SI20693A

SI20693A - Humana hibridna gostiteljska celica za ekspresijo sesalskih genov

Info

Publication number: SI20693A
Application number: SI9920096A
Authority: SI
Inventors: Cho
Original assignee: Bayer Corporation
Priority date: 1998-12-10
Filing date: 1999-12-08
Publication date: 2002-04-30
Also published as: RU2228355C2; CZ302677B6; SK287888B6; AU757188B2; AU1938300A; SI20693B; JP5826311B2; BR9916095A; UA77642C2; RO121563B1; DK1137768T3; DE69927707D1; CA2353698A1; DE69927707T2; CU23238A1; EP1137768A1; EP1137768B1; WO2000034462A1; JP2002531125A; HU229775B1

Abstract

Humane/humane hibridne celice so bile narejene s fuzijo humanih embrionalnih ledvičnih celic (293S) in modificiranih celic Burkittovega limfoma (2B8). Fuzijske celice so uporabne kot gostiteljske celice za rekombinantno ekspresijo sesalskih genov. Prednosti uporabe teh hibridnih klonov humanih ledvičnih in B-celic, imenovanih HKB, za ekspresijo sesalskih genov vključujejo: (i) celice so negativne za imunoglobulinsko ekspresijo, (ii) celice zlahka rastejo v plazemskem mediju brez proteina (z dodatkom rekombinantnega inzulina ali brez njega) kot suspenzijskih kulturah v stresalni steklenici ali v fermentorju, (iii) celice so zelo občutljive za transfekcijo DNA in (iv) celice izločajo visoke nivoje heterolognih rekombinantnih proteinov, kot npr. rekombinantna monoklonska protitelesa, topne ICAM-1, rIL-4 in rFVIII.ŕ

Description

BAYER CORPORATION

Humana hibridna gostiteljska celica za ekspresijo sesalskih genov

Sorodne prijave: Prijava od Choja in Chana, označena MSB-7254 (US ser. št. 09/209,915), Vektorji s terminalno ponovljajočo se sekvenco Epstein-Barrovega virusa in prijava od Choja et al., označena MSB-7255 (US ser. št. 09/209,916), Ekspresijski sistem za faktor Vlil vsebujeta sorodne predmete. Obe prijavi sta bili vloženi 10. decembra 1998.

Predloženi izum se na splošno nanša na genetsko konstruirane sesalske celične linije za produkcijo biološko aktivnega proteina. Bolj podrobno se predloženi izum nanaša na humane hibridne celične klone, izvedene pri fuzijskem postopku humanih embrionalnih ledvičnih (293S) celic in celic Burkittovega limfoma. Te humane hibridne celice se lahko uporabijo za produkcijo heterolognih proteinov.

Do danes je bila večina terapevtskih rekombinantnih proteinov producirana iz nehumanih sesalskih celic. Nekateri primeri:

Kitajskega hrčka ovarijske (CHO) (dhff-) celice (Urlaub et al., 1980, Proč Natl Acad Sci USA 77: 4216-4220) s pomnožljivo selekcijsko označevalno dihidrofolatno reduktazo (Kaufman et al., 1982, Mol. Biol. 159: 601-621; Gasser et al., 1982, Proč Natl Acad Sci USA 79: 6522-6526) so bile uporabljene za produkcijo terapevtskega rekombinantnega proteina.

Znani so številni rekombinantni terapevtski proteini, ki so bili producirani v sesalskih celicah, npr. rekombinantni faktor VIII (rFVIII) (Kaufman et al., 1988, J Biol Chem 263: 6352-6362), tkivni plazminogeni aktivator (tPA) (US-patent 4,766,075 od Goeddela et al., 1988), eritropoietin (EPO) (US-patent 4,703,008 od Lina, 1987) in monoklonska protitelesa (mAb) (US-patent 4,816,397 od Bossa et al., 1989).

Hrčkovih mladičev ledvične (BHK) celice (BHK21) so uporabili za produkcijo rFVIII po G418 selekciji in metotreksatnem (ΜΤΧ) pomnoževanju celic, odpornih proti G418 (US-patent 4,965,199 od Capona et al., 1990).

Mišje mielomske (NSO) celice so uporabili za produkcijo konstruiranega humanega anti-TNF protitelesa (EHAT). (US-patent 4,816,397 od Bossa et al., 1989). Vendar pa te celične linije producirajo proteine z ogljikovimi hidratnimi vzorci, specifičnimi za miši, ki niso ugodni za humano uporabo.

Humano celično linijo Namalwa (izvora Burkittovega limfoma) so uporabili za produkcijo alfa-interferona v Wellcome Research Laboratory in za produkcijo prourokinaze (Satoh et al., 1996, Cytotechnology 18: 167-185, 1996), tkivnega plazminogenega aktivatoija (t-PA) (Khan et al., 1995, Biochem Soc Trans 23: S99), granulocitno makrofagno kolonijo stimulirajočega faktoija (Okamoto et al., 1991, Arch Biochem Biophys 286: 562-568) interferonov in limfotoksina (Hosoi et al., 1991, Cytotechnology 5: 17-34) ter granulocitno kolonijo stimulirajočega faktoija (Hosoi et al., 1991, Cytotechnology 7: 25-32) v Tokyo Research Laboratories. Vendar pa so te celice zelo težavne za transfekcijo z DNA.

Walls et al. (1989, Gene 81: 139-149) navajajo uporabo dhfr/ΜΤΧ sopomnoževalne strategije za ekspresijo funkcionalnega proteina C v humanih embrionalnih ledvičnih celicah (293S celice). Za 293 celice (Stillman et al., 1985, Mol. Celi. Biol. 5: 20512060) je znano, da tvorijo velike agregate v suspenziji, posebno pri visokih koncentracijah kalcija (>100 μΜ), kar pospešuje večjo agregacijo in nižjo celično viabilnost (Peshwa et al., 1993, Biotech in Bioeng 41: 179-187). Vse navedene reference so tukaj vključene z referenco.

Sedaj smo izdelali klone hibridiziranih humanih celic, ki se enostavno transfektirajo z elektroporacijo ali kationskim liposomom in so zlahka prilagojeni za rast v suspenzijski kulturi. Heterologni proteini so lahko izrazijo pri uporabi nizkih nivojev (50-100 ηΜ) ΜΤΧ-pomnoževanja v humanem celičnem okolju. Poleg tega so celice zlahka prilagojene za rast v mediju brez seruma.

Te celice so produkt fuzije med humanimi embronialnimi ledvičnimi (293S) celicami in celicami Burkittovega limfoma. Povzetek je prikazan na Fig. 1. Ti hibridni kloni, imenovani HKB, so pristan za defektivni EBV-genom, izveden iz HH514-16, ki je celična linija, ki izvira iz celic Burkittovega limfoma, P3HR1 (Hinuma et al., 1967, J Virol 1: 1045-1051). P3HR1 celice so pristan za ne-imortalizirajoče EBV. HH514-16 je klon P3HR1 (Hinuma et al., 1967, J Virol 1: 1045-1051), ki je pristan za neimortalizirajoče EBV. HH514-16 je izgubil het-DNA, latenco-prekinjajočo DNA, med klonimim postopkom (Rabson et al., 1983, Proč natl Acad Sci USA 87: 3660-3664). Zato je EBV klonov HKB ne-imortalizirajoči virus in ostane kot latenca.

HKB so humane hibridne gostiteljske celice, prikladne za rekombinantno produkcijo terapevtskih proteinov. Te gostiteljske celice dobimo s hibridizacijo različnih parentalnih celičnih linij, pri čemer ima vsaka drugačne ugodne lastnosti. Gostiteljske celice, ki imajo ugodne lastnosti vsake od parentalnih celičnih linij, dobimo iz celic, ki so rezultat hibridizacije.

Gostiteljske celice lahko genetsko konstruiramo, da izrazijo visoke nivoje širokega področja proteinov. Proteini, kijih lahko proizvedemo s konstruiranimi gostitelj skimi celicami, vključujejo, vendar neomejujoče, topni ICAM-1, rekombinantni interlevkin4 (IL-4), tPA, EPO, rFVIII in BDD-FVIII (variante faktoija VIII z izpuščeno domeno B) in derivate teh proteinov. Faktor VIII ima organizacijo domene A1-A2-B-A3-C1C2 in je sintetiziran kot enoverižni polipeptid z 2351 aminokislinami, od katerih se odcepi 19-aminokislinski signalni peptid po translokaciji v lumen endoplazemskega retikuluma. Ker se faktor VIII težko glikozilira, je težko doseči ekspresijo z visokim nivojem (>0,2 pg/c/d) faktoija VIII (Lind et al., 1995, Eur J Biochem. 232: 19-27; Kaufman et al., 1989, Mol Celi Biol. 9: 1233-1242). Ekspresija faktoija VIII v sesalskih celicah je značilno 2-3 rede velikosti nižja kot tista, ki jo opazimo z drugimi geni pri uporabi podobnih vektorjev in načinov. Produktivnost pri produkciji celičnih linij za faktor Vilije v območju 0,5-1 E/c/d (0,1-0,2 pg/c/d).

Izkazalo seje, daje B-domena faktorja VIII nebistvena za prokoagulantno aktivnost. Izboljšano ekspresijo faktoija VIII v sesalskih celicah z uporabo skrajšanih variant faktorja VIII navajajo številne skupine (Lind et al., 1995, Eur J Biochem 232: 19-27; Tajima et al., 1990, Proč 6. Int Symp H.T. str. 51-63; US-patent 5,661,008 od Almstedta, 1997). Vendar pa ekspresijski nivo variant faktoija VIII ostane pod 1 pg/c/d iz stabilnega celičnega klona. Ugotovili so tudi, da čeprav endogeni imunoglobulin (Ig) ni bil izražen, je bila ekspresija rekombinantnega Ig iz konstruiranih gostiteljskih celic visoka. Proteini, proizvedeni iz HKB11 celic, imajo glikozilacijski profil, specifičen za človeka. Zato so kloni optimalne gostiteljske celice za produkcijo gensko konstruiranega Ig in drugih proteinov.

Kot uporabljamo tukaj, je celica izvora Burkittovega limfoma tista celica, ki je celica Burkittovega limfoma, izvedena iz celice Burkittovega limfoma, izvedene iz druge celice izvora Burkittovega limfoma, ali celica, ki je rezultat mitotične delitve katerekoli od zgornjih. Izraz izvedena iz je v tej zvezi namenjen, da vključuje, vendar neomejujoče, normalno mitotično celično delitev in postopke, kot npr. transfekcije, celične fuzije ali drugi genetski inženiring ali tehnike celične biologije, uporabljene za spreminjanje celic ali produkcijo celic z novimi lastnostmi. Podobno je celica humanega embrionalnega ledvičnega izvora tista celica, ki je humana embrionalna ledvična celica, izvedena iz humane embrionalne ledvične celice, izvedene iz druge celice humanega embrionalnega ledvičnega izvora, ali celica, ki je rezultat mitotične delitve katerekoli od zgornjih. Tudi celica izvora 293S je tista celica, ki je 293S celica, izvedena iz 293S celice, izvedene iz druge celice izvora 293S, ali celica, ki je rezultat mitotične delitve katerekoli zgornje. Tudi celica izvora 2B8 je tista celica, ki je 2B8 celica, izvedena iz 2B8 celice, izvedene iz druge celice izvora 2B8 ali celica, ki je rezultat mitotične delitve katerekoli od zgornjih. Heterologni protein je protein, za katerega je bila celica konstruirana, da ga proizvede.

KRATEK OPIS SLIK

Fig. 1 prikazuje povzetek izvedbe HKB celic.

Fig. 2 prikazuje fizikalne mape ekspresijskih vektorjev, navedenih v tekstu. Vsi plazmidi so bili konstruirani na osnovi pBR322 ogrodja in vsebujejo dhfr ekspresijsko enoto. Vsi geni, ki kodirajo proteine, ki nas zanimajo, so na osnovi regulacije CMV pospeševalca/promotorja (CMVe/p); 5'intron (MIS ali CIS) je bil nameščen na 5' koncu genov, razen BZLF1. Poli A signalna regija je bila označena kot pA. Oba plazmida pSH157 in pCIS25DTR vsebujeta sekvenco EBV-TR (402 bp).

Fig. 3 prikazuje primerjavo gostiteljskih celičnih linij za gensko ekspresijo v prehodnem transfekcijskem preskusu. Transfekcije smo izvedli pri enakih razmerah: enako število celic 293S, 2B8 in HKB 11 smo transfektirali z enako količino plazmidnih DNA z uporabo istega transfekcijskega sredstva. Tkivne kulturne tekočine smo zbrali 2 dni po transfekciji. Nivoje proteinske produkcije smo ugotovili s preskusom ELISA (IgG in ICAM-1; izmerjeno kot ng proteina/10⁶ celic/2 dni) in z preskusnim kompletom Coatest® (rFVIII; izmerjeno kot milienote/10⁷ celic/2 dni).

Materiali in postopki

HH514-16 smo dobili pri dr. Georgu Millerju (Yale University). 293S celice smo dobili pri dr. Bradu Zerlerju (Molecular Therapeutic Institute, West Heaven, CT), 293 S celice so 293 celice (deponirane pri American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA 20110-2209, ZDA, februarja 1980 pod depozitno št. CRL-1573 ), ki so bile prilagojene za rast v suspenzijski kulturi (Stillman et al., 1985, Mol Celi Biol 5: 2051-2060).

Plazmidi

Vsi ekspresijski vektorji, uporabljeni v tem poročilu, so bili v osnovi plazmidi na osnovi pBR322 s funkcijo dhfr genskega ekspresijskega segmenta. Fizikalne mape ekspresijskih vektorjev so opisane na Fig. 2. Plazmida pSH157 in pCIS25DTR imata tudi terminalno ponavljajočo se sekvenco Epstein-Barrovega virusa (EBV-TR). Glej patentno prijavo od Choja in Chana, označeno MSB-7254, Terminalna ponavljajoča se sekvenca Epstein-Barrovega virusa poveča razmerje selekcije zdravila, za EBVTR sekvenco. Vektor pSH131, ki je bil deponiran pri American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA 20110-2209, ZDA, 16. septembra 1998 pod depozitno št. 98879, se lahko uporabi za produkcijo ekspresijskih vektorjev za izbrani protein, kot opisujeta Cho in Chan (MSB-7254, zgoraj).

ELISA

Za meritev tICAM-1 sekrecije smo absorbirali monoklonsko protitelo za ICAM-1, C92,5 (McClelland et al, 1991, Proč Natl Acad Sci USA 88: 7993-7997) na mikrotitrske plošče z okroglim dnom. Plošče smo blokirali z obdelavo z raztopino fiziološke raztopine soli s fosfatnim pufrom (PBS), ki je vsebovala 1 % govejega serumskega albumina (BSA), nato pa inkubirali z vzorci, vsebujočimi tICAM-1. Plošče smo nato sprali z izpiralnim pufrom (PBS in 0,005 % Tweena 20) in inkubirali z biotiniliranim C78,5, drugo monoklonsko protitelo za drugačen epitop na tICAM-1 (McClelland et al, 1991, zgoraj). Po izpiranju smo plošče inkubirali s HRPstreptavidinom. Plošče smo nato sprali z izpiralnim pufrom, izpostavili reakciji s tetrametil benzidinom (TMB) in reakcijo ustavili z 1 N HC1. Koncentracijo tICAM-1 smo ugotovili z odčitavanjem OD pri 450/570 nm in s primerjavo s standardno krivuljo za očiščeni tICAM-1.

Za merjenje imunoglobulinske (Ig) sekrecije smo uporabili anti-Ig protitelo za premazanje plošče, biotinilirano anti-Ig protitelo pa smo uporabili kot detekcij sko protitelo. Znano koncentracijo Ig molekule smo uporabili kot standard. Sicer pa je bil postopek enak.

Za merjenje sekrecije interlevkina-4 (IL-4) smo uporabili anti-IL-4 protitelo za premazanje plošče, biotinilirano anti-IL-4 protitelo pa smo uporabili kot detekcij sko protitelo. Očiščeno molekulo IL-4 smo uporabili kot standard.

Preskus za merjenje rFVHI sekrecije rFVIII molekulo smo kvantitativno določili z reagenti od Coatest VIII:C/4 komplet (Chromogenix, Molndal, Švedska). US-standardni anti-hemofilni faktor (faktor VIII), znan kot MEGA 1 (Office of Biologics Research and Review, Bethesda, MD), smo uporabili kot standard meritve za EIA/RIA A/2 ploščice (Corning, Corning, NY), predhodno segrete na 37 °C na izbranih toplotnih blokih (VWR Scientific, San Francisco, CA). Faktor IXa, faktor X, fosfolipid in CaCl₂ smo dodali vsakemu vzorcu in le-te inkubirali 10 minut za aktivacijo faktoma X. Nato smo dodali kromogeni substrat (S2222) in inkubirali 10 minut za sprostitev kromogenske skupine pNA. To reakcijo smo ustavili z dodatkom 50 % ocetne kisline. Nato smo izmerili kolorimetrično absorbanco pri 405/450 nm na spektrofotometrskem mikroploščnem čitalniku SPECTRAmax^@ 250 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) in podatke izračunali s programsko opremo SOFTmax PRO od Molecular Devices.

Izvedba celične linije Burkittovega iimfoma, občutljive za HAT in odporne proti G418

Za pridobitev celic, občutljivih za HAT, smo izdelali celične linije s pomanjkanjem hipoksantin gvanin fosforibozil transferaze (HGPRT) (Szybalska et al., Proč. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026-2034, 1962; Littlefield, Proč. Natl. Acad. Sci. USA 50: 568576, 1963) po standardnem protokolu, ki ga opisujejo: Siadak et al. (US-patent 4,834,975, 1989).

HH514-16 celice (dobljene pri dr. G. Milleiju, Yale University), ki so brez EBV hetDNA (Rabson et al., 1983, Proč Natl Acad Sci USA 87: 3660-3664), smo obdelovali s 300 pg/ml etil estra metansulfonske kisline (MSE) (Sigma, St. Louis, MO) v suspenzijskem mediju RPMI-1640 (Life Science, Gaithersburg, MD), dopolnjenem s 15 % fetalnega govejega seruma (FBS) (Hyclone, Logan, UT) 24 ur. Po izpiranju celic z medijem, smo le-te nanesli v mediju, vsebujočem 6-tiogvanin (6TG) (Sigma) (5 pg/ml) na plošče, za izbiro HGPRT-negativnih celic. Koncentracijo 6TG smo povečali od 5 pg/ml na 30 pg/ml v šestmesečni selekcijski periodi. Celice smo nato preskusili za njihovo občutljivost na medij, vsebujoč HAT. Enocelične klone (SCC) smo dobili pri omejujočem razredčevalnem kloniranju (ena celica na vdolbino na ploščah s 96 vdolbinami) HAT-senzitivne populacije A5. Enega od SCC, A5/1D7, smo transfektirali s pSV2neo, ki ima neo gen pod SV40 promotorjem v pBR vektorju, da smo dobili celice, odporne proti G418. Enega od SCC, odpornih proti G418 (1,5 mg/ml), imenovanega 2B8 (deponirano pri American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA 20110-2209, ZDA, 16. septembra 1998 pod depozitno št. CRL-12569) smo uporabili za fuzijo.

PRIMER 1

Celična fuzija in izvedba posameznih celičnih klonov

Celično fuzijo smo primarno izvedli v skladu z polietilenglikolnim (PEG) fuzijskim postopkom, ki ga opisuje Kennett (1979, Meth Enzymol 58: 5-359). Pet milijonov vsakih 293S in 2B8 celic v logaritmični rasti smo sprali s PBS brez Ca⁺⁺ in Mg⁺⁺ (Life Technologies, Rockville, MD) in zasejali v eno vdolbino plošče s 6 vdolbinami, predhodno obdelane z arašidnim aglutininom (Sigma) (5 pg/ml). Plošče s 6 vdolbinami z nanesenimi celicami smo centrifugirali pri 400 g 6 minut v Beckmanovi J-6M/E centrifugi (Beckman, Palo Alfo, CA). Po odstranitvi PBS iz vdolbine smo celice obdelalovali z 2 ml 40 % (w/v) PEG (Sigma) eno minuto. Za kontrolo ene vdolbine nismo obdelali s PEG. Celice smo sprali 3-krat s 5 ml PBS, vsebujočim 5 % DMSO, nato pa 3-krat s PBS. Celice smo inkubirali s svežim medijem, dopolnjenim s 15 % FBS 25 minut. Celice smo zasejali na plošče s 96 vdolbinami (1,2 x 10⁶ celic na ploščo) z uporabo svežega medija, vsebujočega G418 (1 mg/ml) in HAT (Life Technology), dopolnjenega s 15 % FBS. Celice smo nahranili dvakrat na teden s selekcijskim medijem. Pri tem Primeru za začetno selekcijo so imele celice 293S želeno lastnost pomanjkanja občutljivosti za medij, vsebujoč HAT, podobno pa so imele celice 2B8 želeno lastnost, da so bile odporne proti G418.

Medtem ko so fuzionirane celice rastle v selektivnih razmerah, pa mešane celice niso rastle v enakih razmerah. Tri tedne po selekciji smo začetne populacije prenesli za večje formate. Da bi dobili SCC, smo 20 stabilno rastočih začetnih populacij zmešali in izpostavili omejujočemu razredčevalnemu kloniranju (ena celica na vdolbino) z uporabo selektivnega medija. 19 SCC smo izbrali izmed 15 plošč s 96 vdolbinami po previdnem opazovanju individualnih klonov z mikroskopom. SCC, izvedene pri fuzijskem eksperimentu, smo imenovali HKB celice (hibridne celice humanih ledvičnih in B-celic). Sedem SCC smo izbrali pri transfekcijskem študiju. Teh sedem SCC smo nadalje preskusili za stabilno produkcijo različnih proteinov. Enega od sedmih SCC, HKB 11 (deponirano pri American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA 20110-2209, ZDA, 16. septembra 1998 pod depozitno št. CRL-12568) smo izbrali kot prednostnega sesalskega celičnega gostitelja za produkcijo heterolognih proteinov. Povzetek je prikazan na Fig. 1.

PRIMER 2

Karakterizacija HKB klonov

Čeprav smo vse hibridne celice izbrali v selektivnih razmerah, pa smo hibridni status potrdili s štetjem kromosomskih števil v celicah. Vsi HKB so imeli modalno kromosomsko število 90-110. Ta števila so bila podobna vsoti modalnih kromosomskih števil za 293S in 2B8 (64 oz. 47, po podatkih ATCC). 293S (Stillman et al., 1985, Mol Celi Biol 5: 2051-2060) je suspenzijsko prilagojena 293 (deponirano pri ATCC, Manassas, VA 20110-2209, ZDA, februarja 1980 pod depozitno št. CRL1573).

Vse hibridne celične klone smo preskusili za endogeno Ig (mu in kapa) ekspresijo z direktnim imunofluorescenčnim preskusom z uporabo celic, fiksiranih z metanolom, za določitev, kateri celični kloni izločajo endogeni Ig. V ponovljenih eksperimentih čez daljšo periodo smo za te celice opazili, da so negativne za ekspresijo mu in kapa verig na osnovi imuno fluorescenčnega preskusa (tabela 1) in preskusa ELISA (podatki niso prikazani).

-1010

Tabela 1. Detekcija Ig-genske ekspresije

celice	genska ekspresija
težka veriga (mu)	lahka veriga (kapa)
293S	negativno	negativno
2B8	pozitivno	pozitivno
HKB	negativno	negativno

Tabela 1 prikazuje rezultate, ki smo jih dobili pri imunofluorescenčnem preskusu treh tipov celic. Celice smo resuspendirali v PBS in prenesli kot madež na objektno steklo. Po sušenju celic smo objektna stekla fiskirali v hladnem (-20 °C) metanolu 5 minut. Celice smo barvali s FITC-anti humanimi kapa in anti-humanimi mu verigami (1:20 razredčitev) (Zymed Laboratories, Inc. So. San Francisco, CA) v ovlaženi komori pri 37 °C 45 minut. Po spiranju objektnih stekel s PBS 10 minut smo le-ta opremili s pokrivnim steklom pri uporabi PBS/glicerola (1:1). Celice smo opazovali v fluorescenčnem mikroskopu (Carl Zeiss, Inc., Thomwood, NY).

Humani specifični vzorec vezave sialinske kisline, alfa(2-6) sialiltransferaze smo potrdili s FACS-analizo HKB celic in z uporabo Sambucus nigra lektina, konjugiranega s FITC (SNA) (Sigma, St. Louis, MO). Protein, izločen iz HKB celic (klon 1G2, deponiran pri American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA 20110-2209, ZDA, 19. maja 1999 pod depozitno št. PTA-87), je kazal alfa(2-3) in alfa(2-6) vezavo sialinske kisline za glikozilacijski profil, analiziran z oligosaharidno metodo prstnega odtisa (fingerprint) (podatki niso prikazani). To opaženje označuje, da HKB celice, izvedene s fuzijo 293S in 2B8 celic, vzdržujejo humane specifične glikozilacijske encime.

Da bi preskusili, ali imajo te hibridne celice zmogljivost, da izrazijo tuje gene, smo celice transfektirali z ekspresij skimi vektorji za ICAM-1 in IgG (anti-TNF protitelo). Za preskus izločanja IgG smo celice HKB (5 χ 10⁶ celic) transfektirali z elektroporacijo z 10 pg plazmidne DNA, ki zagotovlja funkcionalno ekspresijo težkih (gama) in lahkih (kapa) verig. Za preskus sekrecijskih nivojev topnih ICAM-1 smo celice HKB (5 χ 10⁶ celic) transfektirali z elektroporacijo z 10 pg plazmidne DNA, ki

-1111 zagotavlja funkcionalno ekspresijo topnega ICAM-1. Sekrecijske nivoje smo določili s preskusom ELISA za IgG ali ICAM-1. Vseh 19 SCC je izločilo relativno visoke nivoje ICAM-1 (100-500 ng/ml/2d) in IgG (30-200 ng/ml/2d) pri prehodnem transfekcijskem preskusu (tabela 2). Iz teh podatkov je razvidno, da hibridne celice podpirajo ekspresijo transfektiranih Ig genov, čeprav je bila ekspresija endogenega Ig gena uničena.

Epstein Barr virus (EBV) obstaja kot episomi v 2B8 celicah. Vsi SCC so bili pozitivni za EBNA-1 ekspresijo (podatki niso prikazani), kar označuje, da so pozitivni za EBV.

-1212

Tabela 2. Prehodni transfekcijski preskusi za sekrecijo IgG in topnega ICAM iz HKB klonov, ki jih dobimo zgodaj po klonimem postopku. Vrednosti so sekrecijski nivoji proteina (ng/ml/2d).

HKB klon	IgG	topni ICAM-1
1	-150	-500
2	-30	-30
3	-20	-50
4	-80	-200
5	-100	-500
6	-50	-300
7	-40	-200
8	-30	nd
9	-80	nd
10	-80	-100
11	-200	nd
12	-100	nd
13	-80	-150
14	-80	nd
15	-30	-200
16	-80	-200
17	-160	-500
18	-80	-200
19	-80	-100

nd = ni narejeno

Vendar pa ni bilo znano, ali celotni EBV genom še vedno obstaja v hibridnih celicah. Zato smo status EBV genoma v hibridnih celicah preskusili s transfekcijo celic z EBV genomskim fragmentom BZLF1, latenco prekinjajočim trans-aktivirajočim genom. HKB celice (5-10⁶ celic) smo transfektirali z 10 pg plazmidne DNA (pSH121), ki

-1313 dopušča funkcionalno ekspresijo BZLF1. Detekcijo EBV kapsidnega antigena (EBVVCA) smo izvedli z indirektno imunofluorescenco z uporabo humanega seruma, vsebujočega anti-EBV-VCA titer in anti-humani IgG, konjugiran s FITC. Tehnične podrobnosti za imuno fluorescenčni preskus so opisane zgoraj. Kot je prikazano v tabeli 3, so bile navidezno transfektirane celice negativne za ekspresijo EBV kapsidnega antigena (EBV-VCA), kar označuje, da so bile negativne za EBV replikacijo. Vendar pa je bil majhen odstotek transfektiranih celic pozitiven za antigensko ekspresijo. Ti podatki označujejo, da so hibridne celice pristan za EBV genom v njegovi latentni obliki.

Tabela 3. Indukcija EBV replikacije s transfekcijo z BZLF1

	ekspresija virusnega kapsidnega antigena (%)
HKB klon	navidezna transfekcija	BZLF1
HKB1	negativno	0,20 %
HKB5	negativno	1-2%
HKB 7	negativno	0,20 %
HKB11	negativno	0,20 %
HKB13	negativno	0,50 %
HKB17	negativno	0,20 %
HKB19	negativno	1-2%

Hibridne celice smo prilagodili za medij brez seruma s serijsko dvakratno redukcijo FBS v stresalnih steklenicah. Po dveh tednih so celice rastle v mediju brez FBS. Celice so rastle kot majhni agregati v stresalnih steklenicah. V nasprotju z 293 S celicami, so bile hibridne celice zlahka prilagodljive za suspenzijske kulture brez seruma. Hibridne celice v mediju brez seruma in mediju brez albumina, dopolnjenem s transferinom in inzulinom, bi lahko vzdrževali več kot eno leto v suspenzijski kulturi z uporabo stresalnih steklenic.

-1414

Za primerjavo sekrecijskih nivojev transfektiranih genskih produktov smo enega od klonov HKB11 in parentalne celice 293S in 2B8 transfektirali s pSM98 (topni ICAM1), pSH125 (anti-TNF IgG) in pCISF8 (rFVIII). Kot je prikazano na Fig. 3, so bili sekrecijski nivoji za ICAM-1 in IgG mnogo višji (pribl. 10-krat) v HKB11 celicah kot 293S celicah. Sekrecijski nivoji obeh proteinov iz 2B8 so bili nedetektibilni. Sekrecijski nivoji RFVIII v HKB11 celicah so bili podobni tistim za 293S celice. Ti podatki označujejo, daje transfekcijska učinkovitost HKB11 celic mnogo boljša kot parentalnih celic.

PRIMER 3

Izvedba stabilnih HKB klonov, ki izločajo heteroiogne proteine

Hibridne klone smo preskusili za stabilno ekspresijo proteinov v genskem pomnožljivem sistemu (dhff/ΜΤΧ). Celice smo najprej transfektirali z ustreznim ekspresijskim vektoijem, nato pa smo transfektirane celice (navadno 10⁶ celic na ploščo s 96 vdolbinami) zasejali in selekcionirali/pomnožili s selekcijskim medijem, ki nima hipoksantina in timidina, vendar je dopolnjen z FBS in ΜΤΧ (50 nM). Po prvem pregledovanju plošč smo izbrali celice iz visoko izločujočih vdolbin in jih prenesli na plošče s 6 vdolbinami. Celice na ploščah s 6 vdolbinami smo nadalje pomnožili z naraščajočimi koncentracijami ΜΤΧ (100, 200 in 400 nM) v mediju. Začetne populacije plošč s 6 vdolbinami smo nadalje pregledali za izvedbo najboljše populacije. Te populacije smo uporabili za kloniranje klonov, izvedenih iz posamezne celice. Kot je prikazano v tabeli 4, so bile HKB 11 celice optimalne za produkcijo visokih nivojev heterolognih humanih proteinov. Za produkcijo ICAM-1, Ig in IL-4 derivata so bile HKB 11 celice prav tako dobre kot CHO celice (podatki niso prikazani). Vendar pa so HKB kloni rastli hitreje kot CHO kloni in bi jih lahko laže prilagodili za suspenzijsko kulturo in razmere brez seruma. V primeru proizvajanja BDD-FVIII so HKB 11 kloni kazali približno 10-krat večjo produktivnost kot CHO

-1515 kloni. Gornji rezultati označujejo, da so HKB11 celice optimalni humani celični gostitelj, uporaben za ekspresijo humanih terapevtskih proteinov.

Tabela 4. Produkcija heterolognih proteinov iz HKB klonov

protein	celični gostitelj	ΜΤΧ pomnoževanje	specifična produktivnost
ICAM-1	HKB11	100 nM	10 pg/c/d’³
Ig	HKB13	50 nM	12 pg/c/d
BDD-FVIII	HKB 11	400 nM	5-10 μΕ/c/d^{2 3}
IL-4SA	HKB11	100 nM	5 pg/c/d²³

1) ICAM-1 produkcijski nivo iz HKB klonov je bil podoben tistemu iz 293S celic. HKB klon, izločujoč ICAM-1, je bil zlahka prilagodljiv za suspenzijsko kulturo, medtem ko so bili 293S kloni zelo težko prilagodljivi za suspenzijsko kulturo.

2) Sekrecijski nivo BDD-FVIII sekrecije je bil približno 10-krat višji od tistega iz klonov, izvedenih iz CHO celic, transfektiranih z istim ekspresijskim vektorjem.

3) gramska količina produkcije IL-4SA (T13D/R121E) je bila možna 6 mesecev po transfekciji z uporabo HKB 11, medtem ko je bilo pri uporabi CHO celic potrebno nekaj več mesecev pri simultanih eksperimentih z uporabo istega ekspresij skega vektoija in podobnega postopka.

Celične linije, izvedene pri gornjem postopku, vključujejo: (i) topni ICAM-1 izločujoče klone (10 pg/celico/dan), izvedene iz HKB 11 celic, transfektiranih s pSM98 po pomnoževanju v 100 nM ΜΤΧ, (ii) monoklonsko protitelo (anti-TNF) izločujoče enocelične klone (12 pg/celico/dan), izvedene iz HKB 13, transfektiranih s pSS125 po pomnoževanju v 50 nM ΜΤΧ in omejujočem razredčevalnem kloniranju brez ΜΤΧ, (iii) skrajšani rFVIII (BDD-FVIII) izločujoče enocelične klone (5-10 μΕ/c/d, v razmerah brez seruma), izvedene iz HKB 11 celic, transfektiranih s pCIS25DTR po pomnoževanju (400 nM ΜΤΧ) in omejujočem razredčevalnem kloniranju brez ΜΤΧ in (iv) IL-4 derivat (IL-4 selektivni agonist, IL-4SA; mutirana dva položaja aminokisline, T13D in R121E) izločujoče klone (5 pg/c/d), izvedene iz

-1616

ΗΚΒ11, transfektiranih s pSH157 po ΜΤΧ pomnoževanju. HKB klon, izločujoč IL4SA, 1G2 smo uporabili za relativno hitro produkcijo majhnih količin proteina (gramska količina). Fizična mapa ekspresijskih vektoijev, navedenih zgoraj, je prikazana na Fig. 2.

RAZLAGA

Hibridne humane celične linije, opisane tukaj, prikazujejo želene lastnosti, ki jih imajo od njihovih parentalnih celičnih linij. HKB celične linije, producirane s fuzijo humanih embrionalnih ledvičnih celic (ali celic, izvedenih iz humanih embrionalnih ledvičnih celic) s celicami Burkittovega limfoma (ali s celicami, izvedenimi iz celic Burkittovega limfoma), so uporabne za razvijanje celičnih linij za ekspresijo heterolognih proteinov.

Začetni namen izdelovanja hibridnih celičnih linij 293S in 2B8 je bil, da bi rešili agregacijski problem 293S celic, ki imajo tendenco, da tvorijo skupke, ko rastejo v suspenzijski kulturi (neželena lastnost). HKB celice, ki so bile razvite pri hibridizacijskem postopku, rastejo kot monoplast, kadar jih kultiviramo v Tsteklenicah. Vendar te celice rastejo kot suspenzijske celice (ne tvorijo velikih agregatov), kadar jih kultiviramo na suspenzijski način. HKB celice so zelo enostavne za ravnanje pri transfekciji, transfekcijska učinkovitost pa je mnogo višja kot pri 293S celicah.

Čeprav ima transformacijski ali hibridizacijski dogodek, potreben v večini primerov za produkcijo stabilne celične linije, lahko za posledico spremenjene glikozilacijske profile (Yamashita, 1989, J Biol Chem 264: 2415-2423), pa smo ugotovili, da ima HKB11, ki je somatična hibridna celična linija, značilne humane glikozilacijske encime, npr. alfa(2-3) in alfa(2-6) sialil transferaze. Poleg tega imajo proteini, proizvedeni iz transfektiranih HKB celic, normalne humane glikozilacijske vzorce vezav alfa(2-3) in alfa(2-6) sialilne kisline.

-1717

HKB so hibridne humane celice, ki imajo želene lastnosti od vsake od parentalnih celičnih linij; in sicer, zlahka rastejo v suspenzijski kulturi brez agregacije (kot smo opazili pri 2B8 celicah) in so prikladne za transfekcijo in želene sekrecijske lastnosti (kot smo opazili pri 293S celicah). Prednostna hibridna humana celična linija HKB 11 je negativna za imunoglobulinsko gensko ekspresijo kot so 293S celice. Ta lastnost je prednostna, v primerih, kjer je želeno, da rekombinantno proizvedemo monoklonska protitelesa iz humanih celic. Odkritje, da ima fuzija humanih celic za posledico celice s prednostnimi lastnostmi, vzpodbuja nadaljnje fuzijske študije z uporabo 293S in drugih celičnih linij B-celičnega izvira, npr. Namalwa in 6F11, da dobimo nove kombinacije lastnosti v hibridnih celicah pri fuzioniranju različnih parentalnih celičnih linij.

Zgornji Primeri so namenjeni za ponazoritev izuma, mišljene pa so tudi variacije, ki jih bodo izvedli strokovnjaki. V skladu s tem je namenjeno, da naj bi bil obseg izuma omejen le s spodnjimi zahtevki.

Claims

PATENTNI ZAHTEVKI

1. Celica, izvedena pri fuziji celice humanega embrionalnega ledvičnega izvora s celico izvora Burkittovega limfoma.
2. Celica po zahtevku 1, označena s tem, da je celica humanega embrionalnega ledvičnega izvora celica izvora 293.
3. Celica po zahtevku 1, označena s tem, da je celica humanega embrionalnega ledvičnega izvora celica izvora 293S.
4. Celica po zahtevku 3, označena s tem, da je celica izvora Burkittovega limfoma izvora celica 2B8 (deponirano pri ATCC, Manassas, VA 20110-2209, ZDA, 16. septembra 1998 pod depozitno št. CRL-12569).
5. Celica po zahtevku 1, označena s tem, da izraža heterologni protein.
6. Celica po zahtevku 5, označena s tem, daje heterologni protein izbran iz skupine, ki jo sestavljajo FVIII, BDD-FVIII, monoklonsko protitelo, anti-TNF protitelo, rIL4, tPA in EPO.
7. Celična linija, označena HKB11 (deponirano pri ATCC, Manassas, VA 201102209, ZDA, 16. septembra 1998 pod depozitno št. CRL-12568).
8. Celična linija, označena s tem, da izraža heterologni protein, pri čemer je celična linija izvedena iz celične linije, označene HKB 11 (deponirano pri ATCC, Manassas, VA 20110-2209, ZDA, 16. septembra 1998 pod depozitno št. CRL-12568).
9. Celična linija po zahtevku 8, označena s tem, daje protein ICAM-1.
10. Celična linija po zahtevku 8, označena s tem, daje protein BDD-FVIII.

-1919
11. Celična linija po zahtevku 8, označena s tem, daje protein monoklonsko protitelo.
12. Celična linija po zahtevku 11, označena s tem, daje monoklonsko protitelo antiTNF.
13. Celična linija po zahtevku 8, označena s tem, daje protein rIL4.
14. Celična linija po zahtevku 8, označena s tem, daje protein FVIII.
15. Celična linija po zahtevku 8, označena s tem, daje protein tPA.
16. Celična linija po zahtevku 8, označena s tem, daje protein EPO.
17. Celična linija po zahtevku 8, označena s tem, daje protein IL-4SA (T13D/R121E) in je navedena celična linija označena 1G2 (deponirano pri ATCC, Manassas, VA 20110-2209, ZDA, 19. maja 1999 pod depozitno št. PTA-87).
18. Celična linija po zahtevku 8, označena s tem, da je protein humani protein s humanim glikozilacijskim profilom.
19. Postopek za produkcijo hibridnih humanih celic, uporabnih za ekspresijo heterolognega proteina, označen s tem, da obsega stopnje:

a) pridobivanje celic humanega embrionalnega ledvičnega izvora, ki imajo prvo želeno lastnost

b) pridobivanje celic izvora humanega Burkittovega limfoma, ki imajo drugo želeno lastnost

c) kontaktiranje celice iz stopnje a) s celicami iz stopnje b) v razmerah, ki dopuščajo, da pride do celične fuzije

d) pregledovanje celic, dobljenih v stopnji c), za celice, ki prikazujejo vsaj eno želeno lastnost vsakih od celic iz stopenj a) in b).

-2020
20. Postopek po zahtevku 19, označen s tem, da so celice humanega embrionalnega ledvičnega izvora celice izvora 293.
21. Postopek po zahtevku 20, označen s tem, da so celice humanega embrionalnega ledvičnega izvora celice izvora 293S.
22. Celica po zahtevku 21, označena s tem, daje celica izvora Burkittovega limfoma celica 2B8 (deponirano pri ATCC, Manassas, VA 20110-2209, ZDA, 16. septembra 1998 pod depozitno št.: CRL-12569).