JPWO2007040242A1 - 単離されたヒト細胞、その取得方法及び用途 - Google Patents
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Abstract
センダイウイルス(HVJ)の大量生産に適した新規なヒト細胞、その取得方法及びその用途が開示されている。ヒト細胞は、ヒト腎癌化細胞株に由来し、無血清培地中での浮遊培養において、対数増殖期における倍化時間が40時間以下であり、凍結リカバリー性を有し、浮遊培養における最高到達生細胞密度が106個/mL以上であり、細胞内においてHVJの増殖が可能である。ヒト細胞の取得方法は、ヒト腎癌化細胞株を無血清培地中で浮遊培養し、増殖する細胞をクローニングする工程と、クローン化された細胞から、無血清培地中での浮遊培養において対数増殖期における倍化時間が40時間以下であり、凍結リカバリー性を有し、浮遊培養における最高生細胞密度が106個/mL以上であり、細胞内においてHVJの増殖が可能な細胞を選択することを含む。
Description
(1) 細胞の入手
293細胞はJCRB(現ヒューマンサイエンス研究資源バンク(HSRRB))より入手した(継代数:37、倍化時間:62時間)。293細胞を起眠し、5%FBSを添加したMEM培地を用いて接着培養の状態で維持継代した。
293細胞の浮遊化および無血清化を行うための培地は培地・試薬メーカーより293細胞の浮遊化・無血清化用として商品化あるいは開発中のものを入手した。それぞれについてメーカー推奨のプロトコールに従い、L-グルタミンを最終濃度4〜8mMとなるように添加した。また、必要に応じてPluronic F-68を0.1〜0.2%添加した。
血清培地を用い接着培養の状態で維持継代した293細胞をトリプシン処理にて剥がし、遠心処理を行い、ダイレクトアダプテーション(direct adaptation)法を用いて、血清培地から無血清培地へ培地を全交換することにより馴化を試みた。培地を交換すると同時に細胞は125mL三角フラスコに3〜5×105細胞/mLの濃度で播種して、36.5℃、5〜10%CO2濃度のインキュベーター内でロータリーシェーカーを用いて旋回培養(100rpm)を開始した。10種類以上の培地を用いて無血清化・浮遊化を試み、培地交換後、増殖を確認できた細胞について、維持培養を続けることで、徐々に細胞を無血清培地に馴化させていった。維持培養は細胞を3〜5×105細胞/mLの濃度で播種し、数日間旋回培養を行い1×106細胞/mLに達したら、新鮮培地で希釈した。特に、JRH Bioscience社製T6培地(商品名「EXCELL-293」)およびHyClone社製HyQ PF-293培地が良好な増殖性を示した。
最も増殖状態が良かったT6培地に馴化させた細胞から、クローニングを行った。クローニングは96ウェルプレートを使用して限界希釈法を行い、検鏡にて838個のシングルクローンを確認した。シングルクローンからの増殖を補助するため、20〜30%の血清を添加した培地にて培養を開始した。37℃、10%CO2濃度のインキュベーター内で静置培養を行い、細胞の増殖に合せてスケールアップを行いながら、血清濃度を下げていき、無血清・浮遊化の状態に戻した。下記の方法により、凍結リカバリー、増殖性、HVJ生産性を指標に選択し、最終的には、45株のシングルコロニー由来細胞を得た。
細胞は馴化培養、クローニングの過程で凍結保存を行った。細胞をスケールアップ後、遠心処理して新鮮培地:馴化培地:DMSO(ジメチルスルフォキシド)が45:45:10になるように調製した凍結培地に懸濁し、1×107細胞/バイアルに分注した。凍結する際は、調製した細胞バイアルをクライオコンテナーにセットして-80℃冷凍庫にて凍結した。すなわちクライオコンテナーを使用することで、細胞の凍結に理想的とされる-1℃/分の条件で凍結することが可能となり、その結果、細胞が凍結操作により受けるダメージを軽減することができる。-80℃冷凍庫で凍結したバイアルは、その後、液体窒素保存容器に移し、気相部(-150℃以下)で凍結保存した。なお、ここで用いた新鮮培地とは培養に用いている未使用の培地のことであり、馴化培地とは培養に使用した培地、すなわち培養上清のことである。3日間以上の凍結保存後、解凍し、増殖性、HVJ生産性を指標とする選択に供した。
増殖性は、T6培地中、36.5℃、5〜10%CO2下で浮遊培養し、経時的に生細胞密度をベックマン・コールター社の生死細胞オートアナライザー Vi-CELL(登録商標)を用いて測定し、対数増殖期の倍化時間を測定することにより評価した。倍化時間が35時間以下のものを選択した。選択した各クローンの最高到達生細胞密度は、4×106個/mL以上であった。
クローニングで増殖性の良かったクローンをスケールアップの過程で一部サンプリングし、ウイルス高生産性株の選択のために、HVJの生産性試験を行った。
HVJの産生は、細胞にトリプシン2〜8μg/mL(終濃度)および種ウイルスとなるHVJ(multiplicity of infection ; MOI=23)を添加し、32〜34℃、5%CO2インキュベーターで2日〜3日間培養し、遠心処理により上清を回収し、HVJ産生力価を測定した。
HVJ産生量はHA試験(赤血球凝集反応試験:HVJウイルス膜上のHAタンパクのもつ赤血球凝集能を測定することで物理的なウイルス粒子数を定量する)、NA試験(ノイラミニダーゼ活性試験:HVJウイルス膜上のHAタンパクのもつノイラミニダーゼ活性を測定することで、物理的なウイルス粒子数を定量する)もしくはFFU試験(蛍光抗体法:感染細胞数をカウントすることで感染性HVJの定量を行う)を用いて行った。(参考文献:ウイルス実験プロトコール,メジカルビュー社、1995, 68-78、The sialic acids J. Biol. Chem., 240, 3501(1965))1例として、図2にFFU試験にて産生力価を測定した結果を示す。様々な生産性を示すクローンが得られていた。これらの各試験は具体的には次のようにして行なった。
上記2クローン(CloneA, CloneB)について、上記バイオリアクターで産生させ、ハーベストマテリアルを精製して不純物を取り除いたHVJの、遺伝子導入活性を比較した。比較対照として、卵でHVJを増殖させて同様に精製したもの(Egg)を同時に試験した。HVJとルシフェラーゼ遺伝子発現プラスミド(pGL3)とをBHK-21細胞にトランスフェクションを行った。トランスフェクションは、HVJ-Eと導入するpGL3を界面活性剤で処理し遠心処理を行い、pGL3をHVJ-Eに封入、これを導入細胞に添加し、HVJのもつ細胞膜融合能を利用して、細胞に導入するという方法で行った。遺伝子導入から12〜24時間後にルシフェラーゼアッセイ試薬を用いて相対発光ユニット(RLU)を測定した。結果、CloneBがCloneAより高い遺伝子導入活性を示しており、いずれにおいても比較対照の卵で増殖させたそれより、高い活性を得られた(図4)。
(1) 増殖能
HVJ産生能から選択したクローンのバッチ培養での細胞増殖性を検討した。4×105細胞/mLで細胞を植え込み、36.5℃、5%CO2インキュベーター内でロータリーシェーカーを用いて旋回培養(100〜120rpm)を行い、サンプリングを行ってセルカウントを実施した。対数増殖期(day1〜day4)の倍加指間は28時間、培養開始5日目に最高到達密度5×106細胞/mLに達した。セルカウントはベックマン・コールター社の生死細胞オートアナライザー Vi-CELL(登録商標)を用いて行い、直径12〜20μmの細胞をカウントした。結果を図5に示す。
樹立したウイルス高生産性クローンGIC20を用いてHVJウイルスの産生条件の至適化を行い、HVJ産生能を試験した。インフェクション用細胞を2×106細胞/mLまで増殖させ、酪酸ナトリウム(終濃度 1〜4mM)およびトリプシン(終濃度 2〜8μg/mL)を添加したインフェクション用培地を30〜50%添加し、HVJウイルス液をMOI= 1〜10で添加、32〜34℃で40〜44時間培養を行い、培養上清を遠心処理により回収した。回収したサンプルは小分け分注して-80℃で保存した。HVJ回収サンプルの力価測定は、上述の方法により行った。結果、FFU=3.82E+9FFU/mL、NA=289.1mU/mL、HA=1024HAU/mLの力価を得た。
GIC20のHVJ以外のウイルス産生能を確認した。対数増殖期にある細胞2×106細胞/mLを遠心処理により培養上清を捨てて2倍濃度に濃縮し、アデノウイルスベクター(Adeno CMV-LacZ)をMOI=2で感染させた。37℃、5%CO2インキュベーター内でロータリーシェーカーを用いて1時間の感染培養(100rpm旋回培養)行った後に、新鮮培地を等量添加し、さらに感染培養を続けた。感染から48時間後に上清を回収し、アデノウイルス力価を測定した。GIC20細胞により産生されたアデノウイルスベクターはBD Adeno-X Virus Purification Kits(BD, Cat.No.631533)を用いて精製し、BD Adeno-X Rapid Titer Kit(BD, Cat.No.631028)を用いて測定した。その結果、1.3×109ifu/mL 細胞あたりにして 185 ifu/cellの力価を得た。(オリジナルの293細胞を用いて産生させた場合の細胞当たりの産生量は高いもので120 ifu/cellであった。)
Claims (17)
- ヒト腎癌化細胞株に由来し、無血清培地中での浮遊培養において、対数増殖期における倍化時間が40時間以下であり、凍結リカバリー性を有し、浮遊培養における最高到達生細胞密度が106個/mL以上であり、細胞内においてセンダイウイルスの増殖が可能な単離されたヒト細胞。
- 36.5℃、5%CO2下の浮遊培養での対数増殖期における倍化時間が25時間〜30時間である請求項1記載の単離されたヒト細胞。
- 36.5℃、5%CO2下の浮遊培養における最高到達生細胞密度が106個/mL以上である請求項1又は2記載の単離されたヒト細胞。
- 前記最高到達生細胞密度が2 x 106個/mL〜107個/mLである請求項3記載の単離されたヒト細胞。
- センダイウイルスの増殖が、108FFU/mL以上のフォーカス形成単位を達成し得る請求項1記載の単離されたヒト細胞。
- 6 x 108FFU/mL〜5 x 109FFU/mLのフォーカス形成単位を達成し得る請求項5記載の単離されたヒト細胞。
- 前記ヒト腎癌化細胞株がヒト腎癌化細胞株293細胞株である請求項1記載の単離されたヒト細胞。
- FERM BP-10399の受託番号で寄託されたGIC20細胞である請求項7記載の単離されたヒト細胞。
- ヒト腎癌化細胞株を無血清培地中で浮遊培養し、増殖する細胞をクローニングする工程と、クローン化された細胞から、無血清培地中での浮遊培養において対数増殖期における倍化時間が40時間以下であり、凍結リカバリー性を有し、浮遊培養における最高生細胞密度が106個/mL以上であり、細胞内においてセンダイウイルスの増殖が可能な細胞を選択する工程とを含む、ヒト細胞の取得方法。
- 前記細胞を選択する工程において、36.5℃、5%CO2下の浮遊培養での対数増殖期における倍化時間が25時間〜30時間である細胞を選択する請求項9記載の方法。
- 前記細胞を選択する工程において、36.5℃、5%CO2下の浮遊培養における生細胞密度を106個/mL以上とすることができる細胞を選択する請求項9記載の方法。
- 前記細胞を選択する工程において、前記生細胞密度を2 x 106個/mL〜107個/mLとすることができる細胞を選択する請求項11記載の方法。
- センダイウイルスの増殖が、108FFU/mL以上のフォーカス形成単位を達成し得る細胞を選択する請求項9記載の方法。
- 6 x 108FFU/mL〜5 x 109FFU/mLのフォーカス形成単位を達成し得る細胞を選択する請求項13記載の方法。
- 請求項1記載の単離されたヒト細胞を、複数の容器に収容して成るマスターセルバンク。
- 請求項1記載の単離されたヒト細胞に所望のウイルスを接種し、該細胞内でウイルスを増殖させ、増殖したウイルスを回収することを含む、ウイルスの生産方法。
- 前記ウイルスがセンダイウイルス又はアデノウイルスである請求項16記載の方法。
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