ES2642837T3 - Nueva línea celular humana permanente - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la expresión transitoria de polipéptidos y proteínas recombinantes utilizando una línea celular de amniocitos humanos permanente, que comprende las siguientes etapas: a) transfección de la línea celular de amniocitos humanos permanente con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido o proteína recombinante deseado y un lugar de reconocimiento o de unión para el antígeno T grande de SV40 o el antígeno nuclear-1 (EBNA-1) del virus Epstein-Barr (EBV), b) cultivo de la línea celular de amniocitos humanos permanente transfectada obtenida en la etapa a) bajo condiciones que permitan la expresión del polipéptido o la proteína recombinante deseado y, a continuación c) aislamiento del polipéptido o la proteína recombinante deseado a partir de las células o a partir del sobrenadante del cultivo, obteniéndose la línea celular de amniocitos humanos permanente mediante un procedimiento, que comprende: i) transfección de células de amniocitos humanas primarias con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica las funciones génicas E1A y E1B adenovirales, y ii) subsiguiente transfección de la línea celular de amniocitos humana permanente obtenida en la etapa i) con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el antígeno T grande de SV40 o el antígeno nuclear-1 (EBNA-1) del virus Epstein-Barr (EBV).

Description

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DESCRIPCION

Nueva lmea celular humana permanente

La presente invencion se refiere a un procedimiento para la expresion transitoria de polipeptidos y protemas recombinantes en una lmea celular humana permanente que comprende las secuencias de acidos nucleicos para las funciones genicas E1A y E1B adenovirales y la secuencia de acidos nucleicos para el antigeno T grande de SV40 o el antfgeno nuclear 1 (EBNA-1) del virus Eptstein-Barr (EBV).

Junto a bacterias, levaduras y celulas vegetales se utilizan particularmente celulas animales para la produccion de polipeptidos o protemas recombinantes. Aproximadamente 60-70% de todas las protemas terapeuticas se producen hoy en dfa en celulas de mai^eras (Wurm, Nat. Biotechnology 22, 1393-1398, 2004). La produccion de polipeptidos o protemas recombinantes para fines terapeuticos, diagnosticos o tecnicos en cultivo celular, es decir, in vitro, puede tener lugar basicamente de dos modos diferentes. En lmeas celulares estables, establecidas de manera duradera o permanente, el acido nucleico que codifica el polipeptido o la protema deseados, esta integrado en al menos una copia en el ADN cromosomico de la celula y es transmitido a las celulas hijas durante la division celular con el conjunto celular de cromosomas (la denominada expresion estable en lmeas celulares de produccion). Para la preparacion de estas lmeas celulares de produccion estables es necesario que al menos uno de los acidos nucleicos incorporados en la celula mediante transfeccion porte una funcion genica que otorgue a la celula una ventaja de seleccion durante el crecimiento en el cultivo celular. El acido nucleico que contiene una funcion genica de este tipo no tiene necesariamente que estar presente en la misma molecula que el casete de expresion para el polipeptido o la protema deseados. La funcion genica es un gen de resistencia frente a antibioticos o agentes quimioterapeuticos en el medio (p. ej., frecuentemente utilizado en celulas de mairnferos; Wurm, Nat. Biotechnology 22, 1393-1398, 2004), un gen, cuyo producto genico complementa una via del metabolismo deficiente (p. ej., utilizado en celulas de levadura) o una funcion genica transformante (mostrada para celulas del lfquido amniotico humanas; Schiedner et al., BMC Biotechnology 8, 13, 2008). De esta manera se garantiza que este tipo de celulas, en las que ha tenido lugar una integracion estable del acido nucleico transfectado en el ADN cromosomico de la celula y se prepara el producto genico, invadan a las otras celulas sin una integracion de este tipo y puedan seleccionarse. En el caso de la obtencion de las celulas de produccion, mediante transfeccion en la denominada lmea celular del huesped se transfiere, por una parte, el acido nucleico que codifica el polipeptido recombinante (el denominado transgen) con los elementos de regulacion transcripcionales necesarios, por otra, se transfiere un segundo casete de expresion con un gen que codifica un marcador de seleccion y cuyo producto genico otorga a la celula una determinada ventaja de seleccion. Pocos dfas despues de la transferencia del gen, durante la cual las celulas son cultivadas, p. ej., en un medio de cultivo sin reactivo de seleccion, se agrega al medio un reactivo de seleccion adecuado. En presencia del reactivo de seleccion, sobreviven y crecen solamente aquellas celulas que han recogido los acidos nucleicos utilizados para la transfeccion y expresan el marcador de seleccion. Marcadores de seleccion utilizados a menudo son el gen de resistencia a neomicina, el gen de resistencia a higromicina y la dihidrofolato-reductasa (DHFR) (Wurm, Nat. Biotechnology 22, 1393-1398, 2004; Wurm y Jordan, 309-333 en: Makrides (Comp.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003). La seleccion tiene lugar de manera correspondiente en medio de cultivo con los reactivos de seleccion tales como el antibiotico neomicina o higromicina o bien el glucocorticoide sintetico metotrexato. Celulas con el marcador de seleccion y el transgen que sobreviven al proceso de seleccion y proliferan (los denominados transformantes) se individualizan (clonan) seguidamente por norma general con el fin de garantizar que todas las celulas sean geneticamente identicas en el cultivo y con el fin de separar las lmeas celulares de produccion deseadas con la mejor tasa de produccion de lmeas celulares de peor produccion.

Por el contrario, en la denominada expresion transitoria, el acido nucleico incorporado en la celula mediante transfeccion, que codifica el polipeptido o la protema deseados, no es integrado en el ADN cromosomico de la celula o bien no es seleccionado en base a este suceso y, con ello, el acido nucleico incorporado se diluye por norma general en el transcurso de las divisiones celulares durante el crecimiento del cultivo y se pierde, lo cual condiciona la naturaleza pasajera y transitoria de este proceso de expresion. La seleccion de lmeas celulares de produccion estables con una buena eficiencia de la expresion dura algunos meses y determina costes considerables. Por el contrario, mediante la expresion transitoria pueden prepararse sin mas cantidades en miligramos del polipeptido o la protema deseados en el espacio de algunos dfas. La velocidad y los costes son factores esenciales en el desarrollo industrial de productos biofarmaceuticos y de diagnostico. La expresion transitoria de protemas en pequenas cantidades o de diferentes variantes de una protema se lleva a cabo, por lo tanto, excepto en la investigacion basica para el desarrollo exploratorio y pre-clmico temprano, p. ej., en la identificacion de la diana, en el desarrollo del ensayo, la caracterizacion bioqmmica de los productos genicos, para la toxicologfa e investigaciones farmacocineticas asf como farmacodinamicas (Baldi et al., Biotechnol. Lett. 29, 677-684, 2007; Pham et al., Molecular Biotechnology 34, 225-237, 2006). La produccion industrial de protemas a escala de gramos hasta kilogramos para la realizacion de estudios clmicos mayores y el abastecimiento del mercado tiene lugar, por el contrario, con ayuda de lmeas celulares de produccion estables.

En el documento EP 1948789 se describe, por ejemplo, un procedimiento para la preparacion de una lmea celular de amniocitos humana permanente mediante transfeccion de un factor transformante de la celula sin el uso de un marcador de seleccion.

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Protemas segregadas, situadas en la membrana e intracelulares, podfan ser preparadas hasta ahora mediante la expresion genica transitoria. Las celulas de mai^eras son para muchas protemas complejas los sistemas de expresion actualmente habituales, en particular, cuando las protemas deban emplearse para fines terapeuticos, dado que sistemas de celulas procarioticas y eucarioticas inferiores (p. ej., levaduras) estan claramente perjudicadas en relacion con las modificaciones post-traduccion. Para la expresion transitoria de protemas se utilizaron hasta ahora esencialmente cuatro lmeas celulares de mairnferos: celulas COS-1 o bien COS-7 que proceden de la lmea celular de rinon de mono CV-1 del cercopiteco verde africano; celulas BHK que proceden de celulas de rinon de hamster neonatal; celulas CHO que proceden de celulas de ovario del hamster chino; y celulas HEK293, una lmea de celulas de rinon embrionario humano con caracteffsticas neuronales (Pham et al., Molecular Biotechnology 34, 224-237, 2006; Wurn et Bernard, Current Opinion in Biotechnology 10, 156-159, 1999). Junto al uso de vectores de expresion virales tales como el virus Semliki-Forest o adenovirus, que son eficientes pero complejos y estan ligados a elevados requisitos de seguridad y, por lo tanto, estan poco difundidos, la expresion transitoria en estas lmeas de celulas de marnfferos se basa, por norma general, en la transfeccion de un vector de plasmido que contiene el casete de expresion con la secuencia codificante para el producto genico deseado. Para la transferencia de ADN en celulas de mamffero cultivadas se desarrollo una pluralidad de metodos ffsicos y qmmicos. A los metodos de transferencia genica ffsicos pertenecen la electroporacion, la nucleofeccion y la microinyeccion. En el caso de los procedimientos de transfeccion qmmicos, se hace uso de sustancias inorganicas (p. ej., co-precipitacion de fosfato de calcio/ADN), poffmeros cationicos (p. ej., polietilenimina, procedimiento DEAE/dextrano) o ffpidos cationicos (la denominada lipofeccion). Fosfato de calcio y polietilenimina son los reactivos de transfeccion mas frecuentemente utilizados para la transferencia de acidos nucleicos a gran escala (hasta algunos litros) (Baldi et al., Biotechnol. Lett. 29, 677-684, 2007).

Los procedimientos descritos para la expresion transitoria de polipeptidos y protemas sobre la base de lmeas celulares ampliamente conocidos tienen desventajas desde distintos puntos de vista. Un problema en relacion con los procedimientos transitorios son los bajos rendimientos de expresion. Para mejorar los rendimientos de expresion celulares se utilizaron diferentes sistemas geneticos con el fin de aumentar el numero de las copias de genes por celula con ayuda de la replicacion episomal del acido nucleico incorporado. Celulas COS expresan el anffgeno T grande del virus de simio 40 (SV40), un factor de replicacion que determina una replicacion episomal de plasmidos que portan un origen de replicacion de SV40 (SV04 ori) en un elevado numero de copias. El suceso inicial de esta replicacion es la union del anffgeno T al origen de replicacion de SV40 (SV 40 ori), con lo cual se reclutan factores de replicacion celulares al complejo de ADN/anffgeno T y se inicia una replicacion mediante la ADN-polimerasa celular. De la lmea celular HeK293, la cual fue generada hace aproximadamente 30 anos mediante la transformacion de celulas de rinon embrionarias humanas con ADN de adenovirus-tipo 5 fraccionado y que se puede transfectar bien, se describieron dos variantes geneticas que asimismo expresan el anffgeno T grande de SV40 (HEK293T) o bien el anffgeno nuclear 1 (EBNA-1) del virus Eptstein-Barr (EBV) (HEK293E o 293EBNA-1). Estas lmeas celulares han de garantizar una replicacion episomal o amplificacion de plasmidos que contienen un SV40-ori o bien un EBV-oriP. El factor de replicacion EBNA-1 interactua en este ultimo caso con el origen de replicacion de EBV-oriP. Al menos para celulas HEK293E se ha detectado un aumento de los rendimientos de expresion en el caso de utilizar plasmidos de expresion con contenido en oriP. A diferencia del uso de EBNA-1 en combinacion con el origen de replicacion oriP, algunos estudios apuntan al hecho de que en celulas HEK293T no tiene lugar una replicacion intensa de plasmidos con contenido en SV40-ori (Durocher et al., Nucleic Acid Research 30, e9, 2002). De celulas CHO se genero una variante estable que expresa el anffgeno T grande (LT) de poliomavirus (Epi-CHO) y que puede ser empleada en combinacion con un plasmido que porta el origen de replicacion de poliomavirus (PyOri) (Kunaparaju et al., Biotechnology and Bioengineering 91, 670-677, 2005). Con sistemas de celulas de marnffero de este tipo se alcanzan por termino medio, en el caso de la expresion transitoria de protemas recombinantes, rendimientos de aproximadamente 10-20 mg/litro (Baldi et al., Biotechnol. Lett. 29, 677-684, 2007). Por el contrario, con lmeas celulares de produccion estables y permanentes son habituales por lo demas rendimientos en el intervalo de varios gramos por litro, no obstante, tal como ya se ha descrito, con un tiempo invertido y unos gastos muy considerablemente mayores.

Otro inconveniente de los sistemas celulares utilizados hasta ahora para la expresion recombinante de protemas consiste en que algunas lmeas celulares, en virtud de una buena capacidad de transferencia y de la capacidad para la amplificacion episomal del plasmido se adecuan ciertamente para la expresion transitoria (p. ej., celulas HEK293T o HEK293E) pero otras lmeas celulares se utilizan, debido a sus propiedades de cultivo y rendimientos, preferiblemente para la produccion de lmeas celulares estables (p. ej., celulas CHO). Dado que los sistemas celulares se diferencian, sin embargo, claramente en distintos aspectos de la modificacion post-traduccion, tras la expresion transitoria (la mayoffa de las veces en la fase de desarrollo temprana de productos terapeuticos de protemas), en un sistema celular determinado, los datos obtenidos con respecto a la estructura y funcion de los productos genicos solo pueden ser trasladados de forma muy limitada a la estructura y funcion de esos productos genicos tras la expresion en lmeas celulares estables de otro sistema celular (la mayoffa en la fase de desarrollo tardro, para estudios clmicos y el abastecimiento del mercado). En el caso de muchos candidatos de productos terapeuticos, modificaciones tales como, p. ej., glicosilacion, fosforilacion, carboxilacion, palmitilacion o disociaciones espedficas, son de gran importancia para diferentes propiedades de los productos de expresion. Pueden tener una influencia esencial sobre la actividad, solubilidad, tiempo de semivida, estabilidad o inmunogenicidad. Por lo tanto, los sistemas celulares humanos juegan un papel creciente para la produccion de protemas terapeuticas; solamente las celulas humanas como lugares de produccion garantizan una modificacion humana autentica de los productos de

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expresion y, con ello, reducen el riesgo de calidades de producto perjudicadas o efectos secundarios indeseados. As^ por ejemplo, para eritropoyetina recombinante, la cual se emplea en la terapia humana, se conoce que la protema producida en celulas CHO (epoyetina alfa) presenta residuos de acido N-glicolil-neurammico en sus cadenas laterales de hidratos de carbono, mientras que la protema producida en celulas humanas (epoyetina delta) - al igual que la eritropoyetina humana natural - no contiene residuos azucar de este tipo. Ante los antecedentes de que el hombre forma de manera detectable anticuerpos circulantes contra estas estructuras de azucar “extranas”, el empleo de un sistema de expresion humano parece ser ventajoso (Varki, Am. J. Phys. Anthropol. 33, 54-69, 2001). Actualmente no hay disponible un sistema de celulas humano que sea igualmente bien adecuado para la expresion transitoria y la produccion de lmeas celulares de produccion estables y, con ello, garantice un perfil de producto reproducible a lo largo de todo el desarrollo de un agente terapeutico basado en protemas.

Las celulas humanas son particularmente bien adecuadas para la produccion de productos bioterapeuticos humanos, dado que expresan polipeptidos complejos - a diferencia de otras celulas de mairnferos o celulas animales - con un modelo de modificacion post-traduccion autentico. El modelo de glicosilacion de protemas recombinantes complejas, es decir, la estructura y la disposicion de los residuos azucar en la molecula, reproducira, en el caso de una produccion en celulas humanas, de manera esencialmente mejor el modelo del polipeptido humano autentico que en el caso de una produccion en sistemas de produccion no humanos. Este modelo de glicosilacion es de importancia decisiva a menudo para importantes propiedades del polipeptido tales como actividad, estabilidad, solubilidad e inmunogenicidad biologica.

A este respecto, el documento US 2007/0111312 A1 describe un procedimiento para la produccion de una lmea celular humana permanente, asf como un procedimiento que utiliza esta para la preparacion de polipeptidos recombinantes. Ademas, Schiedner et al. (Schiedner, G. et al., Human Gene Therapy, 11; 2000; pags. 2105-2116) describe la produccion de una lmea celular mediante transformacion de amniocitos humanos primarios con funciones E1 adenovirales. Ademas de ello, el documento US 6.558.948 B1 describe una lmea celular de amniocitos permanente que expresa los productos genicos de las regiones E1A y E1B adenovirales.

Por lo tanto, la invencion tiene por mision proporcionar un procedimiento para la expresion transitoria de polipeptidos a base de un sistema celular humano correspondiente.

El problema se resuelve mediante el objeto definido en las reivindicaciones.

Las siguientes figuras explican la invencion.

La Fig. 1 muestra esquematicamente la estructura de los plasmidos para la expresion permanente de antfgeno T. En pGS158 (Fig. 1a) el antfgeno T es expresado bajo el control del promotor CAG humano (un promotor hforido del potenciador inmediato-temprano del citomegalovirus humano y un promotor de p-actina de gallina modificado con un intron) (Niwa et al., Gene 108: 193-199, 1991) en pGS159 (Fig. 1b) bajo el control del promotor de RSV (virus del sarcoma de Rous) (Makrides, 9-26 en: Makrides (Comp.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003) y en pGS161 (Fig. 1c) bajo el control del promotor de CMV (citomegalovirus) humano (Makrides, 9-26 en: Makrides (Comp.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003).

La Fig. 2 muestra esquematicamente la estructura de los plasmidos para la expresion transitoria de la alfa1- antitripsina humana (hAAT) o bien de eritropoyetina humana (Epo), en cada caso bajo el control del promotor de CMV humano. El plasmido pGS116 (Fig. 2a) y pGS151 (Fig. 2b) tienen casetes de expresion identicos para hAAT, pGS151 contiene adicionalmente el punto de inicio de la replicacion de ADN del virus de simio 40 (SV40 ori). pGS177 contiene asimismo, adicionalmente al casete de expresion de Epo, el SV40 ori.

La Fig. 3 muestra esquematicamente la cantidad de hAAT expresado de forma transitoria en el sobrenadante del cultivo en diferentes lmeas celulares de amniocitos que expresan antfgeno T (CAP-T Z582, Z583 y Z597) en comparacion con la lmea celular de amniocitos parental (CAP) sin la expresion de antfgeno T. En Z582, el antfgeno T es expresado bajo el control del promotor CaG (Niwa et al., Gene 108: 193-199, 1991), en Z583 bajo el control del promotor de RSV (virus del sarcoma de Rous) (Makrides, 9-26 en: Makrides (Comp.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003) y en Z597 bajo el control del promotor de CMV (citomegalia) (Makrides, 9-26 en: Makrides (Comp.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003).

La Fig. 4 muestra esquematicamente la cantidad de hAAT expresado de forma transitoria en el sobrenadante del cultivo (barras) y el numero de celulas vivas (lmeas) en diferentes momentos despues de la transfeccion de un plasmido sin SV40 ori (hAAT/numero de celulas -ori, plasmido pGS116) o bien con SV40 ori (hAAT/numero de celulas +ori, pGS151).

La Fig. 5 muestra esquematicamente la cantidad de hAAT expresado de forma transitoria en el sobrenadante del cultivo (barras) y el numero de celulas vivas (lmeas) en diferentes momentos despues de la transfeccion de pGS151 (con SV40 ori) en CAP-T y celulas HEK293T.

La Fig. 6 muestra esquematicamente el numero de copias intracelular de los plasmidos pGS116 (sin SV40 ori) o

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bien pGS151 (con SV40 ori) en diferentes momentos tras la transfeccion en celulas CAP-T y HEK293-T.

La Fig. 7 muestra esquematicamente la cantidad de hAAT expresado de forma transitoria en el sobrenadante del cultivo (barras) y el numero de celulas vivas (lmeas) en diferentes momentos despues de la transfeccion de pGS151 (con SV40 ori) en CAP-T con polietilenimina (PEI) como reactivo de transfeccion.

Por el termino “amniocitos”, tal como se utiliza aqm, se entiende en sentido amplio todas las celulas que estan presentes en el lfquido amniotico y que pueden ser obtenidas mediante puncion del lfquido amniotico. Las celulas proceden del amnio o de tejido fetal que esta en contacto con el lfquido amniotico. Se describieron tres clases principales de amniocitos que se diferencian en base a criterios morfologicos:

Celulas a modo de fibroblastos (celulas F), celulas epiteloides (celulas E) y celulas del lfquido amniotico (Amniotic Fluid Cells, celulas AF) (Hohn et al. Pediat. Res. 8:746-754, 1974). Las celulas AF son el tipo de celulas predominante.

Por la expresion “casete de expresion” se entiende, en particular, una molecula de acido nucleico o bien una zona de una molecula de acido nucleico que contiene un elemento regulador situado delante de la region codificante o promotor, una region codificante o bien un marco de lectura abierto, asf como un elemento de terminacion de la transcripcion situado detras de la region codificante. El elemento regulador situado delante de la region codificante o bien el promotor puede ser un promotor constitutivo, es decir, que activa permanentemente la transcripcion (p. ej., promotor de CMV) o un promotor regulable, es decir, conectable y/o desconectable (p. ej., promotor regulable de tetraciclina). La region codificante del casete de expresion puede ser un marco de lectura abierto continuo como en el caso de un ADNc con un codon de inicio en el extremo 5' y un codon de parada en el extremo 3'. La region codificante puede consistir en una disposicion genomica o en una disposicion nuevamente combinada de exones codificantes e intrones no codificantes situados entremedias. La region codificante del casete de expresion puede consistir, sin embargo, tambien en varios marcos de lectura abiertos que estan separados uno de otro por los denominados IRES (sitios internos de entrada al ribosoma).

Por la expresion “lmeas celulares permanentes”, tal como se utiliza aqm, se entienden celulas que estan modificadas geneticamente de modo que bajo condiciones de cultivo adecuadas pueden continuar desarrollandose permanentemente en el cultivo celular. Celulas de este tipo se denominan tambien celulas inmortalizadas.

Por el termino “polipeptido” o la expresion “polipeptido recombinante”, tal como se utiliza aqm, se entienden peptidos a base de al menos 2 aminoacidos. El polipeptido puede ser modificado co- y/o post-traduccion, p. ej., mediante la colgadura de residuos azucar o mediante modificacion de residuos aminoacidos. El polipeptido puede ser lineal, circular o ramificado. Ademas, el polipeptido puede consistir en mas de una cadena de aminoacidos, pudiendo adoptar las cadenas, mediante enlaces intramoleculares y/o intermoleculares, estructuras en el espacio mas o menos complejas (p. ej., estructura secundaria, terciaria, cuaternaria). Si el polipeptido se compone de una cadena de aminoacidos, esta puede adoptar tambien, mediante enlaces intramoleculares, estructuras en el espacio mas o menos complejas. Los polipeptidos pueden ser polipeptidos farmacologica o inmunologicamente activos o polipeptidos utilizados para fines diagnosticos.

Por la expresion “celulas primarias”, tal como se utiliza aqm, se entienden celulas que se obtuvieron mediante la extraccion directa de un organismo o un tejido y se recogieron en cultivo. Las celulas primarias poseen solo una vida muy limitada.

Por la expresion “lmeas celulares de produccion”, tal como se utiliza aqm, se entienden lmeas celulares permanentes que fueron modificadas geneticamente de modo estable mediante la incorporacion de un transgen que codifica el polipeptido deseado a producir.

Por el termino “CAP”, tal como se utiliza aqm, se entienden lmeas celulares de amniocitos humanos permanentes que han sido generadas mediante inmortalizacion de amniocitos humanos primarios con funciones genicas E1A y E1B adenovirales.

Por el termino “CAP-T”, tal como se utiliza aqm, se entienden celulas CAP que fueron transfectadas de manera estable adicionalmente con una molecula de acido nucleico que contiene la secuencia del antfgeno T grande de SV40.

Por el termino “transfeccion”, tal como se utiliza aqm, se entiende todo procedimiento que se adecue para la incorporacion del o de los acidos nucleicos mencionados en las celulas. Como ejemplos se han de mencionar el metodo de fosfato de calcio clasico, la electroporacion, sistemas liposomales de cualquier tipo y combinaciones de estos procedimientos.

Por la expresion “expresion transitoria”, tal como se utiliza aqm, se entiende todo procedimiento en el que se incorporan en la celula mediante transfeccion acido o acidos nucleicos, sin que mediante un proceso de seleccion adecuado sean seleccionadas lmeas celulares estables que puedan continuar siendo cultivadas durante tiempo en el cultivo celular.

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Por la expresion “expresion estable”, tal como se utiliza aqm, se entiende la expresion de un transgen en lmeas celulares de produccion.

Por el termino “transgen”, tal como se utiliza aqm, se entiende la secuencia de acidos nucleicos que codifica un polipeptido recombinante.

En lo que sigue se describe un procedimiento para la produccion de una lmea celular humana permanente, que comprende las siguientes etapas:

a) transfeccion de celulas humanas primarias con una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de acidos nucleicos que codifica las funciones genicas E1A y E1B adenovirales; la denominada 1a transfeccion y

b) subsiguiente transfeccion de la lmea celular humana permanente con una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de acidos nucleicos que codifica el antigeno T grande de SV40, la denominada 2a transfeccion.

Preferiblemente, la molecula de acido nucleico de la etapa b) del procedimiento mencionado para la produccion de una lmea celular humana permanente comprende una secuencia de acidos nucleicos que codifica una forma no segregada del antigeno T grande de SV40.

En el caso de la transfeccion en la etapa b) del procedimiento mencionado, la lmea celular humana permanente es transfectada alternativamente con una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de acidos nucleicos que codifica el antfgeno nuclear 1 (EBNA-1) del virus Epstein-Barr (EBV), la denominada 2a transfeccion. Preferiblemente, la molecula de acido nucleico comprende una secuencia de acidos nucleicos que codifica una forma no segregada del antfgeno nuclear 1 (EBNA-1) del virus Eptstein-Barr (EBV).

Mediante las transfecciones llevadas a cabo en el procedimiento mencionado, las celulas humanas primarias son transfectadas preferiblemente de manera estable, es decir, el ADN transfectado es integrado en el genoma de la celula.

Mediante la transfeccion de las celulas humanas primarias con la molecula de acido nucleico que comprende las secuencias de acidos nucleicos codificante de E1A y E1B, las celulas son inmortalizadas. La molecula de acido nucleico utilizada para la inmortalizacion de las celulas humanas primarias comprende secuencias de acidos nucleicos E1A y e1b que proceden preferiblemente de adenovirus humanos, en particular del adenovirus humano serotipo 5. En una forma de realizacion preferida, la molecula de acido nucleico utilizada para la inmortalizacion comprende, junto a las secuencias de acidos nucleicos que codifican E1A y E1B, la secuencia de acido nucleico que codifica la funcion genica pIX adenoviral. El polipeptido pIX, una protema estructural viral, actua como activador de la transcripcion sobre diferentes promotores virales y celulares tales como, p. ej., el promotor de timidina quinasa y el promotor de beta-globina.

Una secuencia a modo de ejemplo se encuentra en Genbank N° de acceso X02996. En particular, las moleculas de acidos nucleicos comprenden los nucleotidos 1 a 4344 (SEQ ID NO: 1 comprende secuencias de acidos nucleicos que codifican E1A, E1B y pIX), 505 a 3522 (SEQ ID NO: 2 comprende secuencias de acidos nucleicos que codifican E1A y E1B) o los nucleotidos 505 a 4079 (SEQ ID NO: 3 comprende secuencias de acidos nucleicos que codifican E1A, E1B y pIX) del adenovirus humano serotipo 5.

En particular, las celulas humanas son transfectadas con las secuencias de acidos nucleicos a expresar que codifican la funcion genica deseada en forma de un casete de expresion. El casete de expresion comprende una molecula de acido nucleico que contiene un elemento regulador o promotor situado delante de la region codificante, una region codificante o bien un marco de lectura abierto, asf como un elemento de terminacion transcripcional situado detras de la region codificante.

El casete de expresion o la molecula de acido nucleico contiene en una forma de realizacion, en particular, la secuencia de acidos nucleicos para el antfgeno T grande de SV40 (SEQ ID NO: 4), la secuencia de acidos nucleicos para un promotor elegido del grupo de promotor de CMV (SEQ ID NO: 5), promotor CAG (Niwa et al., Gene 108: 193-199, 1991) y promotor de rSv (Genbank N° de acceso DQ075935), la secuencia para SV40 SD/SA (intron) (SEQ ID NO: 6) y la secuencia de acidos nucleicos para SV40 poliA (SEQ ID NO: 7).

El casete de expresion o la molecula de acidos nucleicos contiene en otra forma de realizacion, en particular, la secuencia de acidos nucleicos para el antfgeno nuclear 1 (EBNA-1) del virus Eptstein-Barr (EBV) (SEQ ID NO: 8), la secuencia de acidos nucleicos para un promotor elegido del grupo de promotor de CMV (SEQ ID NO: 5), promotor CAG (Niwa et al., Gene 108: 193-199, 1991) y promotor de RSV (Genbank N° de acceso DQ075935), la secuencia de acidos nucleicos para SV40 SD/SA (intron) (SEQ ID NO: 6) y la secuencia de acidos nucleicos para SV40 poliA (SEQ ID NO: 7).

Las celulas humanas primarias se obtienen mediante extraccion directa a partir del organismo o de un tejido extrafdo del organismo y se recogen en cultivo. Se prefieren aquellas celulas humanas primarias que puedan ser

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transformadas bien en lmeas celulares humanas permanentes mediante la expresion de E1A y E1B adenoviral, en particular celulas de amniocitos, celulas de la retina embrionaria y celulas embrionarias de origen neuronal.

Preferiblemente, con el procedimiento mencionado se preparan lmeas celulares de amniocitos humanas permanentes.

El procedimiento mencionado puede llevarse a cabo tambien, en lugar de la etapa a) con lmeas celulares humanas inmortalizadas ya presentes, en particular con lmeas celulares de amniocitos humanos inmortalizados ya presentes que en su genoma presentan las secuencias de acidos nucleicos para las funciones genicas E1A y E1B adenovirales. Preferiblemente, las lmeas celulares humanas inmortalizadas comprenden en su genoma las secuencias de acidos nucleicos para las funciones genicas E1A, E1B y pIX adenovirales. Las lmeas celulares humanas inmortalizadas presentes, en particular, lmeas celulares de amniocitos humanos inmortalizados, son transfectadas, en caso necesario, con la molecula de acido nucleico precedentemente descrita que contiene un casete de expresion que codifica el antigeno T grande de SV40 o el antfgeno nuclear 1 (EBNA-1) del virus Eptstein- Barr (EBV). El experto en la materia reconoce que la 2a transfeccion depende cronologicamente de la 1a transfeccion de la celula humana primaria solo en la medida en que deba tener lugar despues de la ia transfeccion. No es necesario que la 2a transfeccion deba tener lugar inmediatamente despues de la 1a transfeccion. Asf, tambien lmeas celulares humanas inmortalizadas ya establecidas desde hace muchos anos, que son inmortalizadas con E1A y/o E1B, pueden ser transfectadas, en caso necesario, con la molecula de acido nucleico precedente en una segunda transfeccion. Preferiblemente, para ello se pueden utilizar amniocitos humanos inmortalizados, celulas de la retina embrionaria humana inmortalizadas, en particular celulas PER.C6, o celulas embrionarias humanas inmortalizadas de origen neuronal, en particular celulas HEK293.

En lo que sigue se describe una lmea celular humana permanente que comprende las secuencias de acidos nucleicos para las funciones genicas E1A y E1B adenovirales y la secuencia de acidos nucleicos para el antfgeno T grande de SV40 o el antfgeno nuclear 1 (EBNA-1) del virus Epstein-Barr (EBV). Preferiblemente, esta es una lmea celular humana permanente que comprende las secuencias de acidos nucleicos para las funciones genicas E1A, E1B y pIX adenovirales y la secuencia de acidos nucleicos para el antfgeno T grande de SV40 o el antfgeno nuclear 1 (EBNA-1) del virus Epstein-Barr (EBV). De manera particularmente preferida, la lmea celular mencionada es una lmea celular de amniocitos humanos permanente que comprende las secuencias de acidos nucleicos para las funciones genicas E1A, E1B adenovirales y la secuencia de acidos nucleicos para el antfgeno T grande de SV40 o el antfgeno nuclear 1 (EBNA-1) del virus Epstein-Barr (EBV). De manera muy particularmente preferida, la lmea celular mencionada es una lmea celular de amniocitos humanos permanente que comprende las secuencias de acidos nucleicos para las funciones genicas E1A, E1B y pIX adenovirales y la secuencia de acidos nucleicos para el antfgeno T grande de SV40 o el antfgeno nuclear 1 (EBNA-1) del virus Epstein-Barr (EBV).

Particularmente, la lmea celular mencionada es una lmea celular humana permanente, preferiblemente una lmea celular de amniocitos humana permanente que se obtiene utilizando el procedimiento precedentemente mencionado.

Un objeto de la presente invencion se refiere a un procedimiento para la expresion transitoria de polipeptidos o protemas recombinantes utilizando la lmea celular de amniocitos humanos permanente mencionada, que comprende las siguientes etapas:

a) transfeccion de la lmea celular de amniocitos humanos permanente con una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de acidos nucleicos que codifica un polipeptido o protema recombinante deseado y un lugar de reconocimiento o de union para el antfgeno T grande de SV40 o el antfgeno nuclear- 1 (EBNA-1) del virus Epstein-Barr (EBV),

b) cultivo de la lmea celular de amniocitos humanos permanente transfectada obtenida en la etapa a) bajo condiciones que permitan la expresion del polipeptido o la protema recombinante deseado y, a continuacion

c) aislamiento del polipeptido o la protema recombinante deseado a partir de las celulas o a partir del sobrenadante del cultivo,

obteniendose la lmea celular de amniocitos humanos permanente mediante el procedimiento precedentemente mencionado para la produccion de una lmea celular de este tipo.

Si la lmea celular de amniocitos humanos permanente contiene una molecula de acido nucleico que comprende la secuencia de acidos nucleicos que codifica el antfgeno T grande de SV40, la lmea celular es transfectada, p. ej., con un plasmido de expresion que comprende un casete de expresion o una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de acidos nucleicos que codifica el transgen a expresar y contiene el origen de la replicacion de SV40 (SV40 ori). El antfgeno T grande de SV40 expresado de manera intracelular de forma estable en la lmea celular se une al origen de replicacion de SV40 del plasmido de expresion incorporado mediante transfeccion en la lmea celular y determina una replicacion episomal del plasmido de expresion y, con ello, una amplificacion del numero de copias del transgen a expresar. El producto genico deseado codificado por el transgen puede obtenerse despues del cultivo de las celulas durante algunos dfas a partir de las celulas o a partir del sobrenadante del cultivo. Por consiguiente, el transgen es expresado de forma transitoria.

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Si la lmea celular de amniocitos humanos permanente contiene una molecula de acido nucleico que comprende la secuencia de acidos nucleicos que codifica el antigeno nuclear-1 (EBNA-1) del virus Epstein-Barr (EBV), la lmea celular es transfectada, p. ej., con un plasmido de expresion que contiene un casete de expresion o una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de acidos nucleicos que codifica el transgen a expresar y el origen de replicacion de EbV (eBv oriP) (Durocher et al., Nucleic Acids Research Vol. 30 N° 2 e9, 2002; Tuvesson et al. Cytotechnology 56: 123-136, 2008). El EBNA-1 de EBV expresado intracelularmente de forma estable en la lmea celular se une al origen de replicacion oriP del plasmido de expresion incorporado mediante transfeccion en la lmea celular y determina una replicacion episomal del plasmido de expresion y, con ello, una amplificacion del numero de copias del transgen a expresar. El producto genico deseado, codificado por el transgen, puede obtenerse despues del cultivo de las celulas durante algunos dfas a partir de las celulas o a partir del sobrenadante del cultivo. Por consiguiente, el transgen es expresado de forma transitoria.

Las celulas mencionadas pueden cultivarse bajo las condiciones habituales para el cultivo de celulas eucarioticas a aproximadamente 37°C, 95% de humedad del aire y 8% de CO2. Las celulas pueden cultivarse en un medio con contenido en suero o exento de suero, en cultivo adherente o en cultivo en suspension. El cultivo en suspension puede tener lugar en los recipientes de fermentacion mas diversos, p. ej., en reactores con caldera de agitacion, reactores “Wave”, en recipientes de agitacion o de centrifugacion o en las denominadas “Roller Bottles”. Por consiguiente, las celulas son adecuadas para la expansion del proceso a escala industrial. La transfeccion de las celulas para la expresion transitoria puede tener lugar con los metodos de transfeccion mas diversos que se describieron arriba. La transfeccion y la expresion transitoria pueden llevarse a cabo tambien en formato de “Alto Rendimiento” o bien de rastreo, p. ej., en formato de 96 o de 384 pocillos.

El antfgeno T del virus del simio 40 (SV40) es una fosfoprotema multifuncional que controla tanto la replicacion viral como las fracciones celulares tras la infeccion. El antfgeno T es un agente transformante e interviene en el ciclo celular a traves de interaccion con la protema supresora de tumores p53. Durante la replicacion del genoma viral, se requiere antfgeno T como ADN-helicasa con el fin de liberar el genoma de doble cadena. El antfgeno T es la unica protema viral que se requiere para la replicacion. Las otras funciones son cumplidas por protemas celulares. En la primera etapa de la replicacion del ADN, 12 moleculas de antfgeno T se unen, como hexameros dobles, al punto de inicio de la replicacion del ADN (ori) en el genoma de SV40. A este complejo de helicasa se unen entonces las protemas celulares necesarias tales como ADN-polimerasa y liberan y replican el ADN. El denominado “ori mmimo” se compone de una secuencia de “nucleo” de 63 pb de longitud. En el caso de una transfeccion transitoria de plasmidos circulares en la celula diana no tiene lugar integracion alguna en el genoma del huesped, lo que conduce a que la concentracion del plasmido tras la division celular disminuya constantemente y la expresion de un gen codificante situado en el plasmido solo sea transitoria. La incorporacion del fragmento SV40 ori en el plasmido de expresion y la expresion del antfgeno T de SV40 en la celula de produccion conducen a un numero de copias incrementado del plasmido y, por consiguiente, a un rendimiento de expresion incrementado.

El procedimiento de acuerdo con la invencion para la expresion transitoria de polipeptidos y protemas tiene la ventaja de que en relacion con la cantidad y calidad del producto genico recombinante es mas eficiente y, con ello, en el proceso global del desarrollo industrial de agentes terapeuticos basados en protemas, tambien mas economico que los procedimientos hasta ahora utilizados.

En particular, es ventajoso proporcionar un sistema de expresion transitorio muy eficiente sobre la base de una lmea celular humana que, en primer lugar, a diferencia de celulas de mairnferos no humanas o celulas no de marnfferos modifique post-traduccion de forma autentica protemas humanas y, en segundo lugar, sea igualmente bien adecuado para el establecimiento de lmeas celulares de produccion estables en el proceso de produccion industrial. De este modo se puede garantizar que en el transcurso del desarrollo de productos diagnosticos o terapeuticos, caractensticas cualitativas del producto genico despues de la expresion transitoria en la fase de desarrollo temprana y despues de la expresion estable en lmeas celulares de produccion permanentes en la fase tardfa y en la produccion industrial presenten una identidad lo mayor posible, en particular en relacion con diferencias en estas caractensticas que pueden ser justificadas en la naturaleza del sistema celular.

Otra ventaja consiste en que las lmeas celulares humanas permanentes mencionadas presentan elevados rendimientos de expresion en el caso de una expresion transitoria. Asf, en el caso de la expresion transitoria de lmeas celulares de amniocitos productoras de antfgeno T de SV40, tras la transfeccion con un vector de plasmido que, aparte de la secuencia codificante del producto genico deseado, porta un origen de replicacion de SV40 (SV40 ori), se encontraron de manera inesperada rendimientos de producto muy elevados en el sobrenadante del cultivo de hasta 60 mg/litro. Los rendimientos de producto eran mas de 70 veces superiores que en el caso de la expresion transitoria en una lmea celular de amniocitos que no expresa antfgeno T alguno.

Otra ventaja de la lmea celular humana permanente mencionada consiste en que se proporciona un sistema celular humano, preferiblemente basado en amniocitos humanos inmortalizados, que se adecua tanto para la expresion transitoria de protemas como para la expresion estable de protemas en lmeas celulares de produccion permanentes (Schiedner et al., BMC Biotechnology 8, 13, 2008). Frente al uso de diferentes sistemas celulares para la expresion transitoria (p. ej. HEK293 o variantes de HEK293) y la expresion estable (p. ej., CHO) se minimiza por consiguiente el riesgo de que se diferencien propiedades estructurales o funcionales de los productos de expresion a partir de la produccion transitoria y estable que se encuentran de forma justificada en la naturaleza del sistema de expresion.

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Con ello, el proceso de desarrollo es mejor planeable, ocupa menos tiempo y es mas economico.

Las secuencias de acidos nucleicos para la expresion del al menos un polipeptido recombinante se presentan en al menos un casete de expresion. Los casetes de expresion contienen promotores y secuencias de terminacion transcripcionales. Como promotores pueden servir, p. ej., promotor de CMV (citomegalovirus) (Makrides, 9-26 en: Makrides (Comp.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003), promotor de EF- 1a (Kim et al., Gene 91:217-223, 1990), promotor CAG (un promotor tnbrido del potenciador inmediato-temprano del citomegalovirus humano y un promotor de p-actina de gallina modificado con un intron) (Niwa et al., Gene 108: 193199, 1991), promotor de pgk (fosfoglicerato quinasa) humano o murino (Adra et al., Gene 60:65-74, 1987), promotor de RSV (virus del sarcoma de Rous) (Makrides, 9-26 en: Makrides (Comp.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003) o promotor de SV40 (virus de simio 40) (Makrides, 9-26 en: Makrides (Comp.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003). Como lugares de poliadenilacion pueden servir, p. ej., las secuencias de poliadenilacion del antigeno T grande de SV40 (Genbank N° de acceso J02400) o del gen G-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos, granulocyte colony stimulating factor) humano (Mizushima y Nagata, Nucl. Acids. Res. 18: 5322, 1990).

En lo que sigue se describe un polipeptido o una protema que se obtiene utilizando el procedimiento conforme a la invencion.

El polipeptido recombinante del procedimiento conforme a la invencion puede ser una protema terapeutica tal como, p. ej., alfa 1 -antitripsina humana o factores de crecimiento tales como eritropoyetina o interleuquina-2. Alfa 1- antitripsina humana (hAAT) es un inhibidor de protemasa que inhibe elastasa y otras protemasas y que en el caso de una deficiencia considerable de hAAT, que conduce a lesiones pulmonares y hepaticas graves, es terapeuticamente eficaz. En el caso de la eritropoyetina se trata de un importante factor de crecimiento para eritrocitos (hematocitos) que en el caso de anemia asf como en pacientes de trasplante tiene un efecto formador de sangre. La interleuquina-2 (IL-2) pertenece a las sustancias mensajeras celulares del sistema inmunologico y tiene una gran importancia en la activacion de la respuesta inmune celular, por ejemplo en el caso de enfermedades tumorales. A los polipeptidos terapeuticamente eficaces pertenecen tambien factores de la coagulacion de la sangre tales como, p. ej., factor VIII y factor IX, que se emplean en pacientes de hemofilia con trastornos de coagulacion. El polipeptido recombinante del procedimiento conforme a la invencion puede ser una hormona. Hormonas producidas por via biotecnologica se utilizan en la terapia de sustitucion en el caso de pacientes con trastornos hormonales. Ejemplos son la hormona hipoglucemiante insulina, de la que dependen muchos pacientes con diabetes mellitus, somatotropina (hormona del crecimiento) para el tratamiento del enanismo y factores gonadotropicos tales como la hormona estimulante de los folmulos (FSH) u hormona luteinizante (LH) para el tratamiento de trastornos de fertilidad. El polipeptido recombinante puede ser, ademas, una enzima que modifica de forma post-traduccion otros polipeptidos recombinantes expresados simultaneamente de forma intracelular o en el sobrenadante del cultivo, p. ej., en la enzima que participa en la glicosilacion. Los productos genicos E1A, E1B y pIX expresados en la lmea celular humana permanente conforme a la invencion, asf como el antfgeno T grande de SV40 y el antfgeno nuclear- 1 (EBNA-1) del virus Epstein-Barr (EBV) no pertenecen al polipeptido deseado a producir.

El polipeptido recombinante del procedimiento conforme a la invencion puede ser un anticuerpo recombinante que puede ser empleado para fines terapeuticos o diagnosticos. Anticuerpos contra el factor de la necrosis tumoral alfa (TNF-a) se emplean en pacientes con artritis reumatoide, anticuerpos contra el receptor celular del factor de crecimiento epidermal (EGFR) en pacientes con cancer. Anticuerpos empleados para fines diagnosticos pueden ser, por ejemplo, componentes de kits de diagnostico comerciales que se basan en ensayos de inmunoadsorcion acoplados a enzima (Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay, ELISA) o ensayos de inmunoadsorcion radiactivos (Radio Immuno Sorbent Assay, RIA). Los anticuerpos sirven en estos procedimientos de ensayo para la deteccion de los antfgenos de germenes infecciosos tales como, por ejemplo, del virus de la hepatitis B humano.

Los anticuerpos o inmunoglobulinas (Ig) se componen de una cadena pesada y una cadena ligera que en cada caso se componen de regiones o dominios variables y constantes. Las secuencias de acidos nucleicos de las moleculas de acidos nucleicos transfectadas para la expresion de un anticuerpo pueden contener dos casetes de expresion separados, de los cuales uno codifica la cadena ligera y el otro codifica la cadena pesada de la molecula de inmunoglobulina. Despues de la expresion de ambas cadenas en la celula conforme a la invencion, estas se reunen para formar una molecula de anticuerpo activa. Los casetes de expresion de las dos cadenas pueden situarse en este caso en una molecula de acido nucleico separada o en la misma. Las secuencias codificantes de la cadena ligera y la cadena pesada pueden situarse, sin embargo, tambien dentro del mismo casete de expresion y separarse mediante una secuencia IRES (internal ribosome entry site, sitio interno de entrada al ribosoma) que garantiza una expresion tanto de la cadena pesada como de la cadena ligera. Las secuencias codificantes para la cadena ligera y la cadena pesada pueden encontrarse, en principio, tambien dentro del mismo casete de expresion y separarse mediante una secuencia que codifica un lugar de disociacion enzimatica para una proteinasa (p. ej., trombina), que luego es expresada al mismo tiempo en la celula y disocia al polipeptido precursor a base de una secuencia de cadenas ligeras y pesadas en una cadena ligera y pesada activa.

Anticuerpos recombinantes que son codificados por la secuencia de acidos nucleicos en la celula, pueden componerse tambien de fragmentos de un anticuerpo en lugar de la cadena ligera y pesada completa. Los denominados anticuerpos de cadenas individuales (scFv, single chain variable fragments) se componen de los

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dominios variables de una cadena pesada y una cadena ligera que son unidos por una secuencia de aminoacidos (un denominado enlazador), la cual garantiza una movilidad libre de ambos dominios. Mediante la reunion intramolecular de ambos dominios se forma una estructura de union a antigenos que corresponde a la region variable de una molecula de inmunoglobulina. Anticuerpos de cadena individual biespedficos (bis-scFv) se componen de dos disposiciones de cadenas individuales de este tipo a base de los dominios variables de una cadena pesada y una cadena ligera que, por su parte, cuelgan de nuevo mediante una secuencia de union y son moviles uno frente a otro; moleculas de este tipo pueden unirse al mismo tiempo a dos lugares de union antigenicos (epftopos) y, con ello, unir de manera no covalente dos estructuras moleculares. Los diacuerpos biespedficos se componen de dos cadenas individuales expresadas por separado que en cada caso contienen dominios variables de una cadena ligera y una cadena pesada, separadas solo por un enlazador muy corto o sin enlazador. El enlazador corto o ausente impide la condensacion intramolecular, mediante condensacion intermolecular de un dominio variable pesado y ligero se forma de nuevo una molecula activa con dos valencias de enlace.

El polipeptido recombinante codificado por la molecula de acido nucleico transfectada en el presente procedimiento puede ser una protema viral, bacteriana o parasita que ha de ser producida para el uso como inoculantes (vacunas) profilacticos o terapeuticos. En este caso, puede tratarse tanto de un polipeptido estructural como de un polipeptido activo de forma reguladora o enzimatica de virus, bacterias o parasitos. Una protema viral puede ser, p. ej., el antfgeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBV Surface Antigen) o la protema estructural L1 de papilomavirus humanos. Una protema bacteriana que entra en consideracion para la produccion de vacunas tras la expresion en lmeas celulares de produccion son, p. ej., sub-unidades de enterotoxina de Escherichia coli enterotoxinogena (ETEC) o protemas de union a transferrina (transferrin binding proteins, Tbp A y B) de Neisseria gonorrhoeae. Un polipeptido de parasitos que podna ser codificado por la molecula de acido nucleico transfectada en el presente procedimiento es, p. ej., la protema de la superficie de merozoitos (Merozoite Surface Protein, MSP) del germen de la malaria Plasmodium falciparum o glutation S-transferasa (GSC) de Schistosoma japonicum.

El polipeptido recombinante codificado por la molecula de acido nucleico transfectada en el presente procedimiento puede ser, ademas, una protema viral que permite en lmeas celulares una produccion de vectores de transferencia genica virales recombinantes. Esta protema viral, denominada tambien factor de complementacion, es expresada en la lmea celular y es el componente enzimatico o estructural necesario para la produccion de los vectores de transferencia genica, que no es codificado en la molecula de acido nucleico del vector de transferencia genica. En vectores de transferencia genica de este tipo se han suprimido por norma general, por motivos de seguridad, determinadas funciones genicas virales. A los vectores de transferencia genica, cuyos factores de complementacion podnan ser codificados por transgenes incorporados con el procedimiento descrito, pertenecen, por ejemplo, vectores que se basan en adenovirus, virus asociados a adenovirus (AAV), retrovirus o lentivirus o virus herpes. El factor de complementacion expresado en la lmea celular puede complementar tambien virus suprimidos o recombinantes en el caso de su produccion, que no contienen un gen a transferir y que, con ello, no funcionan como vectores de transferencia genica, sino que se utilizan, p. ej., como vacuna.

El polipeptido expresado de forma transitoria con el presente procedimiento puede ser, ademas, un polipeptido receptor, que esta localizado, en particular, sobre la superficie de la celula y que es el responsable de la infeccion de la celula por parte de un virus o bien de la transfeccion de la celula por parte de un vector de transferencia genica viral. Como receptor viral para la etapa inicial de la infeccion de celulas con el adenovirus serotipo 2 o 5, de los que se derivan la mayona de los vectores adenovirales convencionales, se identifico el denominado receptor de Coxsackie y adenovirus, CAR (Bergelson et al., Science 275: 1320-1323, 1997). La expresion suficiente de CAR sobre la superficie es una premisa de que una celula se adecua como celula de produccion para vectores de transferencia genica adenovirales. En una forma de realizacion preferida, el polipeptido recombinante es el receptor de Coxsackie y adenovirus (CAR). La sobre-expresion de los polipeptidos del receptor puede mejorar claramente la capacidad de infeccion y, con ello, la eficiencia de produccion de estas celulas en relacion con vectores adenovirales. Ademas, la molecula de acido nucleico puede codificar, aparte de CAR, receptores secundarios o receptores de internalizacion tales como, p. ej., determinadas integrinas que inducen la absorcion de los virus o bien del vector de transferencia genica en la celula y cuya expresion adicional es conveniente en el caso de la produccion de celulas de produccion para vectores adenovirales.

El procedimiento descrito puede utilizarse, entre otros, para la produccion de polipeptidos terapeuticos, factores de la coagulacion de la sangre y de crecimiento, hormonas y anticuerpos, asf como polipeptidos virales, bacterianos o parasitarios para uso como vacuna. Ademas, las celulas mencionadas se pueden utilizar para la produccion de protemas relevantes para el diagnostico tales como, p. ej., antfgenos virales, bacterianos o parasitarios o correspondientes anticuerpos espedficos. Ademas, las celulas conformes a la invencion se pueden utilizar para la produccion de protemas tecnica o industrialmente relevantes, p. ej., de enzimas para la catalisis de procesos de smtesis tecnicos o para la degradacion de sustancias nocivas. Las celulas mencionadas pueden expresar uno o varios polipeptidos recombinantes diferentes. El numero de polipeptidos expresables depende de cuantas secuencias de acidos nucleicos diferentes que codifican los polipeptidos recombinantes sean transfectadas de forma transitoria en las celulas con el procedimiento conforme a la invencion.

Los siguientes ejemplos explican la invencion y no han de considerarse limitantes. En la medida en que no se indique otra cosa, se utilizaron metodos convencionales de biologfa molecular tal como se describen, p. ej., por Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual 2a edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press,

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Cold Spring Harbor, Nueva York.

1. Clonaciones

a. Plasmidos para la transformacion de amniocitos primarios: pSTK146, pGS119, pGS122

El plasmido pSTK146 se describio detalladamente en el documento EP 1 230 354 B1 y comprende el promotor de fosfoglicerato quinasa (pgK) murino, secuencias de adenovirus serotipo 5 (Ad5) nucleotidos (nt.) 505 a 3522 y la senal de corte y empalme y poliadenilacion de SV40. Las secuencias adenovirales en pSTK146 comprenden la region E1A y E1B codificante, siendo regulada la expresion de E1A a partir del promotor de pgk.

El plasmido pGS119 se describio ampliamente en el documento WO 2007/056994 y contiene el promotor de pgk murino, secuencias Ad5 nt. 505-3522 (que comprenden la region E1A y E1B), la senal de corte y empalme y poliadenilacion de SV40, seguida de la region pIX de Ad5 nt. 3485-4079.

El plasmido pGS122 se describio ampliamente en el documento WO 2007/056994 y contiene las secuencias adenovirales nt. 1-4344, que comprenden las regiones E1A, E1B y pIX, incluidas las respectivas secuencias de promotor y poliadenilacion reguladoras. Las secuencias adenovirales en pGS122 estan flanqueadas por lugares de corte de PmeI.

b. Plasmidos de expresion del antigeno T: pGS158, pGS159, pGS161

Los plasmidos pGS158, pGS159 y pGS161 contienen todos el casete de expresion para el antigeno T de SV40 (SeQ ID NO: 4) flanqueado por un intron de SV40 (SEQ ID NO: 6) y un lugar de poliadenilacion (SEQ ID NO: 7). Adicionalmente, pGS158 contiene el promotor CAG (promotor Itibrido consistente en el potenciador de CMV y el promotor de p-actina de gallina) (Niwa et al., Gene 108: 193-199, 1991), pGS159 contiene el promotor de RSV (promotor del virus de sarcoma de Rous) Genbank N° de acceso DQ075935) y pGS161 contiene el promotor de CMV (anteriormente promotor del virus de citomegalia humano) (SEQ ID NO: 5). Para la generacion de lmeas celulares estables, los plasmidos pGS158, pGS159 y pGS161 contienen un casete de expresion de blasticidina con el promotor de ubiquitina (pUB/Bsd, Invitrogen N° V512-20). En una primera etapa, un fragmento de 2,6 kb que contiene las secuencias codificantes del antigeno T, se incorporo en el plasmido pGS140. El plasmido pGS140 contiene el promotor de CMV humano (SEQ ID NO: 5), una region de intron de SV40 con lugar donante de corte y empalme/aceptor de corte y empalme (SEQ ID NO: 6), un lugar de corte por restriccion NotI singular y una secuencia poliA de SV40 (SEQ ID NO: 7). Para la introduccion del fragmento de antigeno T, pGS140 se linearizo con NotI, se relleno el colgante 5' y se ligo con el fragmento aislado. El plasmido, asf resultante, obtuvo la denominacion pGS149.

Para el plasmido pGS158, pGS149 se digirio con XbaI y se aislo un fragmento de aprox. 3 kb que contema la secuencia de intron, antigeno T y secuencia de poliA. Este fragmento se incorporo en el lugar de corte NotI (colgante 5' relleno) de pGS152. pGS152 resulto mediante la incorporacion de un fragmento de promotor CAG de 1,1 kb de tamano (Niwa et al., Gene 108: 193-199, 1991) en el lugar de corte EcoRV de pUB/Bsd.

Para el plasmido pGS159 el fragmento XbaI de 3 kb de tamano que contiene el antigeno T de pGS149 se incorporo

en el lugar de corte NotI relleno de pGS153. pGS153 contiene un fragmento de promotor de rSv con un tamano de aprox. 0,6 kb, incorporado en el lugar de corte EcoRV de pUB/Bsd. Para el plasmido pGS161, pGS149 se digirio con SphI, los colgantes 3' se rellenaron, se aislo el fragmento de 3,6 kb que contema el promotor de CMV, el intron de SV40, la secuencia de antigeno T y el poliA, y se incorporo en el lugar de corte EcoRV de pUB/Bsd.

c. Plasmidos de expresion de hAAT: pGS116, pGS151

El plasmido pGS116 se describio detalladamente en el documento EP 1948789 y contiene el promotor de CMV humano, seguido de un lugar donante de corte y empalme/aceptor de corte y empalme de SV40, el ADNc de hAAT (SEQ ID NO: 12) y el lugar de poliadenilacion de SV40.

El plasmido pGS151 (Fig. 2b) contiene este casete de expresion de hAAT y el punto de inicio de la replicacion de

ADN (origen de replicacion, ori) de SV40. Con ayuda del ADN de SV40 y del cebador ori 1

(CCGGAATTCTTTGCAAAAGCCTAGGCCTC) (SEQ ID NO: 9) y ori 2

(CCGGAATTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCT) (SEQ ID NO: 10) se amplificaron las secuencias de SV40 mediante reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), se digirieron con EcoRI (en cada caso un lugar de corte EcoRI localizado en los cebadores) y se incorporaron en el lugar de corte EcoRI de pGS116.

d. Plasmidos de expresion de Epo: pGS177

El plasmido pGS127 se describio detalladamente en el documento EP 1948789 y contiene el promotor de CMV humano, seguido de un lugar donante de corte y empalme/aceptor de corte y empalme de SV40, el ADNc para la eritropoyetina (Epo) humana y el lugar de poliadenilacion de SV40.

Para el plasmido pGS177, el fragmento ori de SV40 se amplifico, tal como se ha descrito arriba, con los cebadores ori 1 y ori 2 y se incorporo en pGS127.

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2. Examen de las construcciones

a. Analisis de la secuencia

La complecion de todos los plasmidos arriba descritos se examino mediante digestion por restriccion. Ademas, se confirmo la secuencia y orientacion correctas del fragmento ori de SV40 en pGS151 y pGS177 mediante analisis de la secuencia. Las secuencias adenovirales en pSTK146, pGS119 y pGS122 se determinaron mediante analisis de la secuencia y coincidfan plenamente con la secuencia de tipo salvaje Ad5.

b. Verificacion de la expresion transitoria

Los plasmidos pSTK146, pGS119 y pGS122 se transfectaron en celulas HeLa y la expresion de las protemas E1A y E1B se analizo mediante transferencia Western utilizando anticuerpos monoclonales (Merck Bioscience). Los plasmidos pGS158, pGS159, pGS161 se transfectaron en celulas HEK293, y la expresion del antigeno T se detecto mediante transferencia Western y un anticuerpo monoclonal (Abcam, Cambridge, Reino Unido). Los plasmidos pGS116 y pGS151 se transfectaron en celulas CAP, y la expresion y secrecion de alfa 1 -antitripsina humana (hAAT) se detecto en el sobrenadante del cultivo mediante ELlSA (vease 6.).

Igualmente, se transfectaron los plasmidos pGS127 y pGS177 en celulas CAP y se detecto la expresion de Epo humana mediante ELISA (vease 6.).

3. Cultivo de celulas

a. Lineas celulares

Celulas de amniocitos (CAP y CAP-T) transformadas se cultivaron en medio 293SFMII (Invitrogen N° 11686-029), antibiotico/antibiotico al 0,5% (Invitrogen N° 15240-062), L-glutamina 4 mM (Invitrogen N° 25030-024) a 37°C, 95% de humedad del aire, 8% de CO2. El medio de cultivo de celulas CAP-T contema adicionalmente, ademas, 5 pg/ml de blasticidina (Invitrogen N° R210-01). Las celulas se inocularon habitualmente con una densidad inicial de 2-4 x 105 celulas/ml en un volumen de 12 ml en un frasco con agitacion y se cultivaron en la incubadora con agitacion a 100 rpm durante 3-4 dfas. A una densidad de 1-2 x 106 celulas/ml, las celulas se recolectaron mediante centrifugacion y se continuaron cultivando con una densidad de inicio arriba descrita en medio reciente.

Celulas HEK293, HEK293-T (ATCC N° CRL-11268) y HeLa se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (Advanced D-MEM, Invitrogen N° 12491-015) con suero de ternero fetal al 10% de forma adherente en placas de cultivo celular. Celulas HEK293-T se adaptaron escalonadamente al desarrollo en suspension exento de suero en medio 293-SFMII y se cultivaron en frascos con agitacion a 100 rpm, 37°C, 95% de humedad del aire y 8% de CO2.

b. Amniocitos primarios

Amniocitos primarios se obtuvieron, siguiendo metodos rutinarios correspondientes, en el marco de una puncion de lfquido amniotico. De esta puncion se cultivaron 1-2 ml con 5 ml de medio F10 de Ham (Invitrogen N° 31550-023), suero de ternero fetal al 10%, Ultroser G al 2% (CytoGen GmbH), 1 x antibiotico/antimicotico (Invitrogen N° 15240062) a 37°C, 95% de humedad del aire y 5% de CO2 en placas de cultivo celular Primaria de 6 cm (Falcon). Al cabo de 4-6 dfas, los amniocitos comenzaron a volverse adherentes y se anadieron 3 ml de medio reciente mas adiciones (vease la frase precedente). Si las celulas eran completamente adherentes, se retiro el medio y se reemplazo por 5 ml de medio reciente mas adiciones. Para los pasajes ulteriores, las celulas confluentes se lavaron con PBS, se desprendieron con tripsina (TrypleSelect, Invitrogen N° 12563011) y se transfirieron en 10 o bien 25 ml de medio reciente mas adiciones a placas de 10 cm o bien 15 cm.

4. Transformacion de amniocitos primarios

a. Transfeccion

Amniocitos primarios cultivados (vease 3b) se transformaron mediante transfeccion en cada caso con los plasmidos pSTK146, pGS119 o pGS122. Anteriormente, los plasmidos respectivos se linearizaron mediante digestion con enzimas de restriccion adecuadas (pSTK146, pGS119: ScaI; pGS122: PmeI). Antes de la transfeccion, los amniocitos se adaptaron escalonadamente a medio Opti-Pro (Invitrogen N° 12309-019) con Ultroser al 2%. Para ello, las celulas se mezclaron siempre despues de en cada caso 2-3 dfas con medio F10 de Ham reciente (con adiciones, vease 3b) mas medio Opti-Pro (con Ultroser al 2%) en la relacion 75:25%, 50:50%, 25:75% y 0:100%. Para la transfeccion, las celulas de una placa de 15 cm aprox. 80% confluentes se repartieron en seis placas de 6 cm, lo cual correspondfa a un numero de celulas de 5-7 x 105 celulas por placa. Al dfa siguiente, las celulas se transfectaron en 5 placas en cada caso con 2 pg de pSTK146, pGS119 o pGS122 linearizado utilizando el reactivo de transfeccion Effectene (Qiagen) segun los datos del fabricante. Una placa se continuo cultivando como control no transfectada. Al dfa siguiente, las celulas se lavaron con PBS, se desprendieron con TrypleSelect y se transfirieron en cada caso a una placa de 15 cm. Las celulas se cultivaron durante otros 10-15 dfas, reemplazando cada 3-4 dfas el medio por medio reciente. Durante este tiempo, se redujo la adicion de Ultroser a 1%. Despues de aprox. 10-15

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dfas, las celulas eran confluentes y se hicieron reaccionar en cada caso en dos placas de 15 cm tal como se ha descrito arriba.

b. Aislamiento de clones de celulas transformados

Pocas semanas despues de la transfeccion, se podfan observar en todas las transfecciones islas de celulas clonales que se diferenciaban morfologicamente de manera inequvoca de los amniocitos no transformados. Estas islas de celulas fueron escogidas y transferidas a placas de 24 pocillos (corresponde al pasaje 1). Las celulas se continuaron multiplicando y primeramente se transfirieron a placas de 6 cm y despues a placas de 15 cm. La expresion de las protemas E1 en las lmeas celulares clonales respectivas se detectaron en analisis de transferencia Western utilizando anticuerpos monoclonales (vease 2b).

La preparacion de lmeas celulares que expresan antigeno T en base a lmeas celulares de amniocitos transformadas se describe seguidamente a modo de ejemplo para una lmea celular resultante mediante transfeccion con pGS119 (denominada en lo que sigue lmea celular CAP). Despues del aislamiento y la expansion de las islas de celulas clonales, a partir de los clones de celulas se prepararon mediante clonacion de celulas individuales en el “proceso de dilucion limitada” lmeas geneticamente unitarias. En resumen, para ello una celula del clon a clonar se extendio en una cavidad de una placa de 96 pocillos y se controlo microscopicamente en el transcurso de los dfas siguientes la expansion real de solamente una celula. Lmeas que resultan a partir de celulas individuales se expandieron escalonadamente en placas de hasta 15 cm. Mediante la dilucion escalonada del medio de cultivo Opti-Pro/Ultroser al 1% con medio 293SFMII, las celulas se adaptaron al desarrollo en suspension en medio exento de suero. Las distintas lmeas celulares se examinaron en cuanto a la expresion de protemas estable y transitoria y a la elevada densidad de crecimiento, se eligio un clon con las propiedades mejores y seguidamente se continuo utilizando.

5. Preparacion de agrupaciones de celulas que expresan antfgeno T

En cada caso 1 x 107 celulas CAP (que resultan mediante transfeccion de amniocitos primarios con el plasmido pGS119, adaptadas al crecimiento en suspension en medio exento de suero) se transfectaron en cada caso con 5 |jg de ADN de plasmido pGS158, pGS159 y pGS161 linearizado, y se cultivaron en el matraz con agitacion bajo las condiciones arriba descritas. Para la seleccion de celulas establemente transfectadas se anadieron, 48 h despues de la transfeccion, 5 jg/ml de blasticidina, y las celulas se continuaron cultivando hasta que al cabo de aprox. 3-4 semanas resultaron agrupaciones de celulas de crecimiento estable. Las agrupaciones de celulas recibieron la denominacion Z582 (transfeccion con pGS158, antfgeno T expresado del promotor CAG), Z583 (transfeccion con pGS159, antfgeno T expresado del promotor de RSV) y Z597 (transfeccion con pGS161, antfgeno T expresado del promotor de CMV). Dado que se desconoce si una concentracion incrementada de antfgeno T es eventualmente toxica para celulas CAP, se intento expresar el antfgeno T con ayuda de promotores de diferente intensidad. Se pudo demostrar que la expresion de una protema de referencia en celulas cAp resulta la mas elevada en el caso de utilizar el promotor de CMV, es ligeramente mas debil con el promotor CAG y es claramente mas debil con el promotor de RSV. Con los tres promotores se pudieron generar agrupaciones de celulas de crecimiento estable y las tres agrupaciones de celulas expresan antfgeno T intracelular.

6. Expresion transitoria de protemas en celulas CAP y CAP-T

El fragmento ori de 359 pb utilizado aqu contiene frente al ori mmimo de 63 pb de longitud, adicionalmente a esta secuencia del “Nucleo” ademas las secuencias de repeticion de 21 pb y 72 pb (SEQ ID NO: 11). Estas dos secuencias de repeticion son ciertamente importantes principalmente para la funcion del promotor que se solapa con ori, pero existen indicios de que tambien refuerzan la replicacion de ADN de SV40 (Chandrasekharappa y Subramanian, J. Virol. 61,2973-2980, 1987).

Con el fin de testar si la concentracion de antfgeno T en la celula tiene influencia sobre la expresion de una protema de referencia, se testaron tres agrupaciones de celulas Z582, Z583 y Z597 que expresan antfgeno T bajo promotores de diferente intensidad y se compararon con la expresion transitoria en celulas CAP que no expresan antfgeno T. Para ello, en cada caso 1 x 107 celulas se transfectaron, con ayuda de la tecnologfa Nucleofector (Amaxa/Lonza, programa X-001, tampon V) con el plasmido circular pGS151 y se cultivaron en un volumen de inicio de 12 ml. Tres y seis dfas despues de la transfeccion, se cambio el medio, aumentandose el dfa 6 tambien el volumen hasta 15 ml. A partir del tercer hasta inclusive el septimo dfa despues de la transfeccion y el noveno dfa despues de la transfeccion se recogio en cada caso una parte almuota, se determino el numero de celulas y se determino la expresion de hAAT con ayuda del metodo ELISA (ensayo de inmunosorbente enlazado a enzima) utilizando anticuerpos anti-hAAT policlonales (no acoplados y acoplados a HRP; ICN Biomedicals). Como control se utilizo hAAT purificada a partir de plasma humano (ICN Biomedicals).

El resultado de este experimento se representa graficamente en la Fig. 3. En todas las agrupaciones de celulas CAP-T se alcanzo una expresion transitoria mayor en comparacion con las celulas CAP. La expresion transitoria en Z582 se encuentra 8 veces, en Z583 25 veces y en Z597 70 veces por encima de la de las celulas CAP. Tambien una segunda agrupacion de celulas CAP-T con expresion de antfgeno T del promotor de CMV proporciono una expresion elevada equiparable a la de Z597.

Estos datos demuestran que tanto la expresion permanente de antfgeno T en celulas CAP como tambien la

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magnitud de la expresion de antigenos T tiene una influencia sobre la magnitud de la expresion transitoria.

En otro experimento se determinaron las magnitudes de expresion transitorias de hAAT en la agrupacion de celulas Z597 despues de la transfeccion transitoria del plasmido pGS116 o bien pGS151. Estos dos plasmidos se diferencian solo por la presencia del fragmento de SV40-ori en pGS151. La transfeccion y el analisis cuantitativo de hAAT se llevaron a cabo tal como se ha descrito arriba, determinandose tanto la magnitud de la expresion de hAAT como tambien el desarrollo del numero de celulas vivas a lo largo del espacio de tiempo de ensayo de 9 dfas. El resultado de este ensayo esta representado graficamente en la Fig. 4. La presencia del fragmento de SV40-ori en el plasmido de expresion conduce a una expresion transitoria incrementada 30 veces. En conjunto, mediante la transfeccion de 1 x 107 celulas CAP-T en el espacio de 9 dfas se pudieron expresar 2,5 mg de hAAT en 40 ml de volumen, lo cual corresponde a un rendimiento de expresion de aprox. 60 mg/L y hasta 40 pg/celula/dfa. Aproximadamente 3 dfas despues de la transfeccion, se inicia el desarrollo de las celulas, la mitad de las celulas sigue permaneciendo por encima del espacio de tiempo total de ensayo por encima de 80%.

Con el fin de demostrar que este rendimiento de expresion transitoria no es espedfico para hAAT, se expreso de forma transitoria otra protema muy glicosilada, eritropoyetina (Epo) en celulas cAP-T. Tal como se ha descrito para hAAT, 1 x 107 celulas CAP-T de la agrupacion de celulas Z597 se transfectaron con los plasmidos pGS177 (contiene el casete de expresion de Epo y el fragmento de SV40-ori) y la Epo se cuantifico en el sobrenadante del cultivo celular mediante ELISA (R&D Systems, Quantikine IVD, Human Epo Immunoassay, DEP00). A lo largo de un espacio de tiempo de ensayo de 7 dfas podfan expresarse 0,73 mg de Epo en el caso de un rendimiento de la expresion de 32 mg/L.

7. Comparacion con la expresion transitoria en otros sistemas celulares

Una lmea celular humana ya descrita anteriormente, la denominada lmea celular HEK293-T, expresa de forma estable el antfgeno T de SV40 y se basa en la lmea celular HEK293 transformada con adenovirus humana (DuBridge et al., Mol. Cell. Biol. 7, 379-387, 1987). De manera equiparable a Z597, 1 x 107 celulas HEK293-T (medio exento de suero, cultivo en suspension) se transfectaron y cultivaron con 5 |jg de plasmido circular pGS151 con ayuda de la tecnologfa Amaxa-Nucleofektor segun los datos del fabricante (programa X-001, tampon V). El resultado de este experimento se representa graficamente en la Fig. 5. A pesar de que el numero de celulas 293-T el dfa 9 es claramente mayor que con CAP-T, la expresion transitoria en CAP-T esta aumentada aprox. 40 veces con respecto a 393-T.

8. Ensayo de replicacion

En un ensayo de replicacion debfa demostrarse si la expresion de antfgeno T en celulas CAP-T conduce a un numero de copias incrementado del plasmido de expresion con contenido en ori y, por consiguiente, explica la expresion de protemas transitoria claramente incrementada. Para ello, celulas Z597 o bien HEK293-T se transfectaron con los plasmidos pGS116 o bien pGS151 y se cultivaron tal como se describe arriba. Despues de 6, 12, 24, 48, 72 y 96 horas se recogieron en cada caso 1 x 105 celulas, se separaron por centrifugacion, se recogieron en PBS y se lisaron mediante la adicion de un volumen igual de NaOH 0,8 N. Los lisados celulares se transfirieron a un sistema de aparatos SlotBlot sobre una membrana de nilon cargada positivamente (GE Healthcare, Hybond-N+). Para el control se anadieron cantidades crecientes de plasmidos pGS116 y pGS151 a 1 x 105 celulas Z597, se lisaron tal como se describe arriba y se transfirieron. Esta norma correspondfa a 1000, 2500, 5000, 10000 y 15000 copias por celula. El ADN se fijo mediante incubacion durante 30 minutos de la membrana a 120°C y se hizo visible con ayuda de una sonda de PCR no marcada radiactivamente procedente del ADNc de hAAT segun los datos del fabricante (AlkPhos Direct Labelling and Detection System, GE Healthcare, RPN 3680 y 3682). El numero de copias en celulas transfectadas con pGS116 y pGS151 se cuantifico con ayuda de la concentracion conocida del plasmido estandar. El resultado de este ensayo de replicacion se representa graficamente en la Fig. 6. Como era de esperar, solamente pGS151, pero no pGS116 se replica en CAP-T Z597. En el caso de un numero de celulas constante, el numero de copias de pGS151 aumenta de aprox. 1500 copias/celula, 6 h despues de la transfeccion hasta casi 7000 copias/celula, 72 h despues de la transfeccion. Frente a ello, el numero de copias de pGS151 permanece constante en HEK293-T a lo largo de 96 h. Dado que el numero de celulas 293-T en este espacio de tiempo se ha duplicado, se puede partir del hecho de una debil replicacion de pGS151 en estas celulas, sin embargo, esta se encuentra claramente por debajo de la tasa de replicacion de Z597.

La deteccion de la expresion de antfgeno T en las lmeas celulares de amniocitos y celulas HEK293-T se realizo mediante analisis de transferencia Western. De las tres agrupaciones de celulas CAP-T y celulas HEK293-T se recogieron en cada caso 1 x 106 celulas en 50 jl de Tris/HCl 50 mM, pH 8, NaCl 140 mM, NP40 al 0,5%, EDTA 4 mM, EGTA 2 mM, PMSF 0,5 mM, glicerol al 5% y se incubaron durante 30 min en hielo. La mezcla de protemas se separo por centrifugacion durante 10 min a 13.000 rpm, y la concentracion de protemas en el sobrenadante se determino con ayuda de un kit de determinacion de protemas (Coomassie, Bradford, Thermo Life Science N° 23200). En un gel de SDS-poliacrilamida al 12% se separaron en cada caso 10 jg de protema, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Hybond ECL, Amersham Pharmacia Biotech) y con ayuda de un anticuerpo espedfico para el antfgeno T (Abcam, antfgeno T anti-SV40 ab16879) se visualizaron. Con este experimento se pudo demostrar que en Z597 se expresa mas antfgeno T que en las dos otras agrupaciones y que en celulas HEK293-T.

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9. Transfeccion con polietilenimina

Dado que el metodo de transfeccion arriba descrito solo se puede aumentar de manera condicionada, se testo otro reactivo de transfeccion, polietilenimina (PEI, Polysciences, N° 23966) que se describio sobre todo para transfecciones a gran escala. PEI lineal (PM = 25.000) se disolvio segun los datos del fabricante con una concentracion de 1 mg/ml y se empleo en la relacion ADN:PEI = 1:3. Para la transfeccion, 10 |jg de pGS151 se mezclaron con 30 jg de PEI, se incubaron durante 10 min a temperatura ambiente y se anadieron a 1 x 107 celulas CAP-T Z597 en 6 ml de medio FreeStyle (Invitrogen N° 12338-018). Despues de 5 h, se anadieron 6 ml de medio 293-SFMII y las celulas se incubaron a lo largo de 7 dfas. Tres dfas despues de la transfeccion, el medio se cambio por 293-SFMII y, en virtud del fuerte crecimiento de las celulas el volumen se elevo a 30 ml. El resultado de este experimento se representa en la Fig. 7. Mediante la transfeccion con PEI se alcanzo una expresion de protemas transitoria elevada en CAP-T. No obstante, el rendimiento de protemas maximo se encontraba aprox. 2 veces por debajo de la expresion alcanzada con la nucleofeccion. Lo destacable es que las celulas despues de la transfeccion con PEI crecen de manera claramente mas rapida e intensa y al cabo de 7 dfas se alcanza un numero de celulas de aprox. 10 veces en comparacion con la nucleofeccion.

Listado de secuencias

<110> CEVEC Pharmaceuticals GmbH

<120> Nueva lmea celular humana permanente

<130> C 4662EU-kl

<150> DE 10 2009 003 439.0 <151> 2009-02-05

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1 <211> 4344 <212> DNA

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> 1-4344 Ad5 <400> 1

Claims (10)

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   REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento para la expresion transitoria de polipeptidos y protemas recombinantes utilizando una lmea celular de amniocitos humanos permanente, que comprende las siguientes etapas:

   a) transfeccion de la lmea celular de amniocitos humanos permanente con una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de acidos nucleicos que codifica un polipeptido o protema recombinante deseado y un lugar de reconocimiento o de union para el antfgeno T grande de SV40 o el antigeno nuclear-1 (EBNA-1) del virus Epstein-Barr (EBV),

   b) cultivo de la lmea celular de amniocitos humanos permanente transfectada obtenida en la etapa a) bajo condiciones que permitan la expresion del polipeptido o la protema recombinante deseado y, a continuacion

   c) aislamiento del polipeptido o la protema recombinante deseado a partir de las celulas o a partir del sobrenadante del cultivo,

   obteniendose la lmea celular de amniocitos humanos permanente mediante un procedimiento, que comprende:

   i) transfeccion de celulas de amniocitos humanas primarias con una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de acidos nucleicos que codifica las funciones genicas E1A y E1B adenovirales, y

   ii) subsiguiente transfeccion de la lmea celular de amniocitos humana permanente obtenida en la etapa i) con una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de acidos nucleicos que codifica el antfgeno T grande de SV40 o el antfgeno nuclear-1 (EBNA-1) del virus Epstein-Barr (EBV).
2. 2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que la secuencia de acidos nucleicos que codifica las funciones genicas E1A y E1B adenovirales procede de un adenovirus humano, en particular del adenovirus humano serotipo 5.
3. 3. Procedimiento segun la reivindicacion 2, en el que la secuencia de acidos nucleicos que codifica las funciones genicas E1A y E1B adenovirales comprende los nucleotidos 1 a 4344, 505 a 3522 o 505 a 4079 del adenovirus humano serotipo 5.
4. 4. Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que la secuencia de acidos nucleicos que codifica el antfgeno T grande de SV40 comprende, ademas, la secuencia de acidos nucleicos para un promotor elegido del grupo del promotor de CMV, promotor CAG y promotor de RSV, la secuencia de acidos nucleicos para SV40 SD/SA (intron) y la secuencia de acidos nucleicos para SV40 poliA, y la secuencia de acidos nucleicos para el antfgeno nuclear-1 (EBNA-1) del virus Eptstein-Barr (EBV) comprende, ademas, la secuencia de acidos nucleicos para un promotor elegido del grupo de promotor de CMV, promotor CAG y promotor de RSV, la secuencia de acidos nucleicos para SV40 SD/SA (intron) y la secuencia de acidos nucleicos para SV40 poliA.
5. 5. Procedimiento segun una de las reivindicaciones precedentes, en el que en lugar de la etapa i) se utilizaron celulas de amniocitos humanos ya inmortalizadas mediante transfeccion con acidos nucleicos que codifican las funciones genicas E1A y E1B adenovirales.
6. 6. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el polipeptido recombinante o la protema es una hormona, un factor del plasma, un factor de la coagulacion de la sangre, un factor de crecimiento, un receptor celular, una protema de fusion, el receptor de Coxsackie y adenovirus (CAR), un anticuerpo, un antfgeno viral, bacteriano o parasitario o un factor de complementacion para la produccion de virus recombinantes.

   Promatar UbC

   imagen1

   • polLA

   Pormotor CAG

   Antigena T

   Intran SV40

   Promotor UbC

   imagen2

   Promotor UbC

   imagen3

   tig, le

   Promotor CMV

   Introri SV40

   imagen4

   ADNc de AAT

   imagen5

   360c?

   imagen6

   Promotor CMV

   imagen7

   imagen8

   Influencia de on sobre expresion transitoria

   2500

   2000

   - 20

   1500

   1000

   500

   hAAT -ori Recuento celulas -ori

   hAAT +or\

   Recuento celulas +ori

   dias

   imagen9

   Replication del plasmido en 293T y CAP-T

   £000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000

   O 20 40 60 80 100

   —•-CAP-T; pGS116 CAP-T: pGSISl horas

   “O— 293-T; pGS116 —Q— 293-T: pGS151

   imagen10

   imagen11

   CAP-T: Transfeccion de pohetilemmina

   1200
7. 3.E+0S

   1000
8. 2.E+QS

   SOO
9. 2.E + 0S

   600

   l.E + OS qj

   400
10. 5.E + 07

    200

    O.E + OO

    mas

    Recuento

    CAP-T/PEI: hAAT

    CAP-T/PEL ,

    ce u as