JPH04208858A - 遺伝子診断方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

［０００１１

【産業上の利用分野］本発明は試料中に存在する特定の
遺伝子を特異的に検出することにより診断を下す遺伝子
診断方法に関する。 ［０００２］ 【従来の技術】遺伝子（ＤＮＡ）に刻み込まれた遺伝情
報は、メツセンジャーＲＮＡを介して蛋白質又は酵素と
して表現される。この蛋白質や酵素の働きにより、様々
な化合物が生成され、それらの集合体として生物が存在
している。ヒトの遺伝子の総数は５〜１０万といわれて
いる。これらの遺伝子の中に何らかの異常や変化、例え
ば欠失や重複などが生じると、生成される蛋白質の特性
、種類、熾などが変化し、結果として生体系のバランス
が崩れて遺伝病を引き起こす。したがって、逆に病因と
なっている遺伝子を検出することにより、疾患の同定や
予防ができる。同様に、遺伝病だけでなく、病原体に起
因する疾病に関しても、病原体の遺伝子を検出すること
により、疾患の同定や予防ができる。 ［０００３］近年、生化学分野における進歩に伴って、
前述したように遺伝子そのものに基づく診断（遺伝子診
断と呼ばれている）が可能になってきた。この遺伝子診
断には、従来の診断法と比較して、いくつかの特色があ
る。 ［０００４］疾病の発現の機構を考えると、生化学的な
レベルでの変化に先行して、遺伝子上での変化が生じて
いるか、病原体の感染が起こっている。したがって、遺
伝子診断では、病気という変化に先立って、すなわち発
症前や病気の潜伏期又は極めて初期に、診断や予測がで
きることが大きな特色である。 ［０００５］また、遺伝性の疾患に関しては、生体内の
細胞では全ての遺伝子は同一であるので、分析する臓器
や組織には依存しないことも特色の一つである。このこ
とは、特に胎児での診断では重要であり、妊婦から羊水
を採取し羊水中に浮遊している胎児の細胞を調べるだけ
で診断できる。 ［０００６１以下、一般的な遺伝子診断の方法を簡単に
説明する。すなわち、試料から遺伝子を抽出し、必要が
あれば適当な制限酵素で断片化し、電気泳動を行った後
、サザンプロットを行い、目的とする遺伝子に対応する
遺伝子プロープ（放射性同位元素でラベルされている）
をハイブリダイズさせ、その後に低温でＸ線フィルムに
感光させて目的とする遺伝子の有無を確認する。しかし
、この方法では、放射性同位元素を使用することから、
診断場所が限定され、試薬の取扱いにも充分注意しなけ
ればならない。 ［０００７］この点を改善するために、放射性同位元素
に代わる安全なラベル剤の開発が望まれている。すでに
、アビジン−ビオチン結合を利用するもの、酵素や蛍光
物質を使用するものなどが提案されている。しかし、い
ずれも感度の点で放射性同位元素を超えるまでには至っ
ていない。また、遺伝子検出までに少なくとも２〜３日
間を要し、測定操作もかなり煩雑である。 ［０００８］

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、安全
かつ簡便な操作により短時間で実施でき、しかも高感度
で、目的とする遺伝子を検出することができる遺伝子診
断方法を提供することにある。 ［０００９］

【課題を解決するための手段】本発明の遺伝子診断方法
は、試料から１本鎖遺伝子を調製する工程と、前記１本
鎖遺伝子に、目的とするＤＮＡ又はＲＮＡと特異的に反
応するＲＮＡ又はＤＮＡ遺伝子プロープを反応させてＤ
ＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成させる工程と、前記Ｄ
ＮＡ−ＲＮＡハイブリッドと、リン脂質及び／又は糖脂
質からなり、その内部に標識物質が封入されたリポソー
ムの表面にＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ又はＲ
ＮＡを特異的に認識する物質を固定化させた遺伝子検出
用リポソーム試薬とを反応させる工程と、前記ＤＮＡＲ
ＮＡハイブリッドと遺伝子検出用リポソーム試薬との複
合体に、抗−核酸抗体及び補体を反応させ、前記リポソ
ーム試薬が破壊されることにより流出する標識物質を検
出する工程とを具備したことを特徴とするものである。 ［００１０１本発明において、試料から１本鎖遺伝子を
調製する操作は常法に従って行う　（例えば、　［臨床
検査Ｊ、Ｖｏ１．３２．Ｎｏ、４．ｐ、４０１　　（１
９８８）参照）。すなわち、試料溶液から２本鎖遺伝子
を抽出し、制限酵素で断片化した後、例えばアルカリ変
性して１本鎖遺伝子を調製する。 ［００１１１本発明において、ＲＮＡ又はＤＮＡ遺伝子
プロープは、目的とするＤＮＡ又はＲＮＡの特定の塩基
配列に対して相補的な塩基配列を有するものである。Ｒ
ＮＡ又はＤＮＡ遺伝子プロープは、前記のようにして調
製された１本鎖遺伝子中に目的とするＤＮＡ又はＲＮＡ
が存在する場合、これと特異的に反応し、ＤＮＡ−ＲＮ
Ａハイブリッドを形成する。この遺伝子プロープにはラ
ベル剤として放射性同位元素を使用する必要は全くない
。 ［００１２１本発明において用いられるリポソーム試薬
について、より詳細に説明する。本発明者らは先に特開
昭６０−１１７１５９号において、脂質膜からなるリポ
ソームの内部に親水性の標識物質（例えば蛍光性化合物
）を封入し、その表面に親水性の抗体又は抗原を固定化
した免疫分析試薬を開示し７た。この試薬を用いた免疫
分析方法は以下のようなものである。すなわち、抗原又
は抗体が存在する試料中に前記免疫分析試薬を加え、更
に補体を加えると、抗原−抗体反応及びそれに伴う補体
の作用によってリポソームが破壊され、封入されていた
標識物質が流出する。この流出した標識物質の量と、試
料中の被検物質との間には相関関係があるので、流出し
た標識物質を所定の分析方法（例えば蛍光分析）によっ
て定量することにより、被検物質を定量することができ
る。この試薬を用いれば、封入物質の流出に伴う信号増
幅効果により、高い感度が得られ、しかも分析操作の簡
便化が期待できる。このようなリポソーム試薬を遺伝子
の検出試薬として適用できれば、放射性同位元素をラベ
ル剤として使用する場合と同レベルの感度が得られ、し
かも安全かつ簡便に操作できると考えられる。 ［００１３］本発明で用いられる遺伝子検出用リポソー
ム試薬において、リポソームの主要構成成分としては、
ノン脂質及び／又は糖脂質が用いられる。リン脂質及び
糖脂質は特に限定されるものではなく、例えばジパルミ
トイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロ
イルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジパルミトイ
ルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジオ
レオイルホスファチジルエタノールアミン（Ｄ　ＯＰＥ
）、シミリストイルホスファチジルエタノールアミン（
ＤＭＰＥ）　、ジステアロイルホスファチジルエタノー
ルアミン（ＤＳＰＥ）などが挙げられる。これらリン脂
質、糖脂質中の脂肪酸炭素鎖は炭素原子数が１２〜１８
であることが好ましく、更に偶数であることがより好ま
しい。なお、必要に応じてリン脂質、糖脂質に対してコ
レステロールを１０〜５００モル％の割合で加えてもよ
く、これによって安定な多重層リポソームを調製するこ
とができる。 ［００１４１本発明で用いられる遺伝子検出用リポソー
ム試薬において、リポソーム内に封入される標識物質と
しては、親水性であり、リポソーム外に流出した際に定
量可能な物質が選択される。このような物質としては、
例えば高濃度では自己消光により蛍光を示さないが、低
濃度（１０−３Ｍ以下）で非常に強い蛍光を発するカル
ボキシフルオレセインのような蛍光性物質；リポソーム
外で酸化反応により発光するルミノールやルシフェリン
のような発光性物質；可視域又は紫外域に特異的な吸収
帯を有する吸光性化合物（水溶性色素等）；酸化酵素の
作用により分解され、酸素消費又は過酸化水素生成をも
たらすグルコース、シュークロースなどの糖類及びそれ
らの酸化酵素；テトラペンチルアンモニウムのような比
較的大きなイオン性化合物；ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド（ＮＡＤ）のような補酵素類；メチルビオ
ロゲンなどのラジカル化合物などが挙げられる。これら
の化合物は、検出方法、感度及びリポソームの安定性な
どの因子を考慮したうえで適宜選択される。 ［００１５１本発明で用いられる遺伝子検出用リポソー
ム試薬において、リポソーム表面に固定化される、ＤＮ
Ａ−ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ又はＲＮＡを特異的に
認識する物質としては、抗体又は抗体の一部、又は酵素
又は酵素の一部が挙げられる。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＥ
、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＭのいかなるクラス又はサブク
ラスであってもよい。なお、感度の向上という点からは
、ポリクローナル抗体よりもモノクローナル抗体を使用
することが好ましい。また、抗体のＦｃ部分を除去して
得られるＦ（ａｂ’）２、更にこれを還元剤で還元して
得られるＦａｂ’でもよい。例えば、Ｗ、Ｄ、５ｔｕａ
ｒｔらの方法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ｓｃ　ｉ、ｕｓ
Ａ、、Ｖｏｌ、７８．Ｎｏ、６．ｐｐ、３７５１−３７
５４、Ｊｕｎｅ、１９８１）によりマウスで調製された
モノクローナル抗体が挙げられる。酵素としては、ＲＮ
ａｓｅ又はＤＮａｓｅ、例えばＲＮａｓｅＨ，５Ｌ−Ｎ
ｕｃｒｅａｓｅなどが挙げられる。これらのうち、ＤＮ
Ａ−ＲＮＡハイブリッドを特異的に認識できるＲＮａｓ
ｅＨが特に好ましい。また、これらの酵素に部位特異的
突然変異を導入するなどにより修飾して、核酸分解酵素
としての活性を失わせることが好ましい。 ［００１６］以下、前述した遺伝子検出用リポソーム試
薬の製造方法を説明する。なお、ここではリポソーム上
に抗体又は抗体の一部、又は酵素又は酵素の一部を固定
化するための官能基として、ハロゲン化アセチル基を用
いる場合を例として説明する。 ［００１７］まず、所望のリン脂質又は糖脂質に、下記
式で表わされるハロゲン化アセチル基を導入する。 ［００１８］　　Ｃｏ　（ＣＨ２）　ｍＮＨＣＯＣＨ２
Ｘ（ｍは０〜１２の整数であり、ｍの数を適当に設定す
ることにより脂質分子と官能基とを結合させるスペーサ
すなわち（ＣＨ２）ｍの長さを選択できる。ＸはＣ１，
Ｂｒ又はＩ）。 ［００１９］例えば、３−アミノプロピオン酸（ＮＨ２
（ＣＨ２）２　Ｃ００Ｈ）又は５−アミノ吉草酸（ＮＨ
２（ＣＨ２）４　Ｃ００Ｈ）などのω−アミノ酸のアミ
ン基をｔ−ブトキシカルボニル基（以下、Ｂｏｃ基と記
す）などで保護した後、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド
（Ｈ３Ｉ）及びＮ、　Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジ
イミド（ＤＣＣＤ）とともにトリエチルアミン（ＴＥＡ
）存在下でアミノ基含有脂質（例えばＤＰＰＥ）と反応
させ、その後に塩酸などで保護基をはずす。なお、ω−
アミノ酸のアミノ基をＢｏｃ基などで保護した後、Ｈ８
Ｉ及びＤＣＣＤとＴＥＡ存在下で反応させてサクシンイ
ミドエステルを合成し、このサクシンイミドエステルと
アミノ基含有脂質とを反応させ、その後に保護基をはず
してもよい。次に、得られたスペーサ付き脂質に、ハロ
ゲン化酢酸をＨ３Ｉ及びＤＣＣＤとともにＴＥＡの存在
下に反応させる。

【００２０】また、予めω−アミノ酸のカルボキシル基
をエステル化して保護し、ハロゲン化酢酸と結合させ、
保護基をはずした後、アミノ基含有脂質、Ｈ３Ｉ及びＤ
ＣＣＤとＴＥＡ存在下で反応させてもよい。 ［００２１１このようにして合成される脂質の精製には
、分取用薄層クロマトグラフィーを用いると簡便である
。 ［００２２１次いで、前記のようにして得られたーＣ０
（ＣＨ２）ｍ　ＮＨＣＯＣＨ２Ｘ基を有するリン脂質及
び／又は糖脂質、及び必要に応じてコレステロールや他
の脂質の適当量をフラスコに入れ、溶媒を加えて溶解・
混合させた後、溶媒を吸引除去して乾燥する。この結果
、フラスコ壁面に脂質薄膜が形成される。つづいて、フ
ラスコ内に適当な標識物質を含有する水溶液を加え、適
当な温度まで加温した後、密栓して振とうすることによ
り多重層リポソームの懸濁液を調製する。 ［００２３］一方、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＤＮ
Ａ又はＲＮＡを特異的に認識する物質には、ペプシンな
どの酵素による処理及び還元処理を施してＳＨ基を導入
するか、又はＮ−サクシンイミジル−３−（２−ピリジ
ル）ジチオプロピオネート（ＳＰＤＰ）などの二官能性
試薬と反応させた後に還元してＳＨ基を導入しておく。 ［００２４］更に、前記リポソーム懸濁液と前記ＤＮＡ
−ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ又はＲＮＡを特異的に認
識する物質とを適当な緩衝液中で反応させることにより
、リポソーム表面に一〇〇（ＣＨ２）　ｍＮＨＣＯＣＨ
２Ｓ−結合を介してＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＤＮ
Ａ又はＲＮＡを特異的に認識する物質を固定化させるこ
とができる。 ［００２５１本発明において、抗−核酸抗体、例えばウ
サギ抗−核酸抗体は、常法に従って調製することができ
る（「蛋白質　核酸　酵素」臨時増刊、Ｖｏｌ、１１゜
Ｎｏ、　１５．　ｐｐ、　１４５２−１４５７　（１９
６６）参照）。また、補体としては、例えばモルモット
の血清を適当に希釈して使用する９ ［００２６］以下、本発明の遺伝子診断方法の一例を図
１を参照してより詳細に説明する。ここでは、ヒト血清
から肝炎ウィルス（ＨＢＶ）遺伝子を検出する場合を例
として説明する。 ［００２７］まず、被検遺伝子試料溶液（血清）１から
２本鎖ＤＮＡ２を抽出し、これを適当な制限酵素で切断
して断片化した後、例えばアルカリ変性して１本鎖ＤＮ
Ａ３を調製する。この際、−本鎖ＤＮＡ５どうしのセル
フ・ハイブリダイゼーションを防止するために７０℃以
上で反応させることが望ましい。溶液を中和した後、５
０〜６０℃まで冷却し、Ｆ（ＢＶ遺伝子に対するＲＮＡ
遺伝子プロープ４を５０％ホルムアルデヒド存在下で反
応させる。被検遺伝子試料溶液１中にＨＢＶ遺伝が存在
する場合には、この反応によってＤＮＡ−ＲＮＡハイブ
リッド５が形成される。次いで、反応液を適当な緩衝液
で適当に希釈し、遺伝子検出用リポソーム試薬６を加え
て一定時間反応させる。更に、適当な濃度のウサギ抗−
核酸抗体７及び補体８を加えて再び一定時間反応させる
。 ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド５が形成されている場合に
は、この反応によってリポソーム試薬６が破壊されて、
標識物質が流出するので、これを適当な方法（例えば蛍
光分光光度計など）で測定することにより、ＨＢＶ遺伝
子の存在を判定することができる。 ［００２８）この場合、遺伝子検出用リポソーム試薬と
被検遺伝子との充分な反応に要する時間・温度・ｐＨな
どの反応条件は、被検遺伝子及び対応する遺伝子プロー
プの種類（長さ、塩基配列など）、リポソーム試薬の特
性、更にはリン脂質又は糖脂質に化学結合された物質（
ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ又はＲＮＡを特異
的に認識する）の種類、量、純度などによって異なる。 このため、個々の場合に応じて、最適な反応条件及び緩
衝液を設定することが望ましい。 ［００２９］本発明の遺伝子診断方法では、リポソーム
試薬中の標識物質の流出による増幅効果により、遺伝子
プロープのラベル剤として放射性同位元素を使用する従
来法と同程度の感度が得られる。しかも、放射性同位元
素を使用しないので、測定場所を選択する必要もなく安
全に操作できる。また、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドな
どを分離する操作を行わなくてもよいので、測定時間が
短くてすみ、装置による自動化も容易である。更に、目
的とする遺伝子の種類にかかわらず、共通のリポソーム
を使用することができ、試薬開発費の大幅な削減が期待
できる。 ［００３０１本発明の方法を実施するための自動遺伝子
検出装置を図２に示す。ターンテーブル１１上には多数
の反応セル１２がリング状に配列されている。ターンテ
ーブル１１は間欠的に回転する。反応セル１２には、予
めＲＮＡプロープ溶液が入れられている。移動している
各反応セル１２には、順次、試料から前処理により調製
された一本鎖ＤＮＡ溶液１３、希釈液１４、リポソーム
試薬１５、抗−核酸抗体溶液１６、補体溶液１７がそれ
ぞれポンプ１８を通して供給される。反応後の溶液は、
蛍光分光光度計１９により蛍光強度が測定される。ポン
プ１８及び蛍光分光光度計１９の動作はＣＰＵ２０によ
りプログラム制御される。 ［００３１１

【実施例］以下、本発明の詳細な説明する。 ［００３２］実施例１本実施例において用いた試薬のう
ちジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、
ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰ
ＰＥ）、コレステロールはシグマ社製のものを用いた。 他の試薬は市販品（特級）を精製せずに用いた。なお、
水は全てイオン交換水を用いた。 ［００３３］　　（Ａ）モノクローナル抗−ＤＮＡ−Ｒ
ＮＡハイブリッド認識抗体を固定化したリポソーム試薬
の調製 （１）ＮＨ２（ＣＨ２）４　Ｃｏ　　ＤＰＰＥ　（以下
、ＮＨ２−Ｃ５−ＤＰＰＥのように略す）の合成（ａ）
Ｂｏｃ−５−アミノ吉草酸の合成５−アミノ吉草酸（Ａ
ｌｄｒｉｃｈ社製）１．１７ｇ［１０ミリモル］にトリ
エチルアミン（ＴＥＡ）３ミリ［約２０ミリモル］及び
水１０ｍ１を加えて溶解した。 この溶液に２−　（ｔ−ブトキシカルボニルオキシイミ
ノ）−２−フェニルアセトニトリル（ペプチド研究所製
商品名Ｂｏｃ−ＯＮ）２．７ｇ　［１１ミリモル］をジ
オキサン１０ｍ１に溶解した溶液を添加し、室温で３時
間撹拌する二とにより、５−アミノ吉草酸のアミノ基を
Ｂｏｃ基で保護した。反応後、反応液をロータリーエバ
ポレータで濃縮し、酢酸エチル、５％炭酸水素ナトリウ
ム水溶液、５％クエン酸水溶液の順で抽出・精製した。 最後に、無水硫酸ナトリウムで脱水し、低温で結晶化さ
せてＢｏｃ−５−アミノ吉草酸を得た。収率は７０％で
あった。 ［００３４］　　（ｂ）Ｂｏｃ−５−アミノ吉草酸サク
シンイミドエステルの合成 りｏｃ−５−アミノ吉草酸０．２３ｇ　［１ミリモル］
をクロロホルム２０ｍ１に溶解し、Ｎ−ヒドロキシサク
シンイミド（Ｈ３Ｉ：ペプチド研究新製）０．１３ｇ［
１，１ミリモル］及びジシクロへキシルカルボジイミド
（ＤＣＣＤ；ペプチド研究新製）　０．　２５ｇ［１，
２ミリモルＪを添加した後、室温で３時間撹拌した。反
応後、ロータリーエバポレータで溶媒を除去し、生成物
に酢酸エチル３０ｍ１を加えて溶解し、ろ過して沈殿物
を除去した。再び溶媒を除去し、生成物をクロロホルム
５ｍｌに溶解した。このＢｏｃ−５−アミノ吉草酸サク
シンイミドエステル［約０．　２ミリモル／ｍｌと仮定
］溶液を、以下の反応に使用した。 （００３５］　　（Ｃ）ＮＨ２Ｃ３−ＤＰＰＨの合成り
ＰＰＥ７０ｍｇ　［１００マイクロモル１をクロロホル
ム２０ｍ１に懸濁し、これにＴＥＡ５０μｌ及び前記Ｂ
ｏ（−５−アミノ吉草酸サクシンイミドエステル１ｍｌ
し約２００マイクロモル］を加え、２０℃で１晩撹拌し
、サクシンイミド残基とＤＰＰＥとの交換反応を行った
。反応後、メタノール及び３％クエン酸水溶液を用いて
ＴＥＡを抽出し、無水硫酸ナトリウムで脱水し、ロータ
リーエバポレータを用いて溶媒を除去した。次に、生成
物に１Ｍ塩酸／酢酸１．５ミリを加えて溶解し、３７℃
で１時間放置し、Ｂｏｃ基をはずした。反応液をロータ
リーエバポレータで濃縮した後、メタノール及びクロロ
ホルムで繰り返し洗浄し、塩酸及び硫酸を除去した。 次いで、クロロホルム／メタノールエフ／３混合溶媒を
展開溶媒として用い、シリカゲルを吸着剤とする分取用
薄層クロマトグラフィー（＃５７１７、メルク社製）に
より、生成物を精製した。ＮＨ２−Ｃｓ　−ＤＰＰＥの
収率は６０％であった。 ［００３６］　　（２）ブロモアセチル（ＢｒＡｃ）−
ＮＨＣ５，−ＤＰＰＥの合成 ブロモ酢酸１４０ｍｇ［１ミリモル］をクロロホルム３
０ｍ１に溶解し、Ｈ３Ｉ　１４０ｍｇ　［１，２ミリモ
ル］及びＤＣＣＤ２５０ｍｇ　［１，２ミリモル１を添
加し、室温で３時間反応させた後、ロータリーエバポレ
ータで溶媒を除去した。生成物に酢酸エチル３０ｍ１を
加えた。生じた白色沈殿をろ別し、再び溶媒を除去した
後、クロロホルム１０ｍ１に再溶解させた。 ［００３７１次に、（１）で調製したＮＨ２Ｃｒ、　−
ＤＰＰＥのクロロホルム溶液的１０ｍ１［５０マイクロ
モル１に、前記溶液１ｍｌ及びＴＥＡ５０ｕｌを加え、
室温で１晩反応させた。反応後、溶液を濃縮し、クロロ
ホルム／メタノールエフ／３混合溶媒を展開溶媒として
、分取用薄層クロマトグラフィーにより、生成物を精製
した。ＢｒＡｃ　−ＮＨ−Ｃ５−ＤＰＰＥの収率は５０
％であった。なお、最終生成物は１ｍＬｉの濃度となる
ようにクロロホルムで希釈した。 ［００３８］　　（３）リポソームの調製使用した脂質
は全てクロロホルム又はクロロホルム／メタノール（２
／１）混合溶媒に溶解した。 ［００３９１５ｍＭのＤＰＰＣ２００μｌ、１０ｍＭの
コレステロール１００μｍ、　（２）で調製した１ｍＭ
のＢｒＡｃ　−ＮＨ−Ｃｓ　−ＤＰＰＥ５０μｍ及び５
ｍＭのステアリルアミン２５μｍを、１０ｍ１容量のナ
シ型フラスコに入れ、更にクロロホルム２ｍｌを加えて
よく混合した。約４０℃の水浴中でロータリーエバポレ
ータにより溶媒を除去した。フラスコ内に、再びクロロ
ホルム約２ｍｌを加えて充分に撹拌した後、再度ロータ
リーエバポレータにより溶媒を除去した。この操作を数
回繰返すと、フラスコ壁面に脂質薄膜が形成された。つ
づいて、フラスコをデシケータ中に移して真空ポンプで
約１時間吸引して溶媒を完全に除去した。　　　　”［
００４０１次いで、フラスコ内に、０．２Ｍのカルボキ
シフルオレセイン（イーストマンコダック社製、ｐＨ７
，４二以下、ＣＦと記す）溶液１００μｌを添加し、フ
ラスコ内部を窒素で置換した後、密栓して約６０℃の水
浴中に約１分間浸漬した。つづいて、ＶＯｒｔｅＸミキ
サーを用い、フラスコ壁面の脂質薄膜が完全に消失する
までフラスコを激しく振とうした。この操作により多重
層リポソーム懸濁液が調製された。更に、リポソーム懸
濁液に、０．０１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（０，８５％Ｎ
ａＣ１含有、ｐＨ７，４５：以下、ＨＢＳと記す）を少
量添加した後、全て遠心チューブに移し４℃において１
５０００ｒｐｍで２０分間遠心する操作を数回繰返した
。最後に、１０ｍＭのホウ酸緩衝液（０，８５％ＮａＣ
１含有、ｐＨ９，０：以下、ＢＢＳと記す）を用いて、
セラムチューブ（コーニング社製）にリポソームを移し
、１度遠心分離して上澄を除去した。得られたリポソー
ムは、後述するモノクローナル抗−ＤＮＡ−ＲＮＡハイ
ブリッド認識抗体（Ｆａｂ−）の固定化反応に使用する
まで冷蔵庫に保存した。 ［００４１１（４）モノクローナル抗−ＤＮＡ−ＲＮＡ
ハイブリッド認識抗体の修飾 Ｗ、Ｄ、５ｔｕａｒｔらの方法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１
゜Ｓｃ　ｉ、　ＵＳＡ、　、　Ｖｏ　１．　７８．　Ｎ
ｏ、　　６．　　ｐｐ、　　３７５１−３７５４．Ｊｕ
ｎｅ、１９８１）に従ってマウスで調製された、モノク
ローナル抗−ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド認識抗体（サ
ブクラスＩｇＧ＋）溶液１００μｌを０．１Ｍの酢酸緩
衝液（ｐＨ４，５）を用いて透析し、ペプシン（シグマ
社製）１０Ｍｇを添加し、３７℃で１時間反応させた。 この反応により、抗体にＳＨ基を導入した。次（−高速
液体クロマトグラフィーによりＦ　（ａｂ＝）２分画の
みを分取した。このＦ（ａｂ−）２分画を含む０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ６，０）にメルカプトエチルアミン
・塩酸塩１０ｍｇを加え、３７℃で９０分間反応させ、
ゲルろ過（セファデックスＧ−２５ゲル、ＢＢＳろ過液
）により、遊離のＳＨ基を含有するタンパク分画（Ｆａ
ｂ’）のみを分取した。このタンパク分画の溶液の容量
は０．　５ｍｌ、濃度はＯＤ２８０ｎｍ、＝１であった
。 ［００４２］　　（５）モノクローナル抗−ＤＮＡ−Ｒ
ＮＡハイブリッド認識抗体のリポソームへの固定化前記
リポソーム懸濁液とＦａｂ’の溶液とを混和し、２０℃
で４４時間撹拌・反応させた。反応後、ゼラチン−ベロ
ナール緩衝液（以下、ＧＶＢ−と記す）で３回洗浄した
。得られた遺伝子検出用リポソーム試薬を、ＧＶＢ　　
２ｍｌに懸濁させて４℃で保存した。 ［００４３１（Ｂ）遺伝子検出用リポソーム試薬の評価
前記のようにして調製された遺伝子検出用リポソーム試
薬を遺伝子検出に使用するに先立ち、リポソーム表面に
抗体が固定化されていることを確認するために、以下の
ようにして免疫分析を行った。 （００４４］予めウサギ抗−マウスＩｇＧ抗体（Ｄ　ａ
　ｋＯ社製）をＧＶＢ２”　　（ＧＶＢ−に０．５ｍＭ
のＭｇＣｌ２及び０．１５ｍＭのＣａ　Ｃ１２を添加し
たもの）で１０〜１０６倍に希釈しておいた。これらの
溶液各１０μｌに、前記遺伝子検出用リポソーム試薬の
１０倍希釈＊＊液１０μｌ及び補体（モルモット血清；
補体価＝２５０）の８０倍希釈溶液５０μｌを添加し、
３７℃で３０分間反応させた。反応後、０．０１ＭのＥ
ＤＴＡ−ベロナール緩衝液１００　／４１で反応を停止
させ、各濃度のウサギ抗−マウスＩｇＧ抗体溶液につい
て、流出したＣＦ量を蛍光分光光度計（ＭＴＰ−３２、
コロナ電気製）により励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５
２０ｎｍの条件で測定した。そして、次式に基づいて相
対蛍光強度、すなわち溶出率を計算した。 ［００４５１相対蛍光強度＝　（Ｆ　ｅ−Ｆｏ　）　／
　（Ｆ　ａ　−Ｆｏ）Ｘ１００ここで、Ｆｅ：実測した
蛍光強度、Ｆｏ　：ウサギ抗−マウスＩｇＧ抗体を除い
たＧＶＢ２”−を加えたとき（リポソームが全く破壊さ
れていないとき）の蛍光強度、Ｆａ：脱イオン水を添加
してリポソームを全て破壊した時の蛍光強度である。な
お、標準値として１０−７及び１０−８ＭのＣＦ溶液の
蛍光強度を用いた。 ［００４６］この測定結果を図３に示す。図３から明ら
かなように、この遺伝子検出用リポソーム試薬はウサギ
抗−マウスＩｇＧ抗体と特異的に反応しており、リポソ
ーム表面にモノクローナル抗体が固定化されていること
が確認された。 ［００４７１（Ｃ）ヒト血清中のＨＢＶ遺伝子の検出前
述した遺伝子検出用リポソーム試薬を用い、ヒト血清中
のＨＢＶ遺伝子の検出を試みた。 （００４８１常法に従い、ヒト血清から２本鎖ＤＮＡを
抽出し、制限酵素Ｐｓｔｌで断片化した後、アルカリ変
性して１本鎖ＤＮＡを調製した。このようにして調製さ
れた１本鎖ＤＮＡとＨＢＶ遺伝子のＲＮＡ遺伝子プロー
プ（第−化学層）とを１ｍｌのＧＶＢ２＋　（５０％ホ
ルムアミド含有）中において、６０℃で３０分間反応さ
せてハイブリダイズさせた後、この反応液をＧＶＢ２＋
で１０倍に希釈し、予めＧＶＢ２＋で１０倍に希釈した
前記遺伝子検出用リポソーム試薬の懸濁液１００μｌを
添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。次に、
ウサギ抗−核酸抗体（ウサギ血清を予めＧＶＢ２＋で１
０倍に希釈）１００μｌ及び補体（モルモット血清を予
めＧＶＢ２＋で２０倍に希釈）１００μｌを添加し、３
７℃で更に３０分間インキュベートした。 ［００４９］そして、流出したＣＦ量を蛍光分光光度計
により励起波長４９０　ｎｍ、蛍光波長５２０　ｎｍの
条件で測定した。表１に１０検体の相対蛍光強度を示す
。このうち、＃１〜７は肝炎患者、＃８〜１０は正常人
の血清試料である。 ［００５０１ 【表１］ 検体番号（＃）　　　　１　２　３　４　５　６　７　
　Ｂ　　９　１０相対賞光強度（％）　　１５　３２　
３０　２８　４２　１３　２７　１１　６　１表１から
明らかなように、肝炎患者のみからＨＢＶ遺伝　　※出
用リポソーム試薬を用い、標準のＨＢＶ遺伝子に対す子
が検出されていることがわかる。また、前記遺伝予検※
５θ　る検出感度を調べたところ、約１ｐｇのＤＮＡ量
から検出回能であり、放射性同位元素でラベルした遺伝
子プロープを用いる従来法とほぼ等感度であることが示
された。 ［００５１］実施例２ リポソーム表面に固定化させる抗体として、ＲＮＡを特
異的に認識するモノクローナル抗体（実施例１と同様に
Ｗ、Ｄ、５ｔｕａｒ　ｔらの方法に従ってマウスで調製
された）を用いた以外、他の試薬は全て実施例１と同一
の＊＊ものを用いて、遺伝子検出用リポソーム試薬を調
製した。 ［００５２］　この遺伝子検出用リポソーム試薬を用い
、実施例１と同様にして、ＨＢＶ遺伝子の検出を試みた
。 表２に１０検体（実施例１で用いた試料と同一）の相対
蛍光強度を示す。 ［００５３］ 【表２】 検体番号（参）　　　　１　２　３　４　５　６　７　
８　９　１＠相相対先光度（％）　　２２　２５　２５
　２０　２１　２２　２４　３　５　３表２から明らか
なように、実施例１とほぼ同様の結果が得られている。 また、この遺伝子検出用リポソーム試薬について、標準
のＨＢＶ遺伝子に対する検出感度を調べたところ、実施
例１と同様に約１ｐｇのＤＮＡ量から検出可能であり、
放射性同位元素でラベルした遺伝子プロープを用いる従
来法とほぼ等感度であることが示された。 ［００５４］実施例３ 大腸菌由来のＲＮａｓｅ　　Ｈの活性中心に、Ｋ、Ｋａ
ｔａｙａｎａｇ　ｉらの方法（Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ、
３４、ｐｐ、３０６−３０９．２０．Ｓｅｐ、１９９０
）※※により、部位特異的突然変異を導入し、ＲＮａｓ
ｅとしての分解活性を失活させた。この酵素に、二官能
性架橋剤として５ＰＤＰ　　（ファルマシア社製）、及
び還元剤としてジチオトレイトールを反応させ、ＳＨ基
を導入した。この酵素をリポソーム表面に固定化して、
リポソーム試薬を調製した。 ［００５５］この遺伝子検出用リポソーム試薬を用いて
、実施例１と同様に、ＨＢＶ遺伝子の検出を試みた。 表３に示すように、実施例１と同様な結果が得られた。 ［００５６］

【表３】 検体番号（参’）　　　　１　２　３　４　５　６　７
　８　９　１０相対蛍光強度（％）　　２８　３０　３
１　２５　３２　２７　２ラ　５４５［００５７］

【発明の効果】以上詳述したように本発明の遺伝子診断
方法は、安全かつ簡便な操作により短時間で実施でき、
しかも高感度で目的とする遺伝子を検出することができ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の遺伝子診断方法を示す説明図。

【図２】本発明の遺伝子診断方法を実施するための自動
遺伝子検出装置を示す図。

【図３】本発明の遺伝子検出用リポソーム試薬とウサギ
抗−マウスＩｇＧ抗体希釈液との反応による相対量光強
★★度を示す図。

【符号の説明】

■・・・試料溶液、２・・・２本鎖遺伝子、３・・・１
本鎖遺伝子、４・・・ＲＮＡ遺伝子プロープ、５・・・
ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、６・・・遺伝子検出用リ
ポソーム試薬、７・・・抗−核酸抗体、８・・・補体、
１１・・・ターンテーブル、１２・・・反応セル、１３
・・・１本鎖ＤＮＡ溶液、１４・・・希釈液、１５・・
・リポソーム試薬、１６・・・抗−核酸抗体溶液、１７
・・・補体溶液、１８・・・ポンプ、１９・・・蛍光分
光光度計、２０・・・ＣＵ０

【図２】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】試料から１本鎖遺伝子を調製する工程と、
   前記１本鎖遺伝子に、目的とするＤＮＡ又はＲＮＡと特
   異的に反応するＲＮＡ又はＤＮＡ遺伝子プロープを反応
   させてＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成させる工程と
   、前記ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドと、リン脂質及び／
   又は糖脂質からなり、その内部に標識物質が封入された
   リポソームの表面にＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＤＮ
   Ａ又はＲＮＡを特異的に認識する物質を固定化させた遺
   伝子検出用リポソーム試薬とを反応させる工程と、前記
   ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドと遺伝子検出用リポソーム
   試薬との複合体に、抗−核酸抗体及び補体を反応させ、
   前記リポソーム試薬が破壊されることにより流出する標
   識物質を検出する工程とを具備したことを特徴とする遺
   伝子診断方法。