KR0177323B1 - 바이러스 백신 생산에 유용한 사람 이배체 폐세포 및 이를 이용한 수두 백신의 제조방법 - Google Patents
바이러스 백신 생산에 유용한 사람 이배체 폐세포 및 이를 이용한 수두 백신의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 바이러스 백신 생산에 숙주세포로 이용할 수 있는 사람 이배체 세포주 및 이를 이용하여 특히 수두 백신을 제조하는 방법에 관한 것으로, 사람 태아의 폐조직으로 부터 초대 배양한 사람 태아 이배체 폐섬유아세포 LBHEL 세포주 (KCTC 0127BP) 를 숙주 세포로하여 수두 바이러스를 배양하고 이를 분리하는 단계를 포함하는 수두 백신의 제조방법에 의하면, 대규모의 수두백신을 효율적으로 제조할 수 있다.
Description
제1도는 본 발명의 LBHEL 세포주의 핵형 분석 결과를 보여주는 현미경 사진(배율 1,000X)이다.
제2도는 수두바이러스의 역가측정시 반점(plaque) 모양을 나타낸 현미경 사진(배율 40X)으로서, 각각 LBHEL 세포주(A)와 MRC-5 세포주(B)의 경우를 나타낸 것이다.
제3도는 본 발명의 LBHEL 세포주 및 대조군으로서 MRC-5 와 HEL299 세포주의 성장곡선을 배양시간에 따른 세포수로서 나타낸 그래프이다.
제4도는 본 발명의 LBHEL 세포주 및 대조군으로서 MRC-5 와 HEL299 세포주의 FBS 농도에 따른 세포배양결과를 비교한 그래프이다.
제5도는 본 발명의 LBHEL 세포주에 있어서 수두 바이러스 접종비율(MOI)에 따른 세포외 수두 바이러스의 활성(PFU)을 나타낸 그래프이다.
제6도는 본 발명의 LBHEL 세포주에 있어서 세포병변(CPE)에 따른 세포외 수두 바이러스의 활성(PFU)을 나타낸 그래프이다.
제7도는 본 발명의 LBHEL 세포주에 있어서 수두 바이러스 감염세포 파쇄시 첨가되는 정상세포 구성비에 따른 세포외 수두 바이러스의 활성(PFU)을 나타낸 그래프이다.
제8도는 본 발명의 LBHEL 세포주에 있어서 세포 배양용기 표면의 세포 포화도에 따른 세포외 수두 바이러스의 활성(PFU)을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 바이러스 백신 생산에 유용한 사람 이배체 폐세포 및 이 세포를 숙주로 하여 수두 백신을 제조하는 방법에 관한 것이다.
바이러스에 의한 질병으로는 홍역, 풍진, 볼거리, 수두, 유행성 출혈열, 일본뇌염, 소아마비, A형 간염, B형 간염, C형 간염, 천연두 등이 있는데(D. M. Knipe et al., Virus Taxonomy. In: B.N. Fields, ed. Virology, Second Edition, Raven Press, Ltd, New York, 1990), 이중에서 홍역, 볼거리, 풍진, 수두, 유행성 출혈열, 일본 뇌염, 소아마비, A형 간염, 천연두 등은 바이러스 입자를 불활성화하거나 독성을 약화시켜서 예방용 백신으로 사용하고 있다(World Human Vaccine Markets. Forst Sullivan Market Intelligence, 1994).
이들 바이러스를 생산하기 위한 숙주세포로는 달걀의 수정란, 젖먹이 쥐의 뇌, 포유동물의 이배체 세포 등 세가지가 대체로 사용되고 있다.
달걀의 수정란과 젖먹이 쥐의 뇌를 바이러스 배양의 숙주로 사용하면 저렴한 비용으로 바이러스를 생산할 수 있으나, 이들 숙주에 감염되는 바이러스의 종류에는 제한이 있고 바이러스의 정제과정이 복잡할 뿐만 아니라, 정제과정에서 숙주세포의 이종단백질이 포함되어 부작용을 일으킨다는 문제점이 있다.
반면에 사람에게서 유래된 정상 이배체 세포에서 바이러스를 증식시켜 백신을 제조하면 백신 접종시 수반될 수 있는 이종 단백질에 의한 부작용을 줄일 수 있기 때문에, 사람 정상 이배체 세포가 백신 생산에 가장 적합한 것으로 알려져 있다.
사람 이배체 세포로서는 MRC-5 세포(ATCC, CCL 171)와 WI-38 세포(ATCC, CCL 75)가 홍역, 수두, A형 간염 백신 생산에 이미 사용되고 있다.
MRC-5 세포는 1966년 제이콥스에 의해 14주된 남아의 폐조직에서 유래되어 확립된 세포주로서, 증식이 잘되고 WI-38 세포보다 환경적인 요소에 덜 민감하다고 보고되었으며(Proc. Symp. Human Diploid Cells, Yugoslave. Acad. SCI. Arts. Zagreb., pp 43-45, 1970; Nature(Lond.) 227: 168-170, 1970), 다양한 사람 바이러스 백신 생산에 유용한 세포주로 알려져 있다(Nature(Lond) 238: 26, 1972; ibid., 239: 316, 1972).
한편, WI-38 세포는 헤이플릭에 의해 석달된 여아의 폐조직으로부터 유래되어 확립된 사람 이배체 세포주로서(Exp. cell Res. 25: 585, 1961), 콜라겐을 분비하며 다양한 바이러스 백신의 생산에 사용되어 왔다(Am. J. Hyg. 75: 240, 1962).
이들 MRC-5 와 wi-38 세포는 폴리오바이러스 I형(poliovirus type I), 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus), 구내염 바이러스(Indiana stain), 홍역 바이러스(Edmonston stain)에 대한 감수성이 뛰어나다고 보고되어 왔다(proc. Soc. Exp. Boil. Med. 86: 277, 1954).
HEL 299(ATCC CCL 137) 세포는 브래킷이 1965년에 흑인 남자 태아의 폐조직으로 부터 백신 생산에 유용하도록 개발한 이배체 섬유 세포주의 한 종류로서, 독특하게 글루코즈-6-포스페이트 데하이드로게나제 A 형을 나타낸다(W.D. Peterson, Jr. et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 128: 772 1968).
수두(chickenpox)는 흔히 물마마라 불리워지는데, 헤르페스 바이러스 계통의 일종으로 200nm의 크기를 갖는 바리셀라 조스터 바이러스(Varicella-Zoster Virus; VZV)에 의하여 어린이나 면역성이 약화된 노약자 및 환자에게 발병하는 매우 전염성이 강한 바이러스성 질환이다.
VZV 에 감염된 후 14일 정도 지나면 감기증상과 유사하게 열이 발생하고 전신에 반점형태의 발진이 일어나서 여드름 형태로 발전하여 낭을 형성하게 되는데 심한 경우 치명적인 흉터를 동반한다.
바이러스 증식을 제어할 수 없을 정도로 세포성 면역성이 현저히 떨어진 노년층이나 환자의 경우에는, 특히 항체가 존재하더라도 VZV 가 재활성되어 신경절 세포에서 다증식이 이루어져 잠복의 역순에 의해 피부로 다시 이동, 확산되어 대상포진(Herpes zoster)을 일으킨다(h. John, et al., Virol. 5, 241(1994); D.G. Lawrence, et al., Virology, 2011-2054 (1990)).
이렇게 신경절 세포에서 재활성화된 VZV 는 1차 수두성 폐렴과 같은 수두성 질병에 걸려 있는 환자의 경우, 보다 심각한 증상을 야기시킨다.
즉, 1차적으로 떨림, 근육 저긴장증(마비), 급성 소뇌퇴행성과 같은 중추신경계(CNS) 이상이 시작되고 극히 일부이기는 하지만 뇌출혈, 말초혈관 원형세포 침윤 등으로 더욱 심화되어 신경염이나 뇌척수염으로 발전, 결국 사망에까지 이르게되는 치명적인 질환이 되기도 한다.
미국의 경우에는 1년에 400만명 정도의 수두환자와 120만명 정도의 대상포진 환자가 발생하여 매년 100명 이상이 수두성 복합질환에 의해 사망하는데, 특히 백혈병 환자와 같이 면역억제제를 투여해야 하는 경우에 더욱 치명적인 것으로 보고되고 있다(G. Fleisher, et al., Am. J. Dis. Child, 135,896 (1981); R.P. Stephen, et al., Pediatrics, 68, 14(1981), P.A. Patel, et al., Pediatrics, 94, 223 (1979)).
이와 같은 수두를 예방하기 위한 백신은 약독화된 VZV 가 주성분으로 되며, 기존의 세포배양 시스템을 이용한 VZV 의 증식은 사람 양막(Amnion)세포, 사람 갑상선(Thyroid)세포, 사람 태아 폐(Embryolung)세포, 사람 자궁암(Cervix hela)세포, 원숭이 신장(Kidney) 세포 등 여러가지 세포에서 가능한 것으로 보고되었다(E. V. Meurisse et al., J. Microbiol. 2, 317 (1969)).
그러나 이중에서 원숭이 신장 세포는 사람과 다른 이종 세포이므로, 사람 정상 이배체 세포와 비교하여 백신 생산에 적합하지 못한 것으로 알려져 있다.
뿐만 아니라, ATCC에서 분양받을 수 있는 사람 정상 이배체 세포인 MRC-5, WI-38, HEL299 등을 숙주로하여 VZV 를 증식시킬 경우에는 생산성이 매우 낮아 백신 생산용으로 사용하기에 부적절한데, 그 주된 이유는 이러한 세포주들의 계대수가 이미 너무 높기 때문인 것으로 추정된다.
종래에 알려진 수두 백신의 제조방법으로는 오까(Oka) 바이러스주를 기니픽 태아세포주(Guinea Pig Priamry Embryonic Tissue Cell; GPEC)에서 다단계의 약독화 과정을 거친 후 수두백신을 생산하는 방법(미국 특허 제 3,985,615 호, 1976년), 사람 태아 섬유아세포인 WI-38 세포주에서 10-80 회 연속계대배양을 통해 수두 백신을 제조하는 방법(미국 특허 제 4,000,256 호, 1976년) 등이 알려져 있다.
이밖에 온도변화에 민감한 변종(temperature-sensitive mutant) 수두 바이러스를 WI-38 세포에서 제조하는 방법(미국 특허 4,000,317 호, 1977년)도 소개되어 있다.
최근에 미국의 머크(Merck)사에서는 MRC-5 세포에서 향상된 수율로 수두백신을 제조하는 방법(미국 특허 제 5,360,736 호, 1994년)을 소개하고 있다.
그러나, 이들 방법은 수두 바이러스 증식율이 낮은 GPEC 세포, 또는 계대수가 많아져 수두 바이러스 생산능력이 격감된 WI-38 세포나 MRC-5 세포를 사용하기 때문에, 대규모의 수두 백신 생산에는 적용하기 어려운 단점이 있다.
본 발명에서는, 종래 사용되어 온 세포주에 비하여 각종 바이러스에 대한 감염 민감도가 높고, 특히 수두 바이러스의 증식율을 높일 수 있는 신규의 사람 이배체 세포주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적은, 신규의 사람 이배체 세포주를 이용하여 수두백신을 제조할 때, 보다 높은 생산 수율을 얻을 수 있는 바이러스 배양조건을 확립하고 보다 우수한 안정화 제제를 사용한 수두백신의 제조방법을 제공하는 것이다.
특히, 수두 바이러스는 세포 의존성 형질을 가지고 있어 세포밖에서는 바이러스가 비활성화되기 때문에, 세포의 수두 바이러스(cell-free VZV)를 안정화시키는 방법을 제공하고자 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 사람 태아의 폐조직으로부터 초대 배양한 사람 태아 이배체 폐섬유이세포 LBHEL 세포주를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 수두백신의 제조방법은 상기 LBHEL 세포주를 숙주세포로 하여 수두 바이러스를 배양하고 이를 분리하는 단계를 포함한다.
본 발명에서는 여러 바이러스주들이 잘 증식할 수 있는 사람 태아의 폐조직으로부터 초대 배양하여 사람 태아 이배체 폐섬유아세포(human embryonic lung fibroblast diploid cell)인 LBHEL 세포주를 확립하여, 국제 기탁기관인 한국과학기술원 부설 생명공학연구소(KCTC)에 1994년 11월 9일자 기탁번호 KTTC0127BP 로 기탁하였다.
본 발명에 따른 신규한 사람 이배체 세포인 LBHEL 세포주는 다음과 같은 방법으로 제조된다:
사람 태아의 폐조직을 소량 떼어낸 후, 가로 세로 각각 약 2mm 정도로 잘게 절단하여 인산염 완충용액으로 3회 세척하고, 콜라겐 분해 효소와 디스페아제(Dispase)가 각각 130 단위/㎖ 및 1 ㎎/㎖ 씩 들어 있는 인산염 완충용액에서 5 분 동안 배양한다.
배양액을 200 G에서 원심부리하고 침전된 폐조직을 취하여 상기의 분해효소액으로 37℃에서 30 분간 배양한 다음, 상등액을 취하여 5 ％ 송아지 태아 혈청(FBS)으로 중화시킨다.
결합조직만 남을 때까지 상기 분해효소액 처리를 3-4회 실시하여 상등액을 모두 모으고 FBS로 중화시킨다.
위의 세포 추출물 전체를 4 ℃ 에서 1 시간 동안 방치하여 다세포군을 침전시키고, 단일 세포로 존재하는 상등액만을 조심스럽게 취한다.
1000 G에서 원심분리하여 침전된 세포를 수집하고 10％ FBS이 포함된 DME 배지(GibcoBRL 12800-082)에 분산시켜, 3 x 105세포/㎖ 의 갯수로 T-플라스크에서 배양한다.
T-플라스크의 표면에 포화될 때까지 배양한 후, 트립신으로 처리하여 연속 계대배양한다.
이렇게 초대배양하여 얻어진 LBHEL 세포주는 비교 대조세포군인 MRC-5 세포 및 HEL299 세포와 비교할 때, 성장속도가 월등히 우수하고 다양한 바이러스에 대하여 감수성(susceptibility)을 보였으며, 또한 30 계대 이상 지나도 같은 성장속도를 유지하는 것으로 나타났다.
사람 정상 이배체 세포주는 사람 태아의 조직으로 부터 유래된 세포로서, 그세포의 형태 및 생물학적 특성을 대부분 유지하고 있으며 형질전환이 일어나지 않은 세포로 대부분의 세포에 있어서 염색체 수가 2n=46 이어야 한다.
본 발명에서 초대 배양되어 사용된 사람 태아 폐섬유아세포인 LBHEL 세포주는 충남대학교 의과대학에서 수행한 염색체 이상 시험에 통과하였다.
분석 항목으로는 염색체 다배수성 시험, 이수성 시험, 형태 이상 시험, 염색체 절단 시험 및 핵형 분석 시험이 포함되었으며, 모든 시험은 보사부에서 공시한 생물학적 제제기준 및 시험 방법(1992)에 의거하여 음성대조군 MRC-5 세포주를 기준으로 하여 수행되었다.
제1도는 본 발명의 LBHEL 세포주의 핵형 분석 결과를 보여주는 현미경 사진(배율 1,000X)이다.
또한, 본 발명의 LBHEL 세포주는 세포성 면역이 결핍된 누드 마우스 5마리 이상에 각각 2 x 106개 이상씩 피하주사하고 28일간 관찰하였을 때 종양 형성능력이 없음이 확인되었다.
반면, 대조군인 Hela 세포를 5마리 이상의 누드 마우스에 같은 방법으로 마리당 2 x 106개 이상 피하주사 하였을 경우에는 모든 동물에서 종양이 형성되었다.
이상의 실험 결과들은 본 발명의 사람 태아 폐섬유아세포 LBHEL 세포주가 극히 정상적인 이배체 세포임을 확인시켜 주었다.
본 발명에 따라 개발된 신규한 LBHEL 세포주는 다음과 같은 특성을 갖는다:
(1) 세포성장 속도
백신 제조시의 표준 세포주인 MRC-5 와 비교해 볼 때 성장속도가 매우 빨라서, MRC-5 배양일수의 절반동안에 같은 세포수로 성장할 수 있으며 배양용기의 동일 표면적에 70％ 이상의 많은 세포가 증식할 수 있다.
(2) 바이러스 역가 측정의 숙주세포
바이러스의 역가(titer)를 결정하는 실험의 숙주세포로 사용할 때 반점(plaque)의 식별이 매우 용이하여, MRC-5 를 숙주세포로 하여 역가를 측정할때에 비하여 훨씬 재현성이 높은 데이터를 얻을 수 있다.
제2도는 수두 바이러스의 역가측정시 반점(plaque) 모양을 나타낸 현미경 사진(배율 40X)으로서, 각각 LBHEL 세포주(A) 과 MRC-5 세포주(B)의 경우를 나타낸 것이다.
(3) FBS 의 이용도
MRC-5, WI-38 및 HEL299 등 기존의 사람 이배체 정상 세포주는 대부분 배지에 FBS 가 10 ％(v/v)농도로 함유될 필요가 있으나, 본 발명에 의해 제조된 LBHEL 세포주는 5% 의 FBS 가 함유된 배지에서도 10% FBS 가 함유된 배지에서와 동일하게 잘 성장하였다.
포유동물 세포의 대규모 배양시 FBS 가 원료에서 제일 높은 구성비를 차지하는 것은 이미 잘 알려진 사실이다.
LBHEL 세포주는 여타 정상 세포주가 필요로 하는 FBS 사용량의 절반 수준에서도 잘 성장하므로, 대조 세포주보다 제조 원가면에서 월등히 유리하다.
(4) 수두바이러스에 대한 감수성
수두 바이러스를 효과적으로 증식시키기 위해서는 숙주 세포가 바이러스에 대해 높은 민감도(susceptibility)를 갖고 있어야 한다.
다음 표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 LBHEL 세포주는 여타의 사람 이배체 정상세포주 MRC-5, HEL299 및 Lu18 과 비교하였을 때 월등히 높은 민감도를 보인다.
이처럼 민감도가 높다는 것은 수두 바이러스의 증식이 LBHEL 세포주에서 훨씬 효과적으로 일어났다는 것을 보여 주는 것이다.
실험용 수두 바이러스는 시판되고 있는 바리셀라 비켄오까(Varicella Biken Oka)를 사용하였으며, 각각 세포주에 한개의 바이알씩 접종시켰다.
본 발명의 LBHEL 세포주를 사용하여 약독화 수두 백신을 제조하는 방법은 다음과 같다.
(1) 세포배양
LBHEL 세포주는 5% FBS 가 첨가된 DME 배지에서 단층 배양을 하며, 배양온도 37℃ 및 5% 의 CO가 존재하는 대기조건에서 세포 배양을 실시한다.
대조세포군인 MRC-5 와 HEL299 세포주는 10% FBS 가 첨가된 배지에서만 정상적인 세포 성장속도를 보이지만, 본 발명의 LBHEL 세포주는 5% 의 FBS 농도에서도 정상적인 성장속도를 보인다.
세포의 단층 배양시 세포 증시 비율(split ratio)은 1:5 내지 1:10의 범위로 하며 배양용기 표면에 70-80% 만 포화되도록 한 후 다음 단계의 계대배양을 수행한다.
특히, 세포성장이 포화된 세포주에서는 세포외 수두 바이러스 생산량이 격감되므로, 배양용기 표면의 70∼80% 만 포화된 후 계대배양을 실시하며, 수두 바이러스 접종시에도 70∼80% 포화된 단층배양 LBHEL 세포주를 사용한다.
(2) 수두 바이러스의 증식 및 분리
단층배양된 LBHEL 세포주에 대한 바이러스의 접종비율(Multiplicity of Infection; MOI)은 1:15 내지 1:20 으로 하고 세포 병변현상(cytopathic effect; CPE)이 50% 이하, 바람직하게는 30 내지 45%일 때 감염된 세포주를 수확한다.
단층배양된 세포주에 대한 수두 바이러스 접종 비율(MOI)을 1: 15 에서 1: 50까지 변화시켜 가며, 수두 바이러스 생산량의 변화 특성을 살펴 본 결과, LBHEL 은 1:20 일때 가장 높은 바이러스 생산량을 보였는데, 대조 세포주인 MRC-5 나 HEL299 보다 세포 병변(Cytopathic Effect; CPE)에 저항성이 큰 것을 나타낸다.
감염된 세포를 수확하는 시기는 CPE 상태를 현미경으로 관찰하여 결정하는데, LBHEL 세포주의 경우는 CPE 가 50% 이하일 때 가장 높은 수율로 세포외 바이러스를 얻을 수 있다.
바이러스의 실제적인 역가는 플라크 분석(plaque assay)에 의해서 결정되지만, 실험에 여러날이 소요되기 때문에 이 방법으로 감염된 세포를 수확하는 싯점을 결정할 수 는 없기 때문에, CPE을 현미경으로 직접 관찰한 후 수확시기를 결정하게 된다.
본 발명에서의 CPE 조건하에서는 48 시간 이내에서 수행할 때 가장 높은 수율로 바이러스를 획득할 수 있다.
수두 바이러스는 세포 의존성을 갖고 있어서 세포밖으로 분비된 수두 바이러스의 생존율은 거의 영점에 이르며, 세포를 파쇄하여 세포내에 존재하는 수두 바이러스를 세포밖으로 이끌어 낼 경우 매우 빠른 속도로 불활성화된다.
따라서, 미국특허 제 4,000,256 호(1976년)에서는 세포파쇄시 인산염 완충용액에 수크로즈(sucrose)를 약 7.5% 첨가하여, 세포외 수두 바이러스를 보호하고자 하였다.
그러나 초음파 파쇄 방법에 의해 세포를 파쇄할 때는, 세포만 파쇄되는 것이 아니고 여분의 파쇄력에 의해서 바이러스 자체도 파쇄되므로 세포외 바이러스 수득율이 매우 떨어지는 것이 관측되었는데, 수크로즈 첨가제는 이러한 현상을 방지할 수 없다.
본 발명에서는 초음파 파쇄력이 수크로즈보다 훨씬 크기가 큰 고분자성 입자에 의해 흡수된다는 것에 착안하여 다양한 생고분자와 함께 초음파 파쇄실험을 수행한 결과, 세포외 수두 바이러스를 여분의 초음파 파쇄력으로 부터 보호하는 가장 효과적인 입자는 바이러스에 감염되지 않는 LBHEL 세포 그 자체인 것을 발견하였다.
즉, 수두 바이러스에 감염되지 않는 LBHEL 세포를 감염된 세포와 일정비율로 혼합한 후 초음파 파쇄를 수행할 경우, 최고 200%까지 세포외 바이러스 수득율이 향상됨을 알 수 있었다.
이는, 다른 고분자물질은 초음파 파쇄에 의해 자체가 분해되지 않기 때문에 흡수력이 제한되지만, 비감염 LBHEL 세포자체는 매우 큰 생고분자 입자일 뿐 아니라 여분의 초음파 파쇄력이 흡수되면서 세포를 파쇄하는 과정에서 가장 효과적으로 여분의 파쇄력을 소멸 시킬 수 있기 때문인 것으로 해석된다.
이러한 방법에 따라 세포를 파쇄시킬 경우에는 기존의 방법들에 비해 세포잔해물(cell debris)이 많이 생성되기 때문에, 정제과정에서 생기는 여과나 원심분리등의 조작에 의해서도 세포외 바이러스 역가가 떨어지는 것으로 보고되어 있다.
본 발명에서는 세포잔해물을 제거하는 원심분리 과정에서 이와 같이 바이러스 역가가 저하되는 것을 방지하기 위해서, 파쇄용액의 수크로즈 농도를 획기적으로 높이는 방법을 선택하였다.
이 방법에 의하면, 세포잔해물을 효과적으로 제거할 수 있을 뿐 아니라 원심분리 과정에서 생기는 역가의 손실도 효과적으로 방지할 수 있다.
즉, 본 발명의 수두 바이러스 배양방법에 있어서, 세포외 바이러스를 높은 수율로 얻기 위해서는 완충제로서 감염되지 않은 LBHEL 세포를, 바람직하게는 감염된 세포의 20 내지 60% 로 혼합된 후 세포파쇄를 시행하며, 이 때 세포 파쇄후 생기는 세포잔해물의 분리를 돕고 분리중 수두 바이러스의 역가를 보존하기 위해서는 수크로즈를 완충용액의 2배 이상, 바람직하게는 15 내지 45 % 첨가하여 원심분리한다.
이하 본 발명을 실시예에 의해서 더욱 상세히 설명한다.
단 하기의 실시예는 본 발명의 예시일 뿐 본 발명이 이들 만으로 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1]
[LBHEL 세포주와 기존의 MRC-5, HEL299 세포주의 성장 곡선 비교]
사람 태아의 폐조직으로부터 초대배양하여 개발한 본 발명의 LBHEL 세포주(KCTC 0127BP)와 대조군으로서 MRC-5(ATCC CCL 171) 와 HEL299(ATCC CCL 137) 세포주의 성장곡선을 배양시간에 따른 세포수로써 측정하였다.
T80 플라스크에 단층 배양된 세포들을 인산염 완충용액(pH 7.2)으로 3회 세척하고 0.25% 트립신을 처리하여 2-3분 정도 지난 후 세포를 수확하여 1000rpm 에서 3분 정도 원심분리하였다.
침전된 세포를 DME(5-10% FBS)배지로 현탁하여 2 x 10 세포/T80 플라스크가 되도록 넣어 37℃, 5% CO배양기에서 배양하였다.
24시간 간격으로 인산염 완충용액으로 3회 세척하고 0.25% 트립신을 처리하여 2-3분 정도 지난후 세포를 수확하여 1000rpm에서 3분정도 원심분리하였다.
침전된 DME 세포를 배지로 현탁하여 헤모사이토미터에 점적한 후 100배 배율의 현미경하에서 세포수를 측정하였다.
제3도는 본 발명의 LBHEL 세포주 및 대조군으로서 MRC-5 와 HEL299 세포주의 성장곡선을 배양시간에 따른 세포수로서 나타낸 그래프이다.
여기에서 보면, LBHEL 세포주는 MRC-5 또는 HEL299 세포주보다 로그기(log phase)가 하루 앞서 나타나고, 세포단층 형성시 세포수는 1.5배 많았다.
제4도는 본 발명의 LBHEL 세포주 및 대조군으로서 MRC-5 와 HEL299 세포주의 FBS 농도에 따른 세포 배양 결과를 비교한 그래프로서, 각각 4일 배양한 후의 세포수를 나타낸 것이다.
여기에서 보듯이, MRC-5 및 HEL299 세포주는 FBS 가 5% 함유된 DME 배지에서도 거의 비숫한 수준으로 성장하는 것을 알 수 있다.
또한 계대수에 있어서도 LBHEL 세포주는 20계대 이상에서도 잘 성장하였다.
T80 플라스크와 유사한 형태로서 특수한 장치없어도 비교적 많은 양의 세포를 배양할 수 있는 다층 배양판(multitray unit, Nunc 164327, 6000㎠)에서도 LBHEL 세포주는 T80 플라스크와 유사한 수준으로 성장하였는데, 바이러스 백신 생산에서도 숙주 세포 배양이 용이한 LBHEL 세포주가 유리하다.
[실시예 2]
[LBHEL 세포주와 기존의 세포에서 수두 바이러스에 대한 감수성 비교]
사람 태아의 폐조직으로부터 초대배양하여 개발한 본 발명의 LBHEL 세포주 및 대조군으로 MRC-5와 HEL299 세포주를 60mm 페트리디쉬 단층배양하였다.
비켄 수두백신을 DME(3% FBS)배지로 적당히 희석하여 인산염 완충용액으로 3회 세척한 단층배양된 세포에 0.1㎖/디쉬씩 접종하고, DME(3% FBS) 배지를 넣은 후 37℃. 5% CO배양기에서 6-8일간 배양하면서 40배 배율의 현미경으로 플라크수를 세어 세포외 바이러스 활성(Plaque forming unit; PFU)을 측정함으로써 수두 바이러스 감수성을 확인하였다.
또한 이들 각 세포주들의 각각 다른 계대수에 대한 수두 바이러스의 PFU를 측정하여 표 2에 나타내었다.
상기 표 2에서 보듯이, LBHEL 세포주가 MRC-5 또는 HEL299 세포주보다 10배 정도의 높은 감수성을 보였다.
따라서 본 발명의 LBHEL 세포주가 수두 바이러스 백신 생산에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
[실시예 3]
[LBHEL 세포주와 MRC-5, HEL299 세포주에 대한 수두 바이러스의 증식 능력 비교]
(단계 1) 수두 바이러스 접종 및 감염세포의 수확
사람 태아의 폐조직으로부터 초대 배양하여 개발한 LBHEL 세포주, 그리고 대조군으로 MRC-5와 HEL299 세포주를 T80 플라스크에 단층배양하였다.
단층 배양된 세포주를 인산염 완추용액으로 3회 세척한 후 수두 바이러스 감염세포(Varicella Oka Strain, ATCC VR-795, Lot No. 6w)를 접종시켰다.
접종액의 바이러스 활성은 100,000-200,000 PFC/T80 플라스크(2㎖)로 되도록 하였다.
접종하고 1-2시간 정도 지난 후에 3% FBS 를 함유하는 DME 배지를 넣어주고 배양기에 48시간 정도 배양하여 세포병변 효과가 25-50% 정도 나타났을 때 인산염 완충용액으로 다시 3회 세척하고 0.02% EDTA를 처리하였다.
5-10분 정도 배양후 감염세포를 떼어내 1000rpm에서 3분 정도 원심분리하여 감염세포를 수확하였다.
(단계 2) 초음파 파쇄
수확한 간염세포에서 세포외 바이러스를 얻기 위해서 초음파 파쇄를 실시하였다.
먼저, 감염세포를 파쇄용액인 SPGE(pH 7.2, 7.5-37.5%(w/v) 수크르즈, 0.0038M 인산칼륨(1 염기), 0.0072M 인산칼륨(2 염기), 0.0049M 글루탐산 나트륨, 0.2% EDTA)에 5-10 x 10 세포/1㎖의 농도가 되도록 잘 풀어준 후, 초음파 파쇄기(Sonifier; Branson 450)를 이용하여 T80 플라스크의 경우 마이크로팁(Microtip)을, 다층배양판(CF-10)의 경우 호른(Horn)으로 원형세포가 거의 없을 정도까지 파쇄하였다.
이때, 파쇄용액은 얼음 용기에 넣어서 차게 유지하였다.
감염세포 파세액을 4℃ 에서 1000rpm으로 10분 정도 원심 분리하여 상등액만을 취하였다.
(단계 3) 바이러스 활성(PFC PFUC) 조사
실시예 2와 동일한 방법으로 수두 바이러스에 대하여 가장 감수성이 좋은 LBHEL 세포를 페트리 디쉬(직경 60mm)에 단층배양시킨 후 인산염 완충용액으로 3회 세척하였다.
실시예 3의 (단계 2)에서 만든 바이러스 부유액을 적당히 5 으로 연속 희석하여 감염세포의 활성 측정시에는 0.3 ㎖/디쉬, 세포외 바이러스의 활성 측정시는 0.1 ㎖/디쉬가 되도록 넣어 주었다.
37℃, 5% CO배양기에서 30분 내지 1 시간 정도 흡착시킨 후 3% FBS 를 함유하는 DME 배지를 넣어주고 6-8일째 40배 배율의 현미경으로 플라크 숫자를 세어 감염세포 활성(Plaque forming cell; PFC)과 세포의 바이러스 활성(Plaque forming unit; PFU)을 측정하였다.
실험 결과를 아래 표 3에 나타내었다.
표3에서 보듯이, 각 세포주들에서 증식된 수두 바이러스의 활성을 비교하면 LBHEL 세포에서 수두 바이러스의 증식이 가장 잘됨을 알 수 있다.
감염세포의 활성 PFC 의 경우는 MRC-5등의 세포에서는 LBHEL 세포의50% 정도이나, 세포외 바이러스 활성 PFU 의 경우는 LBHEL 세포의 30%에도 미치지 않았다.
이상에서 상세히 살펴본 바와 같이, 본 발명의 사람 태아 이배체 폐세포 LBHEL는 수두 바이러스 백신 생산에 숙주세포로 사용하기 적합한 것이 밝혀졌다.
[실시예 4]
[LBHEL 세포주에서 접종비율(MOI)에 따른 세포외 수두 바이러스의 활성(PFUC) 비교]
실시예 3의 (단계 1)의 방법에 따라 미리 준비된 세포단층에 수두 바이러스 감염세포를 각각 1:10, 1:15, 1:20, 1:25 및 1:50 의 비율로 접종하였다.
실시예 3의 (단계 2)와 (단계 3)의 방법에 따라 감염세포를 수확한 후, 초음파 파쇄하여 세포외 수두 바이러스 활성(PFU)을 측정하였다.
제5도는 본 발명의 LBHEL 세포주에 있어서 수두 바이러스 접종비율(MOI)에 따른 세포외 수두 바이러스의 활성(PFU)을 나타낸 그래프이다.
여기에서 보듯이, LBHEL 세포주에서는 MOI 값이 1:20 일때 가장 높은 수율로 세포외 바이러스를 얻을 수 있음을 확인하였다.
[실시예 5]
[LBHEL 세포주에서 세포병변효과(CPE)에 따른 세포외 수두 바이러스의 활성(PFU) 비교]
실시예 3의 (단계 1)의 방법에 따라 미리 준비된 세포 단층에 수두 바이러스 감염세포를 1:20의 접종비율로 접종하였다.
세포병변효과가 각각 12.5, 25, 37.5, 50, 62.5, 75 및 87.5 %일때, 실시예 3의(단계 2)와 (단계 3)의 방법에 따라 감염세포를 수확한 후 초음파 파쇄하여 세포외 수두 바이러스의 활성(PFU)을 측정하였다.
제6도는 본 발명의 LBHEL 세포주에 있어서 세포병변효과(CPE)에 따른 세포외 수두 바이러스의 활성(PFU)을 나타낸 그래프이다.
여기에서 보듯이, CPE가 50% 이하일 때 세포외 바이러스를 높은 수율로 얻을 수 있음을 확인하였다.
[실시예 6]
[LBHEL 세포주에서 정상세포를 이용한 수두 바이러스의 안정화 효과]
실시예 3의 (단계 1)에서 준비된 감염세포로 부터 세포외 바이러스를 얻기 위한 초음파 파쇄시 수두 바이러스에 대한 정상세포의 안정화 효과를 보기 위해서, 감염세포를 20, 40, 60, 80 및 100% 가 되도록 하고 바이러스에 전혀 감염되지 않은 정상세포를 80, 60, 40, 20 및 0%가 되도록 하여 최종세포수를 동일하게 한 후 초음파 파쇄하였다.
실시예 3의 (단계 2)와 (단계 3)의 방법에 따라 세포외 수두 바이러스의 활성(PFU)을 측정하였다.
제7도는 본 발명의 LBHEL 세포주에 있어서 수두 바이러스 감염세포 파쇄시 첨가되는 정상세포 구성비에 따른 세포외 수두 바이러스의 활성(PFU)을 나타낸 그래프이다.
여기에서 보듯이, 기존의 감염세포만을 파쇄한 경우(즉, 정상세포 0%의 경우)보다 정상세포를 넣어주었을 때 전체적으로 높은 바이러스 활성을 얻을 수 있었다.
감염세포만 존재하는 경우와 비교하면, 전체 세포중 감염세포가 60 %(정상세포40%) 존재할 때 바이러스 활성은 2.3배, 감염세포가 80%(정상세포가 20%) 및 40% (정상세포 60%) 존재할 때 바이러스 활성은 각각 1.7배 및 1,9배 정도 높은 바이러스 활성을 나타내었다.
한편, CF-10을 사용하여 수두 바이러스를 대량 생산할 경우에도 정상세포의 안정화 효과가 있는지 여부를 실험하여 표 4에 나타내었다.
표 4 에서 보는 바와 같이, 수두 바이러스 대량 생산시에도 정상세포가 수두 바이러스 안정화에 효과적임을 확인하였다.
[실시예 7]
[LBHEL 세포주에서 스크로즈를 이용한 원형세포의 제거효과]
실시예 3의 (단계 1)에서 준비된 감염세포로부터 세포외 바이러스를 얻기 위한 초음파 파쇄후, 파쇄액중에 남아 있는 원형세포를 효과적으로 제거하기 위한 원심분리시 수크로즈 쿠션의 영향을 보기 위해서, 파쇄용액의 수크로즈 농도보다 각각 2배(15%), 3배(22.5%), 4배(30%), 5배(37.5%) 높은 수크로즈 쿠션을 사용하여 실험하였다.
이때, 각각의 쿠션층과 침전물은 버리고 바이러스 부유액만을 취하여 실시예 3 의 (단계 2)와 (단계 3)의 방법에 따라 세포외 수두 바이러스의 활성(PFU)을 측정하였고, 원형세포 존재 유무를 현미경하에서 관찰하였다.
실험 결과를 아래 표 5에 나타내었다.
상기 표 5에서 보는 바와 같이, 2 - 5배 농도의 수크로즈 쿠션을 사용하여 원심분리하면 수두 바이러스 활성은 거의 감소하지 않음을 알수 있다.
또한 대량 생산시에도 거의 비숫한 결과를 나타냈다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 방법에 따라 감염세포 파쇄액을 원심분리할 때 15-37.5 % 농도의 수크로즈 쿠션을 사용하면 바이러스 활성의 감소없이 원형세포를 완전히 제거할 수 있음을 확인할 수 있다.
[실시예 8]
[세포 배양용기 표면의 세포포화도에 따른 세포외 수두 바이러스의 활성(PFU) 비교]
LBHEL 세포주를 T80 플라스크에 각각 50, 75 및 100%의 세포단층을 이루게 한 후, 수두 바이러스 감염세포를 접종하여 37℃, 5% CO조건하에서 48시간 배양하였다.
실시예 3의 (단계 2)와 (단계 3)의 방법에 따라 감염세포를 수확한 후 초음파 파쇄하여 수두 바이러스의 세포외 바이러스의 활성(PFU)을 측정하였다.
제8도는 본 발명의 LBHEL 세포주에 있어서 세포 배양용기 표면의 세포 포화도에 따른 세포외 수두 바이러스의 활성(PFU)을 나타낸 그래프이다.
여기에서 보듯이, 100% 완전히 세포단층을 이루는 것보다 75% 정도의 세포단층을 이룰 경우에 세포외 수두 바이러스의 활성이 1.3배 증가되는 것을 알 수 있다.
이상에서는 본 발명의 LBHEL 세포주에 대하여 주로 수두 바이러스의 숙주세포로서의 용도를 설명 하였지만, LBHEL 세포주는 수두 바이러스의 생산에만 한정하지 않고 홍역, 유행성 출혈열, 일본뇌염, A형 간염등 사람 이배체 세포로 생산될 수 있는 모든 백신의 생산에 적용될 수 있다.
Claims (11)
- 사람 태아의 폐조직으로부터 초대 배양한 사람 태아 이배체 폐섬유아세포 LBHEL 세포주(KCTC 0127BP).
- 제 1 항의 LBHEL 세포주를 숙주 세포로 하여 수두 바이러스를 배양하고 이를 분리하는 단계를 포함하는 수두 백신의 제조 방법.
- 제 2 항에 있어서, LBHEL 세포주를 5% FBS 를 포함하는 DME 배지에서 단층 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 3 항 에 있어서, LBHEL 세포의 단층배양시 세포 증식 비율 1:5 내지 1:10 의 범위로 하며, 배양용기 표면에 70 내지 80 % 포화되도록 하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서, LBHEL 세포주에 대한 바이러스의 접종비율(MOI)이 1:15 내지 1;20인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서, 세포병변효과(CPE)이 50% 이하일 때 바이러스에 감염된 LBHEL 세포주를 수확하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 6 항에 있어서, 세포병변효과(CPE)이 30 내지 45 % 일 때 바이러스에 감염된 LBHEL 세포주를 수확하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서, 상기 바이러스 분리시, 감염되지 않은 LBHEL 세포를 감염된 LBHEL 세포와 혼합하여 세포를 파쇄한 후 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 8 항에 있어서, 상기 감염되지 않은 LBHEL 세포를 감염된 LBHEL 세포의 20 내지 60% 범위에서 혼합하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 8 항에 있어서, 상기 세포 파쇄후 바이러스 분리시, 수크로즈를 완충용액중 농도의 2배 이상이 되도록 첨가하여 원심분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 10 항에 있어서, 상기 수크로즈를 15 내지 45 % 농도로 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
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