TW577923B - Process for preparing a human embryonic lung fibroblast diploid cell strain and process for the production of varicella zoster virus using the cell line - Google Patents
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Description
B7 五、發明說明（i) 本發明係關於一種適供用於病毒之生成的新穎人類 胚胎肺纖維細胞二倍體細胞株，以及—種使用該細胞株作 為寄主細胞來生成水痘帶狀疱疹病毒的方法。 ϋ技術之斂诫 病毒可造成許多疾病，例如麻疹、風疹、腮腺炎、 水痘、流行性出血熱、日本Β型腦炎、小兒麻痺症、八型 肝炎、Β型肝炎、C型肝炎及天花。此等病毒疾病可藉由 接種由非活化或減毒病原病毒所製備的疫苗來避免。 一般而言，胚胎化之雞卵、幼鼠腦細胞及哺乳動物 之二倍體細胞已被用作為生產此等病毒疫苗的寄主細胞。 雖然可使用胚胎化之雞卵或幼鼠腦細胞作為寄主細胞，以 降低生產成本，但其等因為對病毒之低感病性、複雜之純 化方法以及由於外來蛋白質污染物之存在所帶來的副作用 而具有缺點。相反地，應用源自於人類的正常二倍體細胞， 可減低由外來蛋白質所造成的副作用，因此，其等在製備 病毒疫苗上是更為所欲的。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 代表性的人類二倍體細胞包括MRC_5細胞株（ATCC， CCL 171)、WI-38細胞株（ATCC，CCL 75)及 HEL 299細胞 株（ATCC，CCL 137):更明確地，MRC巧細胞株係源自於 一 14週雄性胚胎之肺組織[pr〇Ct Symp· Human Dipoid Cells,Yugoslavia. Acad. SCI. Arts. Zagreb., pp43-45(1970) ; A Nature (London)，227, pp 168-170( 1970)]； WI-38係衍生自一 3個月雌性胚胎之肺組織[Exp, Cell Res,, -4- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公髮） 五、發明說明（2 )
p585(1961);及 21，p240(1962)];以及HEL 299細胞株係得自於一雄性胚胎之肺組織[w. D. Peterson， Jr· et al·，Proc. Soc. Exp.Biol. 128, p772(1968)] ° 水痘是一種高傳染性疾病，其藉由水痘帶狀疱疹病 毒（VZV)之感染，而困擾著幼童、老年人及具有降低之免 疫力的病人。已報導VZV可被培養在諸如一人類羊膜細 胞、人類甲狀腺細胞、人類肺細胞、人類子宮頸Hela細胞 及猴子腎細胞的許多細胞中〔參見Ε· V. Meurisse et al.，L Microbiol.又，317(1969)〕。再者，美國專利第 3 985 615 號揭示了藉由在一天竺鼠胚胎組織細胞（GPEC)中，◦匕病 毒之多重減毒來生成VZV疫苗；美國專利第4,000,256號 揭示了藉由將含有VZV病毒的人類胚胎纖維細胞wi-38細 胞株次培養10至80次來生成VZV疫苗；美國專利第 4,000,3 1 7號報導了在WI-38細胞株中，變異株VZV之生 成；美國專利第5,360,736號揭示了用以在MRC-5細胞株 中生成VZV疫苗的改良方法。 然而，在GPEC細胞中，VZV之產率非常低。再者， WI-38及MRC-5細胞株具有高繼代數，因而降低了其等生 成VZV的能力。因此，前述方法無法被應用於vzv疫苗的 大量產製上。再者，VZV因為其細胞-依賴性質，vzv在 一不含細胞環境中傾向變得不活化。 發明之簡要說明 因此，本發明之一目的係提供一種對各種病毒具有 一咼感病性的新穎人類二倍體細胞株，特別是對vzv具有 _ 5 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規;^ (210 X 297公复) ----- (請先閱讀臂面之注意事Ί 『本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 577923 經濟部智慧財產局員工消費合作杜印製 A7 _B7_五、發明說明（3 ) 高感病性，並提供一 VZV之高產率者。 本發明之另一目的係提供一種用以生成VZV的改良 方法。 依據本發明之一層面，其係提供一種源自於一人類 胚胎肺細胞之纖維細胞二倍體細胞株LBHEL (KCTC 0127BP)。 依據本發明之另一層面，其係提供一種用以生成不 含細胞之水痘帶狀疱疹病毒（VZV)的方法，其包含下列步 驟： (a) 將人類胚胎肺纖維細胞二倍體細胞株LBHEL (KCTC 0127BP)培養在培養容器内，以獲得經培養之 L Β Η E L細月包； (b) 以VZV感染該經培養之LBHEL細胞，以獲得受 VZV-感染之細胞； (c) 培養並收集該受VZV-感染之細胞； (d) 破壞該經收集之細胞，以獲得一細胞均質液；及 (e) 將該細胞均質液予以離心，以獲得一含有細胞-游 離之VZV的上澄液。 圖式之簡要說明 當將下列敘述與所附圖式共同參照時，本發明之前 述及其他之目的與特徵將變得清楚： 第1-1及1-2圖顯示本發明之LBHEL細胞株的核型； 第2圖係表示下列生長曲線：本發明之LBHEL細胞株 (♦)、MRC-5細胞株（)及HEL細胞株（△); -6- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) (請先閱讀臂面之注意事Ί 『本頁) 裝 ;錦- 577923 A7 B7 五、發明說明（4) 第3圖敘述在將本發明之LBHEL細胞株、MRC-5細胞 株及HEL299細胞株培養於含有5%或10% FBS之DME培養 基後，所計算出的細胞數目； 第4圖表示在經感染的本發明之LBHEL細胞株中，不 含細胞VZV的溶菌斑形成單位（PFU)的變化； 第5圖顯示在本發明之LBHEL細胞株中，不含細胞 VZV的PFU對細胞病理效應的依賴性； 第6圖顯示作為未感染之LBHEL細胞株含量之一函數 的不含細胞VZV的PFU的變化；以及 第7圖係描述不含細胞VZV之PFU與細胞培養容器表 面之細胞覆蓋度間的變化。 發明之詳述 如使用於此者，名詞“不含細胞”係意指不與其寄 主細胞相結合的病毒。 源自於人類胚胎肺纖維細胞二倍體細胞的本發明之 新穎LBHEL細胞株可如下被生成： 首先，由具有第1-1及1-2圖之核型的一20-週雌性胚 胎中，取出一小部分人類胚胎肺組織。將該組織切成小塊， 並以一磷酸緩衝液（pH 7.1至7.3)洗滌之。接著在一 36至37 C之溫度範圍内’及一 5% C02之大氣壓下，將該組織培 養在一含有膠原蛋白酶及dispase的構酸緩衝液中（‘‘酵 素溶液”），歷時5至1〇分鐘。將所得之培養在30至5〇xg 下予以離心，且在一36至37°C之溫度範圍内，將經沈澱之 肺組織培養在前述酵素溶液中，歷時20至40分鐘。隨後將 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公髮） (請先閱讀臂面之注意事 I --- π本頁) l·-鳍- 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 作 社 印 製 577923 A7 B7 五、發明說明（5 ) 所得培養液之上澄液以5%(v/v)小牛血清（FBS)加以中和。 將此酵素處理重覆3至4次，直到僅存有結締組織。 接著，在一4至之溫度範圍内，令該綜合組織萃 取液靜置1小時，以沈澱出細胞聚集物，且將含有單一細 月已之所传上^豆液予以分離，並在800至1 〇〇〇 rpm下離心1至 2分鐘。收集該經沈澱之細胞，並散佈在含有5至1〇% (v/v)FBS之Dulbecco修飾的Eagle氏培養基（DME培養基） 中，至一為5·1〇χ1〇6個細胞/毫升的範圍内，並隨後在％ 至37°C下，將其培養在一Τ80錐形瓶，直到該培養容器之 表面佈滿細胞為止。在一胰蛋白酶處理後，令該經培養之 細胞接受系列次培養。 依據用於專利程序之微生物寄存的國際認可上的布 達佩斯條約，如前述所生成的本發明之LBHEL細胞株係 以寄存編號KCTC 0127ΒΡ，而在1994年9月9曰寄存於韓 國菌種收集中心（KCTC)(住址：GERI，KIST，P.〇. Box 115, Yusong，Taejon，305-600,大韓民國）。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -裝 (請先閱讀嘴面之注意事項頁) 線· 本發明之LBHEL細胞株係藉由染色體異常性測試 (chromosome abnormality test)而證明為一正常之二倍體細 胞株，且其在動物實驗中不會造成腫癌。再者，其較諸如 MRC-5及HEL299的習知細胞株生長得快，並對許多病毒 具有增進之感病性。尤甚者，其維持了相同之生長速率， 甚至在30次培養繼代之後。 本發明之新穎LBHEL細胞株具有下列特徵： (1)細胞生長速率 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 577923 A7 B7 五、發明說明（6) 較之於MRC-5標準細胞株，LBHEL細胞株可約2倍快 速生長，且在一固定表面積内產生之細胞數目係1.7或更 多倍於MRC-5所產生者。 (2) 溶菌班測定 當使用本發明之LBHEL細胞株作為一測量病毒之效 價的寄主細胞時，可輕易地測定其所形成之溶菌班，且該 細胞株之感病性較MRC-5者為佳。 (3) FBS含量 包括MRC-5、WI-3 8及HEL299之習知人類二倍體正 常細胞株通常被培養在一含有10% (v/v) FBS的培養基 内’而本發明之LBHEL細胞株可良好地生長在一具有一 僅5%之FBS含量的培養基内。因為FBS頗為昂貴，該LBHEL 細胞株在降低生產成本上提供了一顯著的優點。 (4) 對VZV之感病性 如表1所示，本發明之LBHEL細胞株係遠較包括 MRC-5、HEL299及Lul8之習知人類二倍體正常細胞株， 對VZV具有更高之感病性。此明示了 VZV在本發明之 LBHEL·細胞株中，較前述習知人類二倍體正常細胞株中 更易生長。
表I 細胞株（繼代數） 感病性（PFU/離心管） LBHEL(+16) 3625 MRC-5(十 8) 325 HEL299(+10) 300 Lul8(+8) 375 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）
(請先閱讀-t面之注音？事S Γ本頁) 言 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 3 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（7 ) 本發明之LBHEL細胞株可被用作為一種生成諸如麻 療、風疹、A型肝炎及水痘疫苗之許多病毒的寄主細胞。 不含細胞VZV可藉由使用本發明之LBHEL細胞株來 生成如下： (1) 細胞培養： 在一 36至37°C之溫度範圍内，並在一 5% C02之大氣 下’可將本發明之LBHEL細胞株培養於一含有5至10% (v/v)FBS的DME培養基内，以形成單一胞層。 在該單一胞層培養中，細胞之分裂比可在1:5至1:1〇 之範圍内。該細胞培養最好被進行到70至80%之培養容器 表面被細胞所覆蓋為止，並隨後令該經培養之細胞接受系 列次培養。 (2) VZV之增殖 可將VZV以在1:15至1:20之範圍内的多次感染 (MOI)，而接種至前述所製備的經培養之LBHEL細胞株 中。在接種後1至1.5小時，可在一 36至37°C之溫度範圍内 及在一含5% CO〗之大氣下，將受感染之細胞培養在一含 有2至5% FBS的DME培養基内，歷時40至48小時。當在顯 微鏡下（100X)所觀察之細胞病理效應達到50%或更少且較 佳為30至45%時，可將該經感染之細胞加以收集。特定地， 以一磷酸緩衝液（pH 7.2)來洗滌該細胞培養物，並以〇.〇1 至0.03% EDTA來處理。將所得產物培養5分鐘，並接著予 以離心，以收集該受VZV感染的細胞。 -10 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀臂面之注意事項聲 --裝 訂·· 卜線_ 577923 A7 — B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（8 ) (3)細胞之破壞以及不含細胞VZV之分離 可藉由超音波及玻璃珠之^知方法，來破壞如前述 所收集之受VZV感染的細胞。隨後，可藉由諸如離心及過 濾之任何習知方法，而將細胞破片移除，以提供一含有不 含細胞VZV的上澄液。 基於其細胞-依賴性質’當VZV在其寄主細胞外時， 其存活性係幾近於零。因此，當經該病毒感染之寄主細胞 被破壞時，可輕易地將該病毒不活化。前述之美國專利第 4,000,256號描述一個在細胞破壞步驟期間，藉由將約7.5 wt%之蔗糖加入該磷酸緩衝液内，以保護VZV的嘗試。當 藉由超音波來破壞受病毒感染之細胞時，病毒本身常常被 崩毀及不活化，因而降低不含細胞病毒的產率。然而，蔬 糖緩衝層的應用不能避免此一病毒之崩毁及不活化。 在超音波處理期間，在該不含細胞病毒之產率上降 低’可藉由在該超音波步驟之前，將未感染之LBHEL細 胞與經感染之細胞予以混合而有效地防止。在實施本發明 上’未感染之LBHEL細胞係以1:4至3:2之比例與經感染之 細胞相混合。 然而，前述方法常常產生大量之細胞破片，因而在 諸如過濾及離心之純化步驟中，造成不含細胞病毒的些許 損失。為了解決此問題，本發明在諸如離心之純化步驟中 使用一蔗糖溶液。該蔗糖溶液可為丨5 wt%或更高，且較 佳為1 5至45 wt%。 如前述所得之VZV可藉由諸如病毒之減毒或病毒抗 —_________~11 - 本紙張尺度過用中國國家標準（CNS)A4規格⑵Q χ挪公爱了 (請先閱讀-f面之注意事項Μ i裝 頁) ·' .-線· 577923 A7 B7 五、 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 發明說明（9) 原之添加的習知方法，而用以製備疫苗。 本發明被進一步地闡示及敘述於實例及測試例中， 然而，其等並非意欲限制本發明之範圍。 商業上可得之VZV，即水痘病毒（ATCC VR-795批號 6w)被使用在實例中。在此之前及之後，由ATCC所提供 之MRC-5、HEL299及Lul8次培養被編號為繼代數1。 除非另外標明，在此所使用之名詞及縮寫具有其等 的正常意義，例如：“。C”表示攝氏溫度；“M”表示莫 耳體積濃度；“v/v”意指體積/體積；以及“w/v”表示 重量/體積。 實例1 : LBHEL細胞株之製備 由一具有第1圖之核型的20-週齡雌性胚胎中，取出一 小部分之人類胚胎肺組織。將該組織切成小塊（2毫米X2 毫米），並以一磷酸緩衝液（pH 7.2)洗滌3次。在36T：下， 將所得之組織塊培養在一含有130單位/毫升之膠原蛋白 酶及1毫克/毫升之dispase的磷酸緩衝液中（pH 7.2)( ‘‘酵 素溶液）’歷時5分鐘。將該培養液在200 xg下離心2分 鐘，以沈澱該肺組織。在37°C下，收集該組織並將其培養 在前述酵素溶液内，歷時30分鐘。將該培養在5〇 xg下離 心2分鐘，並藉由添加5%之小牛血清（FBS)來中和上澄液。 將該酵素處理重覆4次，直到僅存結締組織為止。 以5% FBS來中和該綜合組織萃取液，令其在4〇c下靜 置1小時，以沈澱出細胞聚集物，且將含有單一細胞之上 澄液在1000 rpm下離心2分鐘。收集該經沈澱之細胞，並 (請先閱讀嘴面之注意事項 ----- 頁： · -12- 577923 A7 _B7_ 五、發明說明（10) 散佈在一含有10% (v/v)FBS之DME培養基中（Gibco BRL，U.S.A·，目錄編號12800-082)，至一3 X 105個細胞 / 毫 升的濃度，並隨後在37°C下，將其培養在一T-錐形瓶内， 直到該錐形瓶之表面細胞所覆蓋為止。在以一 0.25%之胰 蛋白酶溶液處理後，令該經培養之細胞接受系列次培養。 實例2 ： VZV病毒在LBHEL細胞株中的生成 (步驟1 )細胞株 在37°C下以及在一 5% C02之大氣下，將在實例中所 製備之LBHEL細胞株培養在一含有5% FBS的DME培養基 中（Gibco BRL，U.S.A.，目錄編號 12800-082)，以形成一單 一胞層。在該單一胞層培養液中，細胞之分裂比被調整為 1:4。進行該培養，直到85-95%之培養容器表面被覆蓋為 止，並令經培養之細胞接受系列次培養。 (步驟2) VZV之增殖 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將水痘病毒（ATCCVR-795批號6w)以一 1:20之M0I 接種至經培養之LBHEL細胞株。該病毒之活性為100,000 至200,000個溶菌班形成細胞（PFC)/T80錐形瓶（2ml)。在 37°C下以及在5% C02之大氣下，將受VZV感染之細胞加 以培養。當在一顯微鏡下所觀察到之細胞病理效應達到25 至45%時，以一磷酸緩衝液（pH 7.2)洗滌該培養物三次， 並隨後以0.02% EDTA處理之。將所得物培養5分鐘，並收 集受感染之細胞，且在1〇〇〇 rpm下離心約3分鐘，以獲取 該受感染之細胞。 (步鄉3 )細胞之破壞 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 577923 A7 ----B7 ^_ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 發明說明（11) 將受感染之細胞懸浮在一SPGE破壞溶液中〔pH 7.2, 7.5%(w/v)蔗糖、0.0038 Μ之磷酸鉀（單鹽基）、〇·〇〇72Μ 之構酸鉀（雙鹽基）、0.0049 Μ之麩胺酸鈉、0.2% EDTA〕， 至一5-10 X 1〇6個細胞/1亳升的濃度。藉由在一冰浴内使 用一超音波機（Sonifier，Branson 450)，而以一微探針（Τ80 錐形瓶）或U型叉（多盤單元，CF-10)來破壞該等細胞， 直到無原生質存在。 (步驟4)不含細胞VZV之分離 將所得物在100 rpm下離心10分鐘，以獲得一含有VZV 的上澄液。 ^ 測試例1 : LBHEL細胞株之正常性 1) 染色體異常性測試 令在實例1中所製備之LBHEL細胞株接受染色體異常 性測試’其包括染色體多倍體測試、二倍體測試、形態異 常性測試、染色體切割測試及核型分析測試。依據由韓國 公共衛生部所出版的“生物配方標準及其測試方法 (1992)” ，所有的測試係藉由利用MRC-5細胞株作為一負 對照組來進行。第1-1及1-2圖顯示本發明之LBHEL細胞株 的核型。 2) 致癌測試 各將2 X 1〇6個由實例1中所製備之LBHEL細胞株，以 及由ATCC所提供之Hela細胞株經皮下注射入5隻或更多隻 缺乏細胞免疫性的裸鼠内。在注射28天後，在注射LBHEL 之鼠體中未發現腫瘤，而腫瘤已在所有接受Hela細胞株注 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) 577923 A7 B7 五、發明說明（12) 射的鼠體内發展。 此等實驗結果確認了本發明之人類胚胎肺纖維細胞 LBHEL細胞株為一正常之二倍體細胞。 1試實例2 :細胞株之生長曲線的比較 本發明之LBHEL細胞株（KCTC 0127BP)的生長曲線係 藉由如下述般測量相對於生長時間之細胞數目來製備，隨 後與 MRC-5 (ATCC CCL 171)及 HEL299 (ATCC CCL 137) 細胞株所得者相比較。 依據實例2之步驟（步驟1 )，而將各測試細胞株培 養在一 T 8 0錐形瓶中，以形成一單一胞層。以一填酸緩衝 液（pH 7.2)洗滌該等細胞三次，並以0.25%之胰蛋白酶處 理之。約2分鐘後，收集該等細胞，並在1000 rpm下離心 約3分鐘。 將經沈澱之細胞懸浮在一含有5% FBS ( LBHEL )及 10% FBS (MRC-5及HEL299 )的DME培養基内，並隨後 以一 2 X 106個細胞/錐形瓶的量加以T80錐形瓶中。將該 等細胞培養在37°C及5% C02之大氣下。 在24小時之區間内，細胞數目被測量如下：首先， 以一磷酸緩衝溶液（pH 7.2)洗滌該細胞三次，並以0.25% 之胰蛋白酶處理之。約2分鐘後，收集該等細胞，並在1000 rpm下離心約3分鐘。令經沈殿之細胞懸浮在一 DME培養 基内，並滴加在一血球計數器上（Hausser Scientific)。以 一顯微鏡（100X)計算細胞數目。 第2圖顯示相對於培養時間所計算出之本發明之 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ---------—Μ (請先閱讀臂面之注意事項再填寫本頁) 訂---------Mm 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 577923 A7 B7 五、發明說明（π) LBHEL細胞株（♦)、MRC-5細胞株（)及HEL細胞株（△) 的細胞數目。如第2圖所示，LBHEL細胞株展示一較MRC-5 及HEL299細胞株早一天的對數，且LBHEL細胞株之數目 係約1.5倍高於MRC-5及HEL299之數目。 第3圖敘述在含有5%或10% FBS之DME培養基中培養 4天後，本發明之LBHEL細胞株、MRC-5細胞株及HEL299 細胞株的細胞數目。如第3圖所示，培養在一含有5% FBS 之培養基中的LBHEL細胞之數目與在10% FBS下所得者幾 乎相同。相反地，MRC-5或HEL299細胞株在一含有5% FBS 之培養基内並不能良好地生長。此明示了本發明之LBHEL 較其他習知細胞株在經濟上更有利。 再者，本發明之LBHEL細胞株在第20次次培養後生 長良好。其在一多盤單元（Nunc 164327，6000cm2)中亦生 長良好，此明示了 LBHEL細胞株可被用於病毒的大量生 產上。 測試實例3 > VZV之感病性 依據實例2之步驟（步驟1 )將顯示在表Π中之各細 胞株培養在一具有60 mm之直徑的培養皿上，以形成單一 胞層，並以一填酸緩衝液（pH 7 ·2)洗條該經培養之細胞三 次。 以一含有3% FBS之DME培養基來系列地稀釋水痘病 毒。將經稀釋之疫苗以一 〇·1毫升/皿的量接種至細胞。 加入含有3% FBS的DME培養基，並在37°C下及5% C02之 大氣下，將所得物培養7天。 -16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------------獻丨丨 (請先閱讀臂面之注意事項再填寫本頁) 訂--------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 577923 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（14) 利用一顯微鏡（40X)來計算依此所形成之溶菌班數 目，並計算出PFU來評估各細胞株對病毒的感病性。該等 結果係示於表Π。 表Π 細胞株（繼代數） PFU/離心管 LBHEL(+16) 3625 LBHEL(+20) 3000 LBHEL(+24) 2625 MRC-5(+8) 325 MRC-5(+10) 350 MRC-5(+12) 125 HEL299( + 8) 325 HEL299(+10) 300 HEL299(+12) 125 Lul8(+8) 375 Lul8(+10) 325 Lul8(+12) 350 如表Π所示，LBHEL細胞株具有10倍高於MRC-5、 HEL299及Lul8細胞株的感病性。因此，本發明之LBHEL 細胞株可供用於VZV疫苗之生產上。 測試例4 : VZV在細胞株中的增殖 (步驟1 ) : VZV之分離及受感染之細胞的收集 依據實例2之步驟（步驟1 )，將表Π所示之各細胞 株培養在一 T80錐形瓶内，以形成一單一胞層，並以一磷 酸緩衝液（pH 7.2)洗滌經培養之細胞三次。 將受水痘病毒感染之MRC-5細胞以一 100,000至 200,000 pfc/錐形瓶（2毫升）之病毒活性接種至細胞上。 1小時後，加入一含有3% FBS之DME培養基，並在37 °C下及5% C02之大氣下，將所得物予以培養約48小時。 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------------教 (請先閱讀-f面之注意事項再填寫本頁) 訂-------------線- 577923 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（I5) 當細胞病理效應達到25至45%時，以一磷酸緩衝液（pH 7 2) 洗滌三次，並隨後以〇·〇2% EDTA處理之。將所得物培養5 分鐘，收集受感染之細胞，並在1000 rpm下離心約3分鐘， 以獲取受感染之細胞。 (步驟2 )病毒之分離 將受感染之細胞加入一 SPGE破壞溶液中〔pH 7 2 7·5% (w/v)蔗糖、0.0038 Μ之磷酸鉀（單鹽基）、〇·〇072Μ 之磷酸鉀（雙鹽基）、0.0049 Μ之麩胺酸鈉、0.2% EDTA〕， 至一 5-10 X 1〇6個細胞/丨毫升的濃度。藉由在一冰浴内使 用一超音波機（Sonifier，Branson 450)，而以一微探針（T8〇 錐形瓶）或U型叉（多盤單元）（CF-10)來破壞該等細胞， 直到無完整之細胞存在為止。在4°C下，將所得物在100 rpm 下離心10分鐘，以獲得一含有該病毒的上澄液。 (步驟3 )病毒之活性 依據實例2之步驟（步驟1)，將LBheL細胞株培養 在一具有60 mm之直徑的培養孤中，以形成單一胞層，並 以一磷酸緩衝液（pH 7.2)洗滌經培養之細胞三次。將（步 驟1)中所獲取之受感染細胞以一〇·3毫升/盤的量加入單 一胞層之培養細胞中，以決定受感染細胞之活性。進一步， 以4-倍體積之DME培養基來系列地稀釋含有得自於（步驟 2 )之病毒的上澄液，並將其以一 〇·丨亳升/盤的用量加入 該單一胞層之培養細胞中，以鑑定不含細胞病毒之活性。 藉由將該培養液維持在37它及5% c〇2之大氣下歷時60分 鐘’而使該病毒得以吸收進入細胞中。接著，加入一含有 -18- 本紙張尺度過用T國國豕ί示準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀-t面之注意事項再填寫本頁)
577923 A7 B7 五、發明說明（ι〇 3% FBS的DME培養基，並在與前述者相同的條件下繼續 培養。 (請先閱讀臂面之注意事項再填寫本頁) 6天後，利用一顯微鏡（40X)來計算出形成之溶菌斑 數目，並由其算出PFC及PFU，以分別測定受感染細胞及 不含細胞病毒的活性。該等結果係示於表m。 表瓜 細胞Μ株（繼代數） PFC/T80錐形瓶 PFU/T80錐形瓶 LBHEL(+16) 2,900,000 345,000 LBHEL(+22) 2,800,000 412,500 LBHEL(+26) 2,600,000 180,000 MRC-5(+8) 1,910,000 105,000 MRC-5(+ll) 250,000 60,000 MRC-5(+14) .1,300,000 7,500 HEL299( + 8) 1,960,000 122,500 HEL299(+1 1) 1,725,000 127,500 HEL299(+14) 1,375,000 120,000 Lul8(+8) 1,635,000 120,000 Lul8(+12) 1,265,000 62,500 如表Iff所示，在本發明之LBHEL中之VZ V的活性較 在其他習知細胞株中者為高。更明確地，其他習知細胞株 之PFC為LBHEL細胞之約50%，而其等之PFU最高達到 LBHEL細胞之30%。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 測試例5 ：複數感染（MOI)之效應 依據測試4之步驟（步驟1)，來製備LBHEL寄主細 胞之單一胞層培養，並分別以1:10、1:15、1:20、1:25及1:50 之MOI，將經水痘感染的MRC-5細胞接種至該寄主細胞。 依據測試例4之步驟（步驟2及3 )而測出PFU值。 第4圖表示在本發明之LBHEL細胞株中，不含細胞 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 577923 A7 B7 五、發明說明（17) VZV之活性（PFU)對MOI的變化。如第4圖所示，當MOI為 1:20時，不含細胞病毒之產率最高。 (請先閱讀嘴面之注意事項再填寫本頁) 測試例6 ：細胞病理效應對PFU之效應 依據測試例4之步驟（步驟1 )，來製備LBHEL細胞 之單一胞層培養基，並將受水痘感染之MRC-5細胞以一 1:20之MOI接種至該細胞。當細胞病理效應為12.5、25、 37.5、50、62.5、75及87.5%時，收集經感染之細胞。藉 由超音波破壞經收集之細胞，且依據測試例4之步驟（步 驟2及3 )，而測出PFU值。 第5圖顯示在各細胞病理效應下，於本發明之LBHEL 細胞株中，不含細胞VZV之活性（PFU)。當細胞病理效應 低於50%時，不含細胞病毒之產率是高的。 測試例7 :未經感染之細胞的安定效應 依據測試例4之步驟（步驟1 )來製備受VZV感染之 LBHEL細胞，並依LBHEL細胞之總數計，將未經感染之 LBHEL細胞以0%、20%、40%、60%、80%之用量添加至 經感染之LBHEL細胞中。令該混合物接受超音波，並依 據測試例4之步驟（步驟2及3 )測出PFU值。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 第6圖顯示作為未經感染之LBHEL細胞株含量之一函 數的不含細胞VZV之活性（PFU)的變化。如第6圖所示，當 未經感染之細胞存在時，不含細胞病毒之活性會增加，且 在未感染之細胞含量係依LBHEL細胞之總數計為20至60% 時，該活性會變得最高。 再者，混合未經感染之細胞的效應係利用多盤單元 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) ^7923
五 發明說明（18) (CF-10)來評估，且該結果係示於表！v。
表IV 經感染之細胞（％) 未經感染之細胞（％) PFU/CF10 100 0 36,270,000 80 20 45,330,000 60 40 49,130,000 40 60 21,500,000 20 80 8,310,000 如表IV所示，未經感染之細胞可在病毒之大量生產 上，被有效地用以安定不含細胞VZV。 互：蔗糖之效應 依據測試例4之步驟1及2，來製備受感染之LBHEL細 胞，並藉由超音波來破壞它。 如表V所示，在一蔗糖溶液〔pH 7.2，15-35.7%(w/v) 蔗糖、0.0038 Μ之磷酸鉀（單鹽基）、0.0072Μ之磷酸鉀 (雙鹽基）、0.0049 Μ之麩胺酸鈉、0.2% EDTA〕之不存 在或存在下，將所得物在1000 rpm下離心10分鐘，並收集 含有病毒之上澄液。接著，依據測試例4之步驟（步驟3 )來測出PFU值。結果係示於表V。 (請先閱讀嘴面之注意事項再填寫本頁)
Lt IT--------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 表V 樣品 蔗糖％(w/v) 蔗糖體積（ml) PFU 80錐形瓶 一 一 441,250 80錐形瓶 15 1 483,750 80錐形瓶 22.5 1 491,340 80錐形瓶 30 1 509,120 80錐形瓶 37.5 1 512,500 CF10 一 一 37,320,000 CF10 15 80 39,860,000 -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）
Claims (1)
- ^23 ^23/J g修正 補充 '請專利範圍 第086101483號專利再審查案申請專利範圍修正本 修正日期：91年11月 1 · 一種用以生成不含細胞之水痘帶狀疱疹病毒（Vzv)的方 法，其包含下列步驟： (a) 將人類胚胎肺纖維細胞二倍體細胞株lbhel (KCTC 0127BP; CCRC960051)培養在一使用含有 3 至10 /ί>(ν/ν)胎牛血清之杜貝可氏（Duibecco)修飾的 伊格氏（Eagle)培養基之培養容器内，以獲得單層經 培養之LBHEL細胞； (b) 以呈1:15至1:20感染倍數之VZV，感染該單層經培 養之LBHEL細胞，以獲得受vzv_感染之細胞； (c) 培養該受VZV-感染之細胞，且於當細胞病理效應為 50%或更低時，收集該受vzv-感染之細胞； (d) 破壞該收集之細胞，以獲得一細胞均質液；以及 (e) 將該細胞均質液予以離心，以獲得一包含有該不含 細胞之VZ V的上澄液。 2·如申請專利範圍第1項之方法，其中於步驟（a)中，該單 層經培養之LBHEL細胞，覆蓋了 70至80%之培養容器表 面。 3 ·如申租專利|巳圍第1項之方法，其更包含一個下列步 驟·當70至80%之培養容器表面被經培養之lBhel細胞 所覆蓋時’令得自於步驟之經培養的LBhel細胞以 一為1:5至1:1〇之分離比，接受一個次培養。 4·如申請專利範圍第丨項之方法，其中於該細胞病理效應 (請先Μ讀背面之注意事項再填寫本頁) v裝 ---訂---------逢 組濟部智慧財產局員工湞賢合作社卬 ^ Λ. ..¾ t a g I： 577923 A8 E8 C8 —_______D8 _ 六、申請專利範圍 在30至45%之範圍内時，收集該經培養之lbHEL細胞。 5·如申請專利範圍第1項之方法，其更包含一個下列步 ”驟·在步驟⑷前，將未經感染之LBHEL細胞添加至在 步驟（C)中所收集之受VZV.感染的LBHEL·細胞中。 6·如申凊專利範圍第5項之方法，其中該未經感染之 LBHEL細胞係以一依lbhrl細胞的總數計為2〇至 之範圍内的用量被加入。 士申π專利範圍第1項之方法，其更包含一個下列步 驟在步驟(e)刖，將一具有15%(w/v)或更高之濃度的 庶糖溶液加人至在步驟⑷巾所得之細胞均質液内。 8·如申請專利範圍第7項之方法，其中該薦糖溶液之濃度 係在15至45%(w/v)之範圍内。 (請先閒讀背面之;i意事項再填寫本頁) 經濟.部智慧財產局員工湞t合作社印裂
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