JP2960552B2 - 動物細胞の育種方法 - Google Patents
動物細胞の育種方法Info
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- JP2960552B2 JP2960552B2 JP2410166A JP41016690A JP2960552B2 JP 2960552 B2 JP2960552 B2 JP 2960552B2 JP 2410166 A JP2410166 A JP 2410166A JP 41016690 A JP41016690 A JP 41016690A JP 2960552 B2 JP2960552 B2 JP 2960552B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は本来遺伝子の導入による
形質転換動物細胞の育種方法に関するものである。更に
詳しくは、ある形質転換動物細胞に新たな特性を付与す
る方法に関するものである。
形質転換動物細胞の育種方法に関するものである。更に
詳しくは、ある形質転換動物細胞に新たな特性を付与す
る方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】動物細胞に外来遺伝子を導入し、形質転
換体を得る技術は有用な生理活性ペプチドの製造によっ
て重要である。遺伝子導入の親株としてはＣＨＯ，ＢＨ
Ｋ，ＨｅＬａなど種々の細胞株が用いられている。目的
物質を得るために重要な親株の特性は目的物質の単位細
胞当りの生産速度、適切な翻訳後修飾能及び好ましい培
養特性などが挙げられる。しかしこれらをすべて満たす
親株を選択するのは困難である。特に翻訳後修飾の複雑
なタンパク質を生産しようとする場合、適切な修飾能を
持つ宿主細胞は極めて限定され、しかもそのような細胞
は目的物質生産能や培養特性などの面で好ましくない場
合が多い。
換体を得る技術は有用な生理活性ペプチドの製造によっ
て重要である。遺伝子導入の親株としてはＣＨＯ，ＢＨ
Ｋ，ＨｅＬａなど種々の細胞株が用いられている。目的
物質を得るために重要な親株の特性は目的物質の単位細
胞当りの生産速度、適切な翻訳後修飾能及び好ましい培
養特性などが挙げられる。しかしこれらをすべて満たす
親株を選択するのは困難である。特に翻訳後修飾の複雑
なタンパク質を生産しようとする場合、適切な修飾能を
持つ宿主細胞は極めて限定され、しかもそのような細胞
は目的物質生産能や培養特性などの面で好ましくない場
合が多い。
【０００３】例えば抗血栓剤として有望なヒトプロテイ
ンＣの場合、実用的な活性を得るためにはＬ鎖Ｎ末端か
ら数えて初めの９個のグルタミン酸残基がγ−カルボキ
シル化されてγ−カルボキシグルタミン酸となる必要が
ある。しかし、プロテインＣ遺伝子を導入して十分にγ
−カルボキシル化がなされ、十分活性を持つプロテイン
Ｃを産生できる細胞株はごく少ない（S.C.Yan et al;Tr
ends in Biological Sci.,14,264(1989)）。現在知られ
ている最もγ−カルボキシル化活性の高い細胞株はヒト
胎児腎由来２９３株である（S.C.Betty Yan et al;BIO/
TECHNOLOGY, ８655(1990) ）が、この株は細胞同志の凝
集性が高く、最も効率的と考えられているサンペンジョ
ン培養には不向であり、また接着能も弱いため担体接着
型培養にも適さないという培養特性上の欠点を持つ。
ンＣの場合、実用的な活性を得るためにはＬ鎖Ｎ末端か
ら数えて初めの９個のグルタミン酸残基がγ−カルボキ
シル化されてγ−カルボキシグルタミン酸となる必要が
ある。しかし、プロテインＣ遺伝子を導入して十分にγ
−カルボキシル化がなされ、十分活性を持つプロテイン
Ｃを産生できる細胞株はごく少ない（S.C.Yan et al;Tr
ends in Biological Sci.,14,264(1989)）。現在知られ
ている最もγ−カルボキシル化活性の高い細胞株はヒト
胎児腎由来２９３株である（S.C.Betty Yan et al;BIO/
TECHNOLOGY, ８655(1990) ）が、この株は細胞同志の凝
集性が高く、最も効率的と考えられているサンペンジョ
ン培養には不向であり、また接着能も弱いため担体接着
型培養にも適さないという培養特性上の欠点を持つ。
【０００４】一方凝集性が低くサスペンジョン培養に適
した細胞株としてはサスペンジョン馴化ＢＨＫ株がある
が、この株はγ−カルボキシル化活性が低いという欠点
を持つ。
した細胞株としてはサスペンジョン馴化ＢＨＫ株がある
が、この株はγ−カルボキシル化活性が低いという欠点
を持つ。
【０００５】これらの異なる特性を持つ細胞株の特性改
善法の一つとして細胞融合法がある。遺伝子導入形質転
換細胞と他の細胞の融合により特性を改善させた例とし
ては、ＨＢｓ抗原遺伝子を導入したＶｅｒｏ細胞株と、
サル肝臓初代培養細胞を融合してＨＢｓ抗原産生能を増
大させた例がある（Nicole Cheniner et al;BIO/TECHNO
LOGY，８,858(1990)）。しかしこれまで細胞融合により
遺伝子入導入細胞の翻訳後修飾能の改善あるいは培養特
性の改善を行なった例は報告されていない。
善法の一つとして細胞融合法がある。遺伝子導入形質転
換細胞と他の細胞の融合により特性を改善させた例とし
ては、ＨＢｓ抗原遺伝子を導入したＶｅｒｏ細胞株と、
サル肝臓初代培養細胞を融合してＨＢｓ抗原産生能を増
大させた例がある（Nicole Cheniner et al;BIO/TECHNO
LOGY，８,858(1990)）。しかしこれまで細胞融合により
遺伝子入導入細胞の翻訳後修飾能の改善あるいは培養特
性の改善を行なった例は報告されていない。
【０００６】
【発明の目的】そこで本発明者らは上記の問題を解決す
べく、好ましい特性を合わせ持つ目的物質生産細胞株を
得ることを目的として研究を進めた。その結果、細胞融
合法を用いることにより目的が達成され得ることを見出
した。
べく、好ましい特性を合わせ持つ目的物質生産細胞株を
得ることを目的として研究を進めた。その結果、細胞融
合法を用いることにより目的が達成され得ることを見出
した。
【０００７】
【発明の構成】本発明はγ−カルボキシル化及び培養特
性について一方は優れているが一方は劣っているという
特性を持つ細胞に分子内にＧｌａドメインを有するタン
パク質をコードする遺伝子を導入して得られた形質転換
体と、これと反対の特性を持つ細胞を融合することを特
徴とする動物細胞の育種方法である。
性について一方は優れているが一方は劣っているという
特性を持つ細胞に分子内にＧｌａドメインを有するタン
パク質をコードする遺伝子を導入して得られた形質転換
体と、これと反対の特性を持つ細胞を融合することを特
徴とする動物細胞の育種方法である。
【０００８】かかる本発明によれば、高いγ−カルボキ
シル化活性と優れた培養特性を合わせ持つ目的物質生産
株を得ることが可能となる。
シル化活性と優れた培養特性を合わせ持つ目的物質生産
株を得ることが可能となる。
【０００９】すなわち本発明は、低凝集性動物細胞Ｃ１
およびγ−カルボキシル化活性を有する動物細胞Ｃ２の
どちらか一方に、分子内にＧｌａドメインを有するタン
パク質をコード遺伝子を導入して得られた形質転換体と
もう一方の動物細胞とを細胞融合し、Ｇｌａドメインが
カルボキシル化したタンパク質を効率的に生産する細胞
を選択することからなる動物細胞の育種方法である。
およびγ−カルボキシル化活性を有する動物細胞Ｃ２の
どちらか一方に、分子内にＧｌａドメインを有するタン
パク質をコード遺伝子を導入して得られた形質転換体と
もう一方の動物細胞とを細胞融合し、Ｇｌａドメインが
カルボキシル化したタンパク質を効率的に生産する細胞
を選択することからなる動物細胞の育種方法である。
【００１０】また本発明は、低凝集性動物細胞Ｃ１およ
びγ−カルボキシル化活性を有する動物細胞Ｃ２とを細
胞融合して得られた融合細胞に、分子内にＣｌａドメイ
ンを有するタンパク質をコードする遺伝子を導入し、Ｇ
ｌａドメインがカルボキシル化したタンパク質を効率的
に生産する細胞を選択する動物細胞の育種方法である。
びγ−カルボキシル化活性を有する動物細胞Ｃ２とを細
胞融合して得られた融合細胞に、分子内にＣｌａドメイ
ンを有するタンパク質をコードする遺伝子を導入し、Ｇ
ｌａドメインがカルボキシル化したタンパク質を効率的
に生産する細胞を選択する動物細胞の育種方法である。
【００１１】本発明においては、分子内にＧｌａドメイ
ンを有するタンパク質としてヒトプロテインＣまたはヒ
ト活性化プロテインＣが好適である。本発明において、
低凝集性動物細胞としてＢＨＫ株が好適である。γ−カ
ルボキシル化活性を有する動物細胞はヒト胎児由来２９
３株が好適である。
ンを有するタンパク質としてヒトプロテインＣまたはヒ
ト活性化プロテインＣが好適である。本発明において、
低凝集性動物細胞としてＢＨＫ株が好適である。γ−カ
ルボキシル化活性を有する動物細胞はヒト胎児由来２９
３株が好適である。
【００１２】また本発明は、低凝集性動物細胞Ｃ１およ
びγ−カルボキシル化活性を有する動物細胞Ｃ２のどち
らか一方に、分子内にＧｌａドメインを有するタンパク
質をコードする遺伝子を導入して得られた形質転換体と
もう一方の動物細胞とを細胞融合し、Ｇｌａドメインが
カルボキシル化したタンパク質を効率的に生産する細胞
を選択することにより得られるＧｌａ化率５０％以上の
動物細胞を包含する。本発明の実施例によればＧｌａ化
率の上限は８０％前後であるが好ましくは１００％であ
る。かかる動物細胞の平均凝集度は低凝集性動物細胞Ｃ
１と同程度、すなわち１〜５個／凝集塊程度である。
びγ−カルボキシル化活性を有する動物細胞Ｃ２のどち
らか一方に、分子内にＧｌａドメインを有するタンパク
質をコードする遺伝子を導入して得られた形質転換体と
もう一方の動物細胞とを細胞融合し、Ｇｌａドメインが
カルボキシル化したタンパク質を効率的に生産する細胞
を選択することにより得られるＧｌａ化率５０％以上の
動物細胞を包含する。本発明の実施例によればＧｌａ化
率の上限は８０％前後であるが好ましくは１００％であ
る。かかる動物細胞の平均凝集度は低凝集性動物細胞Ｃ
１と同程度、すなわち１〜５個／凝集塊程度である。
【００１３】本発明の低凝集性動物細胞とはサスペンジ
ョン培養を行なう際の培養の難易度の指標となる細胞の
平均凝集度が１〜５個／凝集塊である細胞である。細胞
の平均凝集度は種々の方法で測定することができるが、
適当容量（約５０〜１００ml）の三角フラスコ中に適当
密度の細胞懸濁度（１０6 cells/ml程度）を適当量（１
０〜２０ml）入れ、一定時間（１８〜２４時間）振盪培
養し、一定量の培地中の凝集塊数を計数して平均凝集度
を算出するという方法が簡便かつ適切である。ある細胞
では凝集性がカルシウムイオン依存性であることが知ら
れているため、この際に用いる培地は通常濃度（０．３
〜１．８mM）のカルシウムイオンを含む無結成培地を用
いるべきである。
ョン培養を行なう際の培養の難易度の指標となる細胞の
平均凝集度が１〜５個／凝集塊である細胞である。細胞
の平均凝集度は種々の方法で測定することができるが、
適当容量（約５０〜１００ml）の三角フラスコ中に適当
密度の細胞懸濁度（１０6 cells/ml程度）を適当量（１
０〜２０ml）入れ、一定時間（１８〜２４時間）振盪培
養し、一定量の培地中の凝集塊数を計数して平均凝集度
を算出するという方法が簡便かつ適切である。ある細胞
では凝集性がカルシウムイオン依存性であることが知ら
れているため、この際に用いる培地は通常濃度（０．３
〜１．８mM）のカルシウムイオンを含む無結成培地を用
いるべきである。
【００１４】細胞のγ−カルボキシル化活性は、細胞に
分子内にＧｌａドメインを有するタンパク質をコードす
る遺伝子を導入して生産されるタンパクのＧｌａ化の程
度を測定することにより知ることができる。Ｇｌａ化率
は生産タンパクを精製後アミノ酸分析を行なうことによ
って測定しても良いが、より簡便には目的タンパク質の
Ｇｌａドメインを特異的に認識するモノクローナル抗体
を用いたＥＬＩＳＡにより求められる。本発明では後者
の方法に依った。
分子内にＧｌａドメインを有するタンパク質をコードす
る遺伝子を導入して生産されるタンパクのＧｌａ化の程
度を測定することにより知ることができる。Ｇｌａ化率
は生産タンパクを精製後アミノ酸分析を行なうことによ
って測定しても良いが、より簡便には目的タンパク質の
Ｇｌａドメインを特異的に認識するモノクローナル抗体
を用いたＥＬＩＳＡにより求められる。本発明では後者
の方法に依った。
【００１５】本発明で用いる導入遺伝子のコードするタ
ンパク質はその分子内にＧｌａドメインを有し、翻訳後
のγ−カルボキシル化が活性発現の為に不可欠であるよ
うなものである。例としては血液凝固線溶因子であるプ
ロトロンビン，第IX因子，第Ｘ因子，第VII 因子，プロ
テインＣ，プロテインＳあるいはオステオカルシン，ボ
ーングラタンパクなどが挙げられる。
ンパク質はその分子内にＧｌａドメインを有し、翻訳後
のγ−カルボキシル化が活性発現の為に不可欠であるよ
うなものである。例としては血液凝固線溶因子であるプ
ロトロンビン，第IX因子，第Ｘ因子，第VII 因子，プロ
テインＣ，プロテインＳあるいはオステオカルシン，ボ
ーングラタンパクなどが挙げられる。
【００１６】プロテインＣは、生体内での血液凝固及び
フィブリン溶解活性の発生において、重要な役割を演ず
るセリンプロテアーゼのチモーゲン又は前躯体である。
このものは肝臓中で単鎖ポリペプチドとして合成され、
このポリペプチドはかなりのプロセシンクを受けてジル
スフィド結合により一緒に保持された重鎖（Ｍｒ＝４
０，０００）及び軽鎖（Ｍｒ＝２１，０００）を含んで
なる２本鎖分子となる。循環中のこの２本鎖中間体は、
重鎖のアミノ末端からの１２残基ペプチドのトロンビン
介在開裂により“活性化されたプロテインＣ”（ＡＰ
Ｃ）として知られる生物学的に活性な形の分子に転換さ
れる。
フィブリン溶解活性の発生において、重要な役割を演ず
るセリンプロテアーゼのチモーゲン又は前躯体である。
このものは肝臓中で単鎖ポリペプチドとして合成され、
このポリペプチドはかなりのプロセシンクを受けてジル
スフィド結合により一緒に保持された重鎖（Ｍｒ＝４
０，０００）及び軽鎖（Ｍｒ＝２１，０００）を含んで
なる２本鎖分子となる。循環中のこの２本鎖中間体は、
重鎖のアミノ末端からの１２残基ペプチドのトロンビン
介在開裂により“活性化されたプロテインＣ”（ＡＰ
Ｃ）として知られる生物学的に活性な形の分子に転換さ
れる。
【００１７】本発明においてはかかるタンパクをコード
する遺伝子を宿主細胞に導入した細胞を細胞融合に用い
ることができる。
する遺伝子を宿主細胞に導入した細胞を細胞融合に用い
ることができる。
【００１８】本発明で用いる動物細胞の種類及び組合せ
は特に限定はないが遺伝子導入宿主細胞としてはＢＨＫ
細胞株が適している。特にサスペンジョン培養に馴化し
たＢＨＫ細胞株が有利である。これに対する融合パート
ナーは樹立細胞株であっても初代培養細胞であっても良
い。樹立細胞株としてはヒト胎児腎由来２９３株が有利
に用いられる。
は特に限定はないが遺伝子導入宿主細胞としてはＢＨＫ
細胞株が適している。特にサスペンジョン培養に馴化し
たＢＨＫ細胞株が有利である。これに対する融合パート
ナーは樹立細胞株であっても初代培養細胞であっても良
い。樹立細胞株としてはヒト胎児腎由来２９３株が有利
に用いられる。
【００１９】細胞の融合法はポリエチレングリコールに
よる方法や電気パルスによるエレクトロポレーション法
などが一般的であるが、どのような方法を用いても良
い。
よる方法や電気パルスによるエレクトロポレーション法
などが一般的であるが、どのような方法を用いても良
い。
【００２０】融合株の選択は、樹立細胞株同志の融合の
場合には異なる薬剤耐性マーカー遺伝子を用いることに
より行なうことができる。例えば、細胞Ｃ１にｄｈｆｒ
遺伝子をマーカーとして目的タンパク質遺伝子を導入
し、ＭＴＸで選択した場合、ネオマイシン耐性遺伝子を
導入してＧ４１８で選択した細胞Ｃ２と融合してＭＴＸ
及びＧ４１８を共に含む選択培地で融合株を選択するこ
とができる。融合パートナーに初代培養細胞を用いる場
合には、遺伝子導入細胞にヒポキサンチンホスホリボシ
ルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損株あるいはチ
ミジンキナーゼ（ＴＫ）欠損株を用い、融合後にＨＡＴ
選択培地で融合株を選択することができる。この他にも
無血清培地での増殖性の相違や培養器壁への接着性の相
違などの特性の相違を利用した選択法、あるいはセルソ
ーターによる分離、さらにはこれらの方法の組合せなど
種々の方法が考えられる。
場合には異なる薬剤耐性マーカー遺伝子を用いることに
より行なうことができる。例えば、細胞Ｃ１にｄｈｆｒ
遺伝子をマーカーとして目的タンパク質遺伝子を導入
し、ＭＴＸで選択した場合、ネオマイシン耐性遺伝子を
導入してＧ４１８で選択した細胞Ｃ２と融合してＭＴＸ
及びＧ４１８を共に含む選択培地で融合株を選択するこ
とができる。融合パートナーに初代培養細胞を用いる場
合には、遺伝子導入細胞にヒポキサンチンホスホリボシ
ルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損株あるいはチ
ミジンキナーゼ（ＴＫ）欠損株を用い、融合後にＨＡＴ
選択培地で融合株を選択することができる。この他にも
無血清培地での増殖性の相違や培養器壁への接着性の相
違などの特性の相違を利用した選択法、あるいはセルソ
ーターによる分離、さらにはこれらの方法の組合せなど
種々の方法が考えられる。
【００２１】得られた融合株からの高Ｇｌａ化タンパク
質生産クローンの選択はＧｌａドメイン特異的モノクロ
ーナル抗体を用いたＥＬＩＳＡなどで行う。すなわち各
クローンの培養上清中のタンパクのＧｌａ化率の高いク
ローンを選ぶことにより行える。
質生産クローンの選択はＧｌａドメイン特異的モノクロ
ーナル抗体を用いたＥＬＩＳＡなどで行う。すなわち各
クローンの培養上清中のタンパクのＧｌａ化率の高いク
ローンを選ぶことにより行える。
【００２２】本発明においてＧｌａドメインがカルボキ
シル化したタンパク質を効率的に生産する細胞とは、該
細胞の平均凝集度がサスペンジョン培養を行うに際して
充分低く、かつ、Ｇｌａ化率が充分高い細胞のことをさ
す。一つの基準として、融合に用いた低凝集性細胞と同
程度の平均凝集度を有し、かつ、融合に用いたもう一方
のγ−カルボキシル化活性を有する細胞と同程度のＧｌ
ａ化率を有する細胞を選択することができる。たとえ
ば、低凝集性細胞であるＢＨＫ株と高いＧｌａ化率を有
する２９３株を融合させた融合細胞においては、ＢＨＫ
株の平均凝集度１〜５個／凝集塊程度を維持し、かつ、
２９３株のＧｌａ化率５０〜１００％を維持している細
胞を選択することができる。
シル化したタンパク質を効率的に生産する細胞とは、該
細胞の平均凝集度がサスペンジョン培養を行うに際して
充分低く、かつ、Ｇｌａ化率が充分高い細胞のことをさ
す。一つの基準として、融合に用いた低凝集性細胞と同
程度の平均凝集度を有し、かつ、融合に用いたもう一方
のγ−カルボキシル化活性を有する細胞と同程度のＧｌ
ａ化率を有する細胞を選択することができる。たとえ
ば、低凝集性細胞であるＢＨＫ株と高いＧｌａ化率を有
する２９３株を融合させた融合細胞においては、ＢＨＫ
株の平均凝集度１〜５個／凝集塊程度を維持し、かつ、
２９３株のＧｌａ化率５０〜１００％を維持している細
胞を選択することができる。
【００２３】
【発明の効果】かくして、本発明方法によれば高いγ−
カルボキシル化活性と優れた培養特性を合わせ持つ目的
物質産生細胞を容易に得ることが可能となる。
カルボキシル化活性と優れた培養特性を合わせ持つ目的
物質産生細胞を容易に得ることが可能となる。
【００２４】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を詳述する。
【００２５】
【実施例１】融合株は以下の方法により作成した。
【００２６】遺伝子導入宿主細胞としては無血清サスペ
ンジョン培養馴化低凝集性ＢＨＫ１２Ｄ株を用いた。こ
の低凝集性ＢＨＫ１２Ｄ株はＢＨＫ５０７株のクローニ
ングにより得られたものであり、無血清サスペンジョン
培養に適した株であり、先に出願した特願平２−１８１
４７号（平成２年７月１１日出願：低凝集性ＢＨＫ細胞
及びこれを用いた培養方法）に記載した方法により分離
した株である。ＢＨＫ５０７株とはＢＨＫ２１株より得
られた温度感受性株（ｔｓ１３）（Talavera and Bacil
lico,J.CellPhysiol.92,425-436(1977)）により分離さ
れたチミジンキナーゼ欠損株（Waechter and Baserga,P
NAS 79,1106-1110(1982)）である。
ンジョン培養馴化低凝集性ＢＨＫ１２Ｄ株を用いた。こ
の低凝集性ＢＨＫ１２Ｄ株はＢＨＫ５０７株のクローニ
ングにより得られたものであり、無血清サスペンジョン
培養に適した株であり、先に出願した特願平２−１８１
４７号（平成２年７月１１日出願：低凝集性ＢＨＫ細胞
及びこれを用いた培養方法）に記載した方法により分離
した株である。ＢＨＫ５０７株とはＢＨＫ２１株より得
られた温度感受性株（ｔｓ１３）（Talavera and Bacil
lico,J.CellPhysiol.92,425-436(1977)）により分離さ
れたチミジンキナーゼ欠損株（Waechter and Baserga,P
NAS 79,1106-1110(1982)）である。
【００２７】融合パートナーとしてはヒト胎児腎細胞由
来の２９３株を用いた。この株はγ−カルボキシル化
（Ｇｌａ化）活性は高いが、通常の培地では大きな凝集
塊を形成し、また無血清培地での増殖能も低いため無血
清サスペンジョン培養には不向きである。
来の２９３株を用いた。この株はγ−カルボキシル化
（Ｇｌａ化）活性は高いが、通常の培地では大きな凝集
塊を形成し、また無血清培地での増殖能も低いため無血
清サスペンジョン培養には不向きである。
【００２８】ＢＨＫ１２Ｄ株にｄｈｆｒを選択マーカー
遺伝子としてヒト活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）に遺伝
子を導入し、メソトレキセート（ＭＴＸ）によりＡＰＣ
生産株を選択した。
遺伝子としてヒト活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）に遺伝
子を導入し、メソトレキセート（ＭＴＸ）によりＡＰＣ
生産株を選択した。
【００２９】得られたコロニを２４wellプレートを移
し、２ml/wellの選択培地を加え、コンフルエントに達
するまで培養し、上清中の全ＡＰＣ濃度およびＧｌａ化
ＡＰＣ濃度を測定した。ＡＰＣはサンドイッチ法ＥＬＩ
ＳＡにより行ない、一次抗体にＧｌａ非特異的抗ＰＣモ
ノクローナル抗体を用い、２次抗体には全ＡＰＣ測定の
場合には抗ＰＣポリクローナル抗体を、Ｇｌａ化ＡＰＣ
測定の場合にはＧｌａ特異的抗ＰＣ抗体を用いた。Ｇｌ
ａ化率は｛Ｇｌａ化ＡＰＣ濃度（μg/ml）／全ＡＰＣ濃
度（μg/ml）｝×１００で算出した。ＡＰＣ生産速度は
１０cmφプレートでコンフルエントに達した後、培養上
清を除き、新たに選択培地４mlを加えて２４時間培養す
ることにより求めた。結果を（表１）に示す。このうち
最もＡＰＣ産生能の高かったＢＨＫ１２ＤＡ１Ａ１株を
融合に用いた。
し、２ml/wellの選択培地を加え、コンフルエントに達
するまで培養し、上清中の全ＡＰＣ濃度およびＧｌａ化
ＡＰＣ濃度を測定した。ＡＰＣはサンドイッチ法ＥＬＩ
ＳＡにより行ない、一次抗体にＧｌａ非特異的抗ＰＣモ
ノクローナル抗体を用い、２次抗体には全ＡＰＣ測定の
場合には抗ＰＣポリクローナル抗体を、Ｇｌａ化ＡＰＣ
測定の場合にはＧｌａ特異的抗ＰＣ抗体を用いた。Ｇｌ
ａ化率は｛Ｇｌａ化ＡＰＣ濃度（μg/ml）／全ＡＰＣ濃
度（μg/ml）｝×１００で算出した。ＡＰＣ生産速度は
１０cmφプレートでコンフルエントに達した後、培養上
清を除き、新たに選択培地４mlを加えて２４時間培養す
ることにより求めた。結果を（表１）に示す。このうち
最もＡＰＣ産生能の高かったＢＨＫ１２ＤＡ１Ａ１株を
融合に用いた。
【００３０】
【表１】 ２９３株にはネオマイシン耐性遺伝子を導入し、Ｇ４１
８による選択によりＧ４１８耐性株を得た。
８による選択によりＧ４１８耐性株を得た。
【００３１】細胞融合は以下の方法により行なった。
【００３２】融合剤としてはＰＥＧ４０００を用いた。
ＢＨＫ１２ＤのＡＰＣ生産株のうちの１クローンＢＨＫ
１２ＤＡ１Ａ１株と２９３Ｇ４１８耐性株をそれぞれ２
×１０7 個ずつを混合し、５０％ＰＥＧ４０００溶液に
より融合を行なった。融合後の選択は１μＭのＭＴＸ，
５００μｇ／mlのＧ４１８，５％透析ＦＣＳ，５μg ／
mlのビタミンＫ1 を含むグルコース増強ダルベッコ変性
イーグル培地で行なった。
ＢＨＫ１２ＤのＡＰＣ生産株のうちの１クローンＢＨＫ
１２ＤＡ１Ａ１株と２９３Ｇ４１８耐性株をそれぞれ２
×１０7 個ずつを混合し、５０％ＰＥＧ４０００溶液に
より融合を行なった。融合後の選択は１μＭのＭＴＸ，
５００μｇ／mlのＧ４１８，５％透析ＦＣＳ，５μg ／
mlのビタミンＫ1 を含むグルコース増強ダルベッコ変性
イーグル培地で行なった。
【００３３】融合後約３週間でコロニーが出現した。コ
ロニー出現効率は全処理細胞数当り３〜５×１０-6であ
った。このコロニーを拾い、それぞれのＡＰＣ産生量，
Ｇｌａ化率を測定した。Ｇｌａ化率は｛Ｇｌａ化ＡＰＣ
濃度（μg/ml）／全ＡＰＣ濃度（μg/ml）｝×１００で
算出した。
ロニー出現効率は全処理細胞数当り３〜５×１０-6であ
った。このコロニーを拾い、それぞれのＡＰＣ産生量，
Ｇｌａ化率を測定した。Ｇｌａ化率は｛Ｇｌａ化ＡＰＣ
濃度（μg/ml）／全ＡＰＣ濃度（μg/ml）｝×１００で
算出した。
【００３４】融合株のＡＰＣ産生能力を測定した。
【００３５】融合により得られたコロニーを２４wellプ
レートに移し、２ml/wellの選択培地を加え、コンフル
エントに達するまで培養し、上清中の全ＡＰＣ濃度及び
Ｇｌａ化ＡＰＣ濃度を測定した。ＡＰＣ濃度の測定はサ
ンドイッチ法ＥＬＩＳＡにより行なった。１次抗体には
Ｇｌａ非特異的抗ＰＣモノクローナル抗体を用い、２次
抗体には全ＡＰＣ測定の場合には抗ＰＣポリクローナル
抗体を、Ｇｌａ化ＡＰＣ測定の場合にはＧｌａ特異的抗
ＰＣ抗体を用いた。ＡＰＣ生産速度は１０cmφプレート
でコンフルエントに達した後、培養上清を除き、新たに
選択培地４mlを加えて２４時間培養することにより求め
た。
レートに移し、２ml/wellの選択培地を加え、コンフル
エントに達するまで培養し、上清中の全ＡＰＣ濃度及び
Ｇｌａ化ＡＰＣ濃度を測定した。ＡＰＣ濃度の測定はサ
ンドイッチ法ＥＬＩＳＡにより行なった。１次抗体には
Ｇｌａ非特異的抗ＰＣモノクローナル抗体を用い、２次
抗体には全ＡＰＣ測定の場合には抗ＰＣポリクローナル
抗体を、Ｇｌａ化ＡＰＣ測定の場合にはＧｌａ特異的抗
ＰＣ抗体を用いた。ＡＰＣ生産速度は１０cmφプレート
でコンフルエントに達した後、培養上清を除き、新たに
選択培地４mlを加えて２４時間培養することにより求め
た。
【００３６】クローンは全部で１０個取得した。それぞ
れの２４wellプレートでのＡＰＣ産生量、Ｇｌａ化率は
（表２）に示す。
れの２４wellプレートでのＡＰＣ産生量、Ｇｌａ化率は
（表２）に示す。
【００３７】
【表２】 （表２）に示すように各クローンは２，４，９，１０の
ようにＧｌａ化率の高いクローンと１，３，５，６，
７，８のようにＧｌａ化率の低いクローンとに大別され
た。
ようにＧｌａ化率の高いクローンと１，３，５，６，
７，８のようにＧｌａ化率の低いクローンとに大別され
た。
【００３８】Ｇｌａ化率の高かったクローン２，４，
９，１０の単位細胞，単位時間当りのＡＰＣ産生速度を
求めた。その結果を（表３）に示す。
９，１０の単位細胞，単位時間当りのＡＰＣ産生速度を
求めた。その結果を（表３）に示す。
【００３９】
【表３】 最もＧｌａ化ＡＰＣ産生量の高かったクローン４を以後
の実験に用いた。
の実験に用いた。
【００４０】
【比較例１】２９３株との融合に用いたＢＨＫ１２ＤＡ
１Ａ１株のＡＰＣ生産速度を測定した。
１Ａ１株のＡＰＣ生産速度を測定した。
【００４１】培地にＧ４１８を含まない選択培地を用い
た以外は実施例１のクローン２，４，９，１０のＡＰＣ
生産速度を求めた条件と同様に行なった。結果を（表
４）に示す。
た以外は実施例１のクローン２，４，９，１０のＡＰＣ
生産速度を求めた条件と同様に行なった。結果を（表
４）に示す。
【００４２】
【表４】 このようにＧｌａ化率，Ｇｌａ化ＡＰＣ生産速度はクロ
ーン２，４，９，１０のいずれにも劣っていた。
ーン２，４，９，１０のいずれにも劣っていた。
【００４３】
【実施例２】融合株の培養特性を調べるため細胞の凝集
度を測定した。
度を測定した。
【００４４】５０mlの容量の三角フラスコ中にトリプシ
ン処理によりプレートから分離し、新鮮培地に懸濁した
細胞懸濁液１０mlを入れロータリーシェーカーにより一
定時間攪拌した後、次式により平均凝集度を算出した。 平均凝集度＝初期細胞数／攪拌後全細胞塊数（個／凝集
塊） 攪拌の条件は下記の通りである。
ン処理によりプレートから分離し、新鮮培地に懸濁した
細胞懸濁液１０mlを入れロータリーシェーカーにより一
定時間攪拌した後、次式により平均凝集度を算出した。 平均凝集度＝初期細胞数／攪拌後全細胞塊数（個／凝集
塊） 攪拌の条件は下記の通りである。
【００４５】 細胞密度：１×１０6 cells/ml 培地：ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ） 振盪機：大洋ロータリーシェーカーＲ−II 振盪速度：１３５ｒｐｍ 温度：３７℃ 振盪時間：１８時間 雰囲気：５％ＣＯ2 ，９５％ａｉｒ ＢＨＫ１２ＤＡ１Ａ１と２９３株の融合株であるクロー
ン４の平均凝集度を測定したところ２．２個／凝集塊で
あった。
ン４の平均凝集度を測定したところ２．２個／凝集塊で
あった。
【００４６】
【比較例２】細胞にＢＨＫ１２ＤＡ１Ａ１株及び２９３
株を用いた以外は実施例２と同様に行ない、ＢＨＫ１２
ＤＡ１Ａ１株および２９３株の凝集度を調べた。
株を用いた以外は実施例２と同様に行ない、ＢＨＫ１２
ＤＡ１Ａ１株および２９３株の凝集度を調べた。
【００４７】ＢＨＫ１２ＤＡ１Ａ１および２９３株の平
均凝集度を（表５）に示す。
均凝集度を（表５）に示す。
【００４８】
【表５】 このように融合株の凝集度はＢＨＫ株に近かった。
【００４９】
【実施例３】融合株クローン４の生産したＡＰＣの抗凝
固活性を調べた。
固活性を調べた。
【００５０】ＢＨＫ１２ＤＡ１Ａ１と２９３の融合株ク
ローン４を血清を含む選択培地でプレート上にコンフル
エントに達するまで増殖させた後血清を含まない選択培
地に交換し、約１日後培養上清を採取した。この培養上
清からＧｌａ特異的抗ＡＰＣモノクローナル抗体アフィ
ニティーカラムによりＧｌａ化ＡＰＣを精製し、抗凝固
活性測定した。
ローン４を血清を含む選択培地でプレート上にコンフル
エントに達するまで増殖させた後血清を含まない選択培
地に交換し、約１日後培養上清を採取した。この培養上
清からＧｌａ特異的抗ＡＰＣモノクローナル抗体アフィ
ニティーカラムによりＧｌａ化ＡＰＣを精製し、抗凝固
活性測定した。
【００５１】抗凝固活性は下記の手順により測定した。
【００５２】ヒト正常血漿（ミドリ十字社サイトロール
Ｉ）１００μｌを３７℃で１分間インキュベート後、適
当濃度に希釈した精製ＡＰＣ１００μｌ及びＡＰＴＴ試
薬（ミドリ十字社データファイ・ＡＰＴＴ）１００μｌ
を加えた。３７℃で２分間インキュベート後、２５mM塩
化カルシウム溶液１００μｌを加え、自動血液凝固測定
装置（東亜医用電子ＣＡ−１００）で凝固時間を測定し
た。ＡＰＣを添加しない場合の凝固時間に対する凝固時
間の増加を抗凝固活性の指標とした、
Ｉ）１００μｌを３７℃で１分間インキュベート後、適
当濃度に希釈した精製ＡＰＣ１００μｌ及びＡＰＴＴ試
薬（ミドリ十字社データファイ・ＡＰＴＴ）１００μｌ
を加えた。３７℃で２分間インキュベート後、２５mM塩
化カルシウム溶液１００μｌを加え、自動血液凝固測定
装置（東亜医用電子ＣＡ−１００）で凝固時間を測定し
た。ＡＰＣを添加しない場合の凝固時間に対する凝固時
間の増加を抗凝固活性の指標とした、
【００５３】融合株のクローン４が生産するＡＰＣの抗
凝固活性（血漿凝固時間の増加）を（表６）に示す。
凝固活性（血漿凝固時間の増加）を（表６）に示す。
【００５４】
【表６】
【００５５】
【比較例３】ＢＨＫＡ１Ａ１ １２Ｄ株を用いた以外は
実施例３と同様に行ない、ＢＨＫＡ１Ａ１ １２Ｄ株の
生産したＡＰＣの抗凝固活性（凝固時間増加）を調べ
た。
実施例３と同様に行ない、ＢＨＫＡ１Ａ１ １２Ｄ株の
生産したＡＰＣの抗凝固活性（凝固時間増加）を調べ
た。
【００５６】血漿凝固時間の増加を（表７）に示す。
【００５７】
【表７】 このように融合株生産ＡＰＣはＢＨＫ生産ＡＰＣと同等
以上の活性を有していた。
以上の活性を有していた。
【００５８】
【実施例４】融合株クローン４のサスペンジョン培養を
行なった。
行なった。
【００５９】培養液には基礎培地として、ＲＰＭＩ１６
４０培地，ハムーＦ１２培地及びダルベッコ変法イーグ
ル培地を２：１：１で混合したものにアミノ酸，グルコ
ース等をさらに増強したもの（以下、ｅ−ＲＤＦと称す
る）を用い、増殖因子としてインスリン，トランスフェ
リン，エタノールアミン，亜セレン酸（ＩＴＥＳ）を加
えた。インスリンの添加量は９μｇ／ml，トランスフェ
リンは１０μｇ／ml，エタノールアミンは１０μＭ，亜
セレン酸は２０ｎＭであった。
４０培地，ハムーＦ１２培地及びダルベッコ変法イーグ
ル培地を２：１：１で混合したものにアミノ酸，グルコ
ース等をさらに増強したもの（以下、ｅ−ＲＤＦと称す
る）を用い、増殖因子としてインスリン，トランスフェ
リン，エタノールアミン，亜セレン酸（ＩＴＥＳ）を加
えた。インスリンの添加量は９μｇ／ml，トランスフェ
リンは１０μｇ／ml，エタノールアミンは１０μＭ，亜
セレン酸は２０ｎＭであった。
【００６０】培養には（図１）に示す培養システムを使
用した。培養槽は（図１）のように外壁の内側に隔壁に
よって仕切られたセトリングゾーンがもうけられ、その
上部には培養液の排出口を有しており、正味培養容積は
約２００mlである。酸素は外径４mmφの多孔性テフロン
チューブによって供給した。あらかじめオートクレーブ
滅菌した前記培養槽に正味培養容積が約２００mlになる
ように培養液を送入し、これにＢＨＫ１２ＤＡ１Ａと２
９３の融合株クローン４を１×１０6 個／mlとなるよう
に播種した。
用した。培養槽は（図１）のように外壁の内側に隔壁に
よって仕切られたセトリングゾーンがもうけられ、その
上部には培養液の排出口を有しており、正味培養容積は
約２００mlである。酸素は外径４mmφの多孔性テフロン
チューブによって供給した。あらかじめオートクレーブ
滅菌した前記培養槽に正味培養容積が約２００mlになる
ように培養液を送入し、これにＢＨＫ１２ＤＡ１Ａと２
９３の融合株クローン４を１×１０6 個／mlとなるよう
に播種した。
【００６１】培養槽気層には酸素ガスが（溶存酸素が３
ｐｐｍとなるように）吹込みノズルを通して自動的にコ
ントロールされて送入された。培養槽中の培養液は３７
℃に保持された。培養槽中にはマリン型攪拌翼が取付け
られており、攪拌速度は４０ｒｐｍであった。
ｐｐｍとなるように）吹込みノズルを通して自動的にコ
ントロールされて送入された。培養槽中の培養液は３７
℃に保持された。培養槽中にはマリン型攪拌翼が取付け
られており、攪拌速度は４０ｒｐｍであった。
【００６２】播種後１日間は回分培養を行ない、この後
パーヒュージョンを開始した。
パーヒュージョンを開始した。
【００６３】融合株クローン４のサスペンジョン培養結
果を（表８）に示す。
果を（表８）に示す。
【００６４】
【表８】
【００６５】
【比較例４】ＢＨＫ１２ＤＡ１Ａ１株を用いた以外は実
施例４と同様にＢＨＫＡ１Ａ１株のサスペンジョン培養
を行なった。
施例４と同様にＢＨＫＡ１Ａ１株のサスペンジョン培養
を行なった。
【００６６】ＢＨＫＡ１Ａ１株のサスペンジョン培養結
果を（表９）に示す。
果を（表９）に示す。
【００６７】
【表９】
図１は実施例４で使用し培養システムを示す。
１ 酸素 ２ 新鮮培地 ３ 溶存酸素電極 ４ 多孔性テフロンチューブ ５ 使用済培地
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 5/10 C12N 15/02 C12P 21/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (3)
- 【請求項１】低凝集性動物細胞Ｃ１およびγ−カルボキ
シル化活性を有する動物細胞Ｃ２のどちらか一方に、分
子内にＧｌａドメインを有するタンパク質をコードする
遺伝子を導入して得られた形質転換体ともう一方の動物
細胞とを細胞融合し、Ｇｌａドメインがカルボキシル化
したタンパク質を効率的に生産する細胞を選択する動物
細胞の育種方法。 - 【請求項２】低凝集性動物細胞Ｃ１およびγ−カルボキ
シル化活性を有する動物細胞Ｃ２とを細胞融合して得ら
れた融合細胞に、分子内にＧｌａドメインを有するタン
パク質をコードする遺伝子を導入し、Ｇｌａドメインが
カルボキシル化したタンパク質を効率的に生産する細胞
を選択する動物細胞の育種方法。 - 【請求項３】低凝集性動物細胞Ｃ１およびγ−カルボキ
シル化活性を有する動物細胞Ｃ２のどちらか一方に、分
子内にＧｌａドメインを有するタンパク質をコードする
遺伝子を導入して得られた形質転換体ともう一方の動物
細胞とを細胞融合し、Ｇｌａドメインがカルボキシル化
したタンパク質を効率的に生産する細胞を選択すること
により得られるＧｌａ化率５０％以上の動物細胞。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2410166A JP2960552B2 (ja) | 1990-12-13 | 1990-12-13 | 動物細胞の育種方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2410166A JP2960552B2 (ja) | 1990-12-13 | 1990-12-13 | 動物細胞の育種方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04210590A JPH04210590A (ja) | 1992-07-31 |
| JP2960552B2 true JP2960552B2 (ja) | 1999-10-06 |
Family
ID=18519364
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2410166A Expired - Fee Related JP2960552B2 (ja) | 1990-12-13 | 1990-12-13 | 動物細胞の育種方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2960552B2 (ja) |
-
1990
- 1990-12-13 JP JP2410166A patent/JP2960552B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８（１９９０．Ｊｕｌ．）ｐ．６５５−６６１ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04210590A (ja) | 1992-07-31 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |