CN102057038A - 用于以高品质和高数量制造重组蛋白的人类宿主细胞 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种通过使用基因工程技术使人类胚肾来源的细胞与人类B细胞来源的细胞融合产生的人类宿主细胞。具有良好保持的稳定特征的人类宿主细胞可有效地用于制造基于所需异源重组蛋白的药物。

Description

用于以高品质和高数量制造重组蛋白的人类宿主细胞

技术领域

本发明涉及一种用于以高品质和高数量制造重组蛋白的人类宿主细胞，且更具体来说，涉及通过使用基因工程技术使人类胚肾来源的细胞与人类B细胞来源的细胞融合产生的人类宿主细胞，其中所述人类宿主细胞具有所需稳定特征以有效地用于制造异源重组蛋白。

背景技术

迄今为止，大部分用于人类用途的基于重组蛋白的药物是使用非人类哺乳动物细胞制造的，例如中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)细胞、小鼠黑色素瘤(mouse melanoma，NSO)细胞和小鼠杂交瘤(SP2/0)细胞。已试图使用人类细胞系来制造治疗性重组蛋白，例如使用人类胚肾293细胞来制造活化蛋白C(西格斯(Xigris))(礼来公司(Eli Lylly)，2001)、使用纳马瓦(Namalwa)细胞来制造干扰素-β(威康研究实验室(Wellcome Research Laboratory)，1999)、利用HKB11细胞来制造截短重组因子VIII和多种抗体(曹(Cho)等人，2003，生物技术进展(Biotech.Prog)19：229-232)和利用PER.C6细胞来制造多种抗体和病毒DNA(法劳(Fallaux)等人，1998，人类基因疗法(Human Gene Therapy)，9：1909-1917)(约翰(Jones)等人，2003，生物技术进展(Biotechnol.Prog.)19：163-168和谢(Xie)等人，2003，生物技术与生物工程(Biotech.Bioeng.)83：45-52)。

美国专利第6,136,599号和韩国专利第627,753号揭示使用人类宿主细胞HKB 11细胞来制造难以在CHO细胞中表达的蛋白质(曹(Cho)等人，2003，生物技术进展(Biotech.Prog)19：229-232)(曹(Cho)和陈(Chan)，2002，生物医学科学(Biomedical Science)9：631-638)。美国专利第6,358,703B1号和韩国专利第616,028号揭示一种利用HKB 11细胞来制造截短重组因子VIII的方法。HKB细胞是一种来源于HH514-16的细胞系且包含在B细胞固定和病毒产生方面有缺陷的埃-巴二氏病毒(Epstein Barr virus，EBV)的基因组(拉布森(Rabson)等人，1983，美国科学院院报(PNAS USA)87：3660-3664)。HKB细胞显示诸如高密度生长、高转染效率和简单MTX诱导性扩增、目标蛋白的大量分泌和IgM表达消除等特征，这些特征适于制造治疗性蛋白质。然而，观察到，在细胞培养期间EBV趋向于从HKB细胞中丢失(张(Chang)等人，2002，病毒学杂志(J Virol.)76：3168-3178)。这种趋势表明HKB可能变得不含EBV，从而无法保持各种用于有效表达异源基因的有益性质。

因为EBV基因组并不以游离基因体形式存在，但可插入纳马瓦细胞的染色体中(松尾(Matsuo)等人，科学(Science)1984年12月14日：1322-1325，亨德森(Henderson)等人，1983，美国科学院院报(PNAS USA)80：1987-1991和罗斯(Rose)等人，2002，临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol.)40：2533-25440)，所以本发明者已开发一种新颖人类宿主细胞系，其使用纳马瓦细胞保留EBV来源的特征而无病毒产生。

发明内容

技术问题

本发明的一个目标是提供一种通过使人类胚肾来源的细胞与人类B细胞来源的细胞融合产生的新颖人类宿主细胞系，其中埃-巴二氏病毒(EBV)基因组插入其染色体中。

本发明的另一个目标是提供一种人类宿主细胞用于制造重组蛋白的用途。

技术解决方案

根据本发明的一方面，提供一种通过使人类胚肾来源的细胞与人类B细胞来源的细胞融合产生的人类宿主细胞，其中埃-巴二氏病毒(EBV)基因组插入其染色体中。

根据本发明的另一方面，提供一种人类宿主细胞用于制造重组蛋白(包含单克隆抗体)的用途。

现将参考附图更充分地描述本发明，在附图中显示本发明的例示性实施例。

根据本发明的一实施例的人类宿主细胞是通过使人类胚肾来源的细胞与人类B细胞来源的细胞融合产生的，其中埃-巴二氏病毒(EBV)基因组插入其染色体中。

所述人类胚肾来源的细胞可包含人类胚肾细胞、来源于人类胚肾细胞的细胞、来源于另一种人类胚肾来源的细胞的细胞和由任何上文所提及的细胞进行有丝分裂得到的细胞。本文中所使用的‘来源于’意欲包含(但不限于)正常的细胞有丝分裂和诸如转染、细胞融合或用于改变细胞或制造具有新颖特征的细胞的其它基因工程或细胞生物学技术等过程。具体来说，人类胚肾来源的细胞可为293来源的细胞，且优选为293细胞。所述293细胞展现高转染效率和高蛋白质生产率水平，但在无血清悬浮培养物中出现聚集。

染色体中有EBV基因组插入的人类B细胞来源的细胞可包含人类B细胞、来源于人类B细胞的细胞、来源于另一种人类B细胞的细胞或由细胞有丝分裂得到的细胞。本文中所使用的‘来源于’意欲包含(但不限于)正常的细胞有丝分裂、转染、细胞融合或用于改变细胞或制造具有新颖特征的细胞的其它基因工程或细胞生物学技术。具体来说，染色体中具有EBV基因组的人类B细胞来源的细胞可为纳马瓦细胞。所述纳马瓦细胞具有低转染效率，但在悬浮培养物中生长良好，而且无聚集。

技术解决方案

EBV基因组一般以游离基因体形式存在于B细胞中，但可插入诸如纳马瓦细胞等一些B细胞的染色体中。使用这些优越和独特的特征，本发明的一实施例提供一种稳定人类宿主细胞，其尽管具有病毒信息，但不会产生病毒，可进行制备。因为EBV基因组基因中oriP表达载体所需的埃-巴二氏核抗原1(Epstein-Barr nuclear antigen 1，EBNA1)基因和抗细胞凋亡所需的BHRF1和BALF1基因(卡布拉斯(Cabras)等人，2005，临床病毒学杂志(J ClinicalVirology)34：26-34)在纳马瓦细胞中表达，所以这些基因有效地用作宿主细胞中的病毒信息。另外，因为仅在游离型基因组中表达的作为裂解周期(lytic cycle)基因诱导初始蛋白质表达的BZLF1基因(康垂曼(Countryman)等人，1987，病毒学杂志(J Virol)，61：3672-3679)和LMP2基因(盛普(Sample)等人，病毒学杂志(J Virol)63：933-937)并不在纳马瓦细胞中表达，所以可制备不产生病毒的安全宿主细胞(M.伯纳斯柯尼(M.Bernasconi)等人.病毒学杂志(Virology Journal)，2006，3：43-57)。

本发明实施例的人类宿主细胞是通过使人类胚肾来源的细胞与人类B细胞来源的细胞融合产生，其中埃-巴二氏病毒(EBV)基因组插入其染色体中。因此，所述人类宿主细胞是具有人类胚肾来源的细胞(例如293细胞)与人类B细胞来源的细胞(例如纳马瓦细胞)两者的有益性质的新颖细胞系。通过选择293细胞作为人类宿主细胞的一种融合搭配物，可改良人类宿主细胞的转染效率和蛋白质生产率。另外，通过选择纳马瓦细胞作为融合搭配物，(i)容易维持培养物的悬浮状态；(ii)宿主细胞是安全的，不会产生病毒粒子；(iii)因为EBNA1蛋白在宿主细胞中连续表达，所以oriP表达载体中不需要包含EBNA1基因；(iv)细胞凋亡可通过诸如BHRF1和BALF1等病毒bcl-2同源基因来抑制。

此外，人类B细胞来源的细胞(例如纳马瓦细胞)可为具有HAT敏感性和G418抗性的细胞。为了制备本发明实施例的具有人类胚肾来源的细胞与人类B细胞来源的细胞两者的有用性质的人类宿主细胞，需要在细胞融合后对具有两种细胞的有用性质的克隆进行基因型选择的过程。因为人类胚肾来源的细胞(即293细胞)具有HAT抗性和G418敏感性，所以选择具有HAT敏感性和G418抗性的人类B细胞来源的细胞(例如纳马瓦细胞)作为人类胚肾来源的细胞的融合搭配物。

根据本发明的一实施例，使用293细胞和纳马瓦细胞来开发通过使人类胚肾来源的细胞与人类B细胞来源的细胞融合产生的新颖人类宿主细胞。首先，在补充有胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和6-硫鸟嘌呤的培养基中培养纳马瓦细胞系以获得具有HAT敏感性的纳马瓦细胞作为与293细胞融合的搭配物。测量纳马瓦细胞对含HAT培养基的敏感性，同时增加6-硫鸟嘌呤的浓度，历时数个月的选择期。用pSV2neo质粒转染HAT敏感性纳马瓦细胞群体，且选择对G418具有抗性的细胞群体用作293细胞的融合搭配物。接着，根据RH.肯尼特(Kennett RH.)细胞融合(Cell fusion).酶学方法(Methods Enzymol)58：345-359；1979中所揭示的使用聚乙二醇(PEG)的方法进行293细胞与HAT敏感性纳马瓦细胞的融合。然而，细胞融合并不限于所述方法且可根据所属领域中常用的方法来进行。

根据本发明的一实施例的通过使293细胞与纳马瓦细胞融合产生的人类宿主细胞被称为F2N(293与纳马瓦的融合细胞)。预期因为EBV基因组以整合到F2N染色体中的形式存在，所以在长期培养期间EBV基因组不会从F2N细胞中丢失，这与在其它特征方面与F2N细胞类似的HKB细胞不同。为了证明这种情况，选择数个F2N克隆且培养于无血清悬浮培养基中超过1年。结果，在培养于无血清悬浮培养基中超过1年的所有细胞群体中都观察到EBNA1的表达(参见图5和6)，这说明即使长时间培养F2N细胞，EBV基因组也不会从F2N细胞中丢失。

为了在F2N克隆中选择具有高转染效率的克隆，用表达IgG的pCT132载体(参见图3)转染F2N克隆的细胞，且使用酶联免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)对转染子进行分析以评估抗体产生效率(参见图4A到4C)。一般来说，F2N细胞的转染效率高于293细胞。此外，选择克隆之一，具有高转染效率且在无血清悬浮培养基中生长良好的F2N78，接着在2008年4月11日保藏于韩国典型菌种保藏中心(Korean Collection for Type Cultures，KCTC))(生物资源中心(Biological Resource Center)，韩国生物科学与生物技术研究所(Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology)，大田市儒城区111 Kwahack-ro(111Kwahack-ro，Yuseong-gu，Daejeon))(保藏编号：KCTC11309BP)。

为了鉴别通过使293细胞与纳马瓦细胞融合产生的F2N细胞是否具有所需有益性质，使用从F2N78细胞中提取的mRNA进行反转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)以鉴别EBNA1、Ig-μ、Ig-κ和N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnTIII)的表达。结果显示F2N78克隆表达EBNA1和GnTIII，但不表达IgM(参见图6)。为了鉴别EBNA1、IgM和α(2，6)唾液酸转移酶(α(2，6)ST)的表达，进行免疫荧光法(IF)。结果显示F2N78表达EBNA1和α(2，6)ST，但不表达IgM(参见图5)。在这点上，EBNA1的表达表明F2N克隆中存在EBV基因组，且GnTIII和α(2，6)ST的表达表明糖基化分布类似于人类。IgM的不表达表明在纳马瓦细胞中观察到的免疫球蛋白的表达在由细胞融合获得的F2N细胞中受到抑制。由F2N克隆(尤其由F2N78细胞)制造治疗性重组单克隆抗体需要这些特征。

因此，根据本发明的一实施例的人类宿主细胞组成性表达EBNA1蛋白，表达产生类似于人类的糖基化分布所涉及的酶，并且不表达IgM蛋白。

根据本发明的一实施例的人类宿主细胞提供EBNA1的稳定表达。EBNA1是大小为约3kb的基因并且是oriP表达载体在细胞中自主复制的必要元件。如果EBNA1以顺式或反式形式与oriP表达载体一起存在于细胞中，那么oriP表达载体可在人类细胞中正常复制。然而，如果EBNA1不与oriP表达载体分开存在(呈反式形式)，而是存在于oriP表达载体中(呈顺式形式)，那么可能会因为表达载体太大而使载体DNA不易进行操作，并且包含EBNA1基因在内的所有基因都可能无法有效地转移到细胞中并进行表达。然而，因为EBNA1蛋白由整合到F2N78细胞染色体中的EBV基因组组成性表达，所以oriP质粒在载体构建时不需要具有EBNA1基因。因此，oriP表达载体可被有效地操作，并且载体中所含的基因可容易地进行表达。

根据本发明的一实施例的人类宿主细胞也组成性表达与类似于人类的糖基化分布相关的酶。因为由根据本发明的一实施例的人类宿主细胞制造的蛋白质具有类似于人类的糖基化分布，所以相较于由诸如CHO细胞等非人类细胞制造的蛋白质，所述蛋白质可具有较低活体内免疫原性和较长活体内半衰期，从而改良基于蛋白质的药物的功效。

另外，本发明的一实施例的人类宿主细胞不表达在纳马瓦细胞中表达的IgM蛋白。因此，根据本发明的一实施例的人类宿主细胞具有用于制造治疗性重组单克隆抗体的必要特征。

为了鉴别F2N78细胞的抗细胞凋亡活性，用不同浓度的丁酸钠处理F2N78细胞。一般来说，在细胞培养期间，丁酸钠使受CMV或SV40启动子调节的基因的表达增加(李(Lee)等人，1993，细胞(Cell)72：73-84，考科特(Cockett)等人，1990，生物技术(Bio/technology)8：662-667，张(Chang)等人，1999，自由基研究(Free Rad Res)30：85-91，和高尔曼(Gorman)等人，1983，核酸研究(Nucl Acid Res)11：7631-7648)。丁酸钠还阻滞细胞周期或诱导细胞分化，从而导致细胞凋亡(库斯特(Cuisset)等人，1998，生物化学与生物物理学研究通讯(Biochem Biophy Res Commun)246：760_764，库斯特(Cuisset)等人，1998，生物化学与生物物理学研究通讯(Biochem Biophy Res Commun)246：760764)。然而，根据本发明的一实施例的F2N78细胞显示即使在丁酸钠处理下细胞凋亡也会减少，并且在一些情况下，生长速率比对照组(用0mM丁酸钠处理的F2N78)高。作为对照组的纳马瓦细胞显示在丁酸钠处理后细胞存活力降低并且在所有条件下细胞生长都受到抑制，而293细胞在暴露于高浓度的丁酸钠时显示细胞凋亡(参见图9A到9D)。

为了鉴别F2N78细胞的抗细胞凋亡细胞生长，使用RT-PCR证实EBV基因组中所含的病毒bcl-2同源基因BHRF1和BALF1的表达。如图10中所示，BHRF1在未经处理与用丁酸钠处理的纳马瓦细胞中都表达。另一方面，BHRF1不在未经处理或用丁酸钠处理的F2N78细胞中表达。然而，在不考虑用丁酸钠处理的情况下，BALF1在纳马瓦细胞与F2N78细胞中都表达。BHRF1与BALF1两者都不在作为对照组的293细胞中表达。据报导，当BALF1与BHRF1两者同时表达时，BALF1抑制BHRF1的抗细胞凋亡活性(贝娄(Bellows)等人，2002，病毒学杂志(J Virol.)76：2469-2479，马歇尔(Marshall)等人，1999，病毒学杂志(J Virol.)73：5181-5185)。这一特征可见于纳马瓦细胞中。因此，显示仅BALF1在F2N78细胞中表达的上述结果可证明F2N78细胞具有抗细胞凋亡活性，应阐明其潜在机制。所述抗细胞凋亡细胞生长模式也在其它F2N克隆中观察到。

因此，根据本发明的一实施例的人类宿主细胞当在丁酸钠存在下培养时显示抗细胞凋亡活性。本发明指示根据本发明的一实施例的人类宿主细胞即使当培养基中不添加丁酸钠时，也可在长期分批培养期间对天然存在的细胞凋亡具有抗性。

比较由CHO和F2N78产生的两种产生抗体的细胞系以鉴别当用丁酸钠处理时细胞的抗体生产率。与未用丁酸钠处理的对照组相比，用丁酸钠处理的CHO来源的克隆的细胞生长速率降低50％，且CHO来源的克隆的生产率加倍(参见图11)。另一方面，与未用丁酸钠处理的对照组相比，用丁酸钠处理的F2N78来源的克隆的细胞生长速率增加达2倍，且F2N78来源的克隆的生产率增加4到5倍(参见图12)。上述结果表明用丁酸钠处理的F2N78细胞的抗细胞凋亡影响抗体生产率的增加。

为了在F2N78细胞中使用oriP表达载体鉴别抗体生产率，用两种不同的oriP表达载体pCT132和pCT125转染F2N78细胞，并随后比较抗体生产率。当pCT125在质粒中包含EBNA1编码序列时，pCT132在质粒中不包含EBNA1编码序列。如图7中所示，与用pCT125转染的细胞相比，用pCT132转柒的细胞展现类似或较高的抗体生产率。一般来说，宜使用瞬时转染来制造少量新药开发过程中所需的蛋白质。因为根据本发明的一实施例的人类宿主细胞组成性表达EBNA1，所以细胞可适用于基于使用无EBNA1基因的表达载体(诸如pCT132表达载体)进行瞬时转染的新药开发。

根据本发明的一实施例的人类宿主细胞可用于制造重组蛋白。可对人类宿主细胞进行基因工程改造以表达多种重组蛋白。所述重组蛋白可包含人类治疗性重组蛋白，例如治疗性单克隆抗体和除单克隆抗体以外的治疗性重组蛋白。

有利效果

本发明提供一种通过对人类胚肾来源的细胞与人类B细胞来源的细胞进行体细胞融合产生的人类宿主细胞，其中埃-巴二氏病毒(EBV)基因组整合到其染色体中。使用本发明的一实施例的人类宿主细胞，可在短时间内制造用于研究的蛋白质，并且可以高数量和高品质制造用于人类用途的基于异源重组蛋白的药物。

附图说明

本发明的上述和其它特征和优点将通过参考附图来详细描述其例示性实施例而变得显而易见。

图1说明融合F2N细胞和选择F2N78克隆的过程。

图2A到2D说明在初始阶段F2N克隆的各种生长模式，其中在选择过程中移除如图2C和2D中所示的以聚集体形式生长的克隆。

图3说明本文中所使用的表达载体的物理图。

图4A到4C说明为选择具有高IgG表达的F2N克隆所进行的瞬时转染的结果，其中图4A说明第一次筛选的结果，图4B说明从图4A中选择的17个克隆的第二次筛选的结果，并且图4C说明在最后所选的F2N78细胞与293细胞之间比较IgG生产率的结果。由三次重复实验获得图4C中所示的结果。

图5A说明Ig-μ和Ig-κ的表达，且图5B说明使用免疫荧光检验检测到的EBNA1和α(2，6)-ST的表达。

图6说明使用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测的GntIII、Ig-μ和EBNA1在F2N78、纳马瓦和293细胞中的表达，其中使用CHO细胞作为阴性对照组。表1中显示对GntIII、Ig-μ和EBNA1蛋白具特异性的引物。

图7是说明在F2N78细胞和293细胞中oriP表达载体(pCT125和pCT132)的抗体生产率的图。

图8是说明通过用pCT132对F2N78细胞进行瞬时转染所得的抗体生产率的图，所述pCT132是无EBNA1基因的表达载体。由4次重复实验获得此处所示的结果。

图9A到9D是说明丁酸钠对CHO细胞(图9A)、纳马瓦细胞(图9B)、293细胞(图9C)和F2N78细胞(图9D)的细胞生长的影响的图，其中1mM、2mM和4mM指示培养物中所用的丁酸钠浓度，且1mM-存活力、2mM-存活力和4mM-存活力指示用相应浓度的丁酸钠处理的培养物的细胞存活力。

图10说明使用RT-PCR检测的BHRF1和BALF1在用丁酸钠处理的F2N78、纳马瓦和293细胞中的表达，其中0、1和4指示分别添加到各培养基中的丁酸钠的浓度(mM)。表1中写出RT-PCR中所用的引物组。

图11是说明丁酸钠对CHO#247细胞的抗体生产率的影响的图。

图12是说明丁酸钠对F2N78_Ig细胞的抗体生产率的影响的图。

具体实施方式

下文将参考以下实例更详细地描述本发明。以下实施例仅出于说明性目的且不希望限制本发明的范围。

材料与方法

1.细胞和质粒

人类胚肾(293)细胞(ATCC CRL-1573)和纳马瓦细胞(ATCC CRL-1432)是从美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)获得。图3说明本文中所使用的表达载体的分解图。

2.转染

使用电穿孔和基于阳离子聚合物的方法来进行转染。

电穿孔：将对数生长的3×10⁶个细胞再悬浮于300μl含有12μg质粒pSV2neo载体(2μg)和具有基质连接区(matrix attached region，MAR)序列的载体(10μg)的RPMI 1640培养基中。使用GenePulse II电穿孔仪(伯乐公司(Bio-Rad))(220V/960微法拉(microfarad))进行电穿孔。将转染子悬浮于生长培养基中并培养72小时。接着，将细胞培养于补充有1mg/mlG418和10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的选择性培养基中约14天。发现经转染的细胞活跃地生长，而对照组细胞在选择性培养基中不生长。选择经转染的细胞且另外培养于补充有1mg/ml G418的选择性培养基中。通过使用新霉素基因特异性引物进行聚合酶链反应(PCR)来鉴别新霉素基因的存在。

基于阳离子聚合物的方法：根据制造商的说明书，使用Lipofectamine^TMLTX(英杰公司(Invitrogen)，15338-100)和FreeStyle^TM Max(英杰公司(Invitrogen)，16447-100)进行转染。当使用Lipofectamine^TM LTX试剂时，在转染前一天，将细胞接种于6孔板中以使得在转染当天细胞的汇合度达到每孔50％到80％。在各孔中使用2.5μg DNA和6.25μl LTX进行转染。当使用FreeStyle^TM Max试剂时，在悬浮培养物中进行转染。对于悬浮培养物的转染，接种生长于无血清培养基(FreeStyle 293表达培养基，英杰公司(Invitrogen)，12338，下文称为FreeStyle 293培养基)或EX-CELL 293无血清培养基(西格马公司(Sigma)，14571C，下文称为EX-CELL 293培养基)中的细胞以使得在转染当天细胞浓度被调整到每1毫升含1×10⁶个细胞。在OptiPRO SFM II(英杰公司(Invitrogen)，12309)培养基中进行转染，而DNA和FreeStyle^TMMax试剂的添加比率是1∶1。

3.免疫荧光法(TF)

为了检测EBNA1的表达，应用抗补体免疫荧光法(anti-complement immunoflluroescence，ACIF)(瑞德曼(Reedman)和基利恩(Klein)，1973，以及福莱森(Fresen)和楚尔·豪森(zur Hausen)，1976)。首先，将细胞涂抹在载玻片上且在-20℃下使用甲醇固定5分钟。作为第一反应抗体，使用具有高抗EBNA效价的人类血清与所述细胞反应。接着，用人类补体(血清蛋白)处理细胞以扩增信号形式EBNA1，并且使用接合荧光物质的抗人类补体C3抗体(接合FITC的抗人类补体C3抗体，美国生物公司(USBiological)，C7850-14C)检测EBNA1染色。用1∶1比率的甘油溶液与磷酸盐缓冲液处理所得载片。

为了检测Ig-μ和Ig-κ的表达，以与上述相同的方式，用接合荧光物质的抗人类IgM抗体(接合FITC的经亲和力纯化的山羊抗人类IgM，具有μ链特异性，西格马公司(Sigma)，F5384)和接合荧光物质的抗人类κ链(山羊体内产生的经亲和力纯化的荧光素抗人类κ链，威克特公司(Vector)，FI-3060)处理细胞。

为了检测α(2，6)ST蛋白的表达，以与上述相同的方式，用接合荧光物质的西洋接骨木(Sambucus nigra)凝集素(接合FITC的西洋接骨木(接骨木树皮)-SNA-1，EY实验室(EY laboratories)，F-2602)处理细胞。

4.EBNA1、GnTIII、Ig-μ、BALF1、BHRF1的RT-PCR

使用

Plus Mini试剂盒(恰根公司(Qiagen)，74134)从细胞中提取mRNA，并且使用OneStep RT-PCR试剂盒(恰根公司(Qiagen)，210212)进行RT-PCR。各引物序列显示于下表1中。使用GeneAmp PCR系统9700(应用生物系统公司(Applied Biosystems))进行RT-PCR，且用于RT-PCR的阶段和条件如下：(i)反转录(1个循环，50℃下30分钟)；(ii)反转录酶失活和cDNA变性(1个循环，95℃下15分钟)；(iii)PCR扩增(35个循环，94℃下30秒，52℃下1分钟和72℃下30秒；和(iv)延伸(1个循环，72℃下10分钟)。使用琼脂糖凝胶电泳鉴别RT-PCR的产物。

表1.RT-PCR中所用的引物序列

5.酶联免疫吸附分析(ELISA)

使用酶联免疫吸附分析(ELISA)测量所分泌抗体的浓度。首先，将山羊抗人类免疫球蛋白G(Fcy)(杰克逊免疫研究公司(Jackson ImmunoReserarch)，109-006-098)吸附于96孔微量滴定板(纳克公司(Nunc)，449824)上。通过用含有1％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液处理来阻断所述板，并且将样品的2倍连续稀释液放入板上的各孔中。在室温下培育板2小时，且用经过氧化酶标记的山羊抗人类λ抗体(西格马公司(Sigma)，A5175)处理以进行检测。在室温下培育所得产物1小时且与四甲基联苯胺(tetramethyl benzidine，TMB)反应，并使用1N HCl终止反应。使用从骨髓瘤血浆纯化的人类IgG1λ(西格马公司(Sigma)，15029)作为浓度为250ng/ml的标准物。基于450/570nm下的吸光度，使用Spectramax plus 384(分子装置公司(Molecular Device))测量抗体的浓度。

实例1：通过细胞融合产生人类体细胞杂交细胞系

将纳马瓦细胞培养于补充有10％FBS(海克隆公司(Hyclone)，SH30070.03)和6-硫鸟嘌呤(西格马公司(Sigma)，A4660)的RPMI1640培养基中以产生具有HAT(西格马公司(Sigma)，H0262)敏感性和G418(卡尔生物化学公司(Calbiochem)，345810)抗性的细胞作为融合搭配物。在4个月的选择期内，用5μg/ml到30μg/ml的生长浓度的6-硫鸟嘌呤处理纳马瓦细胞，且鉴别细胞对含1×HAT培养基的敏感性。用pSV2neo质粒转染HAT敏感性纳马瓦细胞群体，并接着选择对G418(1.5mg/ml)具有抗性的细胞以用作融合搭配物。

根据RH肯尼特(Kennett RH)(细胞融合(Cell fusion)，酶学方法(Methods Enzymol)58：345-359；1979)中所揭示的方法，使用聚乙二醇(PEG)进行细胞融合。用不含钙(Ca²⁺)和镁(Mg²⁺)的磷酸盐缓冲液洗涤处于对数生长期的293细胞(4×10⁶个)和纳马瓦细胞(6×10⁶个)两次，且接种于用5μg/ml花生凝集素(西格马公司(Sigma)，L0881)预先处理的6孔板上。在400g下将6孔板离心6分钟(在Beckman Allegra^TM X-12R离心机中)。从各孔中去除磷酸盐缓冲液，且用2ml 40％聚乙二醇(西格马公司(Sigma)，P7777)处理各孔中的细胞2分钟。一个孔中的细胞不用聚乙二醇处理，作为对照组。接着，用5ml补充有5％二甲亚砜(dimethyl sulphoxide，DMSO；西格马公司(Sigma)，D2650)的磷酸盐缓冲液洗涤细胞三次，且用磷酸盐缓冲液洗涤三次。用DMEM/F12培养基与RPMI1640培养基以1∶1比率混合且补充有15％FBS的培养基处理细胞。将细胞维持在CO₂恒温箱中30分钟。接着，去除培养基，且用补充有0.4mg/ml G418、0.5×HAT和15％FBS的选择性培养基处理细胞，其中DMEM/F12与RPMI1640等量混合。将经处理的细胞(1×10⁴个)接种于96孔板的各孔中。一周后，用新鲜的先前所提及的完全选择性培养基更换培养基。接种后两周，向细胞供应具有0.8mg/ml G418、1×HAT和15％FBS的选择性培养基。接种三周后，观察到对照组细胞不生长，但融合细胞生长。合并9个孔的生长快速且良好的细胞，且在96孔板中对所述细胞进行限制稀释克隆(limiting dilution cloning，LDC)以制备单细胞来源的克隆(single cell-derived clone，SCC)。对于限制稀释克隆，用100μl补充有0.8mg/ml G418、1×HAT和15％FBS的选择性培养基将对数生长的细胞稀释到1个细胞，且接种于96孔板的各孔中，每孔100μl。每周在去除一部分旧培养基后，向细胞供应新鲜选择性培养基，且在显微镜下观察各孔以鉴别生长的细胞斑块是否来自单细胞来源。通过上述过程，获得97个单细胞来源的克隆，并称为F2N。F2N是通过使293细胞与纳马瓦细胞融合产生的个别克隆。F2N克隆的生长模式多种多样，从彼此松散地附着到紧密聚集的斑块(图2)。所有克隆都冷冻保存在氮气瓶中。在冷冻前检验转染效率和EBNA1与IgM的表达。发现所有克隆都表达EBNA1，这指示各克隆中存在EBV基因组。另外，发现所有克隆都不表达IgM，这指示免疫球蛋白M在纳马瓦细胞中的表达在融合细胞中受到抑制。对于更系统性的表征，选择17个展现有利生长模式和高转染效率的克隆。当使用表达IgG的pCT132载体检验时，所选17个F2N克隆的转染效率高于293细胞(图3)。在选择17个F2N克隆的过程中，排除以聚集体形式生长的单细胞克隆(参见图2C和2D)。

实例2：对F2N78克隆的进一步表征

对17个显示高IgG表达水平的克隆进行第二次筛选(参见图4A和4B)。在使用pCT132载体的瞬时转染分析中，比较一个最好的克隆F2N78与293细胞的IgG产生。结果，发现在重复分析中F2N78细胞的IgG表达速率是293细胞的2到3倍(参见图4C)。

另一方面，使基于IgG表达效率所选择的17个单细胞克隆中的7个克隆适应于在无血清悬浮培养物中生长。在已适应于在无血清悬浮培养物中生长的7个单细胞克隆中鉴别到EBNA1的持续表达。这表明这7个克隆也具有EBV基因组。如图5中所示，几乎100％已在无血清培养条件下生长超过1年的F2N78细胞群体的EBNA1表达呈阳性。一年时间足以涵盖从转染细胞到产生用于临床试验的物质所花费的时间。

对已在无血清悬浮培养物中培养1年或1年以上的F2N78克隆进行IF(图5)和RT-PCR(参见图6)以检测细胞中重要基因的持续表达。结果如下：(1)使用IF和RT-PCR，使用两种不同类型的引物对来鉴别EBNA1的表达；(2)使用IF和RT-PCR来鉴别Ig-μ表达的消除，且使用IF来鉴别Ig-κ表达的消除；(3)通过RT-PCT，使用两种不同类型的引物对来鉴别与抗体依赖性细胞毒性密切相关的对分型N-乙酰葡萄胺糖结构的形成所涉及的GnTIII的表达(坎贝尔(Campbell)和斯坦利(Stanley)，1984)；和(4)通过IF来鉴别不存在于CHO细胞中但存在于人类细胞中的α(2，6)ST的表达。

实例3：瞬时转染

已使用瞬时转染在短时间内制造开发新药所需的蛋白质。为此，用具有不同结构的两种oriP表达载体pCT132和pCT125转染在FreeStyle 293培养基中培养的F2N78细胞和293细胞悬浮液以比较抗体生产率。pCT125在质粒中包含EBNA1编码序列，而pCT132在质粒中不含EBNA1编码序列。

如图7中所示，在重复进行的转染中，用两种载体转染的F2N78中IgG生产率类似，而用pCT125转染的293的IgG产生高于用pCT132转染的293的IgG产生。此外，由用pCT132转染的F2N78细胞产生的IgG的量(等于或大于25μg/ml)大于由用pCT125转染的293细胞产生的IgG的量(15μg/ml)。因此，在经转染的F2N78细胞中由pCT132(无EBNA1基因)产生IgG的效率高于在经转染的293细胞中由pCT125(有EBNA1基因)产生IgG的效率。另一方面，pCT125的IgG产生高于在无EBNA1基因的293细胞中pCT132的IgG产生。

为增加IgG产生的效率，在F2N78细胞适应于在EX-CELL 293培养基中生长后，使用FreeStyle Max试剂进行转染。结果，在用pCT132转染(重复四次测试)后6天，鉴别到约100μg/ml的抗体生产率(参见图8)。这一结果指示本发明的人类宿主细胞的转染效率高于293细胞系。

实例4：丁酸钠处理对F2N细胞的影响

用丁酸钠处理细胞以两种方式影响产生细胞系。虽然丁酸钠处理通过基因的高度乙酰化而增加转基因的表达水平，但其通过诱导细胞凋亡而降低细胞生长速率。接种已适应于在EX-CELL 293中生长的CHO、293、纳马瓦和F2N78细胞以使得细胞的浓度调整到每1毫升含3×10⁵个细胞，并且在接种后第三天用不同浓度的丁酸钠(0mM、1mM、2mM和4mM)处理。

如图9A到9D中所示，与未经处理的对照细胞相比，经处理的CHO细胞的细胞数目和细胞存活力随丁酸钠浓度的增加而快速降低。经处理的纳马瓦细胞的细胞数目和细胞存活力也在所有浓度的丁酸钠处理下以与CHO细胞类似的方式快速降低。另一方面，经处理的293细胞的生长速率和细胞存活力不受低浓度的丁酸钠(1mM和2mM)影响，但293细胞的生长速率和细胞存活力在高浓度的丁酸钠(4mM)下显著降低。然而，经处理的F2N78细胞的生长速率和细胞存活力在所有条件下都不降低，而且在高浓度的丁酸钠(4mM)下还略有增加。

为了阐明F2N78细胞的抗细胞凋亡细胞生长，使用RT-PCR鉴别来源于纳马瓦细胞的EBV基因组基因中所含的病毒bcl-2同源基因BHRF1和BALF1的表达。如图10中所示，虽然仅BALF1在未经处理与用丁酸钠处理的F2N78细胞中表达，但BHRF1与BALF1都在纳马瓦细胞中表达。BHRF1与BALF1都不在用作阴性对照组的293细胞中表达。F2N78细胞的抗细胞凋亡细胞生长由BHRF1不在F2N78细胞中表达的事实支持，即使F2N78细胞是来源于纳马瓦细胞。已报导当BALF1与BHRF1同时表达时，BALF1抑制BHRF1的抗细胞凋亡活性(马歇尔(Marshall)等人，1999，病毒学杂志(J Virol.)73：5181-5185)。因此，仅BALF1在F2N78细胞中表达的事实可以解释F2N78细胞的抗细胞凋亡活性，这未在用丁酸钠处理的纳马瓦细胞中观察到。然而，因为两种基因都在纳马瓦细胞中表达，所以抗细胞凋亡细胞生长可能不会在纳马瓦细胞中观察到，这与F2N78细胞不同。

接着，对由CHO和F2N78产生的两种产生抗体的细胞系检验丁酸钠对抗体生产率的影响。CHO#247是单细胞来源的产生抗体的克隆，其是从MTX扩增后的经转染CHO获得，且F2N78_Ig是来源于用嘌呤霉素选择后的经转染F2N78的产生抗体的细胞系。接种细胞且在接种后3天用不同浓度(0mM、1mM、2mM和4mM)的丁酸钠处理。在处理后5天，与对照培养物相比，用1mM丁酸钠处理的CHO#247的细胞生长速率降低接近50％，然而与对照组相比，抗体生产率加倍(参见图11)。另一方面，在处理的最后时期(处理后4、5和6天)用4mM丁酸钠处理的F2N78Ig的细胞生长速率增加达2倍，且与对照组相比，F2N78Ig的生产率增加4到5倍(参见图12)。丁酸钠对F2N78_Ig的影响在检验条件中的最高浓度丁酸钠(4mM)下达到最大，而所述影响显示在CHO#247的情况下在1mM丁酸钠下最佳。如图12中所示，丁酸钠对F2N78_Ig的抗体产生的影响高于丁酸钠对CHO#247的影响。这一结果指示在用丁酸钠处理后观察到的F2N78的抗细胞凋亡生长性质可能是对抗体产生的另一种影响。

讨论

虽然EBV基因组一般在EBV生命周期内以游离型状态存在以产生病毒粒子，但纳马瓦细胞具有整合到染色体中的两个EBV基因组拷贝(亨德森(Henderson)等人，1983，美国科学院院报(PNAS USA)80：1987-1991，和罗斯(Rose)等人，2002，临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol.)40：2533-2544)。当使用所述细胞作为宿主细胞系来制造治疗性重组蛋白时，这种整合到染色体中的EBV基因组的优越形式提供两种有益性质。第一，EBV粒子无法由染色体中的这种整合状态和EBNA1蛋白的组成性表达产生。观察到备受关注的现象，即F2N仅表达一种病毒bcl2同源BALF1，而非两种基因。即，F2N细胞中的BHRF1表达的消除是出乎意料的结果，由此F2N78细胞显示抗细胞凋亡生长。另外，EBNA1基因的组成性表达使得有可能有效地使用无EBNA1基因的oriP表达载体。此外，GnTIII和α(2，6)ST的表达提供用于制造具有更类似人类的糖基化分布(glycoprofile)的分子的条件。Ig-μ链和Ig-κ链表达的消除也使得有可能利用F2N细胞来制造重组单克隆抗体。

因为较高细胞密度和较长寿命主要与增加异源蛋白质生产率有关，所以抗细胞凋亡细胞生长对于增加重组蛋白的产生极其重要。因此，用丁酸钠处理时所观察到的F2N细胞的抗细胞凋亡细胞生长可应用于在制造期间结合丁酸钠来增加异源蛋白质的产生。

虽然已参考例示性实施例对本发明进行了具体的显示和描述，但所属领域的技术人员应了解，可在不脱离所附权利要求书所界定的本发明的精神和范围的情况下对形式和细节进行各种改变。

Claims (11)

1.一种通过使人类胚肾来源的细胞与人类B细胞来源的细胞融合产生的人类宿主细胞，其中埃-巴二氏病毒基因组整合到染色体中。

2.根据权利要求1所述的人类宿主细胞，其中所述人类胚肾来源的细胞是293细胞。

3.根据权利要求1所述的人类宿主细胞，其中所述人类B细胞来源的细胞是具有HAT敏感性以及G418抗性的细胞。

4.根据权利要求1所述的人类宿主细胞，其中所述人类B细胞来源的细胞是纳马瓦细胞。

5.根据权利要求4所述的人类宿主细胞，其中所述纳马瓦细胞是具有HAT敏感性以及G418抗性的纳马瓦细胞。

6.根据权利要求1所述的人类宿主细胞，其中所述人类宿主细胞i)组成性表达EBNA1蛋白；ii)不表达IgM蛋白；iii)持续产生类似于人类的糖基化分布；以及iv)表达BALF1，但不表达BHRF1。

7.根据权利要求1或6所述的人类宿主细胞，其中当将丁酸钠添加到培养基中时，所述人类宿主细胞的生长不受抑制。

8.根据权利要求1、6和7中任一权利要求所述的人类宿主细胞，其中所述人类宿主细胞是F2N78(KCTC保藏编号：KCTC 11309BP)。

9.根据权利要求1、6、7和8中任一权利要求所述的人类宿主细胞，其用于制造重组蛋白。

10.根据权利要求9所述的人类宿主细胞，其中所述重组蛋白是单克隆抗体。

11.根据权利要求9所述的人类宿主细胞，其中所述重组蛋白是除所述单克隆抗体以外的治疗性蛋白质。

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