KR102494136B1 - 배양육 생산용 근육세포 배양용 배지 조성물, 이의 제조방법 및 세포 생산 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 근육세포 배양용 배지 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 동물 혈청을 스피룰리나 가수분해물로 대체하여 동물 혈청의 첨가량을 현저하게 감소시키면서도 동물 혈청을 포함한 배지와 동등하거나 더 높은 수준으로 근육세포의 성장을 유도하고 증식을 촉진하므로 배양육의 생산에 효율적으로 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 스피룰리나 가수분해물을 포함하는 근육세포 배양용 배지 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 근육세포의 배양을 위해 세포배양용 배지에 첨가되던 동물 혈청을 스피룰리나 가수분해물로 대체하는 근육세포 배양용 배지 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
국제연합 식량농업기구(FAO)에서 발간한 보고서에 따르면, 세계 인류는 2018년 7월 기준 76억 4천만 명에서 2050년에는 92억 명으로 매년 0.6% 증가 예측하고 있으며, 이에 따라 육류 소비량은 2018년 304만 톤에서 매년 1.3%씩 증가하여 2050년에는 455만 톤에 이를 것으로 전망하고 있다. 미래의 인구 증가에 따른 식량부족은 그에 따르는 환경문제, 윤리문제 등 다양한 이슈를 포함하고 있어, 이 각 분야에 모두 대응할 수 있는 인공육 개발이 필요하다. 이러한 축산물을 대체할 수 있는 '대체 축산물'은 기존 육류 대비 자원 투입량과 온실가스 사용량이 전반적으로 낮고 악취 등 환경오염물질 발생 감소시킬 수 있다.
대표적인 대체 육류로는 식물성 대체육, 식용곤충, 배양육 등이 주목 받고 있으며, 향후 가축의 사육을 통한 식육 증산과 대체육 개발 및 생산은 서로 상호 보완적으로 인간에게 필수적인 영양, 특히 고급 단백질 식량자원을 제공할 것으로 예상된다. OECD 36개국 중 우리나라는 곡물자급률 최하위 국가이며 소고기 자급율도 2018년에는 40% 이하로 감소하여, 수입 소고기에 대응하는 저비용, 고효율 생산 시스템 개발이 필요하다.
전 세계적으로 여러 연구진이 배양육과 관련한 연구를 진행하고 있으나 식물성 대체육과 식용곤충에 비해 배양육은 상업적인 생산 단계까지 상용화되지는 않은 상태이다. 이는 대량 생산 프로세스에서 발생하는 고비용의 문제와 동물세포 배양액으로 인한 제약이 크기 때문이다.
동물세포 배양에 필수적인 혈청은 소태아, 송아지, 말, 양, 돼지, 개, 염소 등의 동물에서 분리하여 사용되는데, 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)이 가장 일반적으로 사용된다. 그러나 소태아혈청의 제조과정을 보면 임신한 어미 소의 자궁에서 소태아를 적출하여 소태아 심장에 바늘을 꽂아 혈액을 채취한 후 혈청을 분리하여 사용하는데 이 과정이 매우 비윤리적이고 비환경적이다. 또한, 생산과정의 어려움과 희소성으로 산업적으로 생산 가능한 소태아혈청 제품은 매우 높은 가격이 책정되는 고비용 구조의 심각한 문제점이 있다. 또, 국제사회의 동물 실험 자제권고로 높아지는 세포 연구 의존도는 소태아혈청 공급의 불안정화와 산·학·연의 연구재료비 부담으로 이어지고 있다. 이에 미국 FDA(US Food and Drug Administration), 유럽연합의 EMEA(European Medicines Agency) 및 국제사회는 소태아혈청 사용의 자제와 혈청 대체재 개발을 권고하고 있는 실정이다.
최근 소태아혈청 대체재로 무혈청배지가 각광받고 있다. 무혈청 배지는 비윤리적, 비환경적, 고비용 문제점을 가진 혈청을 사용하지 않는 세포배양용 배지로 합성배지에 세포배양에 필수적인 다양한 호르몬과 성장인자를 재조합 단백질 합성 기술로 생산하여 첨가해 줌으로 혈청의 사용을 불필요하게 한 세포배양용 배지이다. 하지만, 무혈청 배지에서 세포배양이 가능한 세포주의 종류가 한정적이고, 배양을 위한 세포주 적응 과정이 번거로우며 소태아혈청을 사용하는 대신 재조합 단백질의 첨가가 필요하기 때문에 여전히 고비용 문제점이 있다.
따라서, 배양육 생산에 사용할 수 있는, 표준화 및 대량 생산이 용이하고 무혈청, 무항생제, 무성장인자 등의 친환경적인 배양액을 개발하여 소태아 혈청을 대체함으로써 경제성과 안전성을 확보하는 것이 중요하다.
한편, 스피룰리나 속(Spirulina sp.)은 남조류의 일종으로 WHO에서 완전식품, 수퍼푸드 등으로 인정받아 의료, 건강, 기아해방프로그램 등에 이용되고 있으며, NASA에서는 우주식량으로서 연구·개발을 진행하고 있고, FDA 및 식약처에 그 안전성을 인정받은 생물 소재이다. 친환경적인 스피룰리나 속(Spirulina sp.)은 피코시아닌, 베타카로틴, Ca-Sp, GLA 및 Immolina 등의 생리활성물질을 함유하여 세포 활성 및 면역시스템을 촉진하는 것으로 보고되었고, 노화 및 각종 질병의 원인인 활성산소를 억제하는 항산화 효과가 녹황색야채의 20배에 이르고 Kg당 우유 칼슘의 10배, 당근 베타카로틴의 20배, 시금치 철분의 50배, 계란의 5배 높은 단백질 함유량이 있으며, 미네랄, 비타민, EPA 및 천연색소 등 영양학적으로 완벽한 생물 소재이다. 스피룰리나 속(Spirulina sp.)은 세포분열 및 세포성장 속도가 매우 빨라 단위면적당 생산량이 육상 동·식물에 비해 훨씬 높고, 육상 동·식물에 비교하여 생산비용이 매우 적게 들며, 환경이 척박한 사막 지역에서도 배양이 가능하고 대량배양 후 원료 수거가 용이할 뿐만 아니라 이미 800억 원 규모의 국내 시장이 형성되어 있어 의학·바이오연구 및 산업 분야에 큰 활용 잠재력을 가진 생물자원 이다.
이에 본 발명자들은 안전하고 친환경적인 스피룰리나 가수분해물을 합성배지에 첨가하여 배양육 생산을 위한 근육세포 배양용 배지에 사용시 혈청이 포함된 배지와 유사하거나 더 높은 수준의 효과를 나타내는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은, 동물 혈청의 사용량을 감소시키면서 근육세포를 안정적으로 배양할 수 있는 근육세포 배양용 배지 조성물과 그 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은, 동물 혈청의 사용량을 감소시키면서 근육세포의 성장과 증식 유도능이 우수한 근육세포 배양용 배지 조성물과 그 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제(들)로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제(들)는 이하의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 스피룰리나로부터 스피룰리나 추출물을 수득하는 제1단계; 스피룰리나 추출물에 펩신을 처리한 후 판크레아틴을 처리하여 스피룰리나 가수분해물을 제조하는 제2단계; 스피룰리나 가수분해물을 여과 및 회수하여 스피룰리나 가수분해물 분말을 제조하는 제3단계; 및 스피룰리나 가수분해물 분말과 소혈청태아의 혼합액을 세포배양용 기본 배지에 첨가하는 제4단계;를 포함하고, 상기 제4단계는 상기 스피룰리나 가수분해물의 분말을 20g/L로 포함한 용액과 소태아혈청을 5:5 내지 7:3의 부피비(v/v)로 혼합하여 세포배양용 기본 배지의 10%(v/v)로 첨가하며, 배양육 생산에 사용되는, 근육세포 배양용 배지 조성물의 제조방법을 제공한다.
상기 스피룰리나는 스피룰리나 맥시마(Spirulina maxima), 스피룰리나 플라텐시스(Spirulina platensis), 스피룰리나 게이트레리(Spirulina geitleri), 스피룰리나 사이아메제(Spirulina siamese), 스피룰리나 메이어(Spirulina major), 스피룰리나 서브살사(Spirulina subsalsa), 스피룰리나 프린세프스(Spirulina princeps), 스피룰리나 락시시마(Spirulinalaxissima), 스피룰리나 쿠르타(Spirulina curta), 스피룰리나 스피룰리노이데스(Spirulina spirulinoides) 중 하나 이상일 수 있다.
상기 제1단계는 스피룰리나의 세포막을 파쇄하고, 고온 및 고압에서 추출하는 것 일 수 있다.
상기 제3단계는 스피룰리나 가수분해물을 원심분리 후 상등액을 여과하고, 여과액을 원심분리 후 상등액을 분리하여 동결건조하는 것 일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명은 스피룰리나로부터 스피룰리나 추출물을 수득하는 제1단계; 스피룰리나 추출물에 펩신을 처리한 후 판크레아틴을 처리하여 스피룰리나 가수분해물을 제조하는 제2단계; 스피룰리나 가수분해물을 여과 및 회수하여 스피룰리나 가수분해물 분말을 제조하는 제3단계; 스피룰리나 가수분해물 분말과 소혈청태아의 혼합액을 세포배양용 기본 배지에 첨가하는 제4단계;를 포함하여 제조되고, 상기 제4단계는 상기 스피룰리나 가수분해물의 분말을 20g/L로 포함한 용액과 소태아혈청을 5:5 내지 7:3의 부피비(v/v)로 혼합하여 세포배양용 기본 배지의 10%(v/v)로 첨가하며, 배양육 생산에 사용되는, 근육세포 배양용 배지 조성물을 제공한다.
상기 근육세포는 소, 돼지, 닭 중 어느 하나의 초기 근육세포인 것 일 수 있다.
상기 근육세포 배양용 배지 조성물은 근육세포의 계대배양 회수 증가에 따라 스피룰리나 가수분해물의 함량비를 증가시키고 소태아혈청의 함량비를 감소시키는 것 일 수 있다.
본 발명의 근육세포 배양용 배지 조성물 및 이의 제조방법에 따르면, 동물 혈청의 첨가량을 현저하게 감소시키면서도 동물 혈청을 포함한 배지와 동등하거나 더 높은 수준으로 근육세포의 성장을 유도하고 증식을 촉진하여 배양육을 생산하는 효과가 있다.
본 발명의 근육세포 세포 배양용 배지 조성물 및 이의 제조방법에 따르면, 종래의 스피룰리나 추출물 세포배양액(SACCS)이 스피룰리나 단백질을 고분자 형태로 포함하는 것에 반해, 본 발명의 세포 배양용 배지 조성물은 스피룰리나 단백질을 가수분해 한 펩타이드 형태의 스피룰리나 가수분해물(SH)을 포함함으로써 세포의 성장과 증식에 더 큰 효과를 나타낸다.
본 발명의 근육세포 배양용 배지 조성물 및 이의 제조방법에 따르면, 배양육 생산과정에서 동물에서 유래되는 감염을 줄이고, 항생제나 성장인자로 인한 위험성을 낮추며, 동물 혈청을 얻는 과정에서 발생하는 환경적, 윤리적 문제를 감소시킬 수 있다.
본 발명의 근육세포 배양용 배지 조성물 및 이의 제조방법에 따르면, 기존 배양육 생산에 사용되는 고비용의 동물 혈청의 일정 비율을 스피룰리나 가수분해물로 대체함으로써 배양육 생산의 비용을 줄이는 효과가 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명의 근육세포 배양용 배지 조성물의 제조방법의 공정흐름도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 근육세포 배양용 배지 조성물의 제조방법을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 근육세포 배양용 배지의 농도에 따른 근육세포의 독성시험 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 1~5 세대에서 FBS의 50, 70, 90%를 SH로 대체한 배지에서 배양한 근육세포의 세포성장률을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 1~5 세대에서 FBS의 50, 70, 90%를 SH로 대체한 배지에서 배양한 근육세포의 형태를 관찰한 것이다.
도 6a은 본 발명의 일 실시예에 따라 1~10 세대에서 FBS의 50%를 SH (10g/L, 20g/L)로 대체한 배지에서 근육세포의 세포성장률을 나타낸 것이고, 도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따라 1~10 세대에서 FBS의 70%를 SH(10g/L, 20g/L)로 대체한 배지에서 근육세포의 세포성장률을 나타낸 것이다.
도 7a은 본 발명의 일 실시예에 따라 1~10 세대에서 FBS의 50%를 SH(10g/L, 20g/L)로 대체한 배지에서 근육세포의 세포생존율을 나타낸 것이고, 도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따라 1~10 세대에서 FBS의 70%를 SH(10g/L, 20g/L)로 대체한 배지에서 근육세포의 세포생존율을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 FBS의 50%와 70%를 SH(10g/L, 20g/L)로 대체한 배지에서 10세대 계대 배양한 근육세포의 형태를 관찰한 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 FBS의 50%와 70%를 SH(10g/L, 20g/L)로 대체한 배지에서 10세대 계대 배양한 근육세포의 세포주기를 관찰한 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 근육세포 배양용 배지 조성물의 제조방법을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 근육세포 배양용 배지의 농도에 따른 근육세포의 독성시험 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 1~5 세대에서 FBS의 50, 70, 90%를 SH로 대체한 배지에서 배양한 근육세포의 세포성장률을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 1~5 세대에서 FBS의 50, 70, 90%를 SH로 대체한 배지에서 배양한 근육세포의 형태를 관찰한 것이다.
도 6a은 본 발명의 일 실시예에 따라 1~10 세대에서 FBS의 50%를 SH (10g/L, 20g/L)로 대체한 배지에서 근육세포의 세포성장률을 나타낸 것이고, 도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따라 1~10 세대에서 FBS의 70%를 SH(10g/L, 20g/L)로 대체한 배지에서 근육세포의 세포성장률을 나타낸 것이다.
도 7a은 본 발명의 일 실시예에 따라 1~10 세대에서 FBS의 50%를 SH(10g/L, 20g/L)로 대체한 배지에서 근육세포의 세포생존율을 나타낸 것이고, 도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따라 1~10 세대에서 FBS의 70%를 SH(10g/L, 20g/L)로 대체한 배지에서 근육세포의 세포생존율을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 FBS의 50%와 70%를 SH(10g/L, 20g/L)로 대체한 배지에서 10세대 계대 배양한 근육세포의 형태를 관찰한 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 FBS의 50%와 70%를 SH(10g/L, 20g/L)로 대체한 배지에서 10세대 계대 배양한 근육세포의 세포주기를 관찰한 것이다.
이하 첨부된 도면을 참조하면서 본 발명에 따른 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것을 달성하는 방법은 첨부된 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다.
그러나 본 발명은 이하에 개시되는 실시예들에 의해 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
또한, 본 발명을 설명함에 있어 관련된 공지 기술 등이 본 발명의 요지를 흐리게 할 수 있다고 판단되는 경우 그에 관한 자세한 설명은 생략하기로 한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
근육세포 배양용 배지 조성물의 제조방법
본 발명은 스피룰리나로부터 스피룰리나 추출물을 수득하는 제1단계; 스피룰리나 추출물에 펩신을 처리한 후 판크레아틴을 처리하여 스피룰리나 가수분해물을 제조하는 제2단계; 스피룰리나 가수분해물을 여과 및 회수하여 스피룰리나 가수분해물 분말을 제조하는 제3단계; 및 스피룰리나 가수분해물 분말과 소혈청태아의 혼합액을 세포배양용 기본 배지에 첨가하는 제4단계;를 포함하고, 상기 제4단계는 상기 스피룰리나 가수분해물의 분말을 20g/L로 포함한 용액과 소태아혈청을 5:5 내지 7:3의 부피비(v/v)로 혼합하여 세포배양용 기본 배지의 10%(v/v)로 첨가하며, 배양육 생산에 사용되는, 근육세포 배양용 배지 조성물의 제조방법을 제공한다.
이하, 도 1을 참조하여 본 발명의 근육세포 배양용 배지 조성물의 제조방법을 설명한다.
제1단계: 스피룰리나로부터 스피룰리나 추출물을 수득한다(S100).
본 단계는 스피룰리나 용액을 균질화 한 후, 스피룰리나의 세포막을 파쇄하고, 고온 및 고압으로 처리하여 추출물을 수득할 수 있다.
상기 스피룰리나는 스피룰리나 맥시마(Spirulina maxima), 스피룰리나 플라텐시스(Spirulina platensis), 스피룰리나 게이트레리(Spirulina geitleri), 스피룰리나 사이아메제(Spirulina siamese), 스피룰리나 메이어(Spirulina major), 스피룰리나 서브살사(Spirulina subsalsa), 스피룰리나 프린세프스(Spirulina princeps), 스피룰리나 락시시마(Spirulinalaxissima), 스피룰리나 쿠르타(Spirulina curta), 스피룰리나 스피룰리노이데스(Spirulina spirulinoides) 중 선택된 하나 이상인 것이 바람직하다.
상기 스피룰리나의 형태는 특별히 제한되지는 않으나, 분말 형태인 것이 바람직하다.
세포막 파쇄는 초음파, 용해효소, 동결-해동 용해, 가열, 가압, 압착기, 구슬 분쇄기 등의 방법을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예로, 스피룰리나 분말에 용매를 혼합하여 스피룰리나 용액을 제조하고, 균질화(homogenization) 한 후, 초음파를 이용하여 세포막을 파쇄한 후, 열과 압력을 가하여 스피룰리나 추출물을 수득할 수 있다(도 2).
제2단계: 가수분해 효소를 처리하여 스피룰리나 가수분해물을 제조한다(S200).
본 단계에서는 스피룰리나 추출물에 가수분해 효소를 처리하여 가수분해 수율을 향상시키고 유효 성분의 손상을 최소화 할 수 있다. 강산이나 고온 처리를 통해 가수분해하는 경우, 비타민이 파괴되거나 트립토판과 같은 민감한 아미노산이 손상되는 문제가 발생한다. 이에 반해, 효소를 이용한 가수분해물은 산 가수분해물보다 수율이 우수할 뿐 아니라 유효 성분의 손상이 적다는 장점이 있다.
상기 가수분해 효소는 단백질 분해능을 가진 것이 바람직하다.
또한, 상기 가수분해 효소는 1종 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
상기 가수분해 효소로는, 알칼라아제(Alcalase), 브로멜라인(bromelain), 플라보자임(flavourzyme), 판크레아틴(pancreatin), 파파인(papain), 펩신(pepsin), 프로나아제(pronase), 프로타멕스(protamex), 트립신(trypsin), 또는 이들의 조합 중에서 선택된 것을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 펩신, 판크레아틴 또는 이들의 조합에서 선택된 것을 사용할 수 있으며, 펩신과 판크레아틴을 함께 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 펩신과 판크레아틴을 함께 가수분해 효소로 사용하였다(도 2).
상기와 같이 2종 이상의 가수분해 효소를 조합하여 사용하는 경우에는, 각 가수분해 효소의 반응 온도와 pH가 상이하므로, 각 가수분해 효소의 최적조건(반응 온도, pH, 시간 등)에서 반응할 수 있도록 순차적으로 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 도 2와 같이 펩신과 판크레아틴을 조합하여 사용하는 경우, 스피룰리나 추출물에 1) 펩신은 37 ℃, pH 2에서 2시간 반응시킨 후, 판크레아틴은 37 ℃, pH 7.5에서 2시간 반응시켜 스피룰리나 가수분해물을 제조하는 것이 바람직하다.
상기 효소 반응 후에는 열을 가하여 효소를 불활성화시키는 것이 바람직하다.
제3단계: 스피룰리나 가수분해물을 여과 및 회수하여 스피룰리나 가수분해물 분말을 제조한다(S300).
본 단계는 스피룰리나 가수분해물을 여과 및 회수하여 스피룰리나 가수분해물 분말을 제조하는 단계로서, 제2단계의 스피룰리나 가수분해물을 원심분리하여 그 상등액을 여과한 후 동결건조 할 수 있다. 상기 여과액을 추가로 원심분리 한 후 그 상등액을 동결건조 할 수 있다.
상기 동결건조 된 스피룰리나 가수분해 분말은 증류수에 용해시키고 오염원 제거를 위하여 필터로 여과한 후 세포배양용 기본 배지에 첨가하여 사용할 수 있다.
제4단계: 스피룰리나 가수분해물과 소태아혈청의 혼합액을 세포배양용 기본 배지에 첨가한다(S400).
본 단계는 스피룰리나 가수분해물과 소태아혈청을 일정 범위의 비율로 혼합한 용액을 세포배양용 기본 배지에 첨가하여 근육세포의 성장과 증식에 효과적인 근육세포 배양용 배지 조성물을 제조할 수 있다.
상기 제3단계에서 준비된 스피룰리나 가수분해물의 분말을 포함하는 저장액(stock solution)을 제조하고, 이를 소태아혈청과 혼합하여(소태아혈청의 일부를 대체), 세포배양용 기본 배지에 10% 범위로 첨가하여 사용하는 것이 바람직하다.
도 3을 참조하면, 스피룰리나 가수분해물(SH) 2g/L까지 세포 독성이 없으므로, 상기 스피룰리나 가수분해물의 분말을 포함하는 저장액은 20g/L(최종 농도 2g/L) 이하인 것이 바람직하다. 또한, 도 6a 내지 도 9를 참조하면, 상기 스피룰리나 가수분해물의 분말을 포함하는 저장액은 10 내지 20g/L 인 것이 더욱 바람직하며, 20g/L 인 것이 가장 바람직하다.
상기 스피룰리나 가수분해물의 분말을 포함하는 저장액과 소태아혈청의 혼합비율(v/v)은 5:5 내지 1:9 인 것이 바람직하며, 도 4, 도 6a 내지 도 9를 참조하면, 5:5 내지 7:3 인 것이 더욱 바람직하다.
상기 세포배양용 기본 배지로는 MEM(Minimum Essential Medium), DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium), DMEM-F12, RPMI(Roswell Park Memorial Institute), K-SFM(Keratinocyte Serum Free Medium), M199, Ham's F12, Ham's 10, NCTC 109, NCTC 135, NeuroCult Basal Medium 등이 있으며, 이 외에 당해 업계에서 이용되는 배지이면 충분하며, 각종 영양성분, 미네랄, 무기질, 비타민, 아미노산, 펩타이드를 포함하는 재조합 단백질, 부착인자, 성장인자 및 호르몬으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 세포 배양용 배지 조성물의 제조는 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 물질과 방법을 추가로 이용 또는 적용하여 수행될 수 있다.
근육세포 배양용 배지 조성물
본 발명은 상기 근육세포 배양용 배지 조성물의 제조방법에 의해 제조되고, 배양육 생산에 사용되는, 근육세포 배양용 배지 조성물을 제공한다.
본 발명의 근육세포 배양용 배지 조성물은 스피룰리나 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 것으로, 종래의 스피룰리나 추출물 세포배양액(SACCS)이 스피룰리나 단백질을 고분자 형태로 포함하는 것에 반해, 본 발명의 세포 배양용 배지 조성물은 스피룰리나 단백질을 가수분해 한 펩타이드 형태의 스피룰리나 가수분해물(SH)를 포함하는 것으로, 세포의 성장과 증식에 더 큰 효과를 나타낸다.
상기 근육세포 배양용 배지 조성물은 배양육 생산에 사용되는 것 일 수 있다. 본 발명의 근육세포 배양용 배지 조성물은 동물 혈청 대신 스피룰리나 가수분해물을 포함함으로써 동물에서 유래되는 감염의 우려가 없고, 항생제나 성장인자 등을 포함하지 않으므로 안전하며, 또한 동물 혈청을 대체하여 배양육 생산의 비용을 낮출 수 있다.
스피룰리나 속(Spirulina sp.)은 남조류의 일종으로, 슈퍼푸드, 완전식품으로 FDA 및 식약처에 고시된 원료로 친환경성, 영양학적인 우수성 및 안정성이 입증되어 있으며, 스피룰리나는 50% 이상의 단백질 함량을 나타내며, 6 내지 9%의 지질, 15 내지 20%의 탄수화물을 포함하고 있으며, 이밖에 비타민, 무기질 등 다양한 생리활성물질을 함유하고 있다.
상기 스피룰리나는 스피룰리나 맥시마(Spirulina maxima), 스피룰리나 플라텐시스(Spirulina platensis), 스피룰리나 게이트레리(Spirulina geitleri), 스피룰리나 사이아메제(Spirulina siamese), 스피룰리나 메이어(Spirulina major), 스피룰리나 서브살사(Spirulina subsalsa), 스피룰리나 프린세프스(Spirulina princeps), 스피룰리나 락시시마(Spirulinalaxissima), 스피룰리나 쿠르타(Spirulina curta), 스피룰리나 스피룰리노이데스(Spirulina spirulinoides) 중 하나 이상을 사용할 수 있다.
상기 근육세포는 소, 말, 돼지, 염소, 양, 닭 등 식용이 가능한 동물의 초기 근육세포인 것이 바람직하며, 본 발명의 근육세포 배양용 배지 조성물은 배양육 생산을 위한 것이므로, 동물의 근육세포라면 특별히 제한되지 않는다.
상기 가수분해물은 스피룰리나에 가수분해 효소를 처리하여 수득한 것이 바람직하다. 강산이나 고온 처리를 통해 가수분해하는 경우, 비타민이 파괴되거나 트립토판과 같은 민감한 아미노산이 손상되는 문제가 발생한다. 이에 반해, 효소를 이용한 가수분해물은 산 가수분해물보다 수율이 우수할 뿐 아니라 유효 성분의 손상이 적다는 장점이 있다.
상기 가수분해 효소로는 알칼라아제(Alcalase), 브로멜라인(bromelain), 플라보자임(flavourzyme), 판크레아틴(pancreatin), 파파인(papain), 펩신(pepsin), 프로나아제(pronase), 프로타멕스(protamex), 트립신(trypsin), 또는 이들의 조합 중에서 선택된 것을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는 펩신, 판크레아틴 또는 이들의 조합에서 선택된 것을 사용할 수 있으며, 펩신과 판크레아틴을 함께 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 펩신과 판크레아틴을 함께 가수분해 효소로 사용하였다(도 2).
상기와 같이 2종 이상의 가수분해 효소를 조합하여 사용하는 경우에는, 각 가수분해 효소의 반응 온도와 pH가 상이하므로, 각 가수분해 효소의 최적조건(반응 온도, pH, 시간 등)에서 반응할 수 있도록 순차적으로 사용하는 것이 바람직하다.
상기 스피룰리나 가수분해물은 2 g/L 이하의 농도인 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 스피룰리나 가수분해물의 농도가 2 g/L를 초과하는 경우에는 근육세포의 세포활성이 낮아질 수 있다(도 3).
상기 근육세포 배양용 배지 조성물은 소태아혈청(FBS)을 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 기존 배양육을 위한 근육세포 배양용 배지는 동물 혈청 특히 소태아혈청(FBS)의 필수적으로 포함되어, 배양육 생산에 고비용이 소요되었고, 이는 배양육의 상용화에 한계로 작용하였다. 이에, 본 발명은 스피룰리나 가수분해물을 포함하여, 소태아혈청의 비율을 크게 낮추면서도 근육세포의 성장율이 우수한 근육세포 배양용 배지 조성물을 제공한다.
상기 근육세포 배양용 배지 조성물은 스피룰리나 가수분해물을 0.1 내지 20 부피%(v/v)로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 15 부피%(v/v), 더욱 바람직하게는 5 내지 10 부피%(v/v)로 포함할 수 있다.
상기 근육세포 배양용 배지 조성물은 혈청 및 스피룰리나 가수분해물을 0.1 내지 20 중량%로 포함할 수 있고, 1 내지 15 중량%로 포함하는 것이 바람직하며, 5 내지 10 중량%로 포함하는 것이 더욱 바람직하다.
상기 근육세포 배양용 배지 조성물은 혈청을 0.1 내지 19.9 부피%(v/v)로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 15 부피%(v/v), 더욱 바람직하게는 5 내지 10 부피%(v/v)로 포함할 수 있다.
상기 혈청은 동물 혈액일 수 있으나 이에 한정되지 아니하고, 바람직하게는 포유동물(예: 돼지, 말, 소, 염소, 양 및 개) 혈액으로부터 유래된 혈청이며, 더욱 바람직하게는 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)이다.
본 발명의 근육세포 배양용 배지 조성물은 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 세포배양용 기본 배지에 상기 함량의 소태아혈청 및 스피룰리나 가수분해물을 첨가할 수 있고, 세포배양용 기본 배지로는 MEM(Minimum Essential Medium), DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium), DMEM-F12, RPMI(Roswell Park Memorial Institute), K-SFM(Keratinocyte Serum Free Medium), M199, Ham's F12, Ham's 10, NCTC 109, NCTC 135, NeuroCult Basal Medium 등이 있으며, 이 외에 당해 업계에서 이용되는 배지이면 충분하며, 각종 영양성분, 미네랄, 무기질, 비타민, 아미노산, 펩타이드를 포함하는 재조합 단백질, 부착인자, 성장인자 및 호르몬으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 근육세포 배양용 배지 조성물은 혈청과 스피룰리나 가수분해물을 5:5 내지 1:9의 부피비(v/v)로 포함하는 것이 바람직하다. 혈청:스피룰리나 가수분해물의 부피비(v/v)를 5:5 내지 1:9로 할 수 있고, 구체적으로는 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9 로 사용할 수 있으며, 바람직하게는 5:5 내지 7:3로 할 수 있고, 구체적으로는 5:5, 4:6, 3:7의 부피비(v/v)로 사용할 수 있다. 도 3에서 확인할 수 있듯이, 스피룰리나 가수분해물이 너무 고농도로 첨가되면 세포생존율이 낮아지는 단점이 있고, 또한 FBS 0 : SH 10 의 비율에서는 세포성장률이 현저하게 감소하는 문제가 있다.
상기 근육세포 배양용 배지 조성물은 근육세포의 계대배양이 가능하고, 근육세포의 계대배양 회수 증가에 따라 소태아혈청와 스피룰리나 가수분해물의 부피비 범위인 5:5 내지 1:9(FBS:SH) 내에서 스피룰리나 가수분해물의 함량비(부피)을 점차적으로 증가시키고, 소태아혈청의 함량비(부피)를 점차적으로 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 1~3 세대에서는 5:5, 4세대에서는 3:7, 5세대에서는 1:9와 같이 사용할 수 있다.
실시예
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예
스피룰리나 가수분해물을 제조하기 위하여 추출, 가수분해, 여과 및 회수의 과정을 거쳐 스피룰리나 가수분해물(spirulina hydrolysate, 이하 SH 라고 함)를 제조하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 스피룰리나 건조 분말을 증류수에 4% 농도로 용해시키고 균질화(homogenization) 하였다. 그 후 30분 초음파 처리를 하여 세포를 파쇄하고 121 ℃에서 30 분간 열과 압력을 가하여 추출하였다.
상기 스피룰리나 추출물에 펩신(pepsin)을 37 ℃, pH 2에서 2시간 처리한 후, 판크레아틴(pancreatin)을 37 ℃, pH 7.5에서 2시간 처리하여 가수분해물을 제조하였다. 각각의 효소 반응 후에는 95 ℃에서 10 분간 boiling 하여 효소를 불활성화 시켰다.
상기 가수분해물을 9,000 rpm에서 20분간 원심 분리하여 상등액을 1 μm filter paper로 여과한 후, 30,000 rpm에서 20분간 원심 분리하여 상등액을 취하여 동결건조 하였다.
동결건조 된 가수분해물 분말은 세포배양에 사용하기 전에 증류수에 10 ~ 50 g/L의 농도로 용해시킨 후 0.2 μm PES filter로 여과하여 각종 오염원을 제거하여 stock solution을 제조하였고 이를 배지에 첨가하여 사용하였다.
이하 실시예 및 도면에 표시된 농도는 특별히 다르게 언급한 것을 제외하고는 stock solution(저장 용액)의 농도를 표시한 것이며, 각 실시예에서는 이 stock solution을 배지 부피의 10%의 범위로 첨가하여 사용하였다.
실시예 1: 스피룰리나 가수분해물(SH)의 독성 시험
세포 증식 촉진을 위한 스피룰리나 가수분해물의 적정 첨가 농도를 확인하기 위하여 가수분해물의 농도에 따른 세포생존율을 측정하였다. 상기 제조예에서 제조한 스피룰리나 가수분해물(SH)을 10 ~ 50 g/L 농도의 stock solution으로 제조하고 이를 세포생존율 측정 실험에 사용하였다. 대조군은 FBS 10% 첨가 배지로 하였다.
한국농수산대학으로부터 biopsy를 통하여 약 6개월령 송아지의 사태 근육 부위에서 23번째 채취한 일차 세포(primary cell)의 passage no.2 를 1 X 106 cell/ml으로 분양 받아서 실험에 사용하였다. 한우 사태 초기 근육세포에 대한 스피룰리나 가수분해물(SH)의 세포 독성시험을 수행하였다.
상기 세포를 96 well plate에 4.5x103 cell/well의 농도로 150 μL 분주하고, 24시간 후 스피룰리나 가수분해물(SH) stock solution을 15 μL 첨가하여 최종 농도가 1 ~ 5 g/L가 되도록 하고 37 ℃, 5% CO2 배양기에서 48시간 배양한 후 EZ-CyTox 시약을 10 μL 첨가하여 3시간 배양한 후 플레이트리더기(Biotek, Winooski, USA)를 활용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 3를 참조하면, SH 2g/L까지 세포 독성이 없는 것을 확인하였다.
실시예 2: SH 대체 비율에 따른 세포성장률
한우 사태 초기 근육세포를 FBS 10% 첨가된 DMEM 배지에서 3 passage까지 배양하여 충분한 세포를 확보하였고, 5.0 X 105 cell/dish의 세포를 100 pi cell culture dish에 seeding 한 후 72시간 동안 배양하였다.
상기와 같이 배양된 세포를 1~3 passage에서 50% 비율의 FBS를 SH로 대체하였고, 4 passage에서는 70% 비율의 FBS를 SH로 대체하였고, 5 passage에서는 90% 비율의 FBS를 SH로 대체하여 세포성장률을 확인하였다. FBS를 대체하는 SH는 20 g/L(최종농도 2 g/L)를 사용하였다. FBS 10%을 첨가한 배지를 양성대조군으로 설정하였고, FBS를 5%, 3%, 1%로 첨가량을 줄이고 SH를 첨가하지 않은 배지를 음성대조군으로 사용하였다.
도 4를 참조하면, FBS와 SH를 5:5의 비율로 첨가한 1 passage에서는 FBS 10% 첨가 배지에 비하여 낮은 세포성장률을 나타냈지만, 50% 비율의 FBS를 SH로 대체한 2 passage 부터 70% 비율의 FBS를SH로 대체한 4 passage까지는 FBS 10% 를 첨가한 대조군과 대등한 수준의 세포성장률을 나타내었으며, FBS의 비율을 줄이고 SH를 첨가하지 않은 음성대조군에 비해서는 78% 의 높은 세포성장률을 나타내는 결과를 확인하였다. 90% 비율의 FBS를 SH로 대체한 5 passage에서는 세포가 사멸하여 실험을 진행할 수 없어 이후 장기 계대배양 실험에서는 50%와 70% 비율의FBS를 SH로 대체하여 진행하였다.
도 5를 참조하면, 50, 70, 90% 비율로 FBS를 SH로 대체한 배지에서 배양한 근육세포의 형태를 관찰한 것으로 1 ~ 5 passage에서 세포 형태는 양성대조군 및 음성대조군과 유사함을 확인하였다.
실시예 3: FBS의 50%와 70% 를 SH로 대체한 배지의 세포성장률 및 세포생존율
FBS의 50%와 70%를 SH로 대체한 배지를 사용하여 한우 사태 초기 근육세포를 10세대 계대 배양하면서 각각의 세대마다 세포수를 측정하고 10 passage까지 배양한 세포의 생존율와 세포 형태를 확인하여 세포 증식(proliferation)을 관찰하였다.
도 6a 는 FBS의 50%, 도 6b는 FBS의 70%를 SH로 대체한 배지의 세포성장률을 나타낸 것이고, 도 7a 는 FBS의 50%, 도 7b는 FBS의 70%를 SH로 대체한 배지의 세포생존율을 나타낸 것이며, 도 8 은 FBS의 50%와 70%를 SH로 대체한 배지에서 배양된 세포의 형태를 관찰한 것이다.
FBS 5% 배지에서 성장한 세포의 성장률은 FBS 10% 대비 88%로 감소했으나 FBS 5%+SH 10g/L 5%를 첨가한 배지에서 세포성장률은 FBS 10% 대비 95% 로 유사하였고, 세포생존율은 다소 낮게 나타났다. FBS 5%+SH 20g/L 5%를 첨가한 배지에서 세포성장률은 FBS 10% 대비 124%로 높았고 세포생존율 역시 FBS 10% 대비 111%로 높은 결과를 나타내었다. 세포 형태는 SH 10g/L 와 20g/L그룹 모두 대조군과 유사하였고, FBS 10% 대비 FBS 5%는 70% 정도의 성장을 보인 반면 FBS 5%+SH 10g/L 5%를 첨가한 배지는 FBS 10% 와 유사하게 성장하였고 FBS 5%+SH 20g/L 5%를 첨가한 배지는 FBS 10% 대비 더 높은 세포밀도를 확인하였다(도 6a, 도 7a, 도 8).
FBS 3%+SH 10g/L 7%를 첨가한 배지에서 세포성장률은 FBS 10% 대비 88% 로 다소 감소하였고, 세포생존율 역시 FBS 10% 대비 86%로 다소 낮게 나타났다. 하지만 음성대조군(negative control)인 FBS 3% 배지에서 성장한 세포의 성장률보다 높게 나타났다. FBS 3%+SH 20g/L 7%를 첨가한 배지에서는 세포성장률은 FBS 10% 대비 106%로 높았고 세포생존율은FBS 10% 대비 101%를 나타내었다. 세포 형태는 SH 10g/L 와 20g/L그룹 모두 대조군보다 수축된 형태를 확인하였다. FBS 10% 대비 FBS 3%는 50% 정도의 성장을 보인 반면 FBS 3%+SH 10g/L 7%를 첨가한 배지와 FBS 5%+SH 20g/L 5%를 첨가한 배지는 FBS 10% 대비 더 높은 세포밀도를 확인하였다(도 6b, 도 7b, 도 8).
실시예 4: FBS의 50%와 70% 를 SH로 대체한 배지의 세포주기
FBS의 50%와 70%를 SH로 대체한 배지를 사용하여 한우 사태 초기 근육세포를 10세대 계대 배양하여 적응시킨 세포의 세포주기를 확인하였다. 10 passage까지 배양한 세포를 Propidium Iodide(PI)로 DNA 염색한 다음 flow cytometer를 사용하여 분석하였다.
도 9를 참조하면, FBS 10% 배지에서 성장한 세포의 S기는 7.2% 인데 FBS 5%와 FBS 3% 배지에서 성장한 세포의 S기는 각각 5.3%, 3.8%로 감소한 반면 FBS를 SH 20g/L로 50%와 70% 대체한 경우 S 기가 6.3%, 4.7%로 증가된 것을 확인할 수 있다. 따라서 SH 20g/L를 첨가한 경우 세포 증식이 활발히 일어난 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 따른 근육세포 배양용 배지 조성물은 근육세포를 높은 세포생존율, 세포성장률 및 증식률로 배양시키므로, 배양육 생산에 효율적으로 사용될 수 있음을 알 수 있다.
지금까지 본 발명에 따른 근육세포 배양용 배지 조성물 및 이를 제조방법에 관한 구체적인 실시예에 관하여 설명하였으나, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않는 한도 내에서는 여러 가지 실시 변형이 가능함은 자명하다.
그러므로 본 발명의 범위는 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 안 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.
즉, 전술된 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술될 특허청구범위에 의하여 나타내어지고, 그 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (7)
- 스피룰리나로부터 스피룰리나 추출물을 수득하는 제1단계;
스피룰리나 추출물에 펩신을 처리한 후 판크레아틴을 처리하여 스피룰리나 가수분해물을 제조하는 제2단계;
스피룰리나 가수분해물을 여과 및 회수하여 스피룰리나 가수분해물 분말을 제조하는 제3단계; 및
스피룰리나 가수분해물 분말과 소혈청태아의 혼합액을 세포배양용 기본 배지에 첨가하는 제4단계;를 포함하고,
상기 제4단계는 상기 스피룰리나 가수분해물의 분말을 20g/L로 포함한 용액과 소태아혈청을 5:5 내지 7:3의 부피비(v/v)로 혼합하여 세포배양용 기본 배지의 10%(v/v)로 첨가하며,
배양육 생산에 사용되는 것을 특징으로 하는,
근육세포 배양용 배지 조성물의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 스피룰리나는
스피룰리나 맥시마(Spirulina maxima), 스피룰리나 플라텐시스(Spirulina platensis), 스피룰리나 게이트레리(Spirulina geitleri), 스피룰리나 사이아메제(Spirulina siamese), 스피룰리나 메이어(Spirulina major), 스피룰리나 서브살사(Spirulina subsalsa), 스피룰리나 프린세프스(Spirulina princeps), 스피룰리나 락시시마(Spirulinalaxissima), 스피룰리나 쿠르타(Spirulina curta), 스피룰리나 스피룰리노이데스(Spirulina spirulinoides) 중 하나 이상인 것을 특징으로 하는,
근육세포 배양용 배지 조성물의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
제1단계는
스피룰리나의 세포막을 파쇄하고, 고온 및 고압에서 추출하는 것을 특징으로 하는,
근육세포 배양용 배지 조성물의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
제3단계는
스피룰리나 가수분해물을 원심분리 후 상등액을 여과하고,
여과액을 원심분리 후 상등액을 분리하여 동결건조하는 것을 특징으로 하는,
근육세포 배양용 배지 조성물의 제조방법.
- 스피룰리나로부터 스피룰리나 추출물을 수득하는 제1단계;
스피룰리나 추출물에 펩신을 처리한 후 판크레아틴을 처리하여 스피룰리나 가수분해물을 제조하는 제2단계;
스피룰리나 가수분해물을 여과 및 회수하여 스피룰리나 가수분해물 분말을 제조하는 제3단계; 및
스피룰리나 가수분해물 분말과 소혈청태아의 혼합액을 세포배양용 기본 배지에 첨가하는 제4단계;를 포함하여 제조되고,
상기 제4단계는 상기 스피룰리나 가수분해물의 분말을 20g/L로 포함한 용액과 소태아혈청을 5:5 내지 7:3의 부피비(v/v)로 혼합하여 세포배양용 기본 배지의 10%(v/v)로 첨가하며,
배양육 생산에 사용되는 것을 특징으로 하는,
근육세포 배양용 배지 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 근육세포는
소, 말, 돼지, 염소, 양, 닭 중 어느 하나의 초기 근육세포인 것을 특징으로 하는,
근육세포 배양용 배지 조성물.
- 제5항에 있어서,
근육세포의 계대배양 회수 증가에 따라 스피룰리나 가수분해물의 함량비를 증가시키고 소태아혈청의 함량비를 감소시키는 것을 특징으로 하는,
근육세포 배양용 배지 조성물.
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Legal Events
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