CN117062906A - 包含螺旋藻水解物的用于细胞培养的培养基组合物以及其制备方法 - Google Patents

包含螺旋藻水解物的用于细胞培养的培养基组合物以及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于细胞培养的培养基组合物以及其制备方法，通过用螺旋藻水解物代替动物血清，可以在显著减少动物血清的添加量的同时以与包含动物血清的培养基相同或更高水平诱导细胞的生长并促进增殖。

Description

包含螺旋藻水解物的用于细胞培养的培养基组合物以及其制 备方法
技术领域
本发明涉及一种包含螺旋藻水解物的用于细胞培养的培养基组合物以及其制备方法，更详细地，涉及一种用于细胞培养的培养基组合物以及其制备方法，其用螺旋藻水解物代替添加到培养基中的用于细胞培养的动物血清，以进行细胞培养。
背景技术
细胞培养是医学、免疫学以及生物学研究中最重要的基础技术之一。细胞培养的应用领域逐渐扩散，例如，通过人类基因组分析以及蛋白质组分析的生命现象研究，用于治疗不治之症以及再生医学的干细胞研究，用作食品/药品原料的天然物以及生理活性物质的毒性以及稳定性测试，通过病因分析进行诊断方法以及预防方法的开发，通过如抗生素、抗癌剂以及疫苗等新药候选物质筛选进行新药开发以及机制分析，生产用于医学以及工业的各种重组肽以及蛋白质等，其重要性日益凸显。细胞研究的重要性在于，来源于生物体的细胞被视为生物体模型并代替生物体进行研究。
动物细胞的培养始于1885年由Roux对鸡受精卵进行培养，经过众多研究人员的努力，开发了以各种动物来源细胞为对象的细胞培养技术，并在1952年由Gey建立了HeLa细胞系作为最初的人类来源永生细胞系，由此为细胞研究奠定了基础。
为了在实验室的平板盘子上稳定地培养来自生物体的活细胞，用于细胞培养的培养基是必不可少的。细胞培养使用以10％至20％的浓度添加血清(serum)的合成培养基(synthetic media)，合成培养基包含各种营养成分、微生物以及无机质，血清的组成成分尚未完全清楚，但包含参与细胞的生长、分裂以及分化等的细胞必需的激素、粘附因子以及生长因子。动物细胞培养必需的血清从胎牛、小牛、马、羊、猪、狗、山羊等动物中分离来使用，最常用胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)。
最常用胎牛血清是因为需要血液量多的大个体以顺利供给血清，而牛在全球范围内饲养的动物中最合适，并且当培养动物细胞时，来自其他物种的血清的免疫球蛋白会诱导免疫排斥反应，由此导致各种副作用。由于胎牛血清是从母牛分娩前的胎牛中分离，仅具有最低限度的固有免疫球蛋白，因此与其他动物来源血清相比诱导的免疫排斥反应相对较少，从而最适合细胞培养。
查看用于细胞培养的胎牛血清的制备过程，从怀孕的母牛的子宫中取出胎牛后，通过将针插入胎牛心脏进行采血后分离血清来使用，这一过程非常不道德以及不环保。并且，由于生产工艺的难度以及稀缺性，导致能够工业化生产的胎牛血清产品存在定价非常高的高成本结构严重问题。并且，由于国际社会建议限制动物实验，因此对细胞研究的依赖日益增加导致胎牛血清供应不稳定以及产/学/研的研究材料成本的负担。对此，美国食品药品监督管理局(US Food and Drug Administration，FDA)，欧盟的欧洲药品管理局(European Medicines Agency，EMEA)以及国际社会建议限制使用胎牛血清并开发血清替代物。
近年来，无血清培养基作为胎牛血清替代物而备受关注。无血清培养基是一种不使用存在不道德、不环保、高成本问题的血清的用于细胞培养的培养基，在合成培养基中添加通过重组蛋白合成技术生产的细胞培养必需的各种激素以及生长因子，因此是一种无需使用血清的用于细胞培养的培养基。
国内外对无血清培养基的需求迅速增长，尤其在制药行业市场中的依赖度日益增加。原因在于，通过细胞培养生产的重组蛋白药品由于使用胎牛血清，无意中合成具有未知抗原的重组蛋白，从而可能导致潜在的副作用，因此作为药品获得批准/许可的过程非常困难且成本高，相反，通过从无血清培养基中培养的细胞生产的重组蛋白药品的组成成分明确，因此具有副作用小并可以生产高纯度的重组蛋白的优点。
然而，由于能够在无血清培养基中进行细胞培养的细胞系的种类有限，用于培养的细胞系适应过程繁琐，需要添加重组蛋白代替使用胎牛血清，因此仍然存在高成本问题。尤其，除了工业重组肽以及蛋白质生产领域以外，在基于细胞培养的细胞信号传递、基质分析、功能性以及新药候选物质筛选、化妆品/食品/药品原料的细胞毒性以及稳定性测试等全方位医学、免疫学以及生物学研究领域中存在难以应用的局限性。
为了克服由未表征的血清组合物的性质以及血清的批次之间(lot-to-lot)变化导致的不确定性，优选地使用血清替代物或无血清培养基培养物(Pei etal.，ArchAndrol.49(5):331-42，2003)。此外，当将在细胞培养物中生长的用作治疗用途的细胞、重组蛋白或疫苗给药到人类时，由于附加的动物来源成分可以会导致潜在的病毒污染、传染性海绵状脑病(Transmissible Spongiform Encephalopathy：TSE)感染和/或动物蛋白潜在的免疫原性效果而不可取。开发血清替代物，以不仅使胎牛血清对细胞培养物的影响最小化，还使用于人类细胞的培养物的动物蛋白的量最小化。血清替代物，例如KNOCKOUTTM血清替代物(英杰公司(Invitrogen)，加利福尼亚州)是指一种包含细胞生长必需的营养素以及其他蛋白质而不包含血清的化学上规定的培养物培养基。KNOCKOUT SRTM包含大部分包含在商业配方中的具有短半衰期的蛋白因子。由于KNOCKOUT SRTM缺乏粘附因子，因此当接种饲养(feeder)细胞时无法用作胎牛血清的替代物，从而导致不适合上述配方的细胞粘附。PC-1TM无血清培养基(龙沙(Lonza)，马里兰州)是一种从特殊改良的DMEM/F12培养基中配制的低蛋白/无血清培养基，包含具有已知量的胰岛素、转铁蛋白、脂肪酸以及专利蛋白的完整的HEPES缓冲系统。PC-1培养基中的转铁蛋白在溶液中的半衰期为2～4周。CellgroCOMPLETETM(Cellgro公司，弗吉尼亚州)是一种以DMEM/F12、RPMI 1640以及McCoy 5A的混合为基质的无血清低蛋白剂型。Cellgro COMPLETETM不包含胰岛素、转铁蛋白、胆固醇、生长或粘附因子。Cellgro COMPLETETM包含微量元素以及高分子量碳水化合物、过量维生素、非动物蛋白源以及牛血清白蛋白(1g/L)的混合物。Cellgro FREETM(Cellgro公司，弗吉尼亚州)是一种不包含任何激素或生长因子的无血清无蛋白生长培养基。
另一方面，螺旋藻属(Spirulina sp.)为蓝绿藻的一种，已被WHO认可为完全食品以及超级食品等，用于医疗、健康、饥饿救济计划等，NASA正在进行作为太空食物的研究/开发，是一种安全性得到FDA以及食品药品安全处的认可的生物材料。据报道，环保的螺旋藻属(Spirulina sp.)包含藻蓝蛋白、β胡萝卜素、Ca-Sp、GLA以及Immolina等生理活性物质，因此促进细胞活性以及免疫系统，抑制导致衰老以及各种疾病的活性氧的抗氧化效果比黄绿色蔬菜高20倍，钙比每Kg牛奶高10倍、β胡萝卜素比胡萝卜高20倍、铁质比菠菜高50倍、蛋白质含量比鸡蛋高5倍，是一种矿物质、维生素、EPA以及天然色素等营养齐全的生物材料。螺旋藻属(Spirulina sp.)的细胞分裂以及细胞生长速度非常快，因此单位面积的产量远高于陆上动/植物，生产成本更低于陆上动/植物，还可以在环境贫瘠的沙漠地区进行培养，不仅大规模培养后容易收集原料，还在韩国已形成800亿韩元规模的国内市场，因此是一种在医学/生物研究以及产业领域具有大的应用潜力的生物资源。
对此，本发明人确认到可以将安全且环保的螺旋藻水解物用作细胞培养用血清替代物，开发包含螺旋藻水解物的用于细胞培养的培养基，并确认到其表现出与现有的包含动物血清的培养基相似或更高水平的效果，从而完成了本发明。
发明内容
技术问题
本发明的目的在于提供一种可以在减少动物血清的使用量的同时稳定地培养细胞的用于细胞培养的培养基组合物以及其制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种在减少动物血清的使用量的同时细胞的生长及增殖诱导能力优异的用于细胞培养的培养基组合物以及其制备方法。
本发明所要解决的问题不限于上述问题，本领域的技术人员可以通过以下说明明确理解未提及的其他问题。
解决问题的方案
根据本发明的一方面，本发明提供一种用于细胞培养的培养基组合物的制备方法，包括：第一步骤，从螺旋藻中得到螺旋藻提取物；第二步骤，通过用水解酶处理螺旋藻提取物来制备螺旋藻水解物；以及第三步骤，过滤以及回收螺旋藻水解物。
上述螺旋藻可以为选自极大螺旋藻(Spirulina maxima)、钝顶螺旋藻(Spirulinaplatensis)、吉特勒氏螺旋藻(Spirulina geitleri)、连体螺旋藻(Spirulina siamese)、大螺旋藻(Spirulina major)、盐泽螺旋藻(Spirulina subsalsa)、为首螺旋藻(Spirulinaprinceps)、宽松螺旋藻(Spirulinalaxissima)、库塔螺旋藻(Spirulina curta)、卷曲螺旋藻(Spirulina spirulinoides)中的一种以上。
上述在第一步骤中，将螺旋藻溶液均质化后，(a)超声波处理后在高温以及高压下进行提取，或者(b)冻融(freeze-thaw)溶解后，通过超声波处理进行提取。
上述第二步骤中的水解酶可以具有蛋白质分解能力。
上述第二步骤中的水解酶可以使用一种或两种以上的组合。
可以依次使用两种以上的上述水解酶。
上述第二步骤中的水解酶可以选自碱性蛋白酶(Alcalase)、菠萝蛋白酶(bromelain)、风味蛋白酶(flavourzyme)、胰酶(pancreatin)、木瓜蛋白酶(papain)、胃蛋白酶(pepsin)、链霉蛋白酶(pronase)、复合蛋白酶(protamex)、胰蛋白酶(trypsin)或它们的组合中。
上述在第三步骤中，可以离心螺旋藻水解物后过滤上清液，离心滤液后分离上清液并进行冷冻干燥。
根据本发明的另一方面，本发明提供一种包含螺旋藻(Spirulina)水解物作为有效成分的用于细胞培养的培养基组合物。
上述水解物可以通过用蛋白水解酶处理螺旋藻提取物来得到。
上述水解酶可以选自胃蛋白酶、胰酶、胰蛋白酶、链霉蛋白酶、木瓜蛋白酶或它们的组合中。
上述螺旋藻水解物的浓度可以为5g/L以下。
上述用于细胞培养的培养基组合物中螺旋藻水解物的含量可以为0.1～20体积百分比(v/v)。
上述用于细胞培养的培养基组合物中血清以及螺旋藻水解物的含量可以为0.1～20体积百分比(v/v)。
上述用于细胞培养的培养基组合物中血清的含量可以为0.1～19.9体积百分比(v/v)。
上述用于细胞培养的培养基组合物中血清与螺旋藻水解物的体积比(v/v)可以为5:5至1:9。
上述细胞可以为动物细胞、昆虫细胞或植物细胞。
发明的效果
根据本发明的用于细胞培养的培养基组合物以及其制备方法，具有在显著减少动物血清的添加量的同时以与包含动物血清的培养基相同或更高的水平诱导细胞的生长并促进增殖的效果。
根据本发明的用于细胞培养的培养基组合物以及其制备方法，现有的螺旋藻提取物细胞培养液(SACCS)以高分子形式包含螺旋藻蛋白，而本发明的用于细胞培养的培养基组合物包含将螺旋藻蛋白水解的肽形式的螺旋藻水解物(SH)，从而对细胞的生长以及增殖表现出更大的效果。
根据本发明的用于细胞培养的培养基组合物以及其制备方法，具有减少来自动物的感染性疾病，以及减少在得到动物血清的过程中出现的环境及道德问题的效果。
本发明的效果不限于上述效果，应理解为包含可以从本发明的详细说明或发明要求保护范围中记载的发明的构成中推测的所有效果。
附图说明
图1为本发明的用于细胞培养的培养基组合物的制备方法的工序流程图。
图2示出本发明一实施例的用于细胞培养的培养基组合物的制备方法，示出在制备SH1以及SH2后依次用3种水解酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶)处理的工序。
图3a示出比较本发明一实施例的SH1以及SH2与胎牛血清的常规成分，图3b示出比较SH1及SH2与胎牛血清的矿物质，图3c示出比较SH1以及SH2与胎牛血清的重金属，图3d示出比较SH1以及SH2与胎牛血清的氨基酸，图3e示出比较SH1以及SH2与胎牛血清的氨基酸比例。
图4为本发明一实施例的用于细胞培养的培养基组合物制备方法中各步骤的螺旋藻的SEM图像。
图5示出本发明一实施例的H460细胞根据SH1以及SH2的浓度的存活率。
图6a示出本发明一实施例的添加3％的胎牛血清以及7％的螺旋藻水解物(SH1-A、SH1-B、SH2-A、SH2-B)的培养基中的细胞生长率，图6b示出添加3％的胎牛血清以及7％的螺旋藻水解物(SH1-A、SH1-B、SH2-A、SH2-B)的培养基中的细胞存活率，图6c示出添加1％的胎牛血清以及9％的螺旋藻水解物(SH1-A、SH1-B、SH2-A、SH2-B)的培养基中的细胞生长率，图6d示出添加1％的胎牛血清以及9％的螺旋藻水解物(SH1-A、SH1-B、SH2-A、SH2-B)的培养基中的细胞存活率。
图7示出观察本发明一实施例的在添加3％的胎牛血清以及7％的螺旋藻水解物的培养基中进行培养的H460细胞的形态。
图8示出观察本发明一实施例的在添加1％的胎牛血清以及9％的螺旋藻水解物的培养基中进行培养的H460细胞的形态。
图9示出本发明一实施例的用于细胞培养的培养基组合物的制备方法，用11中水解酶分别处理的工序。
图10示出本发明一实施例的不同水解酶种类螺旋藻水解物的H460细胞的细胞生长率。
图11示出本发明一实施例的用于细胞培养的培养基组合物的制备方法，根据水解酶组合来制备三种螺旋藻水解物(PA、PB、PC)的工序。
图12a示出本发明一实施例的添加5％的胎牛血清以及5％的螺旋藻水解物(PA、PB、PC)的培养基中的H460细胞系的细胞生长率，图12b示出添加5％的胎牛血清以及5％的螺旋藻水解物(PA、PB、PC)的培养基中的H460细胞系的细胞存活率，图12c示出添加3％的胎牛血清以及7％的螺旋藻水解物(PA，PB，PC)的培养基中的H460细胞系的细胞生长率，图12d示出添加3％的胎牛血清以及7％的螺旋藻水解物(PA、PB、PC)的培养基中的H460细胞系的细胞存活率，图12e示出添加1％的胎牛血清以及9％的螺旋藻水解物(PA、PB、PC)的培养基中的H460细胞系的细胞生长率，图12f示出添加1％的胎牛血清以及9％的螺旋藻水解物(PA、PB、PC)的培养基中的H460细胞系的细胞存活率。
图13a示出观察本发明一实施例的在以5:5的配比添加FBS以及螺旋藻水解物的培养基中进行培养的H460细胞系的形态，图13b示出观察在以3:7的配比添加FBS以及螺旋藻水解物的培养基中进行培养的H460细胞系的形态，图13c示出观察在以1:9的配比添加FBS以及螺旋藻水解物的培养基中进行培养的H460细胞系的形态。
图14a示出本发明一实施例的添加5％的胎牛血清以及5％的螺旋藻水解物(PA、PB、PC)的培养基中的Hela细胞系的细胞生长率，图14b示出添加5％的胎牛血清以及5％的螺旋藻水解物(PA、PB、PC)的培养基中的Hela细胞系的细胞存活率，图14c示出添加3％的胎牛血清以及7％的螺旋藻水解物(PA、PB、PC)的培养基中的Hela细胞系的细胞生长率，图14d示出添加3％的胎牛血清以及7％的螺旋藻水解物(PA、PB、PC)的培养基中的Hela细胞系的细胞存活率。
图15a示出观察本发明一实施例的在以5:5的配比添加FBS以及螺旋藻水解物的培养基中进行培养的Hela细胞系的形态，图15b示出观察在以3:7的配比添加FBS以及螺旋藻水解物的培养基中进行培养的Hela细胞系的形态。
具体实施方式
以下，将参考附图详细说明本发明优选实施例。
如果参考与附图一起详细后述的实施例，则本发明的优点、特征以及实现其的方法会变得明确。
然而，本发明可以以各种不同形式实现而不限于以下公开的实施例，本实施例仅使本发明的公开完整，并且为了将发明的范畴完整地告知本发明所属领域的普通技术人员而提供，本发明仅由发明要求保护范围定义。
并且，在本发明的说明中，当判断相关的公知技术等可能模糊本发明的主旨时，将省略其详细说明。
以下，将详细说明本发明。
用于细胞培养的培养基组合物的制备方法
本发明提供一种用于细胞培养的培养基组合物的制备方法，包括：第一步骤，从螺旋藻中得到螺旋藻提取物；第二步骤，通过用水解酶处理螺旋藻提取物来制备螺旋藻水解物；以及第三步骤，过滤以及回收螺旋藻水解物。
以下，参考图1来说明本发明的用于细胞培养的培养基组合物的制备方法。
第一步骤S100：从螺旋藻得到螺旋藻提取物。
在本步骤中，将螺旋藻溶液均质化后，(a)超声波处理后在高温以及高压下进行提取，或者(b)冻融(freeze-thaw)溶解后，通过超声波处理得到提取物。
优选地，上述螺旋藻为选自极大螺旋藻(Spirulina maxima)、钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)、吉特勒氏螺旋藻(Spirulina geitleri)、连体螺旋藻(Spirulinasiamese)、大螺旋藻(Spirulina major)、盐泽螺旋藻(Spirulina subsalsa)、为首螺旋藻(Spirulina princeps)、宽松螺旋藻(Spirulinalaxissima)、库塔螺旋藻(Spirulinacurta)、卷曲螺旋藻(Spirulina spirulinoides)中的一种以上。
上述螺旋藻的形式没有特别的限制，但优选为粉末形式。
可以使用超声波、裂解酶、冻融溶解、加热、加压、压缩机、株磨机等方法来破碎细胞膜，但不限于此。
作为本发明一实施例，混合螺旋藻粉末和溶剂以制备螺旋藻溶液，进行均质化(homogenization)后，可以(a)利用超声波破碎细胞膜后通过加热以及加压来得到螺旋藻提取物(图2，SH1)，或者可以(b)通过反复冻融来溶解细胞膜后，通过超声波处理进行提取(图2，SH2)。
第二步骤S200：通过用水解酶处理螺旋藻提取物来制备水解物。
在本步骤中，可以通过用水解酶处理螺旋藻提取物来提高水解产率，并且使有效成分的损伤最小化。当通过用强酸或高温处理进行水解时，存在维生素被破坏或如色氨酸等敏感的氨基酸受损的问题。与此相反的，利用酶的水解物的优点在于，不仅产率优于酸水解物，对有效成分的损伤也小的优点。
优选地，上述水解酶具有蛋白质分解能力。
并且，上述水解酶可以使用一种或两种以上的组合。
可以使用选自碱性蛋白酶(Alcalase)、菠萝蛋白酶(bromelain)、风味蛋白酶(flavourzyme)、胰酶(pancreatin)、木瓜蛋白酶(papain)、胃蛋白酶(pepsin)、链霉蛋白酶(pronase)、复合蛋白酶(protamex)、胰蛋白酶(trypsin)或它们的组合中作为上述水解酶，但不限于此。
根据本发明一实施例，使用碱性蛋白酶(Alcalase)、菠萝蛋白酶(bromelain)、风味蛋白酶(flavourzyme)、胰酶(pancreatin)、木瓜蛋白酶(papain)、胃蛋白酶(pepsin)、链霉蛋白酶(pronase)、复合蛋白酶(protamex)、胰蛋白酶(trypsin)、胃蛋白酶+胰蛋白酶+碱性蛋白酶，胃蛋白酶+胰酶，胃蛋白酶+胰蛋白酶，或者胃蛋白酶+胰酶+木瓜蛋白酶作为水解酶(图2、图9、图11)。
如上所述，当组合使用两种以上的水解酶时，由于每种水解酶的反应温度以及pH不同，因此，优选为依次使用，使得可以在每种水解酶的最佳条件(反应温度、pH、时间等)下进行反应。例如，如图2所示，当组合使用3种水解酶时，在螺旋藻提取物中添加1)胃蛋白酶后在37℃的温度、pH2的条件下反应2小时，然后在37℃的温度、pH8的条件下与2)胰蛋白酶反应2小时，然后在50℃的温度、pH8的条件下与3)碱性蛋白酶反应2小时以制备螺旋藻水解物。
在上述每种水解酶反应结束后，优选地，通过加热使酶失活。
第三步骤S300：过滤以及回收螺旋藻水解物。
本步骤为过滤以及回收螺旋藻水解物的步骤，可以将离心第二步骤中的螺旋藻水解物得到的上清液过滤后冷冻干燥。并且，可以将进一步离心上述滤液后得到的上清液冷冻干燥。
可以将上述冷冻干燥的螺旋藻水解粉末溶于蒸馏水中后用过滤器过滤以去除污染源，然后添加到用于细胞培养的基础培养基中并使用。
上述用于细胞培养的基础培养基包括最低必需培养基(Minimum EssentialMedium，MEM)、Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM)、DMEM-F12、罗斯威尔公园纪念研究所培养基(Roswell Park Memorial Institute，RPMI)、无血清角质形成细胞培养基(Keratinocyte Serum Free Medium，K-SFM)、M199、Ham’sF12、Ham’s 10、NCTC 109、NCTC 135、NeuroCult基础培养基(NeuroCult Basal Medium)等，除此以外，只要是本领域使用的培养基就足够，可以包含选自由各种营养成分、矿物质、无机质、维生素、氨基酸、包含肽的重组蛋白、粘附因子、生长因子以及激素组成的组中的一种以上，但不限于此。
可以通过进一步利用或应用本发明所属技术领域常用的物质以及方法来制备本发明的用于细胞培养的培养基组合物。
用于细胞培养的培养基组合物
本发明提供一种包含螺旋藻水解物作为有效成分的用于细胞培养的培养基组合物。
本发明的用于细胞培养的培养基组合物的特征在于包含螺旋藻水解物，不同于现有的螺旋藻提取物细胞培养液(SACCS)以高分子形式包含螺旋藻蛋白，本发明的用于细胞培养的培养基组合物包含将螺旋藻蛋水解的肽形式的螺旋藻水解物(SH)，对细胞的生长以及增殖表现出更大的效果。
螺旋藻属(Spirulina sp.)为蓝绿藻的一种，作为超级食品以及完全食品，是由FDA以及食品药品安全处所告示的原料，已证明其环保性、营养优秀性以及稳定性，螺旋藻的蛋白质含量为50％以上，包含6％至9％的脂质、15％至20％的碳水化合物，除此以外，包含维生素、无机质等各种生理活性物质。
上述螺旋藻可以使用选自极大螺旋藻(Spirulina maxima)、钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)、吉特勒氏螺旋藻(Spirulina geitleri)、连体螺旋藻(Spirulinasiamese)、大螺旋藻(Spirulina major)、盐泽螺旋藻(Spirulina subsalsa)、为首螺旋藻(Spirulina princeps)、宽松螺旋藻(Spirulinalaxissima)、库塔螺旋藻(Spirulinacurta)、卷曲螺旋藻(Spirulina spirulinoides)中的一种以上。
优选地，通过用蛋白水解酶处理螺旋藻得到上述水解物。当通过用强酸或高温处理进行水解时，存在维生素被破坏或如色氨酸等敏感氨基酸受损的问题。与此相反的，利用酶的水解物的优点在于，不仅产率优于酸水解物，对有效成分的损伤也小。
上述蛋白水解酶可以使用选自碱性蛋白酶(Alcalase)、菠萝蛋白酶(bromelain)、风味蛋白酶(flavourzyme)、胰酶(pancreatin)、木瓜蛋白酶(papain)、胃蛋白酶(pepsin)、链霉蛋白酶(pronase)、复合蛋白酶(protamex)、胰蛋白酶(trypsin)或它们的组合中，但不限于此。
根据本发明一实施例，使用碱性蛋白酶(Alcalase)、菠萝蛋白酶(bromelain)、风味蛋白酶(flavourzyme)、胰酶(pancreatin)、木瓜蛋白酶(papain)、胃蛋白酶(pepsin)、链霉蛋白酶(pronase)、复合蛋白酶(protamex)、胰蛋白酶(trypsin)、胃蛋白酶+胰蛋白酶+碱性蛋白酶、胃蛋白酶+胰酶、胃蛋白酶+胰蛋白酶、或者胃蛋白酶+胰酶+木瓜蛋白酶作为水解酶(图2、图9、图11)。其中，尤其，胃蛋白酶+胰酶、胃蛋白酶、胃蛋白酶+胰蛋白酶、链霉蛋白酶、木瓜蛋白酶水解物依次表现出高细胞生长率(图10)。
优选地，以5g/L以下的浓度包含上述螺旋藻水解物。在大于5g/L的浓度下可能存在表现出细胞毒性的问题(图5)。
上述用于细胞培养的培养基组合物中螺旋藻水解物的含量可以为0.1～20体积百分比(v/v)，优选地，可以为1～15体积百分比(v/v)，更优选地，可以为5～10体积百分比(v/v)。
上述用于细胞培养的培养基组合物还可以包含血清，血清以及螺旋藻水解物的含量可以为0.1～20体积百分比(v/v)，优选地，可以为1～15体积百分比(v/v)，更优选地，可以为5～10体积百分比(v/v)。
上述用于细胞培养的培养基组合物中血清的含量可以为0.1～19.9体积百分比(v/v)，优选地，可以为1～15体积百分比(v/v)，更优选地，可以为5～10体积百分比(v/v)。
上述血清可以为动物血液，但不限于此，优选为来自哺乳动物(例如：猪、马、牛、山羊、羊以及狗)的血液的血清，更优选为胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)。
上述用于细胞培养的组合物可以在用于细胞培养的基础培养基(basal medium)中添加适量的本发明的螺旋藻水解物和/或动物血清来使用。上述用于细胞培养的基础培养基包括最低必需培养基(Minimum Essential Medium，MEM)、Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM)、DMEM-F12、罗斯威尔公园纪念研究所培养基(Roswell Park Memorial Institute，RPMI)、无血清角质形成细胞培养基(KeratinocyteSerum Free Medium，K-SFM)、M199、Ham’s F12、Ham’s 10、NCTC 109、NCTC 135、NeuroCult基础培养基(NeuroCult Basal Medium)等，除此以外，只要是本领域使用的培养基就足够，可以包含选自由各种营养成分、矿物质、无机质、维生素、氨基酸、包含肽的重组蛋白、粘附因子、生长因子以及激素组成的组中的一种以上，但不限于此。
优选地，上述用于细胞培养的培养基组合物中血清与螺旋藻水解物的体积比(v/v)为5:5至1:9。可以以5:5、4:6、3:7、2:8、1:9的体积比(v/v)使用血清：螺旋藻水解物，优选地，可以以5:5、3:7、1:9使用。如图5中所确认的，当添加的螺旋藻水解物浓度过高时存在细胞存活率降低的缺点，并且当胎牛血清与SH的比例为0：10时存在细胞生长率显著降低的问题。
可以使用上述用于细胞培养的培养基组合物的细胞的种类没有特别的限制，可以用于培养动物细胞、昆虫细胞或植物细胞，尤其，优选地用于培养人来源细胞。可以使用上述用于细胞培养的培养基组合物的人来源细胞包括H460、Hela、HCT116、T24、IMR90、HEK293、H1299、H358细胞系等，但不限于此。
上述用于细胞培养的培养基组合物可以进行细胞的传代培养，可以进行10代以上的长期传代培养。
实施例
以下，提出优选实施例以帮助理解本发明，但下述实施例仅用于示例本发明，本发明的范围不限于下述实施例。
实施例1：制备螺旋藻水解物
使用两种提取工序，以制备促进细胞增殖的螺旋藻水解物(spirulinahydrolysate，SH)。
如图2所示，将螺旋藻干燥粉末以4％的浓度溶于蒸馏水中后均质化(homogenization)。然后将其分成两份，一份用超声波处理30分钟以破碎细胞，然后在121℃的温度下加热以及加压30分钟进行提取(SH1)。另一份在-50℃以及37℃的温度下反复3次冷冻以及融化的过程以破碎细胞，然后用超声波处理2小时进行提取(SH2)。
为了水解蛋白质，依次用3种作为水解酶的胃蛋白酶(pepsin)(西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich))、胰蛋白酶(trypsin)(西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich))、碱性蛋白酶(Alcalase)(西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich))处理提取物SH1以及SH2以制备水解物。使用螺旋藻干燥重量的1％(w/w)的酶进行水解。分别在螺旋藻提取物SH1以及SH2中添加胃蛋白酶(pepsin)后在37℃的温度、pH2的条件下反应2小时，然后与胰蛋白酶(trypsin)在37℃的温度、pH8的条件下反应2小时。最终与碱性蛋白酶(alcalase)在50℃的温度、pH8的条件下反应2小时以制备水解物。每次酶反应结束后通过在95℃的温度下煮沸10分钟使酶失活，利用HCl以及NaOH滴定用于酶最佳条件的pH。
将上述水解物以9000rpm的转速离心20分钟后仅取上清液并利用1μm的滤纸(filter paper)(沃特曼(Whatman)，梅德斯通(Maidstone)，英格兰(England))过滤，然后以30000rpm的转速离心20分钟以去除细小残留物后仅分离上清液并冷冻干燥。
在用于实验之前，将冷冻干燥的螺旋藻水解粉末溶于蒸馏水中，然后用0.2μm的聚醚砜(polyethersulfone，PES)过滤器(filter)(默克密理博(Merck Millipore)，马萨诸塞州(Massachusetts)，美国(USA))过滤以去除污染源后添加到培养基中并使用。
实施例2：比较根据提取方法的水解物的成分
根据韩国食品法典(2015)以及AOAC法进行SH1以及SH2水解物的常规成分分析，用乙醚提取法分析粗脂肪，用Kjeldahl法分析粗蛋白。对于无机质分析，取1g的试样置于灰化容器中进行碳化后在550℃的温度下加热数小时进行灰化直到得到白色～灰白色灰粉。依次用盐酸分解上述灰粉后稀释、过滤至规定量并利用ICP分析仪(ICP analyzer，Optima8300，珀金埃尔默(Perkin Elmer))进行定量。
对于铅、镉分析，取样品置于坩埚中进行干燥碳化后在450～550℃的温度下进行灰化，然后用水润湿灰粉并添加2～4mL的盐酸在水浴上进行干燥，然后添加4％的硝酸加热溶解，当有不溶物时用玻璃过滤器过滤后定容至20mL以用作试验溶液。将铅、镉的标准溶液、试验溶液以及空白溶液(blank)注入电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES，瓦里安(Varian)，MPX，澳大利亚(AUS))中并进行分析。标准溶液通过将作为参考标准的1000mg/L的标准物质用4％的硝酸稀释来制备混合的浓度为100mg/L的储备(Stock)溶剂，然后将用于试验的标准物质用4％的硝酸再次稀释以用作标准物质。
通过AccQ·Tag氨基酸分析方法(AccQTag amino acid analysis method)(沃特世(Waters)对氨基酸进行分析。分析条件为使用HPLC(Waters 2695，美国(USA))，并使用AccQTag(3.9×150mm)用荧光检测器(EX：250nm，EM：395nm)检测柱。
参考图3a至图3e，分析结果SH1以及SH2之间没有太大差异，但SH1的碳水化合物以及蛋白质含量比SH2高0.3～0.4g。无机质含量中SH2的钾以及锌含量略高于SH1。SH1以及SH2几乎不含重金属。氨基酸的比例相似，氨基酸含量中SH1的谷氨酸(glutamate)以及蛋氨酸(methionine)含量高于SH2。
实施例3：分析螺旋藻水解物制备工序各步骤的SEM图像
在将螺旋藻通过高温高压提取(SH1)方法提取并进行水解的水解物制备过程中，利用场发射扫描电子显微镜(Tescan公司，布尔诺(Brno)，捷克(Czechia))拍摄各步骤的SEM图像。
参考图4可以确认，(A)螺旋藻干燥粉末偶尔可以看出残存棒状的细胞，(B)超声波以及高温高压处理后可以看出螺旋藻被破坏，(C)超声波以及高温高压处理后用酶处理的结果被破坏的螺旋藻被完全分解并以细小的颗粒形式存在。
实施例4：评估螺旋藻水解物的细胞毒性
测定人肺癌组织来源细胞系(H460)中根据水解物的浓度的细胞存活率，以确认用于促进细胞增殖的螺旋藻水解物的合适浓度。将上述实施例1中制备的SH1以及SH2水解物制备成浓度为10～50g/L的储备溶液(stock solution)，并将其用于细胞存活率测定实验。将添加10％的胎牛血清的培养基用作对照组。
利用用于测定细胞中线粒体脱氢酶的活性的EZ-CyTox试剂盒(EZ-CyTox kit)(Daelillab公司，首尔(Seoul)，韩国(Korea))进行细胞存活率测定实验。使用添加10％的胎牛血清的罗斯威尔公园纪念研究所(Roswell Park Memorial Institute，RPMI)1640培养基(Gibco公司，格兰德艾兰(Grand Island)，美国(USA))以及最低必需培养基(MinimumEssential Medium，MEM)(西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich))在37℃的温度、5％的CO2的条件下培养H460细胞系。
将培养的上述细胞分别以5.1×103、3.7×103个细胞/孔(cell/well)的浓度在96孔板(well plate)中接种150μL，24小时后分别添加15μL的SH1以及SH2水解物储备溶液(stock solution)，使得最终浓度达到1～5g/L，然后在37℃的温度、5％的CO2培养箱中培养48小时，然后添加10μL的EZ-CyTox试剂培养3小时后用酶标仪(伯腾(Biotek)，威努斯基市(Winooski)，美国(USA))在450nm处测定吸光度。
参考图5，SH1水解物在3g/L以下、SH2水解物在4g/L以下的浓度下未观察到对H460细胞的毒性。
实施例5：根据提取方法的螺旋藻水解物的细胞增殖效果
使用RPMI 1640在37℃的温度、5％的CO2的条件下培养H460细胞系，以确认SH1以及SH2水解物的细胞增殖促进效果。将培养的上述细胞以2.0×105个细胞/培养皿(cell/dish)的浓度接种(seeding)于60mm的培养皿(cell culture dish)中。
以添加10％的胎牛血清的培养基为标准，在以3％以及1％的浓度添加胎牛血清的培养基中分别添加7％以及9％的SH1以及SH2水解物储备液(stock)(SH1-A：SH1浓度为10g/L，SH1-B：SH1浓度为20g/L，SH2-A：SH2浓度为10g/L，SH2-B：SH2浓度为20g/L)，然后将H460细胞传代培养10代并测定每一代的细胞数量以观察细胞增殖，培养10代后利用EZ-CyTox试剂测定细胞存活率。
参考图6a至图6b，在培养基中添加3％的胎牛血清以及7％的SH1以及SH2水解物后培养H460的结果，所有实验组的细胞生长率均表现出高于添加10％的胎牛血清的对照组(图6a)。从第3天开始，所有实验组的细胞存活率也表现出高于对照组的值，当添加7％的SH1浓度为20g/L(SH1-B)、SH2浓度为10g/L(SH2-A)的储备液(stock)时表现出最高的细胞存活率(图6b)。培养的细胞的形态也与对照组相似(图7)。
参考图6c以及图6d，在培养基中添加1％的胎牛血清以及9％的SH1以及SH2水解物后培养H460的结果，在添加SH2浓度为10g/L的储备液(stock)(SH2-A)的培养基中观察到与添加10％的胎牛血清的对照组相似的细胞生长率，在添加SH2浓度为20g/L(SH-2B)的储备液(stock)的培养基中观察到略低于添加10％的胎牛血清的对照组的细胞生长率。相反，在添加9％的SH1浓度为10g/L(SH1-A)、SH1浓度为20g/L(SH1-B)的SH1水解物储备液(stock)的培养基中，所有实验组的细胞生长率均表现出高于添加10％的胎牛血清的培养基(图6c)。从第3天开始，所有实验组的细胞存活率也表现出高于对照组的值，当添加9％的SH1浓度为20g/L(SH1-B)、SH2浓度为10g/L(SH2-A)的储备液(stock)时表现出最高的细胞存活率(图6d)。并且没有观察到培养的细胞的形态变化(图8)。
在添加3％的胎牛血清的培养基中，添加浓度为10g/L、20g/L的储备液(stock)的培养基的细胞生长率均表现出高于添加10％的胎牛血清的培养基，并且在添加1％的胎牛血清的培养基中，所有实验组的细胞生长率没有表现出显著差异，因此以10g/L的最低浓度制备储备液并用于后续实验，根据SH1以及SH2提取方法的细胞生长率也没有表现出显著差异，因此利用SH1提取物进行后续实验。
实施例6：比较根据水解酶的细胞生长率
比较水解物根据水解酶的细胞生长增殖效果。如图9所示，为了比较水解物根据水解酶的细胞增殖能力，如上述实施例1所述，将4％的螺旋藻溶液进行均质化(homogenization)后通过超声波处理30分钟以破碎细胞，然后在121℃的温度下加热加压30分钟进行提取，然后分别用碱性蛋白酶(Alcalase)(50℃，pH8)(西格玛奥德里奇(SigmaAldrich))、菠萝蛋白酶(bromelain)(50℃，pH6)(西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich)、风味蛋白酶(flavourzyme)(50℃，pH7)(西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich))、胰酶(pancreatin)(37℃，pH7)(西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich))、木瓜蛋白酶(papain)(60℃，pH7)(西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich))、胃蛋白酶(pepsin)(37℃，pH2)(西格玛奥德里奇(SigmaAldrich))、链霉蛋白酶(pronase)(37℃，pH8)(西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich))、复合蛋白酶(protamex)(50℃，pH7)(西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich))、胰蛋白酶(trypsin)(37℃，pH8)(西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich))处理提取的提取物(SH-1)2小时以制备9种水解物，并制备依次用胃蛋白酶(pepsin)以及胰酶(pancreatin)处理2小时的水解物、以及依次用胃蛋白酶(pepsin)以及胰蛋白酶(trypsin)处理2小时的水解物，总共制备11种水解物。
酶反应结束后，如上述实施例1所述，将通过以9000rpm的转速离心20分钟得到的上清液用1um的滤纸(filter paper)过滤，然后以30000rpm的转速离心20分钟后仅分离上清液并冷冻干燥。在用于实验之前，将水解物溶于蒸馏水中，然后用0.2μm的PES过滤器(filter)过滤以去除各种污染源后添加到培养基中并使用。
在上述实施例5中确认，H460细胞在添加1％的胎牛血清、9％的螺旋藻水解物的培养基中表现出与添加10％的胎牛血清的培养基相似的细胞生长率。基于上述结果，在添加1％的胎牛血清的培养基中添加9％的通过水解酶组合制备的11种水解物，然后传代培养6代的H460细胞系后测定细胞生长率，以确认水解物根据水解酶的细胞生长促进效果。
参考图10，与添加10％的胎牛血清的对照组相比，H460细胞在一起用胃蛋白酶(pepsin)以及胰酶(pancreatin)处理的水解物中表现出106％的最高的细胞生长率，细胞生长率依次以胃蛋白酶(pepsin)、胃蛋白酶(pepsin)+胰蛋白酶(trypsin)、链霉蛋白酶(pronase)、木瓜蛋白酶(papain)水解物的顺序高。
实施例7：制备通过水解酶组合的3种水解物
通过胃蛋白酶(pepsin)、胰蛋白酶(trypsin)、木瓜蛋白酶(papain)水解酶的组合制备由上述实施例表现出高细胞增殖效果的3种水解物，以优化细胞增殖促进添加物的水解条件。
具体地，如图11所示，制备螺旋藻提取物SH1后依次用胃蛋白酶(pepsin)(37℃，pH2)、胰酶(pancreatin)(37℃，pH7)、木瓜蛋白酶(papain)(60℃，pH7)处理2小时以分别制备3种仅用胃蛋白酶(pepsin)处理的水解物(PA)、用胃蛋白酶(pepsin)以及胰酶(pancreatin)处理的水解物(PB)、用胃蛋白酶(pepsin)、胰酶(pancreatin)以及木瓜蛋白酶(papain)处理的水解物(PC)。每一次酶反应结束后在95℃的温度下煮沸10分钟使酶失活，然后将通过以9000rpm的转速离心20分钟得到的上清液用1um的滤纸(filter paper)过滤，然后以30000rpm的转速离心20分钟后取上清液并冷冻干燥。在用于细胞培养之前，将冷冻干燥的水解物粉末以10g/L的浓度溶于蒸馏水中，然后用0.2μm的PES过滤器(filter)过滤以去除各种污染源后制备成储备液(stock)，然后将其添加到培养基中并使用。
实施例8：制备通过水解酶组合的3种水解物
在SH1提取工序后，将通过3种水解酶组合制备的水解物(PA、PB、PC)添加到培养基中后培养H460细胞系并测定细胞生长率以及细胞存活率。在添加5％、3％、1％的胎牛血清的培养基中分别添加5％、7％、9％的水解物并用于细胞培养。
图12a至图12f示出H460细胞系的细胞生长率以及细胞存活率，当在5％的胎牛血清培养基中添加5％的水解物后进行培养时，与10％的胎牛血清相比，在PB以及PC组中表现出110％以及114％的高细胞生长率(图12a)，与10％的胎牛血清相比，在PA以及PC组中表现出139％的最高的细胞存活率(图12b)。
并且，当在3％的胎牛血清培养基中添加7％的水解物后进行培养时，与10％的胎牛血清相比，在PB以及PC组中表现出121％、117％的高生长率(图12c)，并且与对照组相比，在PA、PB以及PC组中也均表现出130％以上非常高的细胞存活率(图12d)。
并且，即使当在1％的胎牛血清培养基中添加9％的水解物后进行培养时，与10％的胎牛血清对照组相比，在PB以及PC组中表现出110％、114％的高细胞生长率(图12e)，在添加所有水解物的组中表现出高于对照组的细胞存活率，尤其，与对照组相比，在PA以及PC组中表现出139％的最高的细胞存活率(图12f)。
参考图13a至图13c，在添加5％、3％、1％的胎牛血清以及5％、7％、9％的水解物PA、PB、PC后进行培养的所有组中，H460细胞系的形态均未观察到特异性的形态变化，并且与对照组相似。
实施例9：螺旋藻水解物的Hela细胞增殖功效
如实施例8所述，将螺旋藻水解物(PA、PB、PC)添加到培养基中后培养Hela细胞系并测定细胞生长率以及细胞存活率。利用最低必需培养基(Minimum Essential Medium，MEM)(西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich))在37℃的温度、5％的CO2的条件下培养HeLa。
图14a至图14d示出Hela细胞系的细胞生长率以及细胞存活率，当在5％的胎牛血清培养基中添加5％的水解物后进行培养时，与10％的胎牛血清培养基相比，在PA以及PC中表现出106％、109％的高细胞生长率(图14a)，并且与对照组相比，在PA以及PC组中表现出120％，119％的高细胞存活率(图14b)。
并且，当在3％的胎牛血清培养基中添加7％的水解物后进行培养时，与10％的胎牛血清相比，在PA以及PC水解物组中分别表现出109％的高细胞生长率(图14c)，并且与10％的胎牛血清相比，在添加PA以及PC的培养基中进行培养的组分别表现出123％以及116％的高细胞存活率(图14d)。
参考图15a至图15b，在添加5％、3％的胎牛血清以及5％、7％的水解物PA、PB、PC后进行培养的所有组中，Hela细胞系形态未观察到特异性的形态变化，并且表现出与对照组相似的形态。
至此，说明与本发明的用于细胞培养的培养基组合物以及其制备方法相关的具体实施例，但显而易见的是，在不脱离本发明的范围的情况下可以进行各种变形。
因此，本发明的范围不应限于所说明的实施例，并且应由后述的发明要求范围以及与其发明要求范围等同的范围定义。
即，应理解上述实施例在所有方面均未示例性的，而不是限制性的，并且应解释为本发明的范围显示在后述的发明要求保护范围中而不是详细说明，从其发明要求保护范围的含义、范围以及其等同概念中导出的所有变更或变形的形式都包含在本发明的范围内。
产业可利用性
本发明涉及一种用于细胞培养的培养基组合物以及其制备方法，通过用螺旋藻水解物代替动物血清，可以在显著减少动物血清的添加量的同时以与包含动物血清的培养基相同或更高水平诱导细胞的生长并促进增殖。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种用于细胞培养的培养基组合物的制备方法，其特征在于，包括：
第一步骤，从螺旋藻中得到螺旋藻提取物；
第二步骤，通过用蛋白水解酶处理螺旋藻提取物来制备螺旋藻水解物；以及
第三步骤，过滤以及回收螺旋藻水解物。
2.根据权利要求1所述的用于细胞培养的培养基组合物的制备方法，其特征在于，上述螺旋藻为选自极大螺旋藻、钝顶螺旋藻、吉特勒氏螺旋藻、连体螺旋藻、大螺旋藻、盐泽螺旋藻、为首螺旋藻、宽松螺旋藻、库塔螺旋藻、卷曲螺旋藻中的一种以上。
3.根据权利要求1所述的用于细胞培养的培养基组合物的制备方法，其特征在于，在第一步骤中，将螺旋藻溶液均质化后，(a)超声波处理后在高温以及高压下进行提取，或者(b)冻融溶解后，通过超声波处理进行提取。
4.根据权利要求1所述的用于细胞培养的培养基组合物的制备方法，其特征在于，第二步骤中的水解酶具有蛋白质分解能力。
5.根据权利要求1所述的用于细胞培养的培养基组合物的制备方法，其特征在于，第二步骤中的水解酶使用一种或两种以上的组合。
6.根据权利要求5所述的用于细胞培养的培养基组合物的制备方法，其特征在于，依次使用两种以上的水解酶。
7.根据权利要求1所述的用于细胞培养的培养基组合物的制备方法，其特征在于，第二步骤中的水解酶选自碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶、风味蛋白酶、胰酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶、复合蛋白酶、胰蛋白酶或它们的组合中。
8.根据权利要求1所述的用于细胞培养的培养基组合物的制备方法，其特征在于，在第三步骤中，离心螺旋藻水解物后过滤上清液，离心滤液后分离上清液并进行冷冻干燥。
9.一种用于细胞培养的培养基组合物，其特征在于，包含螺旋藻水解物作为有效成分。
10.根据权利要求9所述的用于细胞培养的培养基组合物，其特征在于，上述水解物通过用蛋白水解酶处理螺旋藻提取物来得到。
11.根据权利要求10所述的用于细胞培养的培养基组合物，其特征在于，上述水解酶选自胃蛋白酶、胰酶、胰蛋白酶、链霉蛋白酶、木瓜蛋白酶或它们的组合中。
12.根据权利要求9所述的用于细胞培养的培养基组合物，其特征在于，上述螺旋藻水解物的浓度为5g/L以下。
13.根据权利要求12所述的用于细胞培养的培养基组合物，其特征在于，螺旋藻水解物的含量为0.1～20体积百分比(v/v)。
14.根据权利要求12所述的用于细胞培养的培养基组合物，其特征在于，血清以及螺旋藻水解物的含量为0.1～20体积百分比(v/v)。
15.根据权利要求14所述的用于细胞培养的培养基组合物，其特征在于，血清的含量为0.1～19.9体积百分比(v/v)。
16.根据权利要求14所述的用于细胞培养的培养基组合物，其特征在于，血清与螺旋藻水解物的体积比(v/v)为5:5至1:9。
17.根据权利要求9所述的用于细胞培养的培养基组合物，其特征在于，上述细胞为动物细胞、昆虫细胞或植物细胞。
说明或声明(按照条约第19条的修改)
1.修改的权利要求
明确修改权利要求1、11。
通过引用权利要求10、说明书中的段落[25]、[84-85]的内容来明确权利要求1中修改的“蛋白水解酶”，因此上述修改得到说明书的支持。
权利要求11中记载的被引用的“权利要求9”为笔误，因此将其修改为“权利要求10”。
2.修改内容
将权利要求1中记载的“第二步骤，通过用水解酶处理螺旋藻提取物来制备螺旋藻水解物”修改为“第二步骤，通过用蛋白水解酶处理螺旋藻提取物来制备螺旋藻水解物”来使其明确，并且将权利要求11中记载的被引用的“权利要求9”修改为“权利要求10”以消除歧义。
3.根据权利要求的修改的与说明书及附图的关系
以上所述的权利要求修改未增加新事项，仅进一步明确以得到说明书的支持，不给说明书和附图带来任何影响。

Claims (17)

1.一种用于细胞培养的培养基组合物的制备方法，其特征在于，包括：
第一步骤，从螺旋藻中得到螺旋藻提取物；
第二步骤，通过用水解酶处理螺旋藻提取物来制备螺旋藻水解物；以及
第三步骤，过滤以及回收螺旋藻水解物。
2.根据权利要求1所述的用于细胞培养的培养基组合物的制备方法，其特征在于，上述螺旋藻为选自极大螺旋藻(Spirulina maxima)、钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)、吉特勒氏螺旋藻(Spirulina geitleri)、连体螺旋藻(Spirulina siamese)、大螺旋藻(Spirulina major)、盐泽螺旋藻(Spirulina subsalsa)、为首螺旋藻(Spirulinaprinceps)、宽松螺旋藻(Spirulinalaxissima)、库塔螺旋藻(Spirulina curta)、卷曲螺旋藻(Spirulina spirulinoides)中的一种以上。
3.根据权利要求1所述的用于细胞培养的培养基组合物的制备方法，其特征在于，在第一步骤中，将螺旋藻溶液均质化后，(a)超声波处理后在高温以及高压下进行提取，或者(b)冻融(freeze-thaw)溶解后，通过超声波处理进行提取。
4.根据权利要求1所述的用于细胞培养的培养基组合物的制备方法，其特征在于，第二步骤中的水解酶具有蛋白质分解能力。
5.根据权利要求1所述的用于细胞培养的培养基组合物的制备方法，其特征在于，第二步骤中的水解酶使用一种或两种以上的组合。
6.根据权利要求5所述的用于细胞培养的培养基组合物的制备方法，其特征在于，依次使用两种以上的水解酶。
7.根据权利要求1所述的用于细胞培养的培养基组合物的制备方法，其特征在于，第二步骤中的水解酶选自碱性蛋白酶(Alcalase)、菠萝蛋白酶(bromelain)、风味蛋白酶(flavourzyme)、胰酶(pancreatin)、木瓜蛋白酶(papain)、胃蛋白酶(pepsin)、链霉蛋白酶(pronase)、复合蛋白酶(protamex)、胰蛋白酶(trypsin)或它们的组合中。
8.根据权利要求1所述的用于细胞培养的培养基组合物的制备方法，其特征在于，在第三步骤中，离心螺旋藻水解物后过滤上清液，离心滤液后分离上清液并进行冷冻干燥。
9.一种用于细胞培养的培养基组合物，其特征在于，包含螺旋藻(Spirulina)水解物作为有效成分。
10.根据权利要求9所述的用于细胞培养的培养基组合物，其特征在于，上述水解物通过用蛋白水解酶处理螺旋藻提取物来得到。
11.根据权利要求9所述的用于细胞培养的培养基组合物，其特征在于，上述水解酶选自胃蛋白酶、胰酶、胰蛋白酶、链霉蛋白酶、木瓜蛋白酶或它们的组合中。
12.根据权利要求9所述的用于细胞培养的培养基组合物，其特征在于，上述螺旋藻水解物的浓度为5g/L以下。
13.根据权利要求12所述的用于细胞培养的培养基组合物，其特征在于，螺旋藻水解物的含量为0.1～20体积百分比(v/v)。
14.根据权利要求12所述的用于细胞培养的培养基组合物，其特征在于，血清以及螺旋藻水解物的含量为0.1～20体积百分比(v/v)。
15.根据权利要求14所述的用于细胞培养的培养基组合物，其特征在于，血清的含量为0.1～19.9体积百分比(v/v)。
16.根据权利要求14所述的用于细胞培养的培养基组合物，其特征在于，血清与螺旋藻水解物的体积比(v/v)为5:5至1:9。
17.根据权利要求9所述的用于细胞培养的培养基组合物，其特征在于，上述细胞为动物细胞、昆虫细胞或植物细胞。
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