KR20110116198A - 영구적인 신규 인간 세포주 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아데노바이러스 유전자 산물 E1A 및 E1B에 대한 핵산 서열 및 SV40 라지 T-항원 또는 엡스타인-바 바이러스(EBV) 핵 항원-1(EBNA-1)에 대한 핵산 서열을 포함하는 영구적인 인간 세포주에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 영구적인 인간 세포주에서 재조합 폴리펩티드 또는 단백질의 일과성 발현을 위한 방법에 관한 것이다.

Description

영구적인 신규 인간 세포주{NOVEL PERMANENT HUMAN CELL LINE}

본 발명은 아데노바이러스의 유전자 산물 E1A 및 E1B를 위한 핵산 서열 및 SV40 라지(large) T-항원 또는 엡스타인-바 바이러스(EBV) 핵 항원-1(EBNA-1)을 위한 핵산 서열을 포함하는 영구적인 인간 세포주에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 영구적인 인간 세포주에서 재조합 폴리펩티드 및 단백질의 일과성 발현을 위한 방법에 관한 것이다.

박테리아, 효모 및 식물 세포와 함께, 특히 동물 세포는 재조합 폴리펩티드 또는 단백질의 제조를 위해 사용된다. 오늘날, 모든 치료 단백질 중 약 60-70%는 포유류 세포에서 생성된다(Wurm, Nat. biotechnology 22, 1393-1398, 2004). 치료, 진단 또는 기술적 목적을 위해 세포 배양, 즉 시험관내에서 재조합 폴리펩티드 또는 단백질을 제조하는 것은 일반적으로 서로 다른 두 가지 방법으로 실시될 수 있다. 안정적이고 지속적 또는 영구적으로 수립된 세포주의 경우, 원하는 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 핵산은 하나 이상의 복제물과 함께 세포의 염색체 DNA로 통합되고, 세포 분열시 세포 염색체 조(chromosome set)와 함께 딸세포로 전달된다(이른바, 세포주 생산에서 안정적인 일과성 발현). 이러한 안정적인 세포주를 생산하기 위해 필요한 것은, 트랜스펙션(transfection)에 의해 세포에 주입된 하나 이상의 핵산이 세포 배양에서 성장할 때 선택의 측면에서 유리한 점을 제공하는 유전자 기능을 수행하는 것이다. 이러한 유전자 기능을 갖는 핵산은 원하는 폴리펩티드 또는 단백질에 대한 발현 카세트와 동일한 분자상에 존재할 필요는 없다. 상기 유전자 기능은 항생제 내성 유전자 또는 매질(예를 들어 포유류 세포에서 종종 사용되는 매질; Wurm, Nat. Biotechnology 22, 1393-1398, 2004) 중 화학요법제에 대한 내성 유전자, 유전자 생산이 불충분한 대사 경로를 보충하는(예를 들어 효모 세포에 대해 사용되는 것) 유전자, 또는 형질전환 유전자 기능(인간 양막세포에 대해 설명됨; Schiedner et al., BMC Biotechnology 8, 13, 2008)이다. 이러한 방법으로 트랜스펙션된 핵산을 세포의 염색체 DNA에 안정적으로 통합시키고 상기 유전자를 생성하는 상기 세포는 통합되지 않은 다른 세포들을 과성장시키고 선택될 수 있도록 보장된다. 소위 숙주 세포주에서 트랜스펙션에 의해 세포를 생산할 때, 한편으로는 재조합 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산(소위 이식 유전자)이 필요한 전사 조절 요소와 함께 전달되고, 다른 한편으로는 유전자 생산이 선택의 측면에서 특정 이점을 제공하는 선택적 마커를 인코딩하는 유전자를 갖는 제2의 발현 카세트가 전달된다. 예를 들어, 유전자 전달 이후에 선택적 시약 없이 세포가 배양 배지에서 배양되는 며칠 동안, 적합한 선택적 시약이 상기 배지에 첨가된다. 상기 선택적 시약의 존재하에서, 트랜스펙션에 사용된 핵산을 수용하고 선택적 마커를 발현시키는 세포만 살아남게 되고 성장한다. 통상적으로 사용되는 선택적 마커는 네오마이신 내성 유전자, 히그로마이신 내성 유전자 및 디히드로엽산 환원효소(DHFR)(Wurm, Nat. Biotechnology 22, 1393-1398, 2004; Wurm und Jordan, 309-333 in: Makrides (Hrsg.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003)이다. 이에 따라, 선택은 항생제인 네오마이신 또는 히그로마이신 및 합성 당질코르티코이드인 메토트렉세이트와 같은 선택적 시약과 함께 배양 배지에서 실시된다. 일반적으로, 선택 과정에서 살아남아 증식된 선택적 마커 및 이식 유전자를 갖는 세포(소위 형질전환주)는 개체화(클론)되어, 배지의 모든 세포들이 유전적으로 동일하도록 보장하고, 최고의 생산율을 갖는 원하는 생성 세포주를 우수하지 못한 생성 세포주와 분리시킨다.

반면, 트랜스펙션에 의해 세포로 유입된 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 핵산은 세포의 염색체 DNA로 통합되지 않고, 이러한 과정으로 선택되지 않는다. 따라서, 상기 유입된 핵산은 일반적으로 배양 배지에서 성장하는 동안 세포 분열 과정에서 축소되고 상실되며, 이는 일시적이고 일회적인 이러한 발현 과정의 특성을 상정한다. 우수한 발현 효과를 갖는 안정적인 생성 세포주의 선택은 수개월이 소요되고, 많은 비용이 소요된다. 이와 반대로, 원하는 폴리펩티드 또는 단백질의 밀리그램에 해당하는 양은 일과성 발현에 의해 며칠 내로 제조될 수 있다. 일반적으로 속도 및 비용은 생약학 및 진단 제품의 산업적 발전의 중요한 요소이다. 따라서, 미량의 단백질 또는 다양한 단백질 변이체들의 일과성 발현은 예를 들어 표적 식별, 어세이 개발, 유전자 산물의 생화학적 특징화, 독성학 및 약동학적 뿐만 아니라 약역학적 연구와 같은 조기 탐지 및 전임상 개발을 위한 기초 연구를 위해 실시된다(Baldi et al., Biotechnol. Lett. 29, 677-684, 2007; Pham et al., Molecular Biotechnology 34, 225-237, 2006). 이와 반대로, 광범위한 임상 연구 수행 및 시장 공급을 위한 그램 내지 킬로그램 규모에 이르는 단백질의 산업적 제조는 안정적인 세포주 제조를 통해 실시된다.

예를 들어, EP 1948789에는 선택적 마커를 사용하지 않고 세포 형질전환 요소의 트랜스펙션에 의해 영구적인 인간 양막 세포주의 제조방법에 대해 개시되어 있다.

지금까지, 분비된 막계 및 세포내 단백질은 일과성 유전자 발현에 의해 제조될 수 있었다. 포유류 세포는 특히 단백질이 치료 목적으로 사용될 경우 다수의 복합 단백질을 위해 통상적으로 사용되는 발현 시스템이며, 그 이유는 원핵 세포 및 단순한 진핵 세포 조직(예컨대 효모)이 번역후 변형과 관련하여 매우 불리하기 때문이다. 일과성 단백질 발현의 경우, 지금까지는 일반적으로 네 개의 포유류 세포주가 사용되었다: 아프리카 사바나 원숭이의 신장세포에서 유래된 CV-1 세포주로부터 유래하는 COS-1 및 COS-7 세포; 어린 햄스터 신장 세포로부터 유래하는 BHK 세포; 중국 햄스터의 난소로부터 유래하는 CHO 세포; 및 뉴런 특성을 갖는 인간 배아 신장 세포주인 HEK293 세포(Pham et al., Molecular Biotechnology 34, 225-237, 2006; Wurm et Bernard, Current Opinion in Biotechnology 10, 156-159, 1999). 포유류 세포주의 일과성 발현은 일반적으로 원하는 유전자 산물을 인코딩하는 서열을 갖는 발현 카세트를 포함하는 플라스미드 벡터의 트랜스펙션에 기초한다. 또한, 셈리키 삼림열 바이러스 또는 아데노바이러스와 같은 바이러스성 발현 벡터가 사용될 수 있으나, 이는 효과적이지만 시간이 걸리고 높은 안정성이 요구되기 때문에 흔하지는 않다. 배양된 포유류 세포에서 DNA 전달을 위해 다수의 물리적 및 화학적 방법들이 개발되었다. 상기 물리적 유전자 전달 방법에는 전기천공법, 뉴클레오펙션 및 미세 주입법이 포함된다. 화학적 트랜스펙션 방법의 경우, 무기 물질(예컨대 인산칼슘/DNA 공침전), 양이온 중합체(예컨대 폴리에틸렌이민, DEAE/덱스트란 방법) 또는 양이온 지질(소위 리포펙션)이 사용된다. 상기 인산칼슘 및 폴리에틸렌이민은 대량(수 리터에 이름)의 핵산 전달을 위해 가장 흔하게 사용되는 트랜스펙션 시약이다(Baldi et al., Biotechnol. Lett. 29, 677-684, 2007).

오랫동안 알려진 세포주에 기초한 폴리펩티드 및 단백질의 일과성 발현을 위한 공지된 방법은 여러 면에서 단점을 나타낸다. 일과성 방법과 관련된 하나의 문제는 낮은 발현율이다. 세포의 발현 수율을 개선하기 위해, 다양한 유전적 시스템들이 주입된 핵산의 에피솜 복제에 의해 세포당 유전자 복제물의 수를 증가시키기 위해 사용되었다. COS 세포는 시미안 바이러스 40(SV40)의 라지 T-항원, 즉 SV40 복제 기점(SV40 ori)을 포함하는 플라스미드의 에피솜 복제의 높은 수에 영향을 미치는 복제 인자를 발현한다. 상기 복제의 초기 이벤트는 T-항원과 SV40 복제 기점(SV40 ori)의 결합이며, 이로 인해 세포 복제 인자가 DNA/T-항원 복합체로 구성되고, 복제는 세포 DNA 폴리머라제에 의해 유도된다. 약 30년 전에 전단된 아데노바이러스 유형의 5 DNA를 갖는 인간 배아 신장 세포의 형질전환에 의해 생성되고, 트랜스펙션이 잘 이루어질 수 있는 HEK293 세포주의 두 개의 유전적 변이체가 개시되었으며, 상기 변이체도 또한 SV40 라지 T-항원(HEK293T) 및 엡스타인-바 바이러스(EBV) 핵 항원-1(EBNA-1)(HEK293E 또는 293EBNA-1)을 발현한다. 이러한 세포주는 SV40-ori 및 EBV-oriP를 포함하는 플라스미드의 에피솜 복제 또는 증폭을 제공해야 한다. 후자의 경우, EBNA-1 복제 인자가 EBV의 복제 기점 oriP와 상호작용한다. 적어도 HEK293E 세포의 경우, 발현율의 증가는 oriP를 포함하는 발현 플라스미드를 사용함으로써 검출되었다. 복제 기점 oriP와 조합한 EBNA-1의 사용과 대조적으로, 일부 연구에서는 SV40-ori를 포함하는 플라스미드의 강한 복제가 HEK293T 세포에서 발생하지 않는다는 점을 지적하고 있다(Durocher et al., Nucleic Acid Research 30, e9, 2002). CHO 세포의 안정적인 변이체가 발생하였으며, 상기 변이체는 폴리오마 바이러스의 라지 T-항원(LT)을 발현시키고(Epi-CHO), 폴리오마 바이러스의 복제 기점(PyOri)을 포함하는 플라스미드와 조합되어 사용될 수 있다(Kunaparaju et al., Biotechnology and Bioengineering 91, 670-677, 2005). 상기 포유류 세포 조직을 사용하여 일과성 발현시 재조합 단백질의 수율은 평균적으로 약 10-20mg/리터에 이른다(Baldi et al., Biotechnol. Lett. 29, 677-684, 2007). 반면, 안정적이고 영구적인 세포주 생산에 의해 수율은 일반적으로 리터당 수 그램의 범위에 이르며, 다만 전술한 바와 같이 상당히 많은 시간과 비용이 소요된다.

지금까지 재조합 단백질 발현에 사용된 세포 조직의 또다른 단점은, 일부 세포주가 쉽게 트랜스펜션되고 에피솜 플라스미드 증폭을 허용하는 능력에 기인하여 일과성 발현에 실제로 적합하기는 하지만(예컨대, HEK293T 또는 HEK293E 세포), 다른 세포주들은 배양 및 수율의 특성으로 인해 안정적인 세포주 생산에 사용되는 것이 바람직하다(예컨대, CHO 세포). 그러나, 세포 조직은 번역후 변형의 여러 측면에서 서로 차이를 보이기 때문에, 일과성 발현(대개는, 치료단백질 제품의 초기 개발 단계에서) 이후에 특정 세포 조직에 대해 획득된 유전자 산물의 구조 및 기능의 데이터가 다른 세포 조직(대개는, 임상 연구 및 시장 공급을 위한 후기 개발 단계에서)의 안정적인 세포주에서 발현된 이후에 상기 유전자 산물의 구조 및 기능으로 전달될 수 있는 것은 매우 제한적인 방법에 의한다. 다수의 치료 제품 후보군의 경우, 글리코실화, 인산화, 카르복실화, 팔미토일화 또는 특이적 분할과 같은 번역후 변형은 발현 산물의 다양한 특징들에 대해 매우 중요하다. 이는 활성, 가용성, 반감기, 안정성 또는 면역원성에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 인간 세포 조직은 치료단백질의 제조에 대해 점점 그 역할이 증가되고 있으며; 단지 생산 장소로서 인간 세포가 발현 산물의 확실한 인간 변형을 보장하고, 이에 따라 제품의 품질 또는 원하지 않는 부작용의 위험이 감소된다. 예를 들어, 인간 치료에 사용되는 재조합 에리스로포이에틴에 대해 알려진 것은, CHO 세포에서 제조된 단백질(에포에틴 알파)이 그의 탄수화물 곁사슬에서 N-글리콜릴뉴라민산 부분을 나타내는 반면, 천연 인간 에리스로포이에틴과 같이 인간 세포에서 제조된 단백질(에포에틴 델타)는 상기 당류 부분을 포함하지 않는다는 점이다. 인간이 "외래" 당류 구조에 대한 순환 항체를 명백히 형성한다고 한다면, 인간 발현 시스템을 사용하는 것이 바람직한 것으로 여겨진다(Varki, Am. J. Phys. Anthropol. 33, 54-69, 2001). 현재, 일과성 발현 및 안정적인 세포주 생산의 제조에 대해 비교적 잘 적합하고 이에 따라 단백질에 기초한 치료의 전체적인 개발에 대해 재생가능 생산 프로파일을 제공하는 인간 세포 시스템이 존재하지 않는다.

인간 세포는 특히 인간 생치료법의 생성을 위해 적합한데, 그 이유는 다른 포유류 세포 또는 동물 세포와 대조적으로 정확한 번역후 변형 패턴과 함께 복잡한 폴리펩티드를 발현시키기 때문이다. 복잡한 재조합 단백질의 글리코실화 패턴, 즉 분자의 당류 부분의 구조 및 배열은, 비인간 제조 시스템에 비해 인간 세포에서 생산시에 정확한 인간 폴리펩티드가 더 잘 재생산된다. 이러한 글리코실화 패턴은 종종 생물학적 활성, 안정성, 가용성 및 면역원성과 같은 폴리펩티드의 중요한 특성에 있어서 매우 중요하다.

따라서, 본 발명의 목적은 폴리펩티드의 일과성 발현 및 안정적인 세포주 제조에 적합한 인간 세포 시스템을 제공하는 것이다.

본 발명의 상기 목적은 청구항에 기재되어 있는 내용을 통해 해결된다.

본원에서 "양막세포"라는 용어는 가장 넓은 의미에서 양수에 존재하고 양수천자에 의해 획득될 수 있는 모든 세포들을 의미한다. 이는 양막으로부터 유래하거나, 또는 양수와 접촉하는 태아 조직으로부터 유래한다. 형태학적 기준에 따라 구분될 수 있는 양막세포의 3개의 주요 군은 공지되어 있다: 섬유아세포 유사 세포(F 세포), 유상피 세포(E 세포), 양막액 세포(AF(Amniotic Fluid) 세포)(Hohn et al., Pediat. Res. 8: 746-754, 1974). AF 세포가 주된 세포 유형이다.

"발현 카세트"라는 용어는 특히 코딩 영역의 전방에 위치한 조절 요소 또는 프로모터, 코딩 영역, 및 오픈 리딩 프레임 뿐만 아니라 코딩 영역의 후방에 위치한 전사 종결 요소를 각각 포함하는 핵산 분자 및 핵산 분자의 영역에 관한 것이다. 상기 코딩 영역의 전방에 위치한 조절 요소 및 프로모터는 구성적 프로모터, 즉 전사를 영구적으로 활성화시키는 프로모터(예컨대, CMV 프로모터)이거나, 또는 조절가능 프로모터, 즉 스위치 온 및/또는 스위치 오프될 수 있는 프로모터(예컨대, 테트라시클린 조절 프로모터)일 수 있다. 상기 발현 카세트의 코딩 영역은 5' 말단에 개시 코돈을 갖고 3' 말단에 종결 코돈을 갖는 cDNA의 경우처럼 연속적 오픈 리딩 프레임일 수 있다. 코딩 영역은 코딩 엑손과 그 사이의 비-코딩 인트론의 게놈성 배열 또는 새로 결합된 배열로 구성될 수 있다. 상기 발현 카세트의 코딩 영역은 다수의 오픈 리딩 프레임으로 구성될 수도 있으며, 이는 소위 IRES(Internal Ribosome Entry Site)에 의해 서로 분리되어 있다.

"영구 세포주"라는 용어는 세포가 적합한 배양 조건하에서 배양될 때 영구적으로 성장을 지속할 수 있도록 유전적으로 변형된 세포로 이해할 수 있다. 상기 세포는 불멸화 세포라고도 한다.

"폴리펩티드" 또는 "재조합 폴리펩티드"라는 용어는 적어도 두 개의 아미노산으로 이루어진 펩티드로 이해할 수 있다. 폴리펩티드는 예를 들어 당류 잔기의 부착에 의해 또는 아미노산 잔기의 변형에 의해 공-번역적으로 및/또는 후-번역적으로 변형될 수 있다. 폴리펩티드는 선형, 환형 또는 분지형일 수 있다. 또한, 폴레펩티드는 한 개보다 많은 아미노산 사슬로 구성될 수 있으며, 상기 사슬은 분자 내 및/또는 분자간 결합에 의해 다소 복잡한 삼차원 구조를 가질 수 있다(예컨대, 2차, 3차, 4차 구조). 만일 폴리펩티드가 하나의 아미노산 사슬로 구성된다면, 이는 분자내 결합에 의해 다소 복잡한 삼차원 구조를 가질 수 있다. 폴리펩티드는 약학적으로 또는 면역학적으로 활성인 폴리펩티드이거나 또는 진단 목적을 위해 사용되는 폴리펩티드일 수 있다.

"일차 세포(primary cell)"라는 용어는 유기물 또는 조직으로부터 직접 제거하여 획득되고 배양되어지는 세포로 이해할 수 있다. 일차 세포는 단지 매우 제한된 수명을 갖는다.

"생산 세포주(production cell line)"라는 용어는, 제조 대상인 원하는 폴리펩티드를 인코딩하는 이식유전자의 도입에 의해 유전학적으로 안정적으로 변형된 영구 세포주로 이해할 수 있다.

"CAP"라는 용어는 아데노바이러스 유전자 산물 E1A 및 E1B를 갖는 일차 인간 양막세포의 면역화에 의해 생성된 영구적인 인간 양막 세포주로 이해할 수 있다.

"CAP-T"라는 용어는 SV40 라지 T-항원의 서열을 포함하는 핵산 분자로 안정적으로 트랜스펙션된 CAP 세포로 이해할 수 있다.

"트랜스펙션"이라는 용어는 언급되는 핵산(들)을 세포로 도입하기 위해 적합한 임의의 방법으로 이해할 수 있다. 일례로서, 고전적인 인산칼슘 방법, 전기천공법, 모든 종류의 리포솜 시스템 및 상기 방법들의 조합이 언급될 수 있다.

"일과성 발현"이라는 용어는 적합한 선택 방법에 의해 안정적인 세포주를 선택하지 않고 트랜스펙션에 의해 핵산(들)이 세포로 도입되는 임의의 방법으로 이해할 수 있으며, 상기 안정적인 세포주는 영구적으로 세포 배양에서 계속 배양될 수 있다.

"안정적 발현"이라는 용어는 생산 세포주에서 이식유전자의 발현으로 이해할 수 있다.

"이식유전자"라는 용어는 재조합 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열로 이해할 수 있다.

본 발명은 영구적인 인간 세포주의 제조방법에 관한 것이며, 이는 하기의 단계를 포함한다:

a) 아데노바이러스 유전자 산물 E1A 및 E1B를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 갖는 일차 인간 세포를 트랜스펙션하는 단계; 소위 1번 트랜스펙션, 및

b) 그 후, SV40 라지 T-항원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 갖는 영구적인 인간 세포주를 트랜스펙션하는 단계; 소위 2번 트랜스펙션.

바람직하게는, 본 발명에 따른 영구적인 인간 세포주의 제조방법의 b) 단계의 핵산 분자는 SV40 라지 T-항원의 분비되지 않은 형태를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.

본 발명에 따른 방법의 b) 단계의 트랜스펙션하는 동안, 영구적인 인간 세포주는 선택적으로 엡스타인-바 바이러스(EBV) 핵 항원-1(EBNA-1)을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 트랜스펙션, 소위 2번 트랜스펙션된다. 바람직하게는, 상기 핵산 분자는 엡스타인-바 바이러스(EBV) 핵 항원-1(EBNA-1)의 분비되지 않은 형태를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.

본 발명에 따른 방법에 의해 실시된 트랜스펙션을 통해, 일차 인간 세포는 바람직하게는 안정적으로 트랜스펙션되며, 즉 트랜스펙션된 DNA가 세포의 게놈으로 통합된다.

E1A 및 E1B를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자로 상기 일차 인간 세포를 트랜스펙션함으로써, 세포가 불멸화된다. 일차 인간 세포의 불멸화를 위해 사용되는 핵산 분자는 E1A 및 E1B의 핵산 서열을 포함하며, 상기 핵산 서열은 바람직하게는 인간 아데노바이러스, 특히 인간 아데노바이러스 혈청형 5로부터 유래한다. 바람직한 실시형태에서, 상기 불멸화를 위해 사용되는 핵산 분자는 E1A 및 E1B를 인코딩하는 핵산 서열과 함께 아데노 바이러스 유전자 산물 pIX를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. pIX 폴리펩티드, 즉 바이러스성의 구조 단백질은 티미딘 키나제 및 베타-글로빈 프로모터와 같이 상이한 바이러스 및 세포 프로모터에 대해 전사 활성자로서 작용한다.

예를 들어, 서열은 GenBank 접근번호 X02996으로 찾을 수 있다. 특히, 핵산 분자는 뉴클레오티드 1 내지 4344(서열번호 1은 E1A, E1B 및 pIX를 인코딩하는 핵산 서열을 포함함), 뉴클레오티드 505 내지 3522(서열번호 2는 E1A 및 E1B를 인코딩하는 핵산 서열을 포함함), 또는 인간 아데노바이러스 혈청형 5의 뉴클레오티드 505 내지 4079(서열번호 3은 E1A, E1B 및 pIX를 인코딩하는 핵산 서열을 포함함)를 포함한다.

특히, 발현 카세트 형태의, 발현되어질 원하는 유전자 산물을 인코딩하는 핵산 서열에 의해 인간 세포가 트랜스펙션된다. 상기 발현 카세트는 코딩 영역의 전방에 위치한 조절 요소 또는 프로모터, 코딩 영역 및 오픈 리딩 프레임과 코딩 영역의 후방에 위치한 전사 종결 요소를 포함하는 핵산 분자를 포함한다.

특히 일실시형태에서, 발현 카세트 또는 핵산 분자는 SV40 라지 T-항원에 대한 핵산 서열(서열번호 4), CMV 프로모터(서열번호 5), CAG 프로모터(Niwa et al., Gene 108: 193-199, 1991) 및 RSV 프로모터(GenBank 접근번호 DQ075935)의 군에서 선택된 프로모터에 대한 핵산 서열, SV40 SD/SA(인트론)에 대한 서열(서열번호 6) 및 SV40 polyA에 대한 핵산 서열(서열번호 7)을 포함한다.

또다른 실시형태에서, 발현 카세트 또는 핵산 분자는 특히 엡스타인-바 바이러스(EBV) 핵 항원-1(EBNA-1)에 대한 핵산 서열(서열번호 8), CMV 프로모터(서열번호 5), CAG 프로모터(Niwa et al., Gene 108: 193-199, 1991) 및 RSV 프로모터(GenBank 접근번호 DQ075935)의 군에서 선택된 프로모터에 대한 핵산 서열, SV40 SD/SA(인트론)에 대한 핵산 서열(서열번호 6) 및 SV40 polyA에 대한 핵산 서열(서열번호 7)을 포함한다.

일차 인간 세포는 유기물 또는 상기 유기물로부터 제거된 조직으로부터 직접 제거를 통해 획득되고, 배양된다. 상기 일차 인간 세포는 아데노바이러스 E1A 및 E1B의 발현에 의해 영구적인 인간 세포주로 잘 전환될 수 있는 세포, 특히 양막 세포, 배아 망막 세포 및 뉴런 기원의 배아 세포가 바람직하다.

바람직하게는, 영구적인 인간 양막 세포주는 본 발명에 따른 방법에 의해 제조된다.

본 발명에 따른 방법은 a) 단계를 대신하여 이미 존재하는 불멸화 인간 세포주에 의해 수행될 수 있으며, 특히 게놈에서 아데노바이러스 유전자 산물 E1A 및 E1B에 대한 핵산 서열을 갖는 이미 존재하는 불멸화 인간 양막 세포주에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는, 불멸화 인간 세포주는 게놈에서 아데노바이러스 유전자 산물 E1A, E1B 및 pIX에 대한 핵산 서열을 포함한다. 이미 존재하는 불멸화 인간 세포주, 특히 불멸화 인간 양막 세포주는 필요에 따라 SV40 라지 T-항원 또는 엡스타인-바 바이러스(EBV) 핵 항원-1(EBNA-1)을 인코딩하는 발현 카세트를 포함하는 전술한 핵산 분자에 의해 트랜스펙션된다. 당업자라면 2번 트랜스펙션이 1번 트랜스펙션 이후에 실시되어야 한다는 점에서 시간적으로 일차 인간 세포의 1번 트랜스펙션에 의존한다는 점을 알 것이다. 2번 트랜스펙션은 1번 트랜스펙션 이후에 즉시 실시되어야 할 필요는 없다. 따라서, E1A 및/또는 E1B로 불멸화되어 이미 몇 해 전부터 수립된 불멸화 인간 세포주도 필요에 따라 2번 트랜스펙션에서 전술한 핵산 분자에 의해 트랜스펙션될 수 있다. 바람직하게는, 이를 위해 불멸화 인간 양막세포, 불멸화 인간 배아 망막 세포, 특히 PER.C6 세포, 또는 뉴런 기점의 불멸화 인간 배아 세포, 특히 HEK293 세포가 사용될 수 있다.

본 발명은 아데노바이러스 유전자 산물 E1A 및 E1B에 대한 핵산 서열을 포함하고, SV40 라지 T-항원 또는 엡스타인-바 바이러스(EBV) 핵 항원-1(EBNA-1)에 대한 핵산 서열을 포함하는 영구적인 인간 세포주에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명은 아데노바이러스 유전자 산물 E1A, E1B 및 pIX에 대한 핵산 서열을 포함하고, SV40 라지 T-항원 또는 엡스타인-바 바이러스(EBV) 핵 항원-1(EBNA-1)에 대한 핵산 서열을 포함하는 영구적인 인간 세포주에 관한 것이다. 특히 바람직하게는, 본 발명은 아데노바이러스 유전자 산물 E1A 및 E1B에 대한 핵산 서열을 포함하고, SV40 라지 T-항원 또는 엡스타인-바 바이러스(EBV) 핵 항원-1(EBNA-1)에 대한 핵산 서열을 포함하는 영구적인 인간 양막 세포주에 관한 것이다. 특히 더 바람직하게는, 본 발명은 아데노바이러스 유전자 산물 E1A, E1B 및 pIX에 대한 핵산 서열을 포함하고, SV40 라지 T-항원 또는 엡스타인-바 바이러스(EBV) 핵 항원-1(EBNA-1)에 대한 핵산 서열을 포함하는 영구적인 인간 양막 세포주에 관한 것이다.

특히, 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 따라 획득한 영구적인 인간 세포주, 바람직하게는 영구적인 인간 양막 세포주에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 영구적인 인간 세포주를 사용하여 재조합 폴리펩티드 또는 단백질의 일과성 발현을 위한 방법에 관한 것으로서, 하기 단계를 포함한다:

a) 원하는 재조합 폴리펩티드 또는 단백질 및 SV40 라지 T-항원 또는 엡스타인-바 바이러스(EBV) 핵 항원-1(EBNA-1)에 대한 인식 위치 또는 결합 위치를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 갖는 영구적인 인간 세포주를 트랜스펙션시키는 단계,

b) 상기 원하는 재조합 폴리펩티드 또는 단백질의 발현을 허용하는 조건하에서, a) 단계에서 획득된 트랜스펙션된 영구적인 인간 세포주를 배양하는 단계, 및

c) 그 후, 상기 원하는 재조합 폴리펩티드 또는 단백질을 세포 또는 배양 상청액으로부터 분리하는 단계.

본 발명의 바람직한 실시형태는 본 발명에 따른 영구적인 인간 양막 세포주를 사용하여 재조합 폴리펩티드 또는 단백질의 일과성 발현을 위한 방법에 관한 것으로서, 하기 단계를 포함한다:

a) 원하는 재조합 폴리펩티드 또는 단백질 및 SV40 라지 T-항원 또는 엡스타인-바 바이러스(EBV) 핵 항원-1(EBNA-1)에 대한 인식 위치 또는 결합 위치를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 갖는 영구적인 인간 양막 세포주를 트랜스펙션시키는 단계,

b) 상기 원하는 재조합 폴리펩티드 또는 단백질의 발현을 허용하는 조건하에서, a) 단계에서 획득된 트랜스펙션된 영구적인 인간 양막 세포주를 배양하는 단계, 및

c) 그 후, 상기 원하는 재조합 폴리펩티드 또는 단백질을 세포 또는 배양 상청액으로부터 분리하는 단계.

만일 본 발명에 따른 영구적인 인간 세포주가 SV40 라지 T-항원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다면, 상기 세포주는 예를 들어 발현되어질 이식유전자 및 SV40 복제 기점(SV40 ori)을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트 또는 핵산 분자를 포함하는 발현 플라스미드로 트랜스펙션된다. 상기 세포주에서 안정적으로 세포내 발현된 SV40 라지 T-항원은 트랜스펙션에 의해 세포주로 도입된 발현 플라스미드의 SV40 복제 기점에 결합되고, 발현 플라스미드의 에피솜 복제를 야기하고, 이에 따라 발현되어질 이식유전자의 복제 수를 증폭시킨다. 이식유전자에 의해 인코딩된 원하는 유전자 산물은 수일 동안 세포를 배양한 후에 세포 또는 배양 상청액으로부터 획득될 수 있다. 따라서, 상기 이식유전자는 일시적으로 발현된다.

만일 본 발명에 따른 영구적인 인간 세포주가 엡스타인-바 바이러스(EBV) 핵 항원-1(EBNA-1)을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다면, 상기 세포주는 예를 들어 발현되어질 이식유전자 및 EBV 복제 기점(EBV oriP)을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트 또는 핵산 분자를 포함하는 발현 플라스미드로 트랜스펙션된다(Durocher et al., Nucleic Acids Research Vol. 30 Nr. 2 e9, 2002; Tuvesson et al. Cytotechnology 56: 123-136, 2008). 상기 세포주에서 안정적으로 세포내 발현된 EBV의 EBNA-1은 트랜스펙션에 의해 세포주에 도입된 발현 플라스미드의 oriP 복제 기점에 결합되고, 발현 플라스미드의 에피솜 복제를 야기하고, 이에 따라 발현되어질 이식유전자의 복제 수를 증폭시킨다. 이식유전자에 의해 인코딩된 원하는 유전자 산물은 수일 동안 세포를 배양한 후에 세포 또는 배양 상청액으로부터 획득될 수 있다. 따라서, 상기 이식유전자는 일시적으로 발현된다.

본 발명에 따른 세포는 약 37℃, 95% 습도 및 8% CO₂의 진핵세포 배양을 위해 통상의 조건하에서 배양될 수 있다. 본 발명에 따른 세포는 혈청 함유 배지 또는 무혈청 배지에서 배양되거나, 부착 배양 또는 현탁 배양으로 배양될 수 있다. 현탁액에서의 배양은 다양한 발효 용기, 예를 들어 교반 탱크 반응기, 파 반응기, 셰이커 용기 또는 스피너 용기 또는 소위 회전 병에서 실시될 수 있다. 따라서, 세포는 산업적 규모로 공정 확대에 적합하다. 일과성 발현을 위한 세포의 트랜스펙션은 전술한 바와 같이 다양한 트랜스펙션 방법에 따라 실시될 수 있다. 트랜스펙션 및 일과성 발현은 또한 예를 들어 96 웰 형태 또는 384 웰 형태와 같은 고속 대량 형태 및 스크리닝으로 실시될 수도 있다.

시미안 바이러스 40(SV40)의 T-항원은 감염 이후 바이러스 복제 뿐만 아니라 세포 기능을 제어하는 다기능 인단백질이다. T-항원은 형질전환 물질이고, 종양 억제 단백질 p53과 상호작용함으로써 세포 주기에 관여한다. 바이러스 게놈이 복제되는 동안, 이중가닥 게놈을 풀기 위한 DNA 헬리카제로서 T-항원이 필요하다. T-항원은 복제를 위해 필요한 유일한 바이러스성 단백질이다. 다른 기능은 세포성 단백질에 의해 충족된다. DNA 복제의 제1단계에서, 12 T-항원 분자는 이중 헥사머로서 SV40 게놈의 DNA 복제의 기점(ori)에 결합된다. 그 후, DNA 폴리머라제와 같은 필요한 세포성 단백질이 상기 헬리카제 복합체에 결합되고, DNA를 풀고 복제한다. 소위 "최소 ori"는 길이가 63 bp인 코어(core) 서열로 구성된다. 표적 세포로 환형 플라스미드의 일과성 트랜스펙션에서, 숙주 게놈으로의 통합이 발생되지 않으며, 이는 세포 분할 이후 플라스미드의 농도가 지속적으로 감소되는 결과를 야기하고, 플라스미드에 놓여 있는 유전자의 발현은 단지 일시적이다. 발현 플라스미드로 SV40 ori-단편의 도입 및 생산 세포주에서 SV40 T-항원의 발현은 플라스미드의 복제 수의 증가와 함께 발현 효율의 증가를 가져온다.

본 발명에 따른 폴리펩티드 및 단백질의 일과성 발현을 위한 방법은 재조합 유전자 산물의 질적 및 양적 측면에서 더 효율적이고, 단백질에 기초한 치료와 관련하여 산업적 발전의 전체 공정에서 지금까지 사용된 방법보다 비용면에서 저렴하다는 장점을 갖는다.

특히, 매우 효과적인 일과성 발현이 인간 세포주에 기초하여 제공되며, 상기 인간 세포주는 첫째로 비인간 포유류 세포 또는 비포유류 세포와 대조적으로 인간 단백질을 확실하게 번역후 변형시키며, 둘째로 산업 제조 공정에서 안정적인 생산 세포주를 수립하는데 적합하다. 이러한 방식으로, 진단 또는 치료 제품의 개발과 관련하여 초기 개발 단계에서 일과성 발현 이후와 후기 단계에서 영구적인 생산 세포주에서의 안정적 발현 이후의 유전자 산물의 질적 특성은 특히 이러한 특성에서 나타나는 차이와 관련하여 가능하면 동일성을 가지는 것이 보장될 수 있으며, 이는 세포 시스템의 성질에 의해 야기될 수 있다.

본 발명의 또다른 장점은 본 발명에 따른 영구적인 인간 세포주가 일과성 발현시 높은 발현율을 나타낸다는 것이다. 원하는 유전자 산물을 코딩하는 서열 외에 SV40 복제 기점(SV40 ori)을 갖는 플라스미드 벡터에 의한 트랜스펙션 이후에 SV40 T-항원을 생성하는 양막 세포주의 일과성 발현의 경우, 60 mg/리터에 이르는 매우 높은 생산율이 배양 상청액에서 발견되었다. 상기 생산율은 T-항원을 발현하지 않는 양막 세포주에서의 일과성 발현에 비해 70배 이상 더 높았다.

본 발명에 따른 영구적인 인간 세포주의 또다른 장점은 바람직하게는 불멸화 인간 양막세포에 기초한 인간 세포 시스템이 제공되는 것이며, 이는 단백질의 일과성 발현 뿐만 아니라 영구적인 생산 세포주에서 단백질의 안정적인 발현을 위해 적합하다는 데 있다(Schiedner et al., BMC Biotechnology 8, 13, 2008). 일과성 발현(예컨대, HEK293 또는 HEK293 변이체) 및 안정적인 발현(예컨대, CHO)을 위한 다양한 세포 시스템의 사용에 대해, 만일 일과성 및 안정적 생산으로부터의 발현 산물의 구조적 또는 기능적 특성이 발현 시스템의 성질에 기초한 것이라면, 상기 구조적 또는 기능적 특성이 서로 달라지게 되는 위험은 최소화된다. 이에 따라, 개발 프로세스가 계획적으로 향상될 수 있고, 시간과 비용이 효과적으로 절약된다.

하나 이상의 재조합 폴리펩티드의 발현을 위한 핵산 서열은 하나 이상의 발현 카세트에 포함된다. 상기 발현 카세트는 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. 프로모터로서, 예를 들어 CMV(시토메갈로 바이러스) 프로모터(Makrides, 9-26 in: Makrides (Hrsg.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003), EF-1α 프로모터(Kim et al., Gene 91; 217-223, 1990), CAG 프로모터(인간 시토메갈로 바이러스의 즉시-초기 인핸서 및 제1의 인트론을 갖는 변형된 닭 β-액틴 프로모터의 하이브리드 프로모터)(Niwa et al., Gene 108: 193-199, 1991), 인간 또는 뮤린 pgk(포스포글리세르산 키나제) 프로모터(Adra et al., Gene 60: 65-74, 1987), RSV(Rous Sarcoma Virus) 프로모터(Makrides, 9-26 in: Makrides (Hrsg.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003) 또는 SV40(시미안 바이러스 40) 프로모터(Makrides, 9-26 in: Makrides (Hrsg.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003)가 사용될 수 있다. SV40 라지 T-항원(GenBank 접근번호 J02400) 또는 인간 G-CSF(과립구집락자극인자) 유전자(Mizushima and Nagata, Nucl. Acids Res. 18: 5322, 1990)의 폴리아데닐화 서열이 예를 들어 폴리아데닐화 위치로서 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 방법을 사용하여 획득되는 폴리펩티드 또는 단백질에 관한 것이다.

본 발명에 따른 방법의 재조합 폴리펩티드는 인간 알파 1-항트립신과 같은 치료단백질 또는 에리스로포이에틴 또는 인터루킨-2와 같은 성장인자일 수 있다. 인간 알파 1-항트립신(hAAT)은, 엘라스타제 및 다른 프로테나제를 억제하면서 폐와 간의 심각한 손상을 야기하는 선천적 hAAT 결핍에 대해 치료적으로 활성인 프로테나제 억제제이다. 에리스로포이에틴은 빈혈 환자 및 이식 환자에게서 혈액 형성 활성을 갖는 적혈구에 대해 중요한 성장인자이다. 인터루킨-2(Il-2)는 면역시스템의 세포 전달자이며, 이는 예를 들어 종양 질환의 경우 세포면역 반응의 활성화에 있어서 매우 중요하다. 또한 치료적으로 활성인 폴리펩티드에 속하는 것은 응고 장애를 앓는 혈우병 환자에게 사용되는 제VIII 인자 및 제IX 인자와 같은 혈액 응고 인자이다. 본 발명에 따른 방법의 재조합 폴리펩티드는 호르몬일 수 있다. 생명공학적으로 제조된 호르몬은 호르몬 장애를 갖는 환자의 경우에 대체 요법으로 사용된다. 예를 들어, 다수의 당뇨병 환자가 의존하는 혈당 강하 호르몬인 인슐린, 왜소증 치료를 위한 소마토트로핀(성장 호르몬), 및 임신 장애 치료를 위한 여포 자극 호르몬(FSH) 또는 황체 형성 호르몬(LH)과 같은 성선 자극 인자가 있다. 또한, 상기 재조합 폴리펩티드는 세포내에서 발현되거나 또는 배양 상청액에서 동시에 발현되는 다른 재조합 폴리펩티드를 번역후 변형시키는 효소, 예를 들어 글리코실화에 관연하는 효소일 수 있다. 본 발명에 따른 영구적인 인간 세포주에서 발현된 유전자 산물 E1A, E1B 및 pIX 및 SV40 라지 T-항원과 엡스타인-바 바이러스(EBV) 핵 항원-1(EBNA-1)은 제조될 원하는 폴리펩티드에 해당하지 않는다.

본 발명의 방법에 따른 재조합 폴리펩티드는 치료 또는 진단 목적으로 사용될 수 있는 재조합 항체일 수 있다. 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)에 대한 항체는 류머티즘 관절염 환자에게 사용되며, 표피 성장인자의 세포 수용체(EGFR)에 대한 항체는 암 환자에게 사용된다. 진단을 목적으로 사용되는 항체는 예를 들어 효소결합면역흡착측정법(ELISA) 또는 방사 면역흡착 측정법(RIA)과 같은 방법에 기초한 상업적 진단 키트의 구성요소일 수 있다. 이러한 측정법에서, 항체는 예를 들어 인간 B형 간염 바이러스와 같은 감염성 제제의 항원을 검출하기 위해 사용된다.

항체 또는 면역글로불린(Ig)은 중쇄 및 경쇄로 이루어지며, 중쇄 및 경쇄는 각각 가변 및 불변 영역 또는 도메인으로 구성된다. 항체를 발현하기 위한 트랜스펙션된 핵산 분자의 핵산 서열은 두 개의 분리된 발현 카세트를 포함할 수 있으며, 이 중 하나는 면역글로불린 분자의 경쇄를 인코딩하고, 다른 하나는 면역글로불린 분자의 중쇄를 인코딩한다. 본 발명에 따른 세포에서 두 개의 사슬의 발현에 따라, 이러한 사슬들은 활성 항체 분자를 형성하도록 어셈블리된다. 두 개의 사슬의 발현 카세트는 분리된 핵산 분자 또는 동일한 핵산 분자에 존재할 수 있다. 그러나, 경쇄 및 중쇄에 대한 코딩 서열은 동일한 발현 카세트 내에 존재할 수 있으며, 중쇄 및 경쇄 모두의 발현을 제공하는 IRES 서열(내부 리보솜 유립점)에 의해 분리될 수 있다. 경쇄 및 중쇄에 대한 코딩 서열은 원칙적으로 동일한 발현 카세트 내에 존재할 수 있고, 세포 내에서 동시에 발현되고 경쇄 및 중쇄의 서열로 구성된 전구 폴리펩티드를 활성인 경쇄 및 중쇄로 절단하는 프로테나제(예컨대, 트롬빈)에 대한 효소 절단 부위를 인코딩하는 서열에 의해 분리될 수 있다.

본 발명에 따른 세포의 핵산 서열에 의해 인코딩된 재조합 항체는 완전한 경쇄 및 중쇄 대신에 항체의 단편으로 구성될 수도 있다. 소위 단일 사슬 항체(scFv: single chain variable fragment)는 두 개의 가변 도메인의 자유로운 이동성을 제공하는 아미노산 서열(소위, 연결자)에 의해 연결된 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인으로 구성된다. 면역글로불린 분자의 가변 영역에 대응하는 항원 결합 구조는 두 개의 도메인의 분자내 조합에 의해 형성된다. 이특이적 단일 사슬 항체(bis-scFv)는 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인으로 구성된 상기 단일 사슬 조합물의 두 개로 구성되며, 이는 연결 서열을 통해 순차적으로 연결되고, 서로에 대해 이동될 수 있다; 이러한 분자는 두 개의 항원 결합 부위(에피토프)에 동시에 결합될 수 있고, 이로 인해 두 개의 분자 구조가 비공유 방식으로 연결될 수 있다. 이특이적 디아체는 개별적으로 발현된 두 개의 단일 사슬로 구성되며, 이들 각각은 단지 매우 짧은 연결자에 의해서만 분리되거나 또는 연결자가 없는 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인을 포함한다. 짧은 연결자 또는 연결자가 없는 것은 분자내 조합을 억제하며; 가변적인 중쇄 도메인과 경쇄 도메인의 분자내 조합에 의해, 두 개의 결합가를 갖는 활성 분자가 다시 형성된다.

본 발명의 방법에서 트랜스펙션된 핵산 분자에 의해 인코딩된 재조합 폴리펩티드는 바이러스 단백질, 박테리아 단백질 또는 기생 단백질일 수 있으며, 이는 예방 또는 치료 백신으로 사용하기 위해 제조된다. 상기 단백질은 바이러스, 박테리아 또는 기생생물의 구조 폴리펩티드 뿐만 아니라 조절 폴리펩티드 또는 효소 활성 폴리펩티드일 수 있다. 바이러스성 단백질은 예를 들어 B형 간염 바이러스 표면 항원(HBV 표면 항원) 또는 인간 유두종 바이러스의 구조 단백질 L1일 수 있다. 생산 세포주에서 발현 이후에 백신 제조를 위해 고려되는 박테리아 단백질은, 예를 들어 엔테로톡신생성 대장균(ETEC)의 엔테로톡신 서브유닛 또는 나이세리아 고노레아의 트랜스페린 결합 단백질(Tbp A 및 B)가 있다. 본 발명의 방법에 의해 트랜스펙션된 핵산 분자에 의해 인코딩될 수 있는 기생생물의 폴리펩티드는, 예를 들어 말라리아 플라스모듐 팔시파룸의 원인인자의 메로조이트 표면 단백질(MSP) 또는 시스토소마 자포니쿰의 글루타티온 S 전이효소(GST)가 있다.

또한, 본 발명의 방법에 따라 트랜스펙션된 핵산 분자에 의해 인코딩된 재조합 폴리펩티드는 세포주에서 재조합 바이러스성 유전자 전달 벡터의 생산을 허용하는 바이러스성 단백질일 수 있다. 상보성 인자(complementation factor)라고도 불리우는 상기 바이러스성 단백질은 세포주에서 발현되고, 유전자 전달 벡터의 생산을 위해 필요한 효소적 또는 구조적 성분이며, 상기 성분은 유전자 전달 벡터의 핵산 분자상에서 인코딩되지 않는다. 상기 유전자 전달 벡터에서, 안전성을 이유로 특정 바이러스성 유전자 기능이 삭제되는 것이 일반적이다. 유전자 전달 벡터의 상보성 인자는 전술한 방법에 의해 도입된 이식유전자에 의해 인코딩될 수 있으며, 이는 예를 들어 아데노바이러스, 아데노바이러스 연관 바이러스(AAV), 레트로바이러스 또는 렌티 바이러스 또는 헤르페스 바이러스에 기초한 벡터이다. 세포주에서 발현된 상보성 인자는 생산하는 동안 삭제되거나 재조합된 바이러스를 보완할 수도 있으며, 상기 바이러스는 전달대상인 유전자를 포함하지 않음에 따라 유전자 전달 벡터로서 기능하지 않고 예컨대 백신으로서 사용될 수도 있다.

또한, 본 발명의 방법에 의해 일과성 발현된 폴리펩티드는, 특히 세포의 표면에 편재하고, 바이러스성 유전자 전달 벡터에 의한 세포의 형질도입 및 바이러스에 의한 세포의 감염에 책임이 있는, 수용체 폴리펩티드일 수 있다. 대부분의 통상의 아데노바이러스 벡터가 유래되는 아데노바이러스 혈청형 2 또는 5를 갖는 세포 감염의 초기 단계를 위한 바이러스 수용체로서, 소위 콕사키 및 아데노바이러스 수용체(CAR)가 확인되었다(Bergelson et al., Science 275: 1320-1323, 1997). 표면상에서 CAR의 충분한 발현은, 세포가 아데노바이러스 유전자 전달 벡터에 대한 생산 세포로서 적합한 전제 조건이다. 바람직한 실시형태에서, 재조합 폴리펩티드는 콕사키 및 아데노바이러스 수용체(CAR)이다. 수용체 폴리펩티드의 과발현은 아데노바이러스 벡터와 관련하여 세포의 감염성을 유의적으로 향상시킴에 따라 세포의 생산 효율성을 향상시킬 수 있다. 또한, 상기 핵산 분자는 CAR 이외에, 세포에서 바이러스 및 유전자 전달 벡터의 수용을 매개하고 이의 추가적인 발현이 아데노바이러스 벡터에 대한 생산 세포의 제조에 유리한 특정 인테그린과 같은 이차 수용체 또는 내재 수용체를 인코딩할 수 있다.

전술한 방법은 그 중에서도 치료용 폴리펩티드, 혈액 응고 인자와 성장인자, 호르몬과 항체, 및 백신으로서 사용하기 위한 바이러스 폴리펩티드, 박테리아 폴리펩티드 또는 기생생물 폴리펩티드의 생산을 위해 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 세포는 바이러스 항원, 박테리아 항원 또는 기생생물 항원과 같은 진단 관련 단백질, 또는 관련 특이적 항체의 생산을 위해 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 세포는 기술적 또는 산업적으로 중요한 단백질의 생산, 예를 들어 기술적 합성 과정의 촉매를 위하거나 또는 유해 물질의 분해를 위한 효소의 생산을 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 세포는 하나 또는 다수의 다양한 재조합 폴리펩티드를 발현할 수 있다. 발현가능한 폴리펩티드의 수는, 얼마나 많은 다양한 재조합 폴리펩티드 인코딩 핵산 서열들이 본 발명의 방법에 따라 세포로 일과성 트랜스펙션될 수 있는지에 의존한다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따라 제조된 영구적인 인간 세포주, 특히 폴리펩티드 또는 단백질의 생산을 위한 영구적인 인간 양막 세포주의 사용에 관한 것이다.

본 발명은 하기의 실시예에서 설명되지만 이에 한정되지 않는다. 달리 기재되지 않는 한, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual, 제2판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York]에 개시된 바와 같은 분자생물학적 표준 방법이 사용되었다.

본 발명은 하기의 도면에 의해 설명된다.
도 1은 T-항원의 영구적 발현을 위한 플라스미드의 구성을 도시적으로 나타낸다. pGS158(도 1)에서 T-항원은 인간 CAG 프로모터(인간 시토메갈로 바이러스의 즉시-초기 인핸서 및 제1의 인트론을 갖는 변형된 닭 β-액틴 프로모터의 하이브리드 프로모터)의 통제하에서 발현되고, pGS159(도 1b)에서는 RSV(Rous Sarcoma Virus) 프로모터(Makrides, 9-26 in: Makrides (Hrsg.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003)의 통제하에서 발현되고, pGS161(도 1c)에서는 인간 CMV(시토메갈로 바이러스) 프로모터(Makrides, 9-26 in: Makrides (Hrsg.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003)의 통제하에서 발현된다.
도 2는 인간 알파 1-항트립신(hAAT)과 인간 에리스로포이에틴(Epo)의 일과성 발현을 위한 플라스미드의 구성을 도시적으로 나타내며, 이들 각각은 인간 CMV 프로모터의 통제하에서 발현된다. 플라스미드 pGS116(도 2a) 및 pGS151(도 2b)는 hAAT에 대해 동일한 발현 카세트를 포함하며, pGS151은 시미안 바이러스 40(SV40 ori)의 DNA 복제의 기점을 추가적으로 포함한다. 또한, pGS177은 Epo 발현 카세트 외에 추가적으로 SV40 ori를 포함한다.
도 3은 T-항원 발현이 없는 모 양수 세포주(CAP)와 비교하여 T-항원을 발현하는 다른 양수 세포주(CAP-T Z582, Z583 및 Z597)에서 일시적으로 발현되는 배양 상청액 중 hAAT의 양을 도시적으로 나타낸다. Z582에서 T-항원은 CAG 프로모터(Niwa et al., Gene 108: 193-199, 1991)의 통제하에서 발현되고, Z583에서는 RSV(Rous Sarcoma Virus) 프로모터(Makrides, 9-26 in: Makrides (Hrsg.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003)의 통제하에서 발현되고, Z597에서는 CMV(시토메갈로) 프로모터(Makrides, 9-26 in: Makrides (Hrsg.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003)의 통제하에서 발현된다.
도 4는 배양 상청액에서 일시적으로 발현된 hAAT의 양(막대), 및 SV40 ori가 포함되지 않은 플라스미드(hAAT/세포수 - ori, 플라스미드 pGS116) 또는 SV40 ori가 포함된 플라스미드(hAAT/세포수 + ori, pGS151)의 트랜스펙션 이후의 다른 시점들에서 살아있는 세포의 세포수(선)를 도시적으로 나타낸다.
도 5는 배양 상청액에서 일시적으로 발현된 hAAT의 양(막대), 및 CAP-T 및 HEK293T 세포에서 pGS151(SV40 ori를 포함함)의 트랜스펙션 이후의 다른 시점들에서 살아있는 세포의 세포수(선)를 도시적으로 나타낸다.
도 6은 CAP-T 및 HEK293T 세포에서 트랜스펙션 이후의 다른 시점들에서 플라스미드 pGS116(SV40 ori 미포함) 및 pGS151(SV40 ori 포함)의 세포내 복제수를 도시적으로 나타낸다.
도 7은 배양 상청액에서 일시적으로 발현된 hAAT의 양(막대), 및 트랜스펙션 시약으로서 폴리에틸렌이민(PEI)를 포함하는 CAP-T에서 pGS151(SV40 ori 포함)의 트랜스펙션 이후의 다른 시점들에서 살아있는 세포의 세포수(선)를 도시적으로 나타낸다.

1. 클로닝 과정

a. 일차 양막세포의 형질전환을 위한 플라스미드: pSTK146, pGS119, pGS122

플라스미드 pSTK146은 EP 1230354 B1에 기재되어 있으며, 이는 뮤린 포스포글리세린산 키나제(pgk) 프로모터, 뉴클레오티드(nt.) 505 내지 3522의 아데노바이러스 혈청형 5(Ad5) 서열을 포함하고, SV40의 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호를 포함한다. pSTK146의 아데노바이러스 서열은 E1A 및 E1B를 인코딩하는 영역을 포함하며, 여기서 E1A의 발현은 pgk 프로모터에 의해 제어된다.

플라스미드 pGS119는 WO 2007/056994에 상세히 개시되어 있으며, 이는 뮤린 pgk 프로모터, nt. 505-3522의 Ad5 서열(E1A 및 E1B 영역을 포함함), SV40의 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호를 포함하며, nt. 3485-4079의 Ad5의 pIX 영역을 포함한다.

플라스미드 pGS122는 WO 2007/056994에 상세히 개시되어 있으며, 이는 각각의 조절 프로모터 및 폴리아데닐화 서열을 포함하는 E1A, E1B 및 pIX를 포함하는 nt. 1-4344를 갖는 아데노바이러스 서열을 포함한다. pGS122의 아데노바이러스 서열은 PmeI 제한 부위의 옆에 있다.

b. T-항원에 대한 발현 플라스미드: pGS158, pGS159, pGS161

플라스미드 pGS158, pGS159 및 pGS161은 모두 SV40의 T-항원에 대한 발현 카세트(서열번호 4)를 포함하며, 이는 SV40의 인트론(서열번호 6)과 폴리아데닐화 부위(서열번호 7)의 옆에 있다. 추가적으로, pGS158은 CAG 프로모터(CMV 인핸서와 닭 β-액틴 프로모터로 구성된 하이브리드 프로모터)(Niwa et al., Gene 108: 193-199, 1991)를 포함하고, pGS159는 RSV 프로모터(Rous Sarcoma Virus)(GenBank 접근번호 DQ075935)를 포함하며, pGS161은 CMV 프로모터(인간 시토메갈로 바이러스의 초기(earlier) 프로모터)(서열번호 5)를 포함한다. 안정적인 세포주 생성을 위해, 플라스미드 pGS158, pGS159 및 pGS161은 유비퀴틴 프로모터(pUB/Bsd, Invitrogen #V512-20)를 갖는 블라스티시딘 발현 카세트를 포함한다.

첫번째 단계에서, T-항원을 인코딩하는 서열을 포함하는 2.6kb 단편이 플라스미드 pGS140으로 도입되었다. 플라스미드 pGS140은 인간 CMV 프로모터(서열번호 5), 스플라이싱 공여/스플라이싱 수용 부위를 갖는 SV40의 인트론 영역(서열번호 6), 단수형(singular) NotI 제한 부위와 SV40의 PolyA 서열(서열번호 7)을 포함한다. T-항원 단편을 도입하기 위해, NotI를 갖는 pGS140은 선형화되었으며, 5'-돌출부(overhang)이 채워지고 분리된 단편과 묶였다. 이러한 과정에 따라 생성된 플라스미드는 pGS149라고 지칭되었다.

플라스미드 pGS158의 경우, XbaI를 갖는 pGS149가 소화되었으며, 인트론 서열, T-항원 및 PolyA 서열을 포함하는 약 3kb의 단편이 분리되었다. 이러한 단편은 pGS152의 NotI 제한 부위로 도입되었다(5' 돌출부가 채워짐). pGS152는 1.1kb 크기의 CAG 프로모터 단편(Niwa et al., Gene 108: 193-199, 1991)을 pUB/Bsd의 EcoRV 제한 부위로 삽입함으로써 생성되었다.

플라스미드 pGS159의 경우, pGS149의 T-항원을 포함하는 3kb 크기의 XbaI 단편이 pGS153의 채워진(filled-up) NotI 제한 부위로 도입되었다. pGS153은 pUB/Bsd의 EcoRV 제한 부위로 도입된 약 0.6kb 크기의 RSV 프로모터 단편을 포함한다.

플라스미드 pGS161의 경우, SphI를 갖는 pGS149가 소화되었으며, 3' 돌출부가 채워졌으며, CMV 프로모터, SV40 인트론, T-항원 서열 및 PolyA를 포함하는 3.6kb 단편이 분리되었으며, pUB/Bsd의 EcoRV 제한 부위로 도입되었다.

c. hAAT에 대한 발현 플라스미드: pGS116, pGS151

플라스미드 pGS116은 EP 1948789에 상세히 기재되어 있으며, 이는 인간 CMV 프로모터를 포함하며 뒤이어 SV40 스플라이싱 공여/스플라이싱 수용 부위, hAAT-cDNA(서열번호 12) 및 SV40 폴리아데닐화 부위를 포함한다.

플라스미드 pGS151(도 2b)은 상기 hAAT 발현 카세트 및 SV40의 DNA 복제 기점(ori)을 포함한다. SV40 DNA 및 프라이머 ori 1(CCGGAATTCTTTGCAAAAGCCTAGGCCTC)(서열번호 9) 및 ori 2(CCGGAATTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCT)(서열번호 10)을 사용하여, SV40 서열이 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭되었으며, EcoRI와 함께 소화되었으며(각각의 EcoRI 제한 부위는 프라이머에 위치함), pGS116의 EcoRI 제한 부위로 도입되었다.

d. Epo에 대한 발현 플라스미드: pGS177

플라스미드 pGS127은 EP 1948789에 상세히 기재되어 있으며, 이는 인간 CMV 프로모터를 포함하며 뒤이어 SV40 스플라이싱 공여/스플라이싱 수용 부위, 인간 에리스로포이에틴(Epo)에 대한 cDNA 및 SV40 폴리아데닐화 부위를 포함한다.

플라스미드 pGS177의 경우, SV40의 ori 단편은 프라이머 ori 1 및 ori 2에 의해 전술한 바와 같이 증폭되었으며, pGS127로 도입되었다.

2. 구조물의 확인

a. 서열 분석

전술한 모든 플라스미드의 완전성은 제한 소화에 의해 시험되었다. 또한, pGS151과 pGS177에서 SV40 ori 단편의 정확한 서열 및 배향은 서열분석을 통해 확인되었다. pSTK146, pGS119 및 pGS122에서 아데노바이러스 서열은 서열분석을 통해 결정되었으며, 이는 Ad5 야생형 서열과 완벽하게 일치하였다.

b. 일과성 발현에 대한 테스트

플라스미드 pSTK146, pGS119 및 pGS122는 HeLa 세포로 트랜스펙션되었으며, E1A 및 E1B 단백질의 발현은 모노클로날 항체를 사용하여 웨스턴 블로팅에 의해 분석되었다(Merck Bioscience). 플라스미드 pGS158, pGS159, pGS161은 HEK293 세포로 트랜스펙션되었으며, T-항원의 발현은 웨스턴 블로팅 및 모노클로날 항체(Abcam, Cambridge, UK)를 사용하여 검출되었다. 플라스미드 pGS116 및 pGS151은 CAP 세포로 트랜스펙션되었으며, 배양 상청액으로 인간 알파 1-항트립신(hAAT)의 발현 및 분비는 ELISA를 사용하여 확인되었다(6 참조).

마찬가지로, 플라스미드 pGS127 및 pGS177은 CAP 세포에서 트랜스펙션되었으며, 인간 Epo의 발현은 ELISA를 사용하여 확인되었다(6 참조).

3. 세포 배양

a. 세포주

형질전환된 양막세포(CAP 및 CAP-T)는 37℃, 95% 습도, 8% CO₂에서 0.5% 항진균제/항생제(Invitrogen #15240-062), 4mM L-글루타민(Invitrogen #25030-024)의 293 SFMII 배지(Invitrogen #11686-029)에서 배양되었다. CAP-T 세포의 배양 배지는 추가적으로 5㎍/ml 블라스티시딘(Invitrogen #R210-01)을 포함하였다. 세포는 진탕 플라스크에서 12ml 부피의 2-4 x 10⁵ 세포/ml의 개시 밀도로 종래의 방법으로 접종되었으며, 진탕배양기에서 100rpm으로 3-4일 동안 배양되었다. 1-2 x 10⁶ 세포/ml의 밀도에서, 세포는 원심분리에 의해 획득되었으며, 신선한 배지에서 전술한 개시 밀도로 계속해서 배양되었다.

HEK293, HEK293-T(ATCC# CRL-11268) 및 HeLa 세포는 세포 배양 접시에서 10% 소태아혈청을 갖는 둘베코 변형 이글 배지(개선 D-MEM, Invitrogen #12491-015)에서 부착 배양되었다. HEK293-T 세포는 293-SFMII 배지에서 무혈청 현탁 성장에 단계적으로 적응되었으며, 37℃, 95% 습도 및 8% CO₂에서 100rpm의 진탕 플라스크에서 배양되었다.

b. 일차 양막세포

일차 양막세포는 각각의 통상의 방법에 따라 양수천자 동안 획득되었다. 이러한 천자(puncture)의 1-2ml는 6cm Primaria 세포 배양 접시(Falcon)에서 37℃, 95% 습도 및 5% CO₂에서 5ml의 Ham's F10 배지(Invitrogen #31550-023), 10% 소태아혈청, 2%의 Ultroser G(CytoGen GmbH), 1x 항진균제/항생제(Invitrogen #15240-062)에 의해 배양되었다. 4-6일이 경과한 후, 양막세포는 착생하기 시작하였으며, 3ml의 신선한 배지 및 첨가물(전술한 내용 참조)이 첨가되었다. 세포가 완전하게 착생되었을 경우, 배지는 제거되었으며, 5ml의 신선한 배지 및 첨가물로 대체되었다. 또다른 계대를 위해, 전면 세포(confluent cell)는 PBS로 세척되었으며, 트립신(TrypleSelect, Invitrogen #12563011)으로 분해되었으며, 각각 10 또는 25ml의 신선한 배지 및 첨가물이 10cm 접시 또는 15cm 접시로 전달되었다.

4. 일차 양막세포의 형질전환

a. 트랜스펙션

배양된 일차 양막세포(3b 참조)는 플라스미드 pSTK146, pGS119 또는 pGS122에 의한 트랜스펙션을 통해 각각 형질전환되었다. 사전에, 개별 플라스미드는 적합한 제한 효소(pSTK146, pGS119: ScaI; pGS122: PmeI)에 의한 소화를 통해 선형화되었다. 트랜스펙션 이전에, 양막세포는 2%의 Ultroser를 갖는 Opti-Pro 배지(Invitrogen #12309-019)에 단계적으로 적응되었다. 또한, 세포는 2-3일마다 75:25%, 50:50%, 25:75% 및 0:100%의 비율로 신선한 Ham's F10 배지(첨가물과 함께, 3b 참조) 및 Opti-Pro 배지(2%의 Ultroser)로 각각 옮겨졌다. 트랜스펙션하는 동안, 약 80% 전면 15cm 접시의 세포는 6cm 접시로 분배되었으며, 이는 접시 당 5-7 x 10⁵개 세포의 세포수에 상응하였다. 다음날, 제조자의 프로토콜에 따라 5개의 접쉬의 세포가 트랜스펙션 시약 Effectene(Qiagen)을 사용하여 2㎍의 선형화된 pSTK146, pGS119 또는 pGS122 각각으로 트랜스펙션되었다. 하나의 접시는 트랜스펙션되지 않았으며, 대조군으로서 계속해서 배양되었다. 다음날, 세포는 PBS로 세척되었으며, TrypleSelect에 의해 분리되었으며, 15cm 접시로 전달되었다. 세포는 다시 10-15일 동안 배양되었으며, 3-4일마다 신선한 배지로 대체되었다. 상기 기간 동안, Ultroser의 첨가는 1%까지 감소되었다. 약 10-15일이 경과한 후, 세포는 전면(confluent)되었으며, 전술한 바와 같이 15cm 접시로 전달되었다.

b. 형질전환된 세포 클론의 분리

트랜스펙션으로부터 몇 주가 경과한 후에, 모든 트랜스펙션에서 클론 세포 섬(clonal cell island)이 관찰되었으며, 상기 세포 섬은 형태학적으로 형질전환되지 않은 양막세포와 유의적으로 구별되었다. 이러한 세포 섬이 선택되었으며, 24-웰 접시로 전달되었다(계대 1에 상응함). 세포는 계속 증식되었으며, 우선 6cm 접시로, 이어서 15cm 접시로 전달되었다. 개별 클론 세포주에서 E1 단백질의 발현은 모노클로날 항체를 사용한 웨스턴 블로팅 분석에서 확인되었다(2b 참조).

형질전환된 양막 세포주에 기초한 T-항원 발현 세포주의 생성은, pGS119에 의한 트랜스펙션을 통해 획득된 세포주(이는 하기에서 CAP 세포주로 명명됨)에 대해 하기에서 예시적으로 기재된다. 클론 세포 섬의 분리 및 증식 이후에, "한계-희석 방법"을 통한 단일 세포 클로닝에 의해 유전적으로 균일한 세포주가 세포 클론으로부터 생성되었다. 요약하면, 클론되어질 클론의 세포가 96-웰 플레이트에 플레이팅되고, 다음날 미세하게 단지 하나의 세포만 실질적인 증식이 현미경을 이용하여 조절되었다. 단일 세포로부터 생성된 세포주는 단계적으로 15cm 접시로 확장되었다. 293SFMII 배지를 갖는 Opti-Pro/1% Ultroser 배양 배지의 단계적 희석을 통해, 세포가 무혈청 배지에서 현탁 성장에 적응하게 되었다. 개별 세포주는 안정적이고 일과성인 단백질 발현과 높은 성장 밀도가 분석되었으며, 가장 우수한 특성을 갖는 클론이 선택되어 하기에서 사용되었다.

5. T-항원을 발현하는 세포 풀(pool)의 생성

각각의 1 x 10⁷개의 CAP 세포(플라스미드 pGS119에 의한 일차 양막세포의 트랜스펙션에 의해 획득되었으며, 무혈청 배지에서 현탁 성장에 적응되었음)는 선형화된 pGS158, pGS159 및 pGS161 플라스미드 DNA 5㎍으로 트랜스펙션되었으며, 전술한 조건하에서 진탕 플라스크에서 배양되었다. 안정적으로 트랜스펙션된 세포를 선택하기 위해, 트랜스펙션한지 48시간 이후에 5㎍/ml의 블라스티시딘이 첨가되었으며, 약 3-4주가 경과한 후에 안정적으로 성장하는 세포 풀이 생성될 때까지 세포는 계속해서 배양되었다. 상기 세포 풀은 Z582(pGS158로 트랜스펙션, T-항원은 CAG 프로모터에 의해 발현됨), Z583(pGS159로 트랜스펙션, T-항원은 RSV 프로모터에 의해 발현됨), 및 Z597(pGS161로 트랜스펙션, T-항원은 CMV 프로모터에 의해 발현됨)로 명명되었다. T-항원 농도의 증가가 CAP 세포에 잠재적으로 독성을 갖는지 여부가 불분명하기 때문에, 서로 다른 강도를 갖는 프로모터를 통해 T-항원을 발현하려는 시도가 있었다. CAP 세포에서 기준 단백질의 발현이 CMV 프로모터를 사용할 때 가장 높았고, CAG 프로모터 사용할 때 약간 더 낮았으며, RSV 프로모터를 사용할 때에는 현저하게 낮았다는 사실을 보여주었다. 상기 세 개의 프로모터 모두를 통해 안정적으로 성장한 세포 풀이 만들어질 수 있었고, 세 개의 모든 세포 풀이 세포내 T-항원을 발현시킬 수 있었다.

6. CAP 및 CAP-T 세포에서 일관성 단백질 발현

여기서 사용된 359bp의 ori-단편은 길이가 63bp인 최소 ori에 비해 코어 서열에 추가적으로 21bp 및 72bp 반복 서열(서열번호 11)을 포함한다. 이러한 두 개의 반복 서열은 ori를 오버래핑하는 프로모터의 기능에 주로 중요하지만, 이는 SV40 DNA의 복제가 증강되었다는 증거이다(Chandrasekharappa and Subramanian, J. Virol. 61, 2973-2980, 1987).

세포에서 T-항원의 농도가 기준 단백질의 발현에 영향을 미치는지 여부를 테스트하기 위해, 서로 다른 강도의 프로모터에 의해 T-항원을 발현하는 세 개의 세포 풀 Z582, Z583 및 Z597이 테스트되었으며, T-항원을 발현하지 않는 CAP 세포의 일과성 발현과 비교되었다. 또한, 각각의 1 x 10⁷ 개의 세포는 뉴클레오펙터 기술(Amaxa/Lonza, 프로그램 X-001, Puffer V)를 사용하여 환형 플라스미드 pGS151로 트랜스펙션되었으며, 12ml의 개시 부피에서 배양되었다. 배지는 트랜스펙션한지 3일과 6일 후에 대체되었으며, 6일째에 부피는 15ml로 증가되었다. 트랜스펙션 이후 3일째부터 7일째를 포함한 날까지, 그리고 트랜스펙션 이후 9일째에 하나의 앨리쿼트(aliquot)가 각각 획득되었으며, 세포수가 결정되었으며, hAAT의 발현은 폴리클로날 항-hAAT 항체(HRP와 짝지어지지 않은 것과 짝지어진 것; ICN Biomedicals)를 사용하여 ELISA(효소결합면역흡착측정) 방법을 통해 결정되었다. 대조군으로서, 인간의 혈장으로부터 정제된 hAAT(ICN Bilmedicals)가 사용되었다.

상기 실험 결과는 도 3에 도표로 도시되어 있다. 모든 CAP-T 세포 풀에서, CAP 세포에 비해 더 높은 일과성 발현이 달성되었다. Z582에서 일과성 발현은 8배, Z583은 25배 및 Z597은 70배로서 CAP 세포보다 더 높다. 또한, CMV 프로모터에 의해 T-항원을 발현하는 두번째 CAP-T 세포 풀은 Z597에서의 발현처럼 비슷하게 높은 발현을 보여주었다. 이러한 데이터는 CAP 세포에서 T-항원의 영구적인 발현 뿐만 아니라 T-항원 발현의 수준이 일과성 발현의 수준에 대해 영향을 미친다는 사실을 입증한다.

또다른 실험에서, hAAT의 일과성 발현의 수준은 플라스미드 pGS116 또는 pGS151의 일과성 트랜스펙션 이후에 세포 풀 Z597에서 결정되었다. 이러한 두 개의 플라스미드는 단지 pGS151의 SV40-ori 단편의 존재에서만 서로 차이를 갖는다. hAAT의 트랜스펙션 및 정량적 분석은 전술한 바와 같이 수행되었으며, hAAT의 발현 수준 뿐만 아니라 살아있는 세포 수의 진행이 9일간의 기간에 걸쳐 결정되었다. 이러한 연구의 결과는 도 4에 도표로 도시되어 있다. 발현 플라스미드에서 SV-ori 단편의 존재는 30배 더 높아진 일과성 발현의 증가를 야기한다. 전체적으로, 9일 이내에 40ml 부피의 1 x 10⁷ 개의 CAP-T 세포의 트랜스펙션을 통해 2.5mg hAAT가 발현될 수 있었으며, 이는 약 60 mg/L 내지 40 pg/cell/day의 발현율에 대응한다. 트랜스펙션한지 약 3일 후에 세포성장이 시작되었으며, 세포의 활력은 전체 연구 기간 동안 80% 이상 남아 있다.

이러한 일과성 발현율이 hAAT에 대해 특이적이지 않다는 점을 입증하기 위하여, 또다른 높은 글리코실화 단백질인 에리스로포이에틴(Epo)이 CAP-T 세포에서 일과성 발현되었다. hAAT에 대해 공지된 바와 같이, Z597 세포 풀의 1 x 10⁷ 개의 CAP-T 세포는 플라스미드 pGS177(SV40-ori 단편 및 Epo에 대한 발현 카세트를 포함함)로 트랜스펙션되었으며, Epo는 세포 상청액에서 ELISA(R&D Systems, Quantikine IVD, Human Epo Immunoassay, DEP00)를 통해 정량화되었다. 7일간의 연구 기간에서, 0.73mg의 Epo가 32 mg/L의 발현율로 발현될 수 있었다.

7. 다른 세포 시스템에서 일과성 발현과의 비교

전술한 인간 세포주, 즉 HEK293-T 세포주는 안정적으로 SV40 T-항원을 발현 시키고, 이는 아데노바이러스로 형질전환된 인간 HEK293 세포주에 기초한다(DuBridge et al., Mol. Cell. Biol. 7, 379-387, 1987). Z597과 비교하여, 1 x 10⁷ 개의 HEK293-T 세포(무혈청 배지, 현탁 배양)는 제조자의 프로토콜에 따른 Amaxa 뉴클레오펙터 기술(프로그램 X-001, Puffer V)을 통해 5㎍의 환형 플라스미드 pGS151로 트랜스펙션되고 배양되었다. 이러한 실험의 결과는 도 5에 도표로 도시되어 있다. 9일째에 293-T 세포수가 CAP-T의 경우보다 현저히 더 높았음에도 불구하고, CAP-T에서의 일과성 발현은 293-T의 경우에 비해 약 40배 더 증가되었다.

8. 복제 어세이(assay)

CAP-T 세포의 T-항원 발현이 ori를 포함하는 발현 플라스미드의 복제 수의 증가를 야기하는지 여부와 이와 함께 현저하게 증가된 일과성 단백질 발현이 설명되는지 여부가 복제 어세이에서 보여져야 한다. 또한, Z597 및 HEK293-T 세포는 플라스미드 pGS116 및 pGS151로 각각 트랜스펙션되었으며, 전술한 바와 같이 배양되었다. 6, 12, 24, 48, 72 및 96 시간이 경과한 후, 각각의 1 x 10⁵ 개의 세포가 획득되고, 원심분리되었으며, PBS에 수용되었으며, 동일한 부피의 0.8N NaOH를 첨가함으로써 용해되었다. 세포 용해물은 SlotBlot 장치에서 양전하 나일론 막(GE Healthcare, Hybond-N+)으로 블로팅되었다. 대조군으로서, 증가한 양의 플라스미드 pGS116 및 pGS151이 1 x 10⁵ 개의 Z597 세포에 첨가되었으며, 전술한 바와 같이 용해되고 블로팅되었다. 이러한 기준은 세포당 1000, 2500, 5000, 10000 및 15000 복제에 대응한다. DNA는 상기 막을 30분 동안 120℃에서 인큐베이트함으로써 고정되었으며, 제조자의 프로토콜에 따라 hAAT-cDNA로 구성된 비-방사성 PCR 프로브를 사용하여 가시화되었다(AlkPhos Direct Labelling and Detection System, GE Healthcare, RPN 3680 and 3682). pGS116 및 pGS151로 트랜스펙션된 세포에서 복제 수는 표준 플라스미드를 알려진 농도로 사용하여 정량화되었다. 이러한 복제 어세이의 결과는 도 6에 도표로 도시되어 있다. CAP-T Z597에서 단지 pGS151만 복제되었으며, pGS116은 복제되지 않았다. pGS151의 복제 수는, 트랜스펙션한지 6시간 경과 후 약 1500 복제/세포로부터 트랜스펙션한지 72시간 경과 후 거의 7000 복제/세포로 증가하였으며, 세포 수는 동일하게 남아있었다. 이에 비해, pGS151의 복제 수는 HEK293-T에서 96시간이 경과한 후에도 일정하게 유지되었다. 293-T 세포의 세포수가 상기 시간 동안 두 배로 증가했기 때문에, 상기 세포에서 pGS151의 복제가 낮다는 점이 추정될 수 있지만, 이는 Z597의 복제율보다 현저하게 낮은 수치이다.

양막 세포주와 HEK293-T 세포에서 T-항원의 발현의 증명은 웨스턴 블로팅 분석을 통해 실시되었다. 세 개의 CAP-T 세포 풀과 HEK293-T 세포에서, 각각의 1 x 10⁶ 개의 세포가 50㎕ 50mM Tris/HCL pH8, 140mM NaCl, 0.5% NP40, 4mM EDTA, 2mM EGTA, 0.5mM PMSF, 5% 글리세롤에 수용되었으며, 30분 동안 얼음상에서 인큐베이트되었다. 단백질 혼합물은 10분 동안 13000rpm으로 원심분리되었으며, 상청액에서 단백질 농도가 단백질 검출 키트(Coomassie, Bradford, Thermo Life Science# 23200)를 사용하여 결정되었다. 12%의 SDS 폴리아크릴아미드 겔에서, 각각의 10㎍ 단백질이 분리되고, 니트로셀룰로스 막(Hybond ECL, Amersham Pharmacia Biotech)으로 이동되었으며, T-항원 특이적 항체(Abcam, 항-SV40 T-항원 ab16879)를 사용하여 가시화되었다. 이러한 실험에 의해, 두 개의 다른 풀과 HEK-293-T 세포의 경우보다 Z597에서 T-항원이 더 많이 발현된다는 사실이 확인될 수 있었다.

9. 폴리에틸렌이민에 의한 트랜스펙션

전술한 트랜스펙션 방법은 제한된 방식으로만 양을 측정할 수 있기 때문에, 특히 대량으로 트랜스펙션을 위해 개시된 또다른 트랜스펙션 시약인 폴리에틸렌이민(PEI, Polysciences, #23966)이 테스트되었다. 선형 PEI(MW=25,000)가 제조사의 프로토콜에 따라 1 mg/ml의 농도로 용해되었으며, DNA:PEI=1:3의 비율로 사용되었다. 트랜스펙션을 위해, 10㎍의 pGS151이 30㎍의 PEI와 혼합되었으며, 10분 동안 실온에서 인큐베이션되었으며, 6ml의 FreeStyle 배지(Invitrogen #12338-018)에서 1 x 10⁷ 개의 CAP-T Z597 세포에 첨가되었다. 5시간이 경과한 후, 6ml의 293-SFMII 배지가 첨가되었으며, 세포는 7일 동안 인큐베이션되었다. 트랜스펙션한지 3일 이후에 배지가 293-SFMII로 대체되었으며, 세포의 강한 성장 때문에 부피가 30ml로 증가하였다. 이러한 실험의 결과는 도 7에 도표로 도시되어 있다. PEI에 의한 트랜스펙션을 통해, CAP-T에서 높은 단백질의 일과성 발현이 달성되었다. 물론 단백질의 최대 수율은 뉴클레오펙션에 의해 달성된 발현보다 약 2배 낮은 수치였다. 놀랍게도, PEI에 의한 트랜스펙션 이후에 세포는 훨씬 더 빠르고 강하게 성장하였으며, 7일 이후에 세포수는 뉴클레오펙션에 비해 약 10배 더 높았다.

SEQUENCE LISTING <110> CEVEC Pharmaceuticals GmbH <120> NOVEL PERMANENT HUMAN CELL LINE <130> IP20111802DE <150> DE 10 2009 003 439.0 <151> 2009-02-05 <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 4344 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 1-4344 Ad5 <400> 1 catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt 60 ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt 120 gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg 180 gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag 240 taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga 300 agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tatttgtcta gggccgcggg 360 gactttgacc gtttacgtgg agactcgccc aggtgttttt ctcaggtgtt ttccgcgttc 420 cgggtcaaag ttggcgtttt attattatag tcagctgacg tgtagtgtat ttatacccgg 480 tgagttcctc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagtag agttttctcc tccgagccgc 540 tccgacaccg ggactgaaaa tgagacatat tatctgccac ggaggtgtta ttaccgaaga 600 aatggccgcc agtcttttgg accagctgat 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tcgaggactt gcttaacgag 1500 cctgggcaac ctttggactt gagctgtaaa cgccccaggc cataaggtgt aaacctgtga 1560 ttgcgtgtgt ggttaacgcc tttgtttgct gaatgagttg atgtaagttt aataaagggt 1620 gagataatgt ttaacttgca tggcgtgtta aatggggcgg ggcttaaagg gtatataatg 1680 cgccgtgggc taatcttggt tacatctgac ctcatggagg cttgggagtg tttggaagat 1740 ttttctgctg tgcgtaactt gctggaacag agctctaaca gtacctcttg gttttggagg 1800 tttctgtggg gctcatccca ggcaaagtta gtctgcagaa ttaaggagga ttacaagtgg 1860 gaatttgaag agcttttgaa atcctgtggt gagctgtttg attctttgaa tctgggtcac 1920 caggcgcttt tccaagagaa ggtcatcaag actttggatt tttccacacc ggggcgcgct 1980 gcggctgctg ttgctttttt gagttttata aaggataaat ggagcgaaga aacccatctg 2040 agcggggggt acctgctgga ttttctggcc atgcatctgt ggagagcggt tgtgagacac 2100 aagaatcgcc tgctactgtt gtcttccgtc cgcccggcga taataccgac ggaggagcag 2160 cagcagcagc aggaggaagc caggcggcgg cggcaggagc agagcccatg gaacccgaga 2220 gccggcctgg accctcggga atgaatgttg tacaggtggc tgaactgtat ccagaactga 2280 gacgcatttt gacaattaca gaggatgggc aggggctaaa 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ctcttggttt tggaggtttc tgtggggctc atcccaggca 1320 aagttagtct gcagaattaa ggaggattac aagtgggaat ttgaagagct tttgaaatcc 1380 tgtggtgagc tgtttgattc tttgaatctg ggtcaccagg cgcttttcca agagaaggtc 1440 atcaagactt tggatttttc cacaccgggg cgcgctgcgg ctgctgttgc ttttttgagt 1500 tttataaagg ataaatggag cgaagaaacc catctgagcg gggggtacct gctggatttt 1560 ctggccatgc atctgtggag agcggttgtg agacacaaga atcgcctgct actgttgtct 1620 tccgtccgcc cggcgataat accgacggag gagcagcagc agcagcagga ggaagccagg 1680 cggcggcggc aggagcagag cccatggaac ccgagagccg gcctggaccc tcgggaatga 1740 atgttgtaca ggtggctgaa ctgtatccag aactgagacg cattttgaca attacagagg 1800 atgggcaggg gctaaagggg gtaaagaggg agcggggggc ttgtgaggct acagaggagg 1860 ctaggaatct agcttttagc ttaatgacca gacaccgtcc tgagtgtatt acttttcaac 1920 agatcaagga taattgcgct aatgagcttg atctgctggc gcagaagtat tccatagagc 1980 agctgaccac ttactggctg cagccagggg atgattttga ggaggctatt agggtatatg 2040 caaaggtggc acttaggcca gattgcaagt acaagatcag caaacttgta aatatcagga 2100 attgttgcta catttctggg aacggggccg aggtggagat agatacggag gatagggtgg 2160 cctttagatg tagcatgata aatatgtggc cgggggtgct tggcatggac ggggtggtta 2220 ttatgaatgt aaggtttact ggccccaatt ttagcggtac ggttttcctg gccaatacca 2280 accttatcct acacggtgta agcttctatg ggtttaacaa tacctgtgtg gaagcctgga 2340 ccgatgtaag ggttcggggc tgtgcctttt actgctgctg gaagggggtg gtgtgtcgcc 2400 ccaaaagcag ggcttcaatt aagaaatgcc tctttgaaag gtgtaccttg ggtatcctgt 2460 ctgagggtaa ctccagggtg cgccacaatg tggcctccga ctgtggttgc ttcatgctag 2520 tgaaaagcgt ggctgtgatt aagcataaca tggtatgtgg caactgcgag gacagggcct 2580 ctcagatgct gacctgctcg gacggcaact gtcacctgct gaagaccatt cacgtagcca 2640 gccactctcg caaggcctgg ccagtgtttg agcataacat actgacccgc tgttccttgc 2700 atttgggtaa caggaggggg gtgttcctac cttaccaatg caatttgagt cacactaaga 2760 tattgcttga gcccgagagc atgtccaagg tgaacctgaa cggggtgttt gacatgacca 2820 tgaagatctg gaaggtgctg aggtacgatg agacccgcac caggtgcaga ccctgcgagt 2880 gtggcggtaa acatattagg aaccagcctg tgatgctgga tgtgaccgag gagctgaggc 2940 ccgatcactt ggtgctggcc 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gagtggaaag agagattgga 2160 caaagagttt agtttgtcag tgtatcaaaa aatgaagttt aatgtggcta tgggaattgg 2220 agttttagat tggctaagaa acagtgatga tgatgatgaa gacagccagg aaaatgctga 2280 taaaaatgaa gatggtgggg agaagaacat ggaagactca gggcatgaaa caggcattga 2340 ttcacagtcc caaggctcat ttcaggcccc tcagtcctca cagtctgttc atgatcataa 2400 tcagccatac cacatttgta gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc 2460 tgaacctgaa acataaggat ccagcgatcc gcctgaatt 2499 <210> 5 <211> 523 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CMV-Promotor <400> 5 gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg 60 acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa 120 tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca 180 agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac 240 atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc 300 atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga 360 tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg 420 gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta 480 cggtgggagg tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc gtc 523 <210> 6 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SV40 SD/SA (intron) <400> 6 taagtttagt ctttttgtct tttatttcag gtcccggatc cggtggtggt gcaaatcaaa 60 gaactgctcc tcagtggatg ttgcctttac ttctagg 97 <210> 7 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SV40 polyA (T-Antigen) <400> 7 ggggatccag acatgataag atacattgat gagtttggac aaaccacaac tagaatgcag 60 tgaaaaaaat gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg ctttatttgt aaccattata 120 agctgcaata aacaagttaa caacaac 147 <210> 8 <211> 1926 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> EBNA-1 <400> 8 atgtctgacg aggggccagg tacaggacct ggaaatggcc taggagagaa gggagacaca 60 tctggaccag aaggctccgg cggcagtgga cctcaaagaa gagggggtga taaccatgga 120 cgaggacggg gaagaggacg aggacgagga ggcggaagac caggagcccc gggcggctca 180 ggatcagggc caagacatag agatggtgtc cggagacccc aaaaacgtcc aagttgcatt 240 ggctgcaaag ggacccacgg tggaacagga gcaggagcag gagcgggagg ggcaggagca 300 ggaggggcag gagcaggagg aggggcagga gcaggaggag gggcaggagg ggcaggaggg 360 gcaggagggg caggagcagg aggaggggca ggagcaggag gaggggcagg aggggcagga 420 ggggcaggag caggaggagg ggcaggagca ggaggagggg caggaggggc aggagcagga 480 ggaggggcag gaggggcagg aggggcagga gcaggaggag gggcaggagc aggaggaggg 540 gcaggagggg caggagcagg aggaggggca ggaggggcag gaggggcagg agcaggagga 600 ggggcaggag caggaggggc aggaggggca ggaggggcag gagcaggagg ggcaggagca 660 ggaggagggg caggaggggc aggaggggca ggagcaggag gggcaggagc aggaggggca 720 ggagcaggag gggcaggagc aggaggggca ggaggggcag gagcaggagg ggcaggaggg 780 gcaggagcag gaggggcagg aggggcagga gcaggaggag gggcaggagg ggcaggagca 840 ggaggagggg caggaggggc aggagcagga ggggcaggag gggcaggagc aggaggggca 900 ggaggggcag gagcaggagg ggcaggaggg gcaggagcag gaggaggggc aggagcagga 960 ggggcaggag caggaggtgg aggccggggt cgaggaggca gtggaggccg gggtcgagga 1020 ggtagtggag gccggggtcg aggaggtagt ggaggccgcc ggggtagagg acgtgaaaga 1080 gccagggggg gaagtcgtga aagagccagg gggagaggtc gtggacgtgg agaaaagagg 1140 cccaggagtc 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tccaaggccg tgcataaggc tgtgctgacc atcgacgaga 1140 aagggactga agctgctggg gccatgtttt tagaggccat acccatgtct atcccccccg 1200 aggtcaagtt caacaaaccc tttgtcttct taatgattga acaaaatacc aagtctcccc 1260 tcttcatggg aaaagtggtg aatcccaccc aaaaataact gcctctcgct cctcaacccc 1320 tcccctccat ccctggcccc ctccctggat gacattaaag aagggttgag ctggattg 1378

Claims (10)

1. 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 영구적인 인간 양막 세포주의 제조방법:
   a) 아데노바이러스 유전자 기능 E1A 및 E1B를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 갖는 일차 인간 양막 세포를 트랜스펙션하는 단계, 및
   b) 그 후, SV40 라지 T-항원 또는 엡스타인-바 바이러스(EBV) 핵 항원-1(EBNA-1)을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 갖는 상기 a) 단계에서 획득된 영구적인 인간 양막 세포주를 트랜스펙션하는 단계.
2. 제1항에 있어서,
   상기 아데노바이러스 유전자 기능 E1A 및 E1B를 인코딩하는 핵산 서열이 인간 아데노바이러스, 특히 인간 아데노바이러스 혈청형 5에서 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제2항에 있어서,
   상기 아데노바이러스 유전자 기능 E1A 및 E1B를 인코딩하는 핵산 서열이 인간 아데노바이러스 혈청형 5의 뉴클레오티드 1 내지 4344, 505 내지 3522 또는 뉴클레오티드 505 내지 4079를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항에 있어서,
   상기 SV40 라지 T-항원을 인코딩하는 핵산 서열이 CMV 프로모터, CAG 프로모터 및 RSV 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터에 대한 핵산 서열, SV40 SD/SA(인트론)에 대한 핵산 서열 및 SV40 polyA에 대한 핵산 서열을 포함하고, 상기 엡스타인-바 바이러스(EBV) 핵 항원-1(EBNA-1)을 인코딩하는 핵산 서열이 CMV 프로모터, CAG 프로모터 및 RSV 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터에 대한 핵산 서열, SV40 SD/SA(인트론)에 대한 핵산 서열 및 SV40 polyA에 대한 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 a) 단계를 대신하여, 이미 불멸화된 인간 양막 세포주가 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 획득되는, 영구적인 인간 양막 세포주.
7. 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제6항에 따른 영구적인 인간 양막 세포주를 사용하여 재조합 폴리펩티드 또는 단백질의 일과성 발현 방법:
   a) 원하는 재조합 폴리펩티드 또는 단백질 및 SV40 라지 T-항원 또는 엡스타인-바 바이러스(EBV) 핵 항원-1(EBNA-1)에 대한 인식 또는 결합 위치를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 갖는 영구적인 인간 양막 세포주를 트랜스펙션하는 단계,
   b) 원하는 재조합 폴리펩티드 또는 단백질의 발현을 허용하는 조건하에서, 상기 a) 단계에서 획득된 트랜스펙션된 영구적인 인간 양막 세포주를 배양하는 단계, 및
   c) 그 후, 원하는 재조합 폴리펩티드 또는 단백질을 세포 또는 배양 상청액으로부터 분리하는 단계.
8. 제7항에 있어서,
   상기 재조합 폴레펩티드 또는 단백질이 호르몬, 플라스마 인자, 혈액 응고 인자, 성장 인자, 세포 수용체, 융합 단백질, 콕사키 및 아데노바이러스 수용체(CAR), 항체, 바이러스성 항원, 박테리아 항원 또는 기생생물 항원, 또는 재조합 바이러스를 생성하기 위한 상보성 인자(complement factor)인 것을 특징으로 하는 방법.
9. 폴리펩티드 또는 단백질을 제조하기 위한, 제6항에 따른 세포주의 사용방법.
10. 제7항 또는 제8항에 따른 방법에 의해 획득될 수 있는 폴리펩티드 또는 단백질.

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