形态各不相同的菌落，经2-5次纯化后{纯化：用无菌的接种环取培养物(LB平板上的菌落)少许在平板上进行划线；当接种环在LB固体培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落，即得到纯化后的单菌落}，得到待鉴定的菌落，保种备用。 

2)、二次筛选：将待鉴定的菌落经前培养后在LB液体培养基中隔夜培养后，点种到筛选培养基平板上，30℃恒温培养2～4d，往培养皿中加入30mL的1mg/mL的刚果红溶液，染色1h，弃去染液，加入50mL的1mol/L的NaCl溶液，洗涤1h，若菌落的周围会出现清晰的透明圈，说明细菌产生纤维素酶，依据透明圈的直径大小选择直径大的产酶菌株。 

用接种针挑取直径大的产酶菌株(在菌落特征上有明显差异的单菌)，对挑取的产酶菌株在LB平板上进行划线培养，直至获得单一菌株，并于LB斜面培养基上划线保种，得到一株菌株LCD51，即纤维素降解菌株LCD51。 

二、纤维素降解菌株LCD51的鉴定： 

1、对纤维素降解菌株LCD51的鉴定： 

对纤维素降解菌株LCD51进行了生理生化的鉴定以及16S rRNA分子的鉴定，从分子水平确定纤维素降解菌株的种属。 

16SrRNA序列分析主要按照以下步骤： 

1)提取细菌核DNA， 

a)集菌：用高压灭菌的牙签挑单菌落接种于LB液体培养基管内培养18小时，取其菌悬液1mL于1.5mL的离心管中8000rpm离心5min，弃上清液。 

b)加STE缓冲液1mL洗一次，振荡重悬细菌，8000rpm离心5min，弃上清液。 

c)加600μL TE缓冲液，剧烈振荡重悬细菌，加入10％的SDS 65μL，65℃水浴5-10min。 

d)加等体积酚氯仿抽提三次。 

e)小心吸取上清液，加入等体积的异丙醇和1/10体积的3MNaAc，12000rpm离心10min。彻底弃上清。 

f)DNA沉淀用70％乙醇洗一次，风干后溶于20μL TE缓冲液备用。 

TE缓冲液：10mmol/L Tris-Cl(pH8.0)；1mmol/L EDTA-Na2(pH8.0)， 

STE缓冲液：0.1mol/L NaCl 10mmol/L Tris-Cl(pH8.0) 1mmol/L EDTA 

           (pH8.0)， 

2)16S rRNA基因的PCR扩增， 

PCR扩增引物参照Weisburg等人的方法合成。 

P1：正向引物5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’ 

P2：反向引物5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’ 

在50μL反应体积中，加入1μL模板DNA(0.1μg)，0.5μL P1和P2(终浓度为0.5μM)，1μLdNTP(每种NTP0.2mM)，0.5μLTaq聚合酶(2U)和5μL 10×PCR缓冲液。PCR扩增条件为：94℃预变性5min；在94℃变性30s，61-65℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；最后72℃终延伸10min。 

3)PCR产物的回收 

将PCR产物以1％琼脂糖凝胶进行电泳后，在紫外灯下切取含欲回收片段的凝胶，放入1.5mL离心管中加2倍体积TE，65℃水浴10分钟后加等体积水饱和酚抽提一次离心后取上层水相再用酚-氯仿-异戊醇抽提一次，收集上清加0.1倍体积的10mol/L乙酸铵和2倍体积无水乙醇沉淀，离心，用70％乙醇洗沉淀一次，风干后溶于适量灭菌双蒸水。 

4)16S rDNA的全序列测定和分析 

PCR测序用正反向引物参照Hiraishi等人方法合成。 

P-f：CACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC； 

P-r：GGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC。 

加入1μL模板DNA(＜0.1μg)，PCR扩增30个循环(94℃ 1min，55℃ 30s，72℃2min)。采用ABI PRISM测序试剂盒中染料终止剂终止反应。然后，在Applied Biosystem 373A DNA测序仪上测序。测得的16S rDNA序列采用BLAST软件与GenBank数据库比较分析，最终从分子水平上确定该菌的种属。 

2、16S rRNA序列测定： 

本发明采用对16SrRNA序列测定和分析的方法对细菌进行分子水平的鉴定。以细菌的核DNA为模板，以16S rRNA基因的PCR扩增的通用引物为引物，进行PCR扩增，得到长度为1421bp的扩增带(用1％琼脂糖凝胶电泳检测)，如图1所示。PCR产物经纯化后，测定其全序列。 

<110>中国地质大学(武汉) 

<120>一株纤维素降解菌株LCD51 

<160>1421 

<210>1 

<211>1421bp 

<212>DNA 

<213>水氏黄杆菌(Flavobacterium mizutaii) 

<400>1 

AGCGGCAGGC CTAATACATG CAAGTCGGAC GGGATCCATC GGTAGCTTGC TACCGATGGT    60 

GAGAGTGGCG CACGGGTGCG TAACGCGTGA GCAACCTACC CATATCAGGG GGATAGCCCG    120 

AAGAAATTCG GATTAACACC GCATGACACT GCTTTCCGGC ATCGGGAGGT GGTCAAATAT    180 

TCATAGGATA TGGATGGGCT CGCGTGACGT TAGCTAGTTG GTGGGGTAAC GGCCCACCAA    240 

GGCGACGATG TCTAGGGGCT CTGAGAGGAG AATCCCCCAC ACTGGTACTG AGACAGGAAC    300 

CAGACTCCTA CGGGAGGCAG CAGTAAGGAA TATTGGTCAA TGGGGGCAAC CCTGAACCAA    360 

CCATGCCGCG TGCAGGACGA CTGCCCTATG GGTTGTAAAC TGCTTTTGTT AGGGAATAAA    420 

CCCCGCTACG TGTAGCGGGC TGAATGTACC TAAAGAATAA GGATCGGCTA ACTCCGTGCC    480 

AGCAGCCGCG GTAATACGGA GGATCCGAGC GTTATCCGGA TTTATTGGGT TTAAAGGGTG    540 

CGTAGGCGGC ACTTTAAGTC AGGGGTGAAA TACGGCAGCT CAACTGTCGC AGTGCCCTTG    600 

ATACTGAAGT GCTTGAATGC GGTTGAAGAC GGCGGAATGA GACAAGTAGC GGTGAAATGC    660 

ATAGATATGT CTCAGAACAC CGATTGCGAA GGCAGCTGTC TAAGCCGTTA TTGACGCTGA    720 

TGCACGAAAG CGTGGGGATC GAACAGGATT AGATACCCTG GTAGTCCACG CCCTAAACGA    780 

TGATGACTCG ATGTTTGCGA TATACCGTAA GCGTCCAAGC GAAAGCGTTA AGTCATCCAC    840 

CTGGGGAGTA CGCCCGCAAG GGTGAAACTC AAAGGAATTG ACGGGGGCCC GCACAAGCGG    900 

AGGAGCATGT GGTTTAATTC GATGATACGC GAGGAACCTT ACCCGGGCTT GAAAGTTACT    960 

GAAGGGCGCA GAGACGCGCC CGTCCTTCGG GACAGGAAAC TAGGTGCTGC ATGGCTGTCG    1020 

TCAGCTCGTG CCGTGAGGTG TTGGGTTAAG TCCCGCAACG AGCGCAACCC CTATGTTTAG    1080 

TTGCCAGCAC GTCAAGGTGG GGACTCTAAA CAGACTGCCT GCGCAAGCAG AGAGGAAGGC    1140 

TGGGACGACG TCAAGTCATC ATGGCCCTTA CGTCCGGGGC TACACACGTG CTACAATGGA    1200 

TGGTACAGCG GGCAGCTACA CAGCAATGTG ATGCCAATCT CGAAAAGCCA TTCACAGTTC    1260 

GGATCGGGGT CTGCAACTCG ACCCCGTGAA GTAGGATTCG CTAGTAATCG CGTATCAGCA    1320 

ATGACGCGGT GAATACGTTC CCGGGCCTTG TACACACCGC CCGTCAAGCC ATGAAAGCTG    1380 

GGGGTACCTA AAGCATGAAA CCGCAAGGAG CGTGTTAGGG T                        1421 

三、菌落形态特征以及生理生化特性： 

菌株LCD51的菌落形态为：菌落呈橘红色、不透明、圆形、表面光滑，中心凸出、边缘整齐；生理特征：细菌呈规则的直杆状，单个或成对排列，常呈V形排列，革兰氏阴性，运动，兼性厌氧，不产生氧化酶和接触酶。最适生长pH值：6.5～7.5，最适生长温度：25～35℃，不能在60℃生长。同时对菌表观也做了扫描电镜观察，结果见图2。 

四、菌株LCD51为新的菌株： 

采用BLAST分析法对菌株LCD51的16S rRNA基因序列与GenBank数据库比较分析发现，菌株LCD51与水氏黄杆菌(Flavobacterium mizutaii)的同源性高达99.0％。 

综合菌株的生理生化以及分子鉴定结果，菌株LCD51命名为水氏黄杆菌(Flavobacteriummizutaii)LCD51。查阅有关资料，尚水氏黄杆菌属有关畜禽养殖废水中降解纤维素能力研究的报道。水氏黄杆菌(Flavobacterium mizutaii)LCD51为新的菌株，已于2009年5月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号：CCTCC NO：M 209100。 

本发明从湖北省鄂州市市郊某种猪养殖场排污口的池底污泥(沉积底泥)中筛选分离出这一株细菌，并发现其有较好降解纤维素养殖废水的功能。这拓宽了人们对水氏黄杆菌(Flavobacterium mizutaii)在其功能方面的应用研究思路，并为降解含纤维素畜禽养殖废水提供了有用的菌源和技术，具有较强的实际应用价值。 

五、菌株LCD51的应用： 

(一)、挑取水氏黄杆菌(Flavobacterium mizutaii)LCD51单菌落，于LB固体培养基中培养过夜，按培养后的水氏黄杆菌(Flavobacterium mizutaii)LCD51：含纤维素废水(如畜禽养殖厂废水)的体积比为0.5-2∶100取水氏黄杆菌(Flavobacterium mizutaii)LCD51接种于含纤维素废水(如畜禽养殖厂废水，即实验废水，取自湖北省鄂州市市郊某种猪养殖场排污口)中，30-35℃恒温培养，pH值为6-8，反应48-72小时。 

所述的LB固体培养基为：蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10.0g，蒸馏水1000mL，琼脂15g(固)，pH7.0。 

(二)、菌株LCD51产纤维素酶的能力： 

纤维素是大分子的聚集，由结晶区和无定形区交错而成。将天然纤维素分解，必须依靠内切型葡聚糖酶(EG)、外切性葡聚糖酶(CBG)和纤维二糖酶(BG)三种酶协同作用才能完成。为了考察菌株对纤维素的降解能力，研究了在产酶培养基中，细菌生产三种酶的能力。取产酶培养基100mL加入250ml的锥形瓶中，加入菌株LCD51的菌悬液(配制：用接种环挑取LCD51菌落于10mL LB液体培养基中，30℃震摇培养12小时)1mL，加入含纤维素废水(实验废水，取自湖北省鄂州市市郊某种猪养殖场排污口)100mL(纤维素的浓度为300-500mg/L)，30℃、震摇培养一周，检测各种酶活(见图3)。结果表明。该菌株在一周内产生的内切型葡聚糖酶(EG)、外切性葡聚糖酶(CBG)和纤维二糖酶(BG)三种酶酶活可分别达到16.0，4.0，16.1U/mL。 

为了考察该菌株在实际处理畜禽养殖废水的中降解纤维素的能力，研究了该菌株投加到畜禽养殖废水厌氧反应器中，纤维素的降解效率。在长期(稳定运行三个月以上)稳定运行的反应器中加入菌株LCD51的菌悬液(配制：用接种环挑取LCD51菌落于10mL LB液体培养基中，30℃震摇培养12小时)10mL，反应器中含纤维素废水(实验废水，取自湖北省鄂州市市郊某种猪养殖场排污口)为1000mL(纤维素的浓度为300-500mg/L)，30℃、静止一周，再稳定运行30天，在反应器稳定运行期间定期检测纤维素的去除效率，与未投加该菌株的对照反应器对比，结果表明，该菌株能在72小时之内去除废水中的纤维素21-28mg/L；该菌株能使该反应器处理纤维素的去除效率提高7-10％(原始处理率为65-70％，加入菌株LCD51后处理率为72-80％)。                 一株纤维素降解菌株LCD51的序列表 

<110>中国地质大学(武汉) 

<120>一株纤维素降解菌株LCD51 

<160>1421 

<210>1 

<211>1421bp 

<212>DNA 

<213>水氏黄杆菌(Flavobacterium mizutaii) 

<400>1 

AGCGGCAGGC CTAATACATG CAAGTCGGAC GGGATCCATC GGTAGCTTGC TACCGATGGT    60 

GAGAGTGGCG CACGGGTGCG TAACGCGTGA GCAACCTACC CATATCAGGG GGATAGCCCG    120 

AAGAAATTCG GATTAACACC GCATGACACT GCTTTCCGGC ATCGGGAGGT GGTCAAATAT    180 

TCATAGGATA TGGATGGGCT CGCGTGACGT TAGCTAGTTG GTGGGGTAAC GGCCCACCAA    240 

GGCGACGATG TCTAGGGGCT CTGAGAGGAG AATCCCCCAC ACTGGTACTG AGACAGGAAC    300 

CAGACTCCTA CGGGAGGCAG CAGTAAGGAA TATTGGTCAA TGGGGGCAAC CCTGAACCAA    360 

CCATGCCGCG TGCAGGACGA CTGCCCTATG GGTTGTAAAC TGCTTTTGTT AGGGAATAAA    420 

CCCCGCTACG TGTAGCGGGC TGAATGTACC TAAAGAATAA GGATCGGCTA ACTCCGTGCC    480 

AGCAGCCGCG GTAATACGGA GGATCCGAGC GTTATCCGGA TTTATTGGGT TTAAAGGGTG    540 

CGTAGGCGGC ACTTTAAGTC AGGGGTGAAA TACGGCAGCT CAACTGTCGC AGTGCCCTTG    600 

ATACTGAAGT GCTTGAATGC GGTTGAAGAC GGCGGAATGA GACAAGTAGC GGTGAAATGC    660 

ATAGATATGT CTCAGAACAC CGATTGCGAA GGCAGCTGTC TAAGCCGTTA TTGACGCTGA    720 

TGCACGAAAG CGTGGGGATC GAACAGGATT AGATACCCTG GTAGTCCACG CCCTAAACGA    780 

TGATGACTCG ATGTTTGCGA TATACCGTAA GCGTCCAAGC GAAAGCGTTA AGTCATCCAC    840 

CTGGGGAGTA CGCCCGCAAG GGTGAAACTC AAAGGAATTG ACGGGGGCCC GCACAAGCGG    900 

AGGAGCATGT GGTTTAATTC GATGATACGC GAGGAACCTT ACCCGGGCTT GAAAGTTACT    960 

GAAGGGCGCA GAGACGCGCC CGTCCTTCGG GACAGGAAAC TAGGTGCTGC ATGGCTGTCG    1020 

TCAGCTCGTG CCGTGAGGTG TTGGGTTAAG TCCCGCAACG AGCGCAACCC CTATGTTTAG    1080 

TTGCCAGCAC GTCAAGGTGG GGACTCTAAA CAGACTGCCT GCGCAAGCAG AGAGGAAGGC    1140 

TGGGACGACG TCAAGTCATC ATGGCCCTTA CGTCCGGGGC TACACACGTG CTACAATGGA    1200 

TGGTACAGCG GGCAGCTACA CAGCAATGTG ATGCCAATCT CGAAAAGCCA TTCACAGTTC    1260 

GGATCGGGGT CTGCAACTCG ACCCCGTGAA GTAGGATTCG CTAGTAATCG CGTATCAGCA    1320 

ATGACGCGGT GAATACGTTC CCGGGCCTTG TACACACCGC CCGTCAAGCC ATGAAAGCTG    1380 

GGGGTACCTA AAGCATGAAA CCGCAAGGAG CGTGTTAGGG T                        1421 

Claims (2)

1.一株纤维素降解菌株LCD51，其特征在于：所述的菌株为水氏黄杆菌(Flavobacteriummizutaii)LCD51 CCTCC NO：M 209100。

2.根据权利要求1所述的一株纤维素降解菌株LCD51，其特征在于：水氏黄杆菌(Flavobacterium mizutaii)LCD51 CCTCC NO：M 209100的菌落形态为：菌落呈橘红色、不透明、圆形、表面光滑，中心凸出、边缘整齐；生理特征：细菌呈规则的直杆状，单个或成对排列，常呈V形排列，革兰氏阴性，运动，兼性厌氧，不产生氧化酶和接触酶；最适生长pH值：6.5～7.5，最适生长温度：25～35℃。

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