ES2427988T3 - Célula humana aislada, procedimiento para la obtención de la misma y su utilización - Google Patents

Abstract

Célula humana aislada, originada a partir de una línea celular humana de riñón transformada, depositada con elnúmero de acceso FERM BP-10399 en el International Patent Organism Depositary, National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology

Description

Célula humana aislada, procedimiento para la obtención de la misma y su utilización

Sector técnico

La presente invención se refiere a una célula humana aislada que es adecuada como célula huésped para producir un virus, tal como el Virus Hemaglutinante de Japón (en lo sucesivo referido como “HVJ”) o un producto génico exógeno, así como a un procedimiento para obtener la célula y la utilización de la célula.

Técnica anterior

El HVJ es un tipo de virus de la neumonía de ratón y no es infeccioso para el ser humano. Presenta dos tipos de glicoproteínas (F y HN) en su membrana externa viral que se fusiona a las células, y las proteínas presentan la capacidad de fusionarse a dos tipos de células (fusión celular). En los últimos años, se ha desarrollado y comercializado una técnica que utiliza la envoltura de HVJ como vector (vector de envoltura de HVJ) (documento de patente 1). La envoltura del HVJ se utiliza como el vector de envoltura de HVJ después de eliminar el ARN genómico de HVJ. Se encapsula un gen exógeno deseado en la envoltura y el virus se infecta en las células cultivadas o un órgano para transfectar el gen deseado en las células. Dado que se ha eliminado el ARN genómico del virus, la envoltura del HVJ es muy segura. Dado que la envoltura presenta la capacidad de fusionarse a células, la eficacia de la transfección a la célula es elevada. Se pueden encapsular una gran cantidad de genes exógenos y el espectro de huéspedes del virus es amplio. Por lo tanto, es esperable que el vector se utilice cada vez más como herramienta para analizar la función de los genes y como vector para terapia génica.

La producción en masa del HVJ se lleva a cabo de manera convencional mediante la inoculación del HVJ en huevos de pollo y haciendo crecer el virus (véase, Virus Experimental Protocols (“Protocolos experimentales para virus”), Medical View Co., Ltd., 1995, 68-78). Sin embargo, con este procedimiento, existe la posibilidad de que una proteína muy inmunogénica, tal como la albúmina de clara de huevo o similar u otras impurezas originarias del huevo del pollo, pueda estar contaminada en el HVJ recuperado. Por lo tanto, la OMS recomienda no utilizar los huevos de pollo, pero sí utilizar células cultivadas humanas. Cuando los huevos de pollo se utilizan como huésped, la operación de inoculación del virus y la operación de recuperación del virus después del crecimiento del mismo son complicadas, de manera que el rendimiento es limitado. Para resolver estos problemas, se ha pensado hacer crecer el HVJ utilizando células cultivadas de mamífero en lugar de huevos de pollo. Dado que los mamíferos son los huéspedes propios de HVJ, éste puede crecer en varias células de mamífero. Sin embargo, no se conocen células cultivadas de mamífero que sean adecuadas para la producción en masa del HVJ.

Documento de patente 1: JP 2001-286282 A Documento que no es de patente 1: Virus Experimental Protocols (“Protocolos experimentales para virus”), Medical View Co., Ltd., 1995, 68-78

Côté y otros (Biotechnology and Bioengeneering, Volumen 59, No. 5: 567-575) dan a conocer la producción sin suero de proteínas recombinantes y vectores adenovirales por células 293SF-3F6. Sin embargo, estas células necesitan cultivarse en medio sin suero complementado con BSA (albúmina de suero bovino) al 0,1% (p/v) y lípidos definidos químicamente al 1% (p/v) a efectos de inducir la viabilidad celular.

Descripción de la invención

Problemas que se propone resolver la presente invención

Un objetivo de la presente invención es dar a conocer una nueva célula humana aislada adecuada para la producción en masa del HVJ, así como un procedimiento para obtener la célula y la utilización de la célula.

Medios para resolver los problemas

Como condición para que la célula sea adecuada como célula huésped para la producción del HVJ, los presentes inventores establecieron la condición de que la célula pueda crecer en un medio sin suero. Si la célula puede crecer en una célula sin suero, se puede eliminar la posibilidad de que el HVJ recuperado se contamine con una sustancia originaria del suero, tal como albúmina de suero, lo cual es ventajoso. Los presentes inventores también pensaron que es ventajoso utilizar una célula que puede crecer en un biorreactor, que es ventajoso utilizar una célula que se puede cultivar en suspensión en un medio de cultivo líquido. Además, los presentes inventores pensaron que es ventajoso si se puede conseguir una densidad celular elevada en el medio líquido y que la célula presente una capacidad de crecimiento elevada. Los presentes inventores incluso pensaron adicionalmente que es ventajoso para la facilidad de manipulación, almacenamiento, transporte y similares, que la célula pueda crecer incluso una vez se ha congelado y, a continuación, descongelado. Los presentes inventores incluso pensaron adicionalmente que dado que la terapia génica y el análisis de la función de los genes se realizan principalmente en el ser humano, resulta ventajosa una célula humana. Los presentes inventores estudiaron de manera intensa para obtener una célula

humana que satisfaga estas diversas condiciones. Como resultado, los presentes inventores consiguieron de manera satisfactoria obtener una célula humana que satisface las diversas condiciones descritas anteriormente mediante la selección y clonación de una célula en diversas condiciones que utilizan una línea celular humana de riñón transformada como célula parental, conformando, de este modo, la presente invención.

Es decir, la presente invención da a conocer una célula humana aislada originada a partir de una línea celular humana de riñón transformada, tal como se define en las reivindicaciones. Se da a conocer un procedimiento para obtener una célula humana, comprendiendo el procedimiento las etapas de cultivar en suspensión una línea celular humana de riñón transformada en un medio sin suero y clonar las células desarrolladas; y seleccionar, entre las células clonadas, una célula cuyo tiempo de duplicación en la fase logarítmica de crecimiento en el cultivo en suspensión en un medio sin suero no es superior a 40 horas, que presenta la propiedad de recuperación en estado de congelación, cuya densidad máxima de células viables en el cultivo en suspensión no es inferior a 106 células/ml, en la que el HVJ puede crecer. La presente invención incluso da a conocer adicionalmente un procedimiento de producción de un virus, comprendiendo el procedimiento inocular un virus deseado en la célula humana aislada, según la presente invención; hacer crecer el virus en la célula; y recuperar el virus desarrollado.

Efectos de la invención

Mediante la presente invención, se dio a conocer por primera vez una célula humana aislada que es adecuada para la producción en masa del HVJ. Dado que la célula humana aislada, según la presente invención, puede crecer en un medio sin suero, no existe la posibilidad de que el virus recuperado esté contaminado con una sustancia originaria del suero, cuando un virus, tal como el HVJ, se hace crecer utilizando las células como huésped y se recupera el virus. Además, dado que la célula humana aislada, según la presente invención, puede crecer mediante el cultivo en suspensión en un medio líquido, dado que la velocidad de crecimiento es elevada y dado que la célula se puede cultivar a una densidad elevada, la célula es adecuada para la producción en masa de un virus utilizando un biorreactor. Adicionalmente, dado que la célula presenta la propiedad de recuperación en estado de congelación, es conveniente el almacenamiento y transporte de las células.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1 Aclimatación de las células en un medio sin suero: la figura 1 muestra los resultados cuando las células se cultivaron durante un periodo de tiempo largo utilizando T6 y HyQ que mostraron una capacidad de crecimiento elevada, procediendo, de este modo, a la aclimatación de las células en un medio sin suero. VC significa células viables, y el % significa la tasa de supervivencia.

Figura 2 Prueba de producción del HVJ de clones individuales durante la clonación: la figura 2 muestra los resultados de la medición de la producción de HVJ mediante la prueba de FFU llevada a cabo mediante el procedimiento en el que se tomó una alícuota de los clones individuales durante la clonación en una placa de 96 pocillos, se añadieron a la misma tripsina (concentración final: 2 μg/ml) y HVJ (multiplicidad de la infección; MOI = 23), se cultivaron las células a 34°C en una incuba dora de CO2 al 5% durante 3 días, y se recuperó el sobrenadante. Las cifras por debajo del eje de abscisas indican la cantidad de clones.

Figura 3 Producción de HVJ mediante biorreactor: la figura 3 muestra los resultados obtenidos utilizando los dos clones (clon A y clon B) que mostraron una capacidad de crecimiento y productividad elevadas. Se realizaron experimentos independientes tres veces y se muestran los resultados de los experimentos respectivos.

Figura 4 Actividad de la transfección de genes (TF): la figura 4 muestra la comparación entre la actividad de transfección de genes de los HVJ producidos por los dos clones (clon A y clon B) que mostraron una capacidad de crecimiento y productividad elevadas, después de eliminar las impurezas mediante purificación del material recogido. Como control para la comparación, también se analizó, de forma simultánea, el HVJ (huevo) desarrollado en un huevo y purificado de la misma manera. Se realizaron experimentos independientes 3 veces y se muestran los resultados de los experimentos respectivos.

La figura 5 muestra la capacidad de crecimiento de las células (cultivo discontinuo) del clon (GIC20) seleccionado en el ejemplo de la presente invención. VC significa células viables.

La figura 6 muestra los resultados de la prueba de la capacidad de crecimiento de las células del clon (GIC20) seleccionado en el ejemplo de la presente invención. VC significa células viables.

La figura 7 muestra los resultados de las mediciones del clon (GIC20) seleccionado en el ejemplo de la presente invención durante 6 meses por su capacidad de producir HVJ (título de FFU y actividad de NA), tiempo de duplicación de la célula y tiempo de duplicación de la población celular. “X” indica el tiempo de duplicación de la población, “.” indica el tiempo de duplicación, “♦” indica el título de FFU y “.” indica la actividad de NA.

Modo óptimo de llevar a cabo la invención

La célula humana aislada, según la presente invención, está originada a partir de una célula 293. La célula 293 (también denominada “célula 293 de HEK”, (HEK es la abreviatura de riñón embrionario humano)) se utiliza ampliamente como célula para la producción de vectores de adenovirus, vectores de AAV (vectores de virus adenoasociados), proteínas recombinantes y similares. La célula 293 está disponible en depósitos públicos, tal como el Health Science Research Resources Bank (“Banco de recursos para la investigación en ciencias de la salud”) y la ATCC, y también está disponible comercialmente, de manera que está fácilmente disponible.

La célula humana aislada, según la presente invención, puede ser cultivada mediante un cultivo en suspensión en un medio sin suero. Como medio sin suero, se pueden utilizar los disponibles comercialmente en varias compañías, tales como el medio T6 utilizado en el ejemplo siguiente, y medios sin suero conocidos para célula 293. El medio T6 está disponible comercialmente en JRH Biosciences, Lenexa, Kansas, Estados Unidos, y contiene 1,1 mg/l de una proteína recombinante, hidrolizados de plantas, 0,1 % de Pluronic F-68 (nombre comercial, surfactante producido por BASF), 6,0 g/l de glucosa, 1,8 g/l de bicarbonato sódico, hipoxantina y timidina.

La célula humana aislada, según la presente invención, presenta un tiempo de duplicación en la fase logarítmica de crecimiento en un cultivo en suspensión en un medio sin suero no superior a 40 horas. El tiempo de duplicación en la fase logarítmica de crecimiento se puede medir midiendo, con el tiempo, el número de células en una unidad de volumen del medio, y calculando el tiempo necesario para que se doble el número de células en la fase logarítmica de crecimiento (la fase en la que se incrementa de manera logarítmica el número de células, es decir, la fase en la que la relación entre el logaritmo común del número de células a lo largo del eje de ordenadas y el tiempo a lo largo del eje de abscisas es lineal). El tiempo de duplicación es el tiempo de duplicación en condiciones en las que las células crecen bien, tales como, por ejemplo, en un cultivo en suspensión en un medio de cultivo adecuado para el crecimiento de células 293, tal como el medio T6 descrito anteriormente, a 36,5ºC, en CO2 al 5-10% y, de manera preferente, el tiempo de duplicación en un cultivo rotativo a 100-120 rpm. El tiempo de duplicación en la fase logarítmica de crecimiento es, de manera preferente, de 25 horas a 30 horas en un cultivo en suspensión a 36,5ºC en CO2 al 5-10%

La célula humana aislada, según la presente invención, presenta la propiedad de recuperación en estado de congelación. La “propiedad de recuperación en estado de congelación” significa, en el presente documento, que la célula puede crecer incluso después de haberse congelado y, a continuación, descongelado. Las células desarrolladas después de la congelación presentan la capacidad de crecimiento y diversas características, tales como la productividad de HVJ, tal como se ha descrito anteriormente.

La célula humana aislada, según la presente invención, consigue una densidad máxima de células viables en el cultivo en suspensión no inferior a 106 células/ml. La “densidad máxima de células viables” significa en el presente documento que cuando las células se cultivan en condiciones apropiadas, la densidad de células viables llega a ser de 106 células/ml o más, como mínimo, en un punto de tiempo posterior al inicio del cultivo. Las “condiciones apropiadas” pueden ser, por ejemplo, en un cultivo en suspensión en un medio de cultivo adecuado para el crecimiento de células 293, tal como el medio T6 descrito anteriormente, a 36,5°C en CO 2 al 5-10% y, de manera preferente, en un cultivo rotativo a 100-120 rpm. De manera preferente, la densidad máxima de células viables en un cultivo en suspensión a 36,5°C, en CO 2 al 5-10% es de 2 x 106 células/ml a 107 células/ml. La densidad de células viables en el medio de cultivo se puede medir fácilmente mediante el recuento manual del número de células bajo un microscopio utilizando un hemocitómetro, o mediante la utilización de un analizador de viabilidad celular automatizado utilizado habitualmente disponible comercialmente.

La célula humana aislada, según la presente invención, es aquélla en la que pude crecer el HVJ. De manera preferente, el crecimiento del HVJ puede conseguir una unidad formadora de focos (FFU) no inferior a 108 FFU/ml, de manera más preferente, una unidad formadora de focos (FFU) no inferior a 6x108 FFU/ml hasta 5x109 FFU/ml. La “unidad formadora de focos” se puede medir mediante una prueba de FFU conocida (procedimiento de anticuerpos fluorescentes: la cuantificación de HVJ infecciosos se lleva a cabo mediante el recuento del número de células infectadas) (referencia: Virus Experimental Protocols (“Protocolos experimentales para virus”), Medical View Co., Ltd., 1995, 68-78; The sialic acids (“Los ácidos siálicos”), J. Biol. Chem., 240, 3501 (1965)), y en el ejemplo siguiente se da a conocer un procedimiento particular. Aunque las condiciones en las que crece el HVJ no están limitadas, las condiciones preferentes son aquellas en las que la densidad celular es de 106 células/ml a 4x106 células/ml; se añade un medio para la infección complementado con butirato de sodio (concentración final de 1-4 mM), y factor Xa (concentración final de 0,05-2 U/mL) o tripsina (concentración final de 2-8 μg/mL) hasta una concentración del 30 al 50%; se añade una solución del virus HVJ a una MOI = 1-10; y el cultivo se lleva a cabo a una temperatura de 30 a 34°C durante 40 a 72 horas. Las condiciones más pre ferentes son aquellas, por ejemplo, en las que la concentración de butirato de sodio es 2 mM y el cultivo se lleva a cabo a 32ºC durante 42 horas; o en las que la concentración de butirato de sodio es 0 mM y el cultivo se lleva a cabo a 34°C durante 72 horas. Tal como se describe e n particular en el ejemplo siguiente, para seleccionar las células que presentan una capacidad elevada de desarrollar HVJ, se pueden seleccionar principalmente las células que muestran una capacidad de crecimiento elevada en el cultivo en un pocillo de microplaca y, a continuación, se pueden seleccionar posteriormente las células que muestran una capacidad de crecimiento elevada en un cultivo en suspensión.

La célula humana aislada, según la presente invención, es aquélla que se puede subcultivar manteniendo las características descritas anteriormente, aquella que se puede subcultivar durante un periodo largo de tiempo no inferior a 1 año. Dado que la célula humana aislada, según la presente invención, está originada a partir de una línea celular humana de riñón transformada, la célula humana aislada, según la presente invención, obtenida mediante el procedimiento descrito a continuación es una célula de una línea celular que se puede subcultivar durante un periodo largo de tiempo no inferior a 1 año.

Como célula humana aislada, según la presente invención, obtenida en el ejemplo descrito a continuación, y como célula que es especialmente excelente en la capacidad de crecimiento y la capacidad de desarrollar HVJ, se obtuvo la célula GIC20. La célula GIC20 se ha depositado en el International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (“Depositario internacional de organismos para patentes, Instituto nacional de ciencia y tecnología industrial avanzada”) (Dirección: AIST Tsukuba Central 6,1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japón), con el número de acceso FERM BP-10399 del 11 de agosto de 2005, bajo el tratado de Budapest.

La célula humana aislada, según la presente invención, se puede obtener mediante un procedimiento para obtener una célula humana, comprendiendo el procedimiento las etapas de cultivar en suspensión una línea celular humana de riñón transformada en un medio sin suero, y clonar las células desarrolladas; y seleccionar, entre las células clonadas, una célula cuyo tiempo de duplicación en la fase logarítmica de crecimiento en el cultivo en suspensión en un medio sin suero no es superior a 40 horas, que presenta la propiedad de recuperación en estado de congelación, cuya densidad máxima de células viables en el cultivo en suspensión no es inferior a 106 células/ml, en la que el HVJ puede crecer.

El cultivo en suspensión en el medio sin suero se puede llevar a cabo tal como se ha descrito anteriormente y, de manera preferente, una cultivo en suspensión en un medio de cultivo adecuado para el crecimiento de células 293, tal como el medio T6 descrito anteriormente, a 36,5°C, en CO 2 al 5-10% y, de manera más preferente, en un cultivo rotativo a 100-120 rpm. La línea celular parental se cultiva habitualmente en placas en un medio que contiene suero. Como procedimiento para cambiar el cultivo a un cultivo en suspensión en un medio sin suero, se utiliza, de manera preferente, el procedimiento de adaptación directa. El procedimiento de adaptación directa es uno de los procedimientos de aclimatación por el que las células cultivadas en presencia de suero se cambian por las que se pueden cultivar en un medio sin suero. El procedimiento de adaptación directa no es un procedimiento en el que la concentración de suero disminuya de forma gradual para aclimatar las células, sino que es un procedimiento en el que el medio que contiene suero se elimina completamente mediante centrifugación o similar, y las células se suspenden directamente en un medio sin suero para iniciar el cultivo, aclimatando, de este modo, las células. Mediante este procedimiento, dado que sólo sobreviven las células que se pueden adaptar a un cambio brusco en el medio de cultivo, se espera que se pueda obtener una línea celular fuerte. Sin embargo, debe indicarse que siempre que se pueda obtener una célula humana aislada que satisfaga los requisitos, también se pueden utilizar otras condiciones de cultivo. Por ejemplo, se pueden utilizar otros medios sin suero utilizados en el cultivo de células 293, se puede cambiar la temperatura del cultivo en el intervalo, por ejemplo, de 32°C a 38°C, o el cultivo se puede llevar a cabo en una atmósfera de CO2 apropiada.

Se recogen y se clonan las células desarrolladas por el cultivo en suspensión en el medio sin suero. La clonación se puede conseguir mediante la separación de las células en células individuales bajo el microscopio, y el crecimiento de cada una de las células individuales separadas a partir de una célula mediante división celular. En la etapa de crecimiento de las células a partir de una célula, el suero se puede añadir al medio a efectos de ayudar en el crecimiento y, de manera preferente, se añade el suero en una cantidad del 20 al 30% en peso. Además, para ayudar en el crecimiento, en esta etapa se utiliza, de manera preferente, un cultivo estático en una placa. Después del crecimiento de las células, el medio se devuelve lentamente al medio sin suero y se suspenden las células. Dado que cada una de las células individuales separadas es aquélla que se puede cultivar en suspensión en el medio sin suero, las células después del crecimiento también pueden cultivarse en suspensión en el medio sin suero. Dado que la población celular después del crecimiento es un clon originado a partir de una célula individual, es una población de células aisladas que no contiene células provenientes de otras células.

A continuación, a partir de los clones obtenidos, se seleccionan el clon o clones que satisfacen las diversas características descritas anteriormente. El procedimiento para medir cada una de las características es tal como se ha descrito anteriormente y también se describe en detalle en el ejemplo siguiente. En cuanto a la capacidad de crecimiento de HVJ, es preferente seleccionar un clon que muestre una capacidad tan elevada como sea posible. En los casos en que se obtiene un conjunto de clones que satisfacen los requisitos de la presente invención, no es necesario decir que es preferente seleccionar un clon que muestre el mejor valor para cada una de las características. Es decir, es preferente seleccionar un clon cuyo tiempo de duplicación en la fase logarítmica de crecimiento es más corto, la densidad de células viables en el cultivo en suspensión es más elevada, y la FFU de HVJ es más elevada. Mediante el procedimiento descrito anteriormente, se puede obtener la célula humana, según la presente invención, que satisface las características definidas en la presente invención. Cada selección se puede llevar a cabo dividiéndose en dos o más etapas. De manera particular, por ejemplo, es posible seleccionar principalmente los clones que satisfacen los requisitos y a continuación, seleccionar posteriormente un clon o clones que muestran las mejoras características en las mismas condiciones o en condiciones más optimizadas. De manera

alternativa, en la selección principal, en las condiciones que se pueden conseguir mediante operaciones simples, se seleccionan los clones que mostraron propiedades excelentes, por ejemplo, los clones que consiguieron resultados de un máximo del 10% o inferior, y posteriormente se seleccionan el clon o clones que satisfacen los requisitos en condiciones más optimizadas. Por ejemplo, en el ejemplo siguiente, en cuanto a la capacidad de crecimiento de HVJ, se seleccionan principalmente los clones que muestran una capacidad elevada en el cultivo estático en una microplaca de 96 pocillos y, a continuación, se realiza la selección posterior utilizando la capacidad de crecimiento de HVJ en el cultivo en suspensión como índice. La selección de los clones que satisfacen cada una de las características se puede llevar a cabo de manera secuencial para las respectivas características. Dado que la capacidad de crecimiento y la densidad máxima de células viables se miden midiendo, con el tiempo, la densidad de células viables en el cultivo en suspensión, las selecciones se pueden conseguir en una sola etapa.

Dado que la célula humana aislada, según la presente invención, se obtuvo utilizando la capacidad de crecimiento del HVJ como uno de los índices, se puede utilizar para la producción de HVJ. De manera especial, dado que la célula de la presente invención se puede cultivar en suspensión en un medio sin suero, presenta una capacidad de crecimiento elevada, y se puede cultivar a una densidad elevada, se puede utilizar de manera adecuada para la producción en masa de HVJ. Como condiciones de producción de HVJ, son preferentes las condiciones descritas anteriormente para la medición de la FFU. El HVJ desarrollado se puede purificar, por ejemplo, mediante la recuperación del sobrenadante de cultivo después de la extracción de las células por filtración o centrifugación, y la purificación del sobrenadante de cultivo mediante cromatografía en columna.

Además, dado que la célula de la presente invención se puede cultivar en suspensión en un medio sin suero, presenta una capacidad de crecimiento elevada y se puede cultivar a una densidad elevada, y se puede utilizar de manera adecuada para la producción de otros virus que pueden crecer en la célula de la presente invención, y para la producción de proteínas recombinantes producidas mediante una técnica de ingeniería genética. Aunque un ejemplo de los otros virus que pueden crecer en la célula de la presente invención es un adenovirus que se describirá en particular en el ejemplo siguiente, los virus no se limitan al mismo.

Dado que la célula presenta una capacidad de crecimiento elevada mediante cultivo en suspensión, se puede preparar fácilmente un banco primario de células que comprende un conjunto de recipientes, comprendiendo cada uno la célula. Como recipiente, se puede utilizar, por ejemplo, un vial de vidrio o similar, aunque el recipiente no se limita al mismo. El número de células contenidas en cada recipiente no está limitado y habitualmente es aproximadamente de 5 x 106 células a 5 x 107 células. Dado que las células incluidas en el banco primario de células son un clon, presentan las mismas propiedades, lo cual es conveniente cuando las células se utilizan como herramienta para analizar la función de genes o como vector para terapia génica.

Tal como se ha descrito anteriormente, dado que la célula humana aislada, según la presente invención, se puede cultivar en suspensión en un medio sin suero, presenta una capacidad de crecimiento elevada, se puede cultivar a una densidad elevada, puede crecer HVJ en la célula y presenta la propiedad de recuperación en estado de congelación, es ventajosa para la producción en masa de HVJ y otros virus, proteínas recombinantes y similares. De manera especial, con la célula preferente, tal como la obtenida en el ejemplo siguiente, dado que la capacidad para crecer el HVJ es elevada, las características no cambian incluso si la célula se subcultiva durante un periodo largo de tiempo, y dado que el cultivo se puede escalar fácilmente, la célula es especialmente ventajosa para la producción en masa en HVJ y otros virus, proteínas recombinantes y similares.

A continuación, se describirá la presente invención, de forma particular, mediante un ejemplo de la misma. Sin embargo, la presente invención no se limita al siguiente ejemplo.

Ejemplo

1. Obtención de la línea celular GIC20 a partir de células 293

(1)

Adquisición de células

Se adquirieron células 293 de JCRB (actualmente el Health Science Research Resources Bank (HSRRB) (“Banco de recursos para la investigación en ciencias de la salud”) (número de subcultivos: 37; tiempo de duplicación: 62 horas). Después de despertar las células 293, se mantuvieron mediante el subcultivo por un cultivo adherente utilizando MEM complementado con FBS al 5%.

(2)

Preparación de los medios de cultivo

Como medio de cultivo utilizado para suspender las células 293 y para cambiar el medio de células 293 en un medio sin suero, respectivamente, se obtuvieron aquellas para suspender células 293 y para cambiar el medio de células 293 a un medio sin suero, que se han comercializado o que están bajo desarrollo por los fabricantes de medios y reactivos. Se utilizó cada uno de los medios según el protocolo recomendado por el fabricante y se añadió L-glutamina hasta una concentración final de 4-8 mM. Además, se añadió Pluronic F-68 en una cantidad de 0,1-0,2%, según fuera necesario.

(3) Cambio del medio a medio sin suero, y suspensión y aclimatación de células

Se separaron mediante un tratamiento con tripsina las células 293 mantenidas mediante el subcultivo por un cultivo adherente que utilizaba un medio que contenía suero, y se recogieron mediante centrifugación. Se intentó la aclimatación mediante la sustitución total del medio que contenía suero a un medio sin suero mediante el procedimiento de adaptación directa. De manera simultánea, con la sustitución del medio, se sembraron las células en un matraz Erlenmeyer hasta una densidad de 3 a 5 x 105 células/ml, y se inició el cultivo de las células mediante un cultivo rotativo (100 rpm) utilizando un agitador rotatorio en una incubadora a 36,5ºC en CO2 al 5-10%. El cambio del medio a un medio sin suero y el cambio del cultivo a un cultivo en suspensión se intentaron utilizando no menos de 10 tipos de medios. Mediante la continuación del cultivo de mantenimiento de las células cuyo crecimiento después de la sustitución del medio estaba confirmado, las células se aclimataron de manera gradual al medio sin suero. En el cultivo de mantenimiento, las células se sembraron a una densidad de 3-5 x 105 células/ml y cuando la densidad celular alcanzó 1 x 106 células/ml después del cultivo rotativo durante varios días, el medio de cultivo se diluyó con un medio fresco. El medio T6 (nombre comercial "EXCELL-293") producido por JRH Bioscience y el medio HyQ PF-293 producido por HyClone mostraron una capacidad de crecimiento particularmente elevada.

De este modo, utilizando T6 y HyQ que mostraban una buena capacidad de crecimiento, las células se cultivaron durante un periodo largo de tiempo (no inferior a 30 días) para proceder a la aclimatación de las células al medio sin suero. Comparando T6 y HyQ, T6 mostró una mejor capacidad de crecimiento y una mejor propiedad de suspensión. En cuanto a las células aclimatadas a T6, el cultivo de aclimatación se llevó a cabo durante 140 días y las células resultantes se sometieron a la clonación descrita en la siguiente sección.

(4)

Clonación de células

Se clonaron las células que mostraron las mejores condiciones de crecimiento y que se aclimataron al medio T6. Se realizó la clonación mediante el procedimiento de dilución limitante utilizando una placa de 96 pocillos y se confirmaron 838 clones individuales bajo el microscopio. Para ayudar en el crecimiento a partir de los clones individuales, se inició el cultivo utilizando un medio complementado con suero en una cantidad del 20-30%. Se realizó un cultivo estático en una incubadora a 37°C en CO2 al 10%. Mientras se escalaba el cultivo según el crecimiento de las células, la concentración de suero se disminuyó de manera gradual para volver a las condiciones de cultivo a un cultivo sin suero y en suspensión. Utilizando la propiedad de recuperación en estado de congelación, la capacidad de crecimiento y la productividad de HVJ como índices por los procedimientos descritos a continuación, se obtuvieron finalmente 45 tipos de células provenientes de colonias individuales.

(5)

Crioconservación de células

Durante el cultivo de aclimatación y la clonación, las células se crioconservaron. Después de escalar las células, éstas se centrifugaron y suspendieron en un medio para su congelación, cuyo medio se preparó para conseguir una proporción de medio fresco:medio acondicionado:DMSO (dimetil sulfóxido) de 45:45:10, seguido de la división y colocación de las células en viales en una población de 1 x 107 células/vial. Cuando se congelaron las células, los viales de células preparadas de este modo se colocaron en un recipiente criogénico, y las células se congelaron en un congelador a -80°C. Mediante la utilización del recipiente criogénico, se puede conseguir una congelación a una velocidad de -1°C/minuto que se conoce que es la id eal en la congelación de células, de manera que se puede reducir el daño de las células debido a la operación de congelación. A continuación, los viales congelados en el congelador a -80°C se transfirieron a un recipiente que contenía nitrógeno líquido y se crioconservaron en fase gas (-150°C). El "medio fresco" utilizado aquí fue el me dio a utilizar para el cultivo, que no se había utilizado, y el medio acondicionado utilizado aquí fue el medio que se había utilizado, es decir, el sobrenadante de cultivo. Después de la crioconservación durante no menos de 3 días, las células se descongelaron y se sometieron a la selección utilizando la capacidad de crecimiento y la productividad de HVJ como índices.

(6)

Selección de clones de crecimiento elevado

La capacidad de crecimiento se evaluó mediante el cultivo en suspensión de las células en medio T6 a 36,5ºC en CO2 al 5-10% y la medición, con el tiempo, de la densidad de células viables con un analizador de viabilidad celular automatizado Vi-CELL (marca registrada) de Beckman Coulter, determinando, de este modo, el tiempo de duplicación en la fase logarítmica de crecimiento. Se seleccionaron células que tenían un tiempo de duplicación no superior a 35 horas. La densidad máxima de las células viables de cada uno de los clones seleccionados fue no inferior a 4 x 106 células/ml.

(7)

Selección de células que producen virus en gran cantidad

Durante la etapa de escalado se tomó una alícuota de cada uno de los clones que mostraron una buena capacidad de crecimiento en la clonación, y se realizó la prueba de producción de HVJ para seleccionar las células que producían el virus en gran cantidad.

(i)

Procedimiento de producción de HVJ

Se produjo el HVJ mediante la adición a las células de 2-8 μg/ml (concentración final) de tripsina y HVJ (multiplicidad de infección: MOI=23) como virus semilla, y el cultivo de las células a 32-34°C en una incubadora de C O2 al 5% durante 2 a 3 días. Después de la centrifugación, se recuperó el sobrenadante y se midió el título de producción de HVJ.

(ii)

Medición del título de producción de HVJ

La cantidad de HVJ producido se midió mediante la prueba de HA (prueba de hemaglutinación: se mide el número físico de partículas de virus midiendo la capacidad de hemaglutinación de la proteína HA en la membrana viral de HVJ), prueba de NA (prueba de actividad de neuraminidasa: se mide el número físico de partículas de virus midiendo la actividad de neuraminidasa de la proteína HA en la membrana viral de HVJ) o la prueba de FFU (procedimiento de anticuerpos fluorescentes: se cuantifica el HVJ infeccioso mediante el recuento del número de células infectadas). (Referencia: Virus Experimental Protocols (“Protocolos experimentales para virus”), Medical View Co., Ltd., 1995, 68-78; The sialic acids (“Los ácidos siálicos”), J. Biol. Chem., 240, 3501 (1965)). Como ejemplo, los resultados de la medición del título de producción determinada mediante la prueba de FFU se muestran en la figura

2. Se obtuvieron clones que mostraban diversas productividades. Estas pruebas se llevaron a cabo concretamente de la siguiente manera:

Prueba de HA: Se mezclaron sangre de pollo almacenada y PBS(-) mediante un mezclado por volteado para preparar una suspensión al 10% de glóbulos rojos de pollo. La muestra de producción de HVJ a medir se descongeló y se colocó en una placa de 96 pocillos, seguido de la dilución en serie con PBS(-). A continuación, la suspensión de glóbulos rojos de pollo al 10% se diluyó hasta 0,5% con PBS(-), y la dilución resultante se añadió a la placa para mezclarse con la muestra de HVJ, seguido de la reacción a 4°C durante 2 horas. Dos horas má s tarde, la placa se observó de manera visual, se determinó el pocillo en el que la concentración de HVJ era la más baja y en el que se aglutinaron los glóbulos rojos, y se calculó la HAU a partir de la proporción de dilución.

Prueba de NA: Se descongeló la muestra de producción de HVJ a medir y se colocó en una placa de 96 pocillos, seguido de una dilución en serie con tampón de reacción. Después de la preincubación a 37°C durante 1 minuto con una placa calefactora, se añadieron 15 ml del sustrato 4-MU-nana y la mezcla resultante se incubó a 37°C durante 15 minutos. La reacción se interrumpió mediante la adición de 60 μl de tampón de interrupción, y se midió la intensidad de fluorescencia con un lector de placas (excitación: aproximadamente 350 nm, emisión: aproximadamente 460 nm). A partir de los valores obtenidos, utilizando una curva estándar de 4-MU, se calculó la concentración de la muestra medida.

Prueba de FFU: Un día antes de la prueba, se sembraron células (LLC-MK2) para la infección en una placa de 24 pocillos y se cultivaron en una incubadora de CO2. Se descongeló la muestra de producción de HVJ a medir y se prepararon diluciones de la muestra diluidas de 102 a 104 veces utilizando PBS(+)/BSA al 1%. Se extrajeron las células LLC-MK2, el medio se sustituyó por PBS(+)/BSA al 1%, y se añadieron las diluciones de HVJ preparadas. Después de centrifugar dos veces a 3000 rpm, a 32°C durante 30 minutos utilizando una centrifugadora para placas, se extrajo la dilución del virus (sobrenadante), y el medio se sustituyó por MEM-E/BSA al 1%, seguido del cultivo para infección a 37°C en una atmósfera de CO 2 al 5% durante 16 a 24 horas. Al siguiente día, se sacó la placa, cada pocillo se lavó con PBS(-), y se llevó a cabo la fijación de las células con acetona/metanol (proporción en volumen: 1:1). A continuación, se añadió una solución de anticuerpo primario, y se realizó una incubación con agitación a 37°C durante 1 a 2 horas, o una incubación a 4°C du rante 16 a 24 horas, permitiendo, de este modo, que las células infectadas con HVJ reaccionen con el anticuerpo primario. Después de lavar, se añadió una solución de anticuerpo secundario y se realizó una incubación con agitación a 37°C durante 1 a 2 horas. Mediante la observaci ón bajo un microscopio fluorescente, se contó el número de células infectadas (se observa fluorescencia verde sólo en el citoplasma, y el núcleo se observa en negro como si se hubiera desprendido), y se calculó el título de FFU.

Se seleccionaron dos clones (clon A y clon B) que mostraron una capacidad de crecimiento y productividad elevadas, y se llevó a cabo la producción de HVJ utilizando un biorreactor. La producción en el biorreactor se llevó a cabo a una escala de 1 l y el cultivo de producción se llevó a cabo en medio T6 en presencia de ácido butírico 2 mM y tripsina 4 μg/ml, a MOI de HVJ = 10, a la vez que se controlaban las condiciones de cultivo, de manera que la velocidad de agitación era de 30 rpm, la temperatura era de 32°C, el DO (nivel de oxígeno disuelto) er a del 15%, y el pH era inferior a 7,2. Cuarenta y dos horas después de la infección, se recuperó el material recogido mediante centrifugación y se medió el título mediante la prueba de FFU. Como resultado, el clon A mostró una productividad ligeramente superior (figura 3).

(8) Medición de la actividad de transfección de genes (actividad TF) de los HVJ obtenidos

Se compararon las actividades de transfección de genes de los HVJ producidos por los dos clones descritos anteriormente (clon A y clon B) en el biorreactor descrito anteriormente, y obtenidos después de la purificación del material recogido para eliminar impurezas. Como control para la comparación, se analizó el HVJ (huevo) proliferado en un huevo y purificado de la misma manera. Se transfectaron el HVJ y un plásmido que expresaba el gen de la

luciferasa en células BHK-21. La transfección se llevó a cabo mediante un procedimiento en el que se trataron el HVJ-E y el pGL3 a introducir con un surfactante, la mezcla resultante se centrífugo, encapsulándose, de este modo, el pGL3 en el HVJ-E, y la mezcla resultante se añadió a las células sometidas a transfección, introduciéndolo, de este modo, en las células utilizando la capacidad de fusión celular del HVJ. De doce a 24 horas después de la transfección génica, se midió la unidad de luminiscencia relativa (RLU) utilizando reactivos de ensayo de luciferasa. Como resultado, el clon B mostró una actividad de transfección de genes superior a la del clon A, y ambos mostraron una actividad superior a la del virus del control para comparación, que proliferó en el huevo (figura 4).

Tal como se ha descrito anteriormente, se obtuvieron un conjunto de clones que tenían una capacidad de crecimiento y productividad del virus diferentes mediante la aclimatación de las células al medio sin suero, y la clonación de las células suspendidas. Entre los clones obtenidos de este modo, el clon (clon B) que presentaba una capacidad de crecimiento y productividad del virus diferentes excelentes, y que tenía una actividad de transfección de genes especialmente elevada, se denominó GIC20. Tal como se ha descrito anteriormente, el GIC20 se ha depositado en el International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, en AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japón, con el número de acceso FERM BP-10399 del 11 de agosto de 2005, bajo el Tratado de Budapest.

2. Análisis de las características de la célula GIC20

(1) Capacidad de crecimiento

Se examinó la capacidad de crecimiento en un cultivo discontinuo de la célula del clon seleccionado en base a la capacidad de producción de HVJ. Las células se sembraron a una densidad de 4 x 105 células/ml, se realizó un cultivo rotativo (100-120 rpm) a 36,5°C, en una inc ubadora de CO2 al 5% utilizando un agitador rotatorio. Se tomó una alícuota del medio de cultivo y se contó el número de células. El tiempo de duplicación en la fase logarítmica del crecimiento (día 1 a día 4) fue de 28 horas, y la densidad celular alcanzó la densidad máxima de 5 x 106 células/ml en el quinto día desde el inicio del cultivo. El recuento celular se llevó a cabo utilizando el analizador de la viabilidad celular automatizado Vi-CELL (marca registrada) de Beckman Coulter, en el que se contaron las células con un diámetro de 12 a 20 μm. Los resultados se muestran en la figura 5.

Además, también se examinó la capacidad de crecimiento en un cultivo de lotes alimentados. De la misma manera descrita anteriormente, las células se sembraron a una densidad de 4 x 105 células/ml, se realizó un cultivo rotativo (100-120 rpm) a 36,5ºC en una incubadora de CO2 al 5% utilizando un agitador rotatorio. En el día 3 y el día 5, la sustitución del medio se llevó a cabo mediante centrifugación. El tiempo de duplicación en la fase logarítmica de crecimiento (día 1 a día 4) fue de 28 horas y la densidad celular alcanzó la máxima densidad de 1 x 107 células/ml en el séptimo día desde el inicio del cultivo (figuras 6).

(2)

Producción de HVJ

Utilizando el clon GIC20 conocido como altamente productor de virus, se optimizaron las condiciones para la producción del virus HVJ, y se analizó la capacidad de producción de HVJ. Las células para la infección crecieron hasta 2 x 106 células/ml, se añadió un medio de cultivo para la infección complementado con butirato de sodio (concentración final: 1-4 mM) y tripsina (concentración final: 2-8 μg/mL) en una cantidad del 30 al 50%, se añadió una solución de HVJ a una MOI de 1 a 10, y se cultivaron las células a una temperatura de 32 a 34ºC durante 40 a 44 horas, seguido de la recuperación del sobrenadante de cultivo mediante centrifugación. La muestra recuperada se colocó en partes divididas en recipientes y se almacenó a -80°C. La medición del título de la muest ra de HVJ recuperada se llevó a cabo mediante el procedimiento descrito anteriormente. Como resultado, los títulos fueron: FFU = 3,82E + 9 FFU/ml, NA = 289,1 mU/ml, y HA = 1024 HAU/ml.

(3)

Producción de adenovirus

Se confirmó la capacidad de producción de GIC20 para producir un virus diferente de HVJ. Las células en la fase logarítmica de crecimiento a una densidad de 2 x 106 células/ml se concentraron 2 veces mediante centrifugación y el posterior descarte del sobrenadante de cultivo, y se infectó un vector de adenovirus (Adeno CMV-LacZ) a una MOI de 2. Después de cultivar para la infección (cultivo rotativo a 100 rpm) a 37ºC en una incubadora de CO2 al 5% utilizando un agitador rotatorio durante 1 hora, se añadió un volumen igual de medio fresco y se continuó el cultivo para la infección. Se recuperó el sobrenadante 48 horas después de la infección y se midió el título de adenovirus. El vector de adenovirus producido por las células GIC20 se purificó utilizando los kits de purificación de virus adeno-X BD (BD, número de catálogo 631533), y se midió utilizando el kit de título rápido de adeno-X BD (BD, número de catálogo 631028). Como resultado, el título fue de 1,3 x 109 ifu/ml, o 185 ifu/célula con respecto al título por célula. (La producción por célula utilizando las células 293 originales que muestran el título más elevado fue de 120 ifu/célula).

Se realizó el subcultivo de GIC20 durante 6 meses y en los días 39, 102, 109, 130 y 179 después de la descongelación se midieron la capacidad de producción de HVJ (título de FFU y actividad de NA), el tipo de duplicación de las células y el tiempo de duplicación de la población celular. No se observaron cambios importantes cuando se compararon con las células inmediatamente después de la descongelación después de un almacenamiento de 6 meses (figura 7). De este modo, se demostró que la célula mantiene la capacidad de crecimiento y la capacidad de producción del virus, como mínimo, durante 6 meses.

Claims (3)

1. REIVINDICACIONES

   1. Célula humana aislada, originada a partir de una línea celular humana de riñón transformada, depositada con el

   número de acceso FERM BP-10399 en el International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced 5 Industrial Science and Technology.
2. 2. Banco primario de células que comprende un conjunto de recipientes, comprendiendo cada uno dicha célula humana aislada, según la reivindicación 1.

   10 3. Procedimiento de producción de un virus, comprendiendo dicho procedimiento inocular un virus deseado a dicha célula humana aislada, según la reivindicación 1; hacer crecer dicho virus en dicha célula; y recuperar el virus desarrollado.
3. 4. Procedimiento, según la reivindicación 3, en el que dicho virus es el virus hemaglutinante de Japón o adenovirus. 15