CN110531074B - 一种检测空肠弯曲杆菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测空肠弯曲杆菌的方法，包括以下步骤：（1）制备检测线包被空肠弯曲杆菌抗体、质控线包被羊抗鼠IgG抗体的试纸条；（2）在试纸条检测区域下方放置磁铁；（3）检测空肠弯曲杆菌含量。本发明的试纸条基于在检测区域聚集的Fe₃O₄@Au所产生的磁信号，可定量测定样品中的空肠弯曲杆菌含量。本发明的试纸条检测限低（1cfu/mL、10 cfu/mL）、特异性好、成本低廉、检测时间短。此外，该类型试纸条不需要任何额外设备即可实现对目标物的快速灵敏检测，能够满足现场快速检测的需求，适用于液体样品中致病菌及各种有毒有害物质的检测，极具实用价值。

Description

一种检测空肠弯曲杆菌的方法

技术领域

本发明属于分析检测领域，具体涉及一种检测空肠弯曲杆菌的方法。

背景技术

空肠弯曲杆菌，一种人畜共患病病原菌，是威胁人类健康的主要病原菌之一。由于其广泛存在于鸟、禽、狗、猫等动物体内，可通过污染肉、奶及未经消毒处理的水而导致感染，由其引发的疾病往往人群数量多，分布广，给食品安全和人们健康带来巨大的威胁。因此，食品中空肠弯曲杆菌的检测具有非常重要的意义。

目前常用的检测食源性致病菌的方法主要有平板计数法、重组酶聚合酶扩增法、即时聚合酶链锁反应法、酶联免疫吸附测定法、表面等离子共振法、石英晶体微天平传感器、阻抗型免疫传感器、颜色传感器、荧光免疫分析法等。这些现有的检测方法通常需要对样品进行分离、纯化培养、富集，步骤繁多、实验周期长，致使整个检测过程费时费力，不能满足现场快速检验的需要。

免疫层析技术因其成本低、快速、简单、便携等特点在食品安全领域有着巨大的应用前景。然而，传统的基于胶体金的免疫层析技术存在灵敏度低的缺陷，极大限制了其应用的广度和商业化的可能性。因此，采用新策略克服免疫层析技术灵敏度低的瓶颈问题，对于拓展其应用范围，提高其实用性就变得尤为必要。

发明内容

为了解决这一阻碍免疫层析技术应用的瓶颈，本发明中，我们通过将经典采用的胶体金置换为磁性金纳米颗粒，采用外加磁场降低其在硝基纤维膜上的移动速率的方式克服了免疫层析技术灵敏度低的缺陷。该策略把磁性纳米颗粒的高选择性、可富集性及流速可控性与免疫层析技术高通量、快速、简捷的优势相结合，大幅提高了检测灵敏度。

本发明涉及的方法的基本原理如下：不同于经典胶体金免疫层析法，本发明提出的基于“磁聚焦”策略的免疫层析法使用Fe₃O₄@Au纳米颗粒代替了胶体金纳米颗粒，并在试纸条检测区域下方放置一块小磁铁。

方法1中：将修饰空肠弯曲杆菌抗体的Fe₃O₄@Au纳米颗粒喷在结合垫上。将空肠弯曲杆菌抗体和羊抗鼠IgG固定在硝基纤维膜的特定区域分别形成检测线和质控线。当将样品溶液滴加到样品垫上时，样品在毛细作用下在试纸条上流动，当移动到结合垫时，基于抗原抗体间的免疫反应，修饰抗体的Fe₃O₄@Au将与样品中含有的空肠弯曲杆菌结合，形成Fe₃O₄@Au-抗体-目标菌复合物。样品继续在硝基纤维膜上继续流动，当复合物流动至检测线区域时，由于磁场的作用，有磁性的Fe₃O₄@Au纳米颗粒会使得流速明显减缓，这样固定在硝基纤维膜上的抗体即可有更长的时间与Fe₃O₄@Au-抗体-目标菌复合物结合形成“三明治”夹心结构。而没有结合空肠弯曲杆菌的复合物则继续向前移动，在质控线处与二抗结合。

方法2：本发明中，我们还可以在免疫层析进行前，首先采用免疫磁性纳米颗粒富集样品溶液中的目标菌，从而达到增强最终检测灵敏度的目的。在免疫层析过程进行前，首先采用修饰空肠弯曲杆菌抗体的Fe₃O₄@Au纳米颗粒与样品溶液混合，富集样品中的空肠弯曲杆菌。随后在外加磁场条件下，将结合空肠弯曲杆菌的Fe₃O₄@Au纳米颗粒与上清液分离，并重新溶解在PBS溶液中并将溶液用于免疫层析检测。将空肠弯曲杆菌抗体和羊抗鼠IgG固定在硝基纤维膜的特定区域分别形成检测线和质控线。将溶解Fe₃O₄@Au-抗体-空肠弯曲杆菌复合物的PBS溶液滴加到样品垫上，样品在毛细作用下在试纸条上流动，当复合物流动至检测线区域时，由于磁场的作用，有磁性的Fe₃O₄@Au纳米颗粒会使得流速明显减缓，这样固定在硝基纤维膜上的抗体即可有更长的时间与Fe₃O₄@Au-抗体-目标菌复合物结合形成“三明治”夹心结构。而没有结合空肠弯曲杆菌的复合物则继续向前移动，在质控线处与二抗结合。

由于反应时间的延长，相应地，与未施加磁场的免疫层析方法相比，就会有更多的目标物被固定在检测区域的抗体所捕获。因此，最终的检测结果明显更好，即检测限更低、灵敏度更高。如果样品中的空肠弯曲杆菌浓度较高，那么在检测线出聚集的“三明治”夹心结构复合物就越多，会显示出Fe₃O₄@Au纳米颗粒的颜色。相反，如果样品中的空肠弯曲杆菌浓度较低，那么在检测线出聚集的“三明治”夹心结构复合物就越少，则不会显示出Fe₃O₄@Au纳米颗粒的颜色。层析过程结束后，将试纸条装进磁信号检测仪专用卡槽，检测试纸条检测区域的磁性号强度，对数据进行整理绘制标准曲线，实现对样品中空肠弯曲杆菌含量的定量测定。

本发明通过引入“磁聚焦”策略，大幅提升了免疫层析方法的灵敏度，方法1的检测限低至10cfu/mL，灵敏度可达到传统胶体金方法的10000倍。方法2的检测限低至1cfu/mL，灵敏度可达到传统胶体金方法的100000倍。且因该方法是基于金磁纳米颗粒的磁性，其检测结果几乎不受样品颜色的影响。因为磁性纳米颗粒磁性很难发生改变，其检测结果也可长时间保存。本发明为食品体系中有害组分的快速现场检测指明了新方向。

优选地，在本方法中所述的磁铁的磁场强度为20mT-200mT。金磁纳米颗粒（Fe₃O₄@Au）直径为100-500nm。

方法3：我们从“使检测区域的信号更容易读取”的角度出发，通过引入负载辅助信号放大因子（即L-半胱氨酸）的脂质体，将传统免疫层析方法中目标物与检测信号1:1的比例关系改变为1:n，进一步提高了免疫层析技术的灵敏度。

本发明涉及的方法的基本原理如下：不同于经典胶体金免疫层析法，本发明提出的基于“磁聚焦”策略的双模式免疫层析法使用Fe₃O₄@AuNPs纳米颗粒与负载辅助信号放大因子（L-半胱氨酸）的脂质体的复合物（脂质体-Fe₃O₄@AuNPs）代替了胶体金纳米颗粒，并在试纸条检测区域下方放置一块小磁铁。将空肠弯曲杆菌抗体和羊抗鼠IgG固定在硝基纤维膜的特定区域分别形成检测线和质控线。将样品溶液与修饰空肠弯曲杆菌抗体的Fe₃O₄@AuNPs和脂质体混合，滴加到样品垫上时，样品在毛细作用下在试纸条上流动，当移动到结合垫时，基于抗原抗体间的免疫反应，修饰抗体脂质体-Fe₃O₄@AuNPs将与样品中含有的空肠弯曲杆菌结合，形成脂质体-Fe₃O₄@AuNPs-抗体-目标菌复合物。样品继续在硝基纤维膜上继续流动，当复合物流动至检测线区域时，由于磁场的作用，有磁性的脂质体-Fe₃O₄@AuNPs会使得流速明显减缓，这样固定在硝基纤维膜上的抗体即可有更长的时间与脂质体-Fe₃O₄@AuNPs-抗体-目标菌复合物结合形成“三明治”夹心结构。而没有结合空肠弯曲杆菌的复合物则继续向前移动，在质控线处与二抗结合。由于反应时间的延长，相应地，与未施加磁场的免疫层析方法相比，就会有更多的目标物被固定在检测区域的抗体所捕获。因此，最终的检测结果明显更好，即检测限更低、灵敏度更高。如果样品中的空肠弯曲杆菌浓度较高，那么在检测线出聚集的“三明治”夹心结构复合物就越多，会显示出脂质体-Fe₃O₄@AuNPs复合物的颜色。相反，如果样品中的空肠弯曲杆菌浓度较低，那么在检测线出聚集的“三明治”夹心结构复合物就越少，则不会显示出脂质体-Fe₃O₄@AuNPs复合物的颜色。层析过程结束后，首先加入Triton X-100破坏脂质体结构，使其空腔中负载的L-半胱氨酸释放出来。然后加入金纳米颗粒，在L-半胱氨酸存在的条件下，金纳米颗粒结合在一起，产生聚集，导致试纸条检测线出产生的红色颜色信号增强。最终，试纸条得以检测出样品中低浓度的空肠弯曲杆菌。

本发明通过引入“磁聚焦”策略和脂质体大幅增加了免疫层析方法的灵敏度，检测限低至10cfu/mL，灵敏度可达到传统胶体金方法的10000倍。本发明为食品体系中致病菌和有毒有害化学组分的快速现场检测指明了新方向。

优选地，在本方法中所述的磁铁的磁场强度为100mT-500mT。脂质体直径为150-500nm。

有益效果

基于样品富集预处理和“磁聚焦”策略，大幅提升了免疫层析试纸条的灵敏度，解决了其灵敏度低的瓶颈问题。该发明中所使用的金磁纳米颗粒（Fe₃O₄@Au）既用于在样品预处理步骤中富集空肠弯曲杆菌，又在随后的免疫层析检测中用于构建信号探针，减少了操作步骤，降低了成本。

本发明的试纸条基于在检测区域聚集的Fe₃O₄@Au所产生的磁信号，可定量测定样品中的空肠弯曲杆菌含量。也通过引入“磁聚焦”策略和包埋L-半胱氨酸的脂质体，大幅提升了免疫层析试纸条的灵敏度，解决了其灵敏度低的瓶颈问题。本发明的试纸条检测限低（1cfu/mL、10 cfu/mL、10 cfu/mL）、特异性好、成本低廉、检测时间短。此外，该类型试纸条不需要任何额外设备即可实现对目标物的快速灵敏检测，能够满足现场快速检测的需求，适用于液体样品中致病菌及各种有毒有害物质的检测，极具实用价值。

附图说明

图1 用于新型免疫层析检测的模具；

图2空肠弯曲杆菌浓度范围为20-10⁵ cfu/mL时基于采集的磁性数据建立的标准曲线；

图3空肠弯曲杆菌浓度范围为10-10⁵ cfu/mL时基于采集的磁性数据建立的标准曲线；

图4空肠弯曲杆菌浓度范围为25-10⁵ cfu/mL时基于采集的颜色数据建立的标曲。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

一种检测空肠弯曲杆菌的方法，包括以下步骤：

（1）金磁纳米颗粒的制备及修饰：

Fe₃O₄纳米颗粒的制备：准确称取11.2 mM 氯化铁溶液和5.6 mM 氯化亚铁溶液，将它们加入到180mL去离子水中，充分搅拌直至完全溶解。然后在氮气保护下加热到50℃，将该混合溶液与12.5mL 0.1M NH₃·H₂O溶液混合并剧烈搅拌30 min。在外加磁场作用下，采用无水乙醇和去离子水交替冲洗至中性，并重新溶解在水溶液中，存于4℃备用；

Fe₃O₄@Au纳米颗粒的制备：首先，在超声条件下，将20 mL ①中制备的Fe₃O₄磁性纳米颗粒溶液与15 mL 1%的氯金酸溶液充分混合20 min。然后，将15 mL 20 mM的柠檬酸三钠溶液逐滴加入到上述混合溶液中，超声，直至溶液颜色变为深红色。最终将制备得到的磁性纳米金颗粒通过外加磁场从溶液中分离出来，然后分别用无水乙醇和超纯水各清洗三遍，并重新溶解在水溶液中，存于4℃备用；

Fe₃O₄@Au的修饰：首先，将10μg抗体及1μL 0.5M的碳酸纳溶液加入到1mL②中制备的 Fe₃O₄@Au纳米粒子溶液中，轻摇混匀后，室温（25℃）下振荡反应2 h。然后将122 μL 5%（w/v）的酪蛋白溶液（溶解在10mM中PBS溶液中）添加到上述溶液中用于封闭Fe₃O₄@Au纳米粒子表面的残余结合位点，摇床振荡过夜。最后，将修饰抗体的Fe₃O₄@Au纳米颗粒溶液5000g离心10分钟，弃去上清液，并将得到的纳米粒子洗涤后重新分散在100μL 5%（w/v）的酪蛋白溶液中。

（2）结合垫的处理：将3μL Fe₃O₄@Au纳米颗粒溶液分别喷于结合垫上，得到处理后的标记物结合垫；

（3）硝基纤维膜的处理：将0.3μg空肠弯曲杆菌多克隆抗体溶液喷涂在硝基纤维膜上形成检测线，将0.3μg羊抗鼠IgG抗体溶液喷涂在硝基纤维膜上形成检测质控线，烘干，即得到处理后的硝基纤维膜；

（4）试纸条的组装：在衬板上依次搭接并粘贴处理后的样品垫、结合垫和硝酸纤维素膜，再在酸纤维素膜的一侧搭接吸水纸，组装后裁剪为60mm长，3.8mm宽的试纸条，即得到所述定量检测空肠弯曲杆菌的免疫层析试纸条，将制得的试纸条与干燥剂一起装入避光袋密封保存待用；

（5）外加磁场的施加：将其应用于样品中空肠弯曲杆菌的检测过程中，试纸条检测区域下方放置一块磁场强度为50mT的小磁铁（图1）；

（6）标准曲线的建立：向不含空肠弯曲杆菌的饮用水溶液中添加菌液，使其浓度分别为20 cfu/mL，10² cfu/mL，10³ cfu/mL，10⁴ cfu/mL和10⁵ cfu/mL。吸取100 μL含有致病菌的样品溶液缓慢滴加到样品垫上，使其在室温下流动10 min。样品溶液在试纸条上层析结束后，将试纸条装进磁信号检测仪专用卡槽，检测试纸条检测区域的磁性号强度，对数据进行整理，绘制标准曲线（图2）。

（7）样品的检测：吸取100 μL含有致病菌的样品溶液缓慢滴加到样品垫上，使其在室温下流动10 min。样品溶液在试纸条上层析结束后，将试纸条装进磁信号检测仪专用卡槽，检测试纸条检测区域的磁性号强度，最终得到的T/C值为0.66，基于已建立的标曲，推导出样品中空肠弯曲杆菌含量为562 cfu/mL。

实施例2

一种检测空肠弯曲杆菌方法，包括以下步骤：

（1）金磁纳米颗粒的制备及修饰：

Fe₃O₄纳米颗粒的制备：准确称取11.2 mM 氯化铁溶液和5.6 mM 氯化亚铁溶液，将它们加入到180mL去离子水中，充分搅拌直至完全溶解。然后在氮气保护下加热到50℃，将该混合溶液与12.5 mL 0.1M NH₃·H₂O溶液混合并剧烈搅拌30 min。在外加磁场作用下，采用无水乙醇和去离子水交替冲洗至中性，并重新溶解在水溶液中，存于4℃备用；

Fe₃O₄@Au纳米颗粒的制备：首先，在超声条件下，将20 mL ①中制备的Fe₃O₄磁性纳米颗粒溶液与15 mL 1%的氯金酸溶液充分混合20 min。然后，将15 mL 20 mM的柠檬酸三钠溶液逐滴加入到上述混合溶液中，超声，直至溶液颜色变为深红色。最终将制备得到的磁性纳米金颗粒通过外加磁场从溶液中分离出来，然后分别用无水乙醇和超纯水各清洗三遍，并重新溶解在水溶液中，存于4℃备用；

Fe₃O₄@Au的修饰：首先，将10μg抗体及1μL 0.5M的碳酸纳溶液加入到1mL②中制备的 Fe₃O₄@Au纳米粒子溶液中，轻摇混匀后，室温（25℃）下振荡反应2 h。然后将122 μL 5%（w/v）的酪蛋白溶液（溶解在10mM中PBS溶液中）添加到上述溶液中用于封闭Fe₃O₄@Au纳米粒子表面的残余结合位点，摇床振荡过夜。最后，将修饰抗体的Fe₃O₄@Au纳米颗粒溶液5000g离心10分钟，弃去上清液，并将得到的纳米粒子洗涤后重新分散在100μL 5%（w/v）的酪蛋白溶液中。

（2）样品富集预处理：将10μL修饰空肠弯曲杆菌抗体的Fe₃O₄@Au纳米颗粒溶液加入到样品溶液中，充分反应30分钟，富集样品中存在的空肠弯曲杆菌，然后在外加磁场条件下，分离出结合空肠弯曲杆菌的免疫磁性纳米颗粒，重新溶解在100μL含有0.5%（w/v）酪蛋白的 PBS溶液中；

（2）硝基纤维膜的处理：将0.3μg空肠弯曲杆菌多克隆抗体溶液喷涂在硝基纤维膜上形成检测线，将0.3μg羊抗鼠IgG抗体溶液喷涂在硝基纤维膜上形成检测质控线，烘干，即得到处理后的硝基纤维膜；

（3）试纸条的组装：在衬板上依次搭接并粘贴处理后的样品垫、结合垫和硝酸纤维素膜，再在酸纤维素膜的一侧搭接吸水纸，组装后裁剪为60mm长，3.8mm宽的试纸条，即得到所述定量检测空肠弯曲杆菌的免疫层析试纸条，将制得的试纸条与干燥剂一起装入避光袋密封保存待用；

（4）外加磁场的施加：将其应用于样品中空肠弯曲杆菌的检测过程中，试纸条检测区域下方放置一块磁场强度为50mT的小磁铁；

（5）标准曲线的建立：向不含空肠弯曲杆菌的饮用水溶液中添加菌液，使其浓度分别为10 cfu/mL，10² cfu/mL，10³ cfu/mL，10⁴ cfu/mL和10⁵ cfu/mL。将10μL修饰空肠弯曲杆菌抗体的Fe₃O₄@Au纳米颗粒溶液加入到饮用水溶液中，充分反应30分钟，富集样品中存在的空肠弯曲杆菌，然后在外加磁场条件下，分离出结合空肠弯曲杆菌的免疫磁性纳米颗粒，重新溶解在100μL含有0.5%（w/v）酪蛋白的 PBS溶液中。吸取100 μL含有致病菌的PBS溶液缓慢滴加到样品垫上，使其在室温下流动10 min。溶液在试纸条上层析结束后，将试纸条装进磁信号检测仪专用卡槽，检测试纸条检测区域的磁性号强度，对数据进行整理，绘制标准曲线（图3）。

（6）样品的检测：将10μL修饰空肠弯曲杆菌抗体的Fe₃O₄@Au纳米颗粒溶液加入到样品溶液中，充分反应30分钟，富集样品中存在的空肠弯曲杆菌，然后在外加磁场条件下，分离出结合空肠弯曲杆菌的免疫磁性纳米颗粒，重新溶解在100μL含有0.5%（w/v）酪蛋白的PBS溶液中。吸取100 μL经过富集预处理的PBS溶液缓慢滴加到样品垫上，使其在室温下流动10 min。溶液在试纸条上层析结束后，将试纸条装进磁信号检测仪专用卡槽，检测试纸条检测区域的磁性号强度，对数据进行整理绘制标准曲线，实现对样品中空肠弯曲杆菌含量的定量测定。

对比例1

其他条件不变，去除实施例2中的第（4）外加磁场的施加：将其应用于样品中空肠弯曲杆菌的检测过程中，试纸条检测区域下方放置一块磁场强度为50mT的小磁铁。

检测的结果（表1）：

如表1所示，施加磁场的新型免疫层析试纸条检测灵敏度明显优于未施加磁场试纸条。此外，施加磁场的新型免疫层析试纸条的检测结果与传统的平板计数法检测所得结果无显著差异，展示出该新型检测方法的实用性。

实施例3

（1）金磁纳米颗粒的制备及修饰：

Fe₃O₄纳米颗粒的制备：准确称取11.2 mM 氯化铁溶液和5.6 mM 氯化亚铁溶液，将它们加入到180mL去离子水中，充分搅拌直至完全溶解。然后在氮气保护下加热到50℃，将该混合溶液与12.5 mL 0.1M NH₃·H₂O溶液混合并剧烈搅拌30 min。在外加磁场作用下，采用无水乙醇和去离子水交替冲洗至中性，并重新溶解在水溶液中，存于4℃备用；

Fe₃O₄@AuNPs纳米颗粒的制备：超声条件下，将20 mL合成的Fe₃O₄溶液与15 mL1%的氯金酸溶液混合20 min。接着，将15 mL 20 mM的柠檬酸三钠溶液逐滴加入到上述混合溶液中，超声，直至溶液颜色变为深红色。最后，将制得的磁性纳米金颗粒通过外加磁场从溶液中分离出来，分别用无水乙醇和超纯水各清洗三遍，并重新溶解在水溶液中，保存于4℃下备用；

Fe₃O₄@AuNPs的修饰：首先，将10μg抗体及1μL 0.5M的碳酸纳溶液加入到1mL②中制备的Fe₃O₄@AuNPs纳米粒子溶液中，轻摇混匀后，室温（25℃）下振荡反应2 h。然后将122μL 5%（w/v）的酪蛋白溶液（溶解在10mM中PBS溶液中）添加到上述溶液中用于封闭Fe₃O₄@AuNPs纳米粒子表面的残余结合位点，摇床振荡过夜。最后，将修饰抗体的Fe₃O₄@AuNPs纳米颗粒溶液5000g离心10分钟，弃去上清液，并将得到的纳米粒子洗涤后重新分散在100μL 5%（w/v）的酪蛋白溶液中。

（2）金纳米颗粒的合成：首先，将1mL 1%的氯金酸溶液加入到100mL煮沸的去离子水中，剧烈搅拌。接着，将1mL 1%的柠檬酸钠溶液加入到上述混合液中，保持沸腾15分钟。

（3）脂质体的制备：将300μL 10mg/mL 的L-α-磷脂酰胆碱溶液与80μL 3mg/mL 的结合生物素的磷酸乙醇胺溶液和50μL 4mg/mL 的胆固醇溶液充分搅拌混合，减压蒸馏以除去氯仿。然后，加入100μL 100μg/mL的 HRP溶液涡旋混合2分钟。最后，经14 kDa透析袋透析得到所需的脂质体。

（4）硝基纤维膜的处理：将0.25μg空肠弯曲杆菌多克隆抗体溶液喷涂在硝基纤维膜上形成检测线，将0.3μg羊抗鼠IgG抗体溶液喷涂在硝基纤维膜上形成检测质控线，烘干，即得到处理后的硝基纤维膜；

（5）试纸条的组装：在衬板上依次搭接并粘贴处理后的样品垫、结合垫和硝酸纤维素膜，再在酸纤维素膜的一侧搭接吸水纸，组装后裁剪为60mm长，3.8mm宽的试纸条，即得到所述定量检测空肠弯曲杆菌的免疫层析试纸条，将制得的试纸条与干燥剂一起装入避光袋密封保存待用；

（6）外加磁场的施加：将其应用于样品中空肠弯曲杆菌的检测过程中，试纸条检测区域下方放置一块磁场强度为150mT的小磁铁（图1）；

（7）标准曲线的建立：向不含空肠弯曲杆菌的饮用水溶液中添加菌液，使其浓度分别为25 cfu/mL，10² cfu/mL，10³ cfu/mL，10⁴ cfu/mL和10⁵ cfu/mL。将100μL含有空肠弯曲杆菌的饮用水溶液与5μL Fe₃O₄@AuNPs溶液、1μL 1mg/mL的亲和素溶液和5μL制备的脂质体充分混合，室温下反应10分钟。然后缓慢滴加到样品垫上，使其在室温下流动10 min。溶液在试纸条上层析结束后，加入5μL Triton X-100溶液。最后，在检测区域加入60μL 金纳米颗粒溶液。反应5分钟后，滴加30μL去离子水冲洗检测区域以洗去未反应的信号探针分子，使用相机拍照，保存图像。采用Image-Pro Plus 6.0软件中的“split channels”指令将读取的图像分为红、绿、蓝三色灰度图，选择效果最好的灰度图像（红）对空肠弯曲杆菌的含量进行定量，建立标准曲线（图4）。

（8）样品的检测：首先将100μL含有空肠弯曲杆菌的饮用水样品溶液与5μL Fe₃O₄@AuNPs溶液、1μL 1mg/mL的亲和素溶液和5μL制备的脂质体充分混合，室温下反应10分钟。然后缓慢滴加到样品垫上，使其在室温下流动10 min。样品溶液在试纸条上层析结束后，加入5μL Triton X-100溶液。最后，在检测区域加入60μL 金纳米颗粒溶液。反应5分钟后，滴加30μL去离子水冲洗检测区域以洗去未反应的信号探针分子，使用相机拍照，保存图像。采用Image-Pro Plus 6.0软件中的“split channels”指令将读取的图像分为红、绿、蓝三色灰度图，选择效果最好的灰度图像（红），基于已建立的标曲，对样品中的空肠弯曲杆菌的含量进行定量。

对比例2

其他条件不变，去除实施例3中的第（6）步骤中外加磁场的施加：将其应用于样品中空肠弯曲杆菌的检测过程中，试纸条检测区域下方放置一块磁场强度为150mT的小磁铁。

检测的结果（表2）：

如表1所示，施加磁场的新型免疫层析试纸条检测灵敏度明显优于未施加磁场试纸条。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一种检测空肠弯曲杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）制备检测线包被空肠弯曲杆菌抗体、质控线包被羊抗鼠IgG抗体的试纸条；

（2）在试纸条检测区域下方放置磁铁；

（3）金磁纳米颗粒的制备及修饰：制备Fe₃O₄@AuNPs纳米颗粒并在其表面修饰空肠弯曲杆菌抗体；

（4）脂质体的制备：采用反相蒸发法制备包埋L-半胱氨酸的生物素化的脂质体；

（5）将样品溶液与Fe₃O₄@AuNPs溶液、亲和素溶液和脂质体充分混合，室温下反应，然后滴加到试纸条层析，样品在毛细作用下在试纸条上流动，当移动到结合垫时，基于抗原抗体间的免疫反应，修饰抗体脂质体-Fe₃O₄@AuNPs将与样品中含有的空肠弯曲杆菌结合，形成脂质体-Fe₃O₄@AuNPs-抗体-目标菌复合物，加入Triton X-100破坏脂质体结构，使其空腔中负载的L-半胱氨酸释放出来，然后加入金纳米颗粒，在L-半胱氨酸存在的条件下，金纳米颗粒结合在一起，产生聚集，导致试纸条检测线出产生的红色颜色信号增强，最终，试纸条得以检测出样品中低浓度的空肠弯曲杆菌。

2.根据权利要求1所述的一种检测空肠弯曲杆菌的方法，其特征在于，所述的磁铁的磁场强度在20mT-500mT。

3.根据权利要求1所述的一种检测空肠弯曲杆菌的方法，其特征在于，所述的试纸条包括衬板、样品垫、纳米颗粒标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述样品垫、磁性纳米颗粒标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸由后到前依次粘贴吸附在所述衬板上，所述硝酸纤维素膜上划有一根检测线和一根质控线；所述检测线包被空肠弯曲杆菌抗体；所述质控线包被羊抗鼠IgG抗体。

4.根据权利要求3所述的一种检测空肠弯曲杆菌的方法，其特征在于，试纸条的制备方法包括以下步骤：

（1）金磁纳米颗粒的制备：合成磁性纳米颗粒Fe₃O₄，在其表面包被一层金，得到Fe₃O₄@AuNPs纳米颗粒；Fe₃O₄@AuNPs表面修饰空肠弯曲杆菌抗体；

（2）样品富集预处理：将修饰空肠弯曲杆菌抗体的Fe₃O₄@AuNPs纳米颗粒溶液加入到样品溶液中充分反应，富集样品中存在的空肠弯曲杆菌，然后在外加磁场条件下，分离出结合空肠弯曲杆菌的免疫磁性纳米颗粒，重新溶解在PBS溶液中；

（3）硝基纤维膜的处理：将空肠弯曲杆菌抗体溶液喷涂在硝基纤维膜上形成检测线，将羊抗鼠IgG抗体溶液喷涂在硝基纤维膜上形成检测质控线，烘干，即得到处理后的硝基纤维膜；

（4）试纸条的组装：在衬板上依次搭接并粘贴处理后的样品垫、结合垫和硝酸纤维素膜，再在酸纤维素膜的一侧搭接吸水纸,组装后裁剪为60mm长，3.8mm宽的试纸条，即得到所述检测空肠弯曲杆菌的免疫层析试纸条，将制得的试纸条与干燥剂一起装入避光袋密封保存待用。

5.根据权利要求3所述的一种检测空肠弯曲杆菌的方法，其特征在于，试纸条的制备方法包括以下步骤：

（1）金磁纳米颗粒的制备：合成磁性纳米颗粒Fe₃O₄，在其表面包被金壳，得到Fe₃O₄@AuNPs纳米颗粒，在Fe₃O₄@AuNPs表面修饰空肠弯曲杆菌抗体；

（2）脂质体的制备：采用反相蒸发法制备包埋L-半胱氨酸的生物素化的脂质体；脂质体直径为150-500nm；

（3）硝基纤维膜的处理：将空肠弯曲杆菌抗体溶液喷涂在硝基纤维膜上形成检测线，将羊抗鼠IgG抗体溶液喷涂在硝基纤维膜上形成检测质控线，烘干，即得到处理后的硝基纤维膜；

（4）试纸条的组装：在衬板上依次搭接并粘贴处理后的样品垫、结合垫和硝酸纤维素膜，再在酸纤维素膜的一侧搭接吸水纸,组装后裁剪为60mm长，3.8mm宽的试纸条，即得到所述检测空肠弯曲杆菌的免疫层析试纸条，将制得的试纸条与干燥剂一起装入避光袋密封保存待用。

6.根据权利要求1所述的一种检测空肠弯曲杆菌的方法，其特征在于，试纸条还包括模纳米颗粒标记物结合垫上修饰有空肠弯曲杆菌抗体的金磁纳米颗粒Fe₃O₄@AuNPs。

7.根据权利要求1所述的一种检测空肠弯曲杆菌的方法，其特征在于，金磁纳米颗粒Fe₃O₄@AuNPs直径在20-500nm。

8.根据权利要求7所述的一种检测空肠弯曲杆菌的方法，其特征在于，所述的试纸条包括衬板、样品垫、纳米颗粒标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述样品垫、磁性纳米颗粒标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸由后到前依次粘贴吸附在所述衬板上所述硝酸纤维素膜上划有一根检测线和一根质控线；所述检测线包被空肠弯曲杆菌抗体；所述质控线包被羊抗鼠IgG抗体；所述磁性纳米颗粒标记物结合垫有修饰空肠弯曲杆菌抗体的金磁纳米颗粒Fe₃O₄@AuNPs。

9.根据权利要求7或8所述的一种检测空肠弯曲杆菌的方法，其特征在于，试纸条的制备方法包括以下步骤：

（1）金磁纳米颗粒的制备：合成磁性纳米颗粒Fe₃O₄，在其表面包被一层金，得到Fe₃O₄@AuNPs纳米颗粒，在Fe₃O₄@AuNPs表面修饰空肠弯曲杆菌抗体；

（2）结合垫的处理：将修饰空肠弯曲杆菌抗体的Fe₃O₄@AuNPs纳米颗粒溶液喷于结合垫上，得到处理后的标记物结合垫；

（3）硝基纤维膜的处理：将空肠弯曲杆菌抗体溶液喷涂在硝基纤维膜上形成检测线，将羊抗鼠IgG抗体溶液喷涂在硝基纤维膜上形成检测质控线，烘干，即得到处理后的硝基纤维膜；

（4）试纸条的组装：在衬板上依次搭接并粘贴处理后的样品垫、结合垫和硝酸纤维素膜，再在酸纤维素膜的一侧搭接吸水纸，组装后裁剪为60mm长，3.8mm宽的试纸条，即得到所述检测空肠弯曲杆菌的免疫层析试纸条，将制得的试纸条与干燥剂一起装入避光袋密封保存待用。

10.根据权利要求1-8之一所述的一种检测空肠弯曲杆菌的方法，其特征在于，空肠弯曲杆菌为单克隆抗体或多克隆抗体。

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