CN101117624A - 一种适合大规模中国仓鼠卵巢细胞培养的无血清培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于大规模培养CHO细胞的无血清培养基。本发明公开了该培养基的配方，以DMEM/F12基础培养基，并添加了维生素C、转铁蛋白、乙醇胺、羟基丁酸钠等成分，本发明所提供的培养基具有如下优点：不含动物血清且蛋白含量很低；CHO细胞的培养效果好，可取得和含有血清的培养基同样的效果。

Description

一种适合大规模中国仓鼠卵巢细胞培养的无血清培养基
技术领域
本发明涉及细胞培养领域。更具体地，本发明涉及用于CHO细胞培养的培养基。
背景技术
中国仓鼠卵巢细胞——CHO细胞(Chinese hamster ovary cell)目前被广泛用于生产各种基因工程蛋白产品。适合用于CHO细胞培养的培养基，根据它的来源及成分的明确程度来划分，其发展大致可分为三个阶段：即天然培养基阶段(直接采用某些组织凝块、生物性液体和组织提取液等作为细胞的培养基)，合成培养基阶段(如MEM，DMEM，RPMI1640，F12等)和无血清培养基阶段。合成培养基通常需在其中添加一些诸如血清(常用的如小牛血清、胎牛血清等，一般在5-15％)等天然的体液性补充物才能较长时间地维持细胞生长。血清的主要作用在于向细胞提供激素(生化因子)、转移蛋白和其它营养物质等。但即使采用低血清培养，还是不能忽视血清带来的问题(如在培养过程中贴壁，不适用于大规模培养)。无血清培养基的优势很大程度上体现在避免了血清的缺点，此外它还具有血清培养难以比拟的优点，如保存和应用方便；使用该种培养基制备的产品易于纯化，提高回收率；成分明确，有利于研究细胞的生理调节机制；可根据不同细胞株设计和优化出适合其高密度生长或高水平目的产物表达的培养基等。因此，近年来许多科研工作者致力于开发无血清培养基。
姚伟公开了一种“国产改良型DMEM培养基”用来培养CHO-C28细胞(《中国生物制品学杂志》2003，16(6)：380-383)，解决了CHO-C28细胞大规模培养过程中易增厚、脱落和不易维持的难题。
赵国胜公开了一种“纯化人CD34+细胞的无动物血清培养”方法(《国外医学输血及血液学分册》1998，21(4)：263-264)，介绍了无动物血清基质液(ASF)培养人骨髓和外周血分离的CD34 +细胞，在这ASF系统中，应用不同的生长因子的组合，培养CD34 +细胞。与含有10％胎牛血清培养基进行比较，ASF培养细胞和祖细胞，同样生长良好。
CN00816020(发明名称为：用于无蛋白无血清培养细胞的培养基)描述了一种培养基，所述培养基用于无蛋白无血清培养细胞，尤其是哺乳动物细胞，该培养基含有一定比例的大豆水解产物。
WO200123527公开了一种包含大豆水解物的无血清、无蛋白培养基。该培养基组成为不超过10％干重的大豆水解物，内毒素的含量不超过500U/g。培养基内还含有氨基酸(半胱氨酸、脯氨酸、色氨酸)或氨基酸混合物。培养基内还含有其它辅助成分、缓冲因子、抗氧化物及蛋白酶抑制剂等。
综上所述，各国科学工作者虽然开发了许多无血清培养基，各培养基大都只适用于一种或一类细胞生长，尤其是缺少适用于大规模CHO细胞培养、且培养效果与有血清培养基相当或更佳的培养基，而对于市售可得的可用于大规模CHO细胞培养的无血清培养基如培养基Excell325PF在使用过程中也存在着细胞密度和蛋白表达量低等问题。因此，本领域迫切需要开发新的适合CHO细胞大规模培养的无血清、无动物组分的培养基。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供一种适合大规模培养CHO细胞的无血清的培养基，以弥补现有技术的不足。
本发明需要解决的另一个技术问题是提供该培养基的用途。
在许多基础培养基中，已经含有了许多微量元素、糖类等营养物质。例如，DMEM/F12(可从Sigma，GIBCO公司等处购买获得)。就是细胞培养中常用的商品化的基础培养基，该培养基由葡萄糖、氨基酸、维生素、无机盐等多种物质组成，为了使细胞在无血清培养基中生长，必须添加结合蛋白、激素、生长因子、低分子量营养物质如微量元素、脂类等，同时应当使培养基中蛋白含量尽量减少，以降低成本，有利于分离纯化，适于工业化生产的特点，从而使得培养效果相当于或优于有血清培养基。
为了适合CHO细胞的生长，适宜在DMEM/F 12的基础上添加如下物质：
(1)转铁蛋白：结合铁的糖蛋白，与细胞表面专一受体作用，传递铁离子，协助铁的吸收，可络合有害离子，起解毒作用，同时还有生长因子的作用。
(2)低分子量营养物质
微量元素主要起调节、传递和控制的作用，在无血清培养基中的作用尤为重要，如：
Fe：酶和血红素的辅基，是线粒体中呼吸链的组成部分。
Cu：超氧化物歧化酶的辅基，是线粒体中呼吸链的组成部分。
Mg：对ATP酶、激酶等起活化作用。
Zn：酶的辅基。
Co：维生素B12的组成部分。
(3)维生素：在细胞生长代谢过程中，维生素是细胞组成成分，细胞的各种代谢活动，离开了维生素都无法进行，因此它是必需的。尤其是维生素C，它起到有效促进CHO细胞生长的作用。
(4)乙醇胺：是无血清培养基的重要组成部分，与磷脂(磷脂酰乙醇胺)的合成有关。
(5)β一巯基乙醇：促进胱氨酸的吸收，还可使谷胱甘肽处于还原状态，从而保护细胞免受过氧化氢的伤害。
本发明的技术方案是这样的：
本发明提供了一种适合大规模CHO细胞培养的培养基，所述培养基由基础培养基和添加物构成，其中，添加物含有：
维生素C    10～25mg/L；
转铁蛋白   5～18mg/L；
乙醇胺     1～10mg/L；
亚硒酸盐   0.01～0.045mg/L；
羟基丁酸钠 0.5-1.5mg/L，按CHO细胞培养基的总体积计。
其中，基础培养基是DMEM/F12。
所述的添加物，还可以含有以下微量元素：
AlCl3·6H2O    0.5～2.5mg/L
AgNO3          0.02～0.045mg/L
CoCl2·6H2O    0.05～0.3mg/L
CuSO4·5H2O    0.002～0.004mg/L
KBr            0.0005～0.0008mg/L
FeSO4·7H2O    0.5～1.5mg/L
Na2SiO3        0.005～0.045mg/L
LiCl           0.0005～0.001mg/L
NiCl2·6H2O    0.02～0.25mg/L
SnCl2·2H2O    2.00～8.00mg/L
ZnSO4·7H2O    0.5～2.5mg/L
所述的添加物还可以含有以下维生素：
维生素B6       0.01～0.2mg/L
维生素B12      0.01～0.5mg/L
生物素         0.05～0.18mg/L
叶酸           0.02～8.00mg/L
核黄素         0.1～0.15mg/L
所述的添加物还可以含有以下物质：
还原型谷胱甘肽 0.5～2.5mg/L
腺嘌呤         5.5～8.5mg/L
鸟嘌呤         5.5～8.5mg/L
尿嘧啶         5.5～8.5m/L
胸腺嘧啶       0.25～1.5mg/L
胞嘧啶         5.5～8.5mg/L
核糖           2.0～8.5mg/L
脱氧核糖       2.0～8.5mg/L
Primatone      500～3500mg/L
HEPES          500～3000mg/L
β-巯基乙醇    0.2～2mg/L
本发明还提供了所述培养基的用途，用于培养中国仓鼠卵巢细胞。
本发明所提供的培养基，培养CHO细胞的方法是将CHO细胞接种于培养基，在适合生长的条件下培养。
本发明所提供的培养基具有如下优点：
(1)不含动物血清且蛋白含量很低；
(2)CHO细胞的培养效果好。
附图说明
图1：本发明提供的无血清培养基和添加了5％(v％)的胎牛血清DMEM/F12培养基的CHO细胞实验结果对比。其中，■表示含有血清的培养基的培养结果；◆表示本发明的无血清培养基的培养结果。
图2：本发明提供的无血清培养基和市售培养基Excell325PF(JRH公司)培养CHO细胞实验结果对比。◆表示无嘌呤嘧啶的培养基；■表示含嘌呤嘧啶的培养基，▲市售培养基Excell325PF。
图3：本发明提供的无血清培养基和市售培养基Excell325PF(JRH公司)培养sTNFR融合基因CHO细胞细胞生长曲线实验结果对比。◆表示无嘌呤嘧啶的培养基；■表示含嘌呤嘧啶的培养基，▲市售培养基Excell325PF。
图4：本发明提供的无血清培养基和市售培养基Excell325PF(JRH公司)培养sTNFR融合基因CHO细胞蛋白表达量结果对比。
图5：本发明提供的无血清培养基和市售培养基Excell325PF(JRH公司)培养人源化抗HER2单克隆抗体细胞生长曲线实验结果对比。◆表示无嘌呤嘧啶的培养基；■表示含嘌呤嘧啶的培养基，▲市售培养基Excell325PF。
图6：本发明提供的无血清培养基和市售培养基Excell325PF(JRH公司)培养人源化抗HER2单克隆抗体蛋白表达量结果对比。
具体实施方式
实施例1培养基的制备和CHO细胞培养
(1)培养基配方：其中基础培养基DMEM/F12培养基(购自Sigma公司)，在该培养基基础上，添加以下物质：
维生素C        10.5mg/L；
转铁蛋白       6.2mg/L；
乙醇胺         3.1mg/L；
亚硒酸盐       0.025mg/L；
羟基丁酸钠     0.85mg/L，按CHO细胞培养基的总体积计。
微量元素：
AlCl3·6H2O    1.2mg/L
AgNO3          0.03mg/L
CoCl2·6H2O    0.21mg/L
CuSO4·5H2O    0.0027mg/L
KBr            0.00061mg/L
FeSO4·7H2O    0.72 mg/L
Na2SiO3        0.005～0.045mg/L
LiCl           0.00083mg/L
NiCl2·6H2O    0.042mg/L
SnCl2·2H2O    2.12mg/L
ZnSO4·7H2O    1.58mg/L
维生素：
维生素B6       0.18mg/L
维生素B12      0.38mg/L
生物素         0.12 mg/L
叶酸           3.12mg/L
核黄素         0.12mg/L
和以下物质：
还原型谷胱甘肽 0.68mg/L
腺嘌呤        6.5mg/L
鸟嘌呤        6.5mg/L
尿嘧啶        6.5mg/L
胸腺嘧啶      0.7mg/L
胞嘧啶        6.5mg/L
核糖          2.0mg/L
脱氧核糖      2.0mg/L
Primatone     1500mg/L
HEPES         2100mg/L
β-巯基乙醇   1.5mg/L
将上述配制好的培养基20ml装入125ml的培养瓶中，再加入CHO细胞，接种密度为1.0×105细胞/ml，放置CO2培养箱中(CO2为5％)中培养，温度为37℃，每隔24小时取样计数。细胞培养到第8天时，活细胞密度达到最高，为2.3×106细胞/ml。
对比例1与添加5％胎牛血清的DMEM/F12培养基对比
在DMEM/F12培养基中添加5％(v％)的胎牛血清，采用与实施例1相同的培养方法对CHO细胞进行培养。到细胞培养到第8天时，活细胞的密度达到最高，为2.0×106细胞/ml。
结果如图1显示，本发明所提供的培养基与添加了5％胎牛血清的培养基相比，没有明显差异，因此，可以用来替代有血清的培养基，培养CHO细胞。
实施例2培养基的制备和CHO细胞培养
(1)培养基配方：其中基础培养基DMEM/F12培养基(购自Sigma公司)，在该培养基基础上，添加以下物质：
维生素C     10.5mg/L；
转铁蛋白    6.2mg/L；
乙醇胺        3.1mg/L；
亚硒酸盐      0.025mg/L；
羟基丁酸钠    0.85mg/L，按CHO细胞培养基的总体积计。
微量元素：
AlCl3·6H2O    1.2mg/L
AgNO3          0.03mg/L
CoCl2·6H2O    0.21mg/L
CuSO4·5H2O    0.0027mg/L
KBr            0.00061mg/L
FeSO4·7H2O    0.72mg/L
Na2SiO3        0.005～0.045mg/L
LiCl           0.00083mg/L
NiCl2·6H2O    0.042mg/L
SnCl2·2H2O    2.12mg/L
ZnSO4·7H2O    1.58mg/L
维生素：
维生素B6       0.18mg/L
维生素B12      0.38mg/L
生物素         0.12mg/L
叶酸           3.12mg/L
核黄素         0.12mg/L
将上述配制好的培养基20ml装入125ml的培养瓶中，再加入CHO细胞，接种密度为1.0×105细胞/ml，放置CO2培养箱中(CO2为5％)中培养，温度为37℃，每隔24小时取样计数。细胞培养到第8天时，活细胞密度达到最高，为2.2×106细胞/ml。
对比例2与添加嘌呤、嘧啶组添加物培养基及市售培养基Excell325PF(JRH公司)培养基对比
在实施例2培养基中添加还原型谷胱甘肽0.68mg/L，腺嘌呤6.5mg/L，鸟嘌呤6.5mg/L，尿嘧啶6.5mg/L，胸腺嘧啶0.7mg/L，胞嘧啶6.5mg/L，核糖2.0mg/L，脱氧核糖  2.0mg/L，Primatone 1500mg/L，HEPES 2100mg/L，β-巯基乙醇1.5mg/L，采用与实施例2相同的培养方法对CHO细胞进行培养。到细胞培养到第8天时，活细胞的密度达到最高，为2.4×106细胞/ml。
利用市售Excell325PF(JRH公司)培养基，采用与实施例2相同的培养方法对CHO细胞进行培养。到细胞培养到第8天时，活细胞的密度达到最高，为1.3×106细胞/ml。
结果如图2显示，本发明所提供的培养基与添加了嘌呤、嘧啶组添加物的培养基相比，基本上也可以达到本发明可以的目的，另外本发明所提供的培养基明显优于市售Excell325PF(JRH公司)培养基。
实施例3培养基的制备和CHO细胞的大规模培养
(1)培养基配方：其中基础培养基DMEM/F12培养基(购自Sigma公司)，在该培养基基础上，添加以下物质：
维生素C        10.5mg/L；
转铁蛋白       6.2mg/L；
乙醇胺         3.1mg/L；
亚硒酸盐       0.025mg/L；
羟基丁酸钠     0.85mg/L，按CHO细胞培养基的总体积计。
微量元素：
AlCl3·6H2O    1.2mg/L
AgNO3          0.03mg/L
CoCl2·6H2O    0.21mg/L
CuSO4·5H2O    0.0027mg/L
KBr            0.00061mg/L
FeSO4·7H2O     0.72mg/L
Na2SiO3         0.005～0.045mg/L
LiCl            0.00083mg/L
NiCl2·6H2O     0.042mg/L
SnCl2·2H2O     2.12mg/L
ZnSO4·7H2O     1.58mg/L
维生素：
维生素B6        0.18mg/L
维生素B12       0.38mg/L
生物素          0.12mg/L
叶酸            3.12mg/L
核黄素          0.12mg/L
和以下物质：
还原型谷胱甘肽  0.68mg/L
腺嘌呤          6.5mg/L
鸟嘌呤          6.5mg/L
尿嘧啶          6.5mg/L
胸腺嘧啶        0.7mg/L
胞嘧啶          6.5mg/L
核糖            2.0mg/L
脱氧核糖        2.0mg/L
Primatone       1500mg/L
HEPES           2100mg/L
β-巯基乙醇    1.5mg/L
用上述配制好的培养基在摇瓶中扩增sTNFR融合基因CHO细胞(按中国发明专利01132074.5实施例中公开的方法制备)，培养条件：37℃，5％CO2，120rpm，每日取样，检测细胞密度，根据需要添加新鲜培养液或转移至合适体积的摇瓶，维持细胞密度在2×106/ml左右。细胞悬液体积扩增至3L时，转入B.Braun BioStatB5L生物反应器中，连续灌注法培养，控制参数：温度37℃，pH6.9，搅拌150rpm，pO2 50％，每日取样，检测细胞密度及残糖浓度，根据需要调节循环速度，维持残糖浓度在150mg/dL左右。细胞密度接近或达到1×107/ml时，转入B.BraunBioStat D5050L生物反应器中，连续灌注法培养，控制参数：温度37℃，pH6.9，搅拌60rpm，pO2 50％，每日取样，检测细胞密度及残糖浓度，根据需要调节循环速度，维持残糖浓度在150mg/dL左右。细胞密度接近或达到5×106/ml时，转入B.Braun BioStat D500 500L生物反应器中，批式法培养，控制参数：温度37℃，pH6.9，搅拌30rpm，pO2 50％，每日取样，检测细胞密度及残糖浓度，并监测目的蛋白表达量，根据需要添加新鲜培养液，维持残糖浓度在150mg/dL左右。当活细胞率低于60％时，结束培养，收获培养上清，检测目的蛋白表达量。
细胞在500L生物反应器中，培养到第8天时，活细胞密度达到最高，为7.5×106细胞/ml。培养结束后，检测目的蛋白(为抗体融合蛋白)表达量为820mg/L。
用同法培养人源化抗HER2单克隆抗体(按中国发明专利01132225.X中公开的方法制备)细胞，在500L生物反应器中，培养到第8天时，活细胞密度达到最高，为8.2×106细胞/ml。培养结束后，检测目的蛋白(为人源化单克隆抗体)表达量为910mg/L。
对比例3与添加嘌呤、嘧啶组添加物培养基及市售培养基Excell325PF(JRH公司)培养基对比
在实施例3培养基中添加还原型谷胱甘肽0.68mg/L，腺嘌呤6.5mg/L，鸟嘌呤6.5mg/L，尿嘧啶6.5mg/L，胸腺嘧啶0.7mg/L，胞嘧啶6.5mg/L，核糖2.0mg/L，脱氧核糖2.0mg/L，Primatone 1500mg/L，HEPES 2100mg/L，β-巯基乙醇1.5mg/L，采用与实施例3相同的培养方法对sTNFR融合基因CHO细胞(按中国发明专利01132074.5实施例中公开的方法制备)细胞进行培养。到细胞培养到第8天时，活细胞的密度达到最高，为7.9×106细胞/ml。培养结束后，检测目的蛋白(为抗体融合蛋白)表达量为850mg/L。采用与实施例3相同的培养方法对人源化抗HER2单克隆抗体(按中国发明专利01132225.X中公开的方法制备)细胞进行培养。到细胞培养到第8天时，活细胞的密度达到最高，为8.8×106细胞/ml。培养结束后，检测目的蛋白表达量为950mg/L。
利用市售Excell325PF(JRH公司)培养基，采用与实施例3相同的培养方法对sTNFR融合基因CHO细胞(按中国发明专利01132074.5实施例中公开的方法制备)细胞进行培养。到细胞培养到第7天时，活细胞的密度达到最高，为4.8×106细胞/ml。培养结束后，检测目的蛋白(为抗体融合蛋白)表达量为470mg/L。采用与实施例3相同的培养方法对人源化抗HER2单克隆抗体(按中国发明专利01132225.X中公开的方法制备)细胞进行培养。到细胞培养到第7天时，活细胞的密度达到最高，为5.1×106细胞/ml。培养结束后，检测目的蛋白(为人源化单克隆抗体)表达量为490mg/L。
结果见图3、图4、图5、图6，本发明所提供的培养基在大规模培养条件下与市售Excell325PF培养基相比，细胞密度及目的蛋白表达量均有显著增加，故本发明提供的培养基明显优于市售Excell325PF培养基。

Claims (6)

1.一种用于大规模培养CHO细胞的培养基，其特征在于，所述培养基是由基础培养基和添加物构成，其中添加物含有：
维生素C        10～25mg/L；
转铁蛋白       5～18mg/L；
乙醇胺         1～10mg/L；
亚硒酸盐       0.01～0.045mg/L；
羟基丁酸钠     0.5-1.5mg/L，按CHO细胞培养基的总体积计。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述的基础培养基是DMEM/F12。
3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述的添加物还含有以下微量元素：
AlCl3·6H2O    0.5～2.5mg/L
AgNO3          0.02～0.045mg/L
CoCl2·6H2O    0.05～0.3mg/L
CuSO4·5H2O    0.002～0.004mg/L
KBr            0.0005～0.0008mg/L
FeSO4·7H2O    0.5～1.5mg/L
Na2SiO3        0.005～0.045mg/L
LiCl           0.0005～0.001mg/L
NiCl2·6H2O    0.02～0.25mg/L
SnCl2·2H2O    2.00～8.00mg/L
ZnSO4·7H2O    0.5～2.5mg/L
4.根据权利要求3所述的培养基，其特征在于，所述的培养基还含有以下维生素：
维生素B6       0.01～0.2mg/L
维生素B12      0.01～0.5mg/L
生物素         0.05～0.18mg/L
叶酸           0.02～8.00mg/L
核黄素            0.1～0.15mg/L
5.根据权利要求4所述的培养基，其特征在于，所述的添加剂还含有以下物质：
还原型谷胱甘肽    0.5～2.5mg/L
腺嘌呤            5.5～8.5mg/L
鸟嘌呤            5.5～8.5mg/L
尿嘧啶            5.5～8.5mg/L
胸腺嘧啶          0.25～1.5mg/L
胞嘧啶            5.5～8.5mg/L
核糖              2.0～8.5mg/L
脱氧核糖          2.0～8.5mg/L
Primatone         500～3500mg/L
HEPES             500～3000mg/L
β-巯基乙醇       0.2～2mg/Lmg/L
6.权利要求1-5任一所述的培养基的用途，用于培养中国仓鼠卵巢细胞。
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