JP2003240784A - クロマトグラフ測定法用試験片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】迅速かつ簡便に、しかも導入する被検試料液量
が変動しても該試料液中の被検物質濃度を定量的に測定
できるクロマトグラフ測定法用試験片を提供すること。
また、本発明は、被検試料液中の夾雑物の影響を受ける
ことなく被検試料液中の被検物質濃度を定量的に測定で
きるクロマトグラフ測定法用試験片を提供すること。 【解決手段】（ｉ）吸水パッド部、（ｉｉ）被検試料液
受領部、（ｉｉｉ）被検物質に特異的に結合しうる第１
の特異的結合物質を固定化してなる固定相、ならびに
（ｉｖ）被検物質に特異的に結合しうる第２の特異的結
合物質と標識物質とを有してなる標識複合体を導入する
ための標識複合体受領部、を、この順に吸水性基材上に
有してなるクロマトグラフ測定法用試験片であって、前
記（ｉ）と前記（ｉｉ）との間の距離ａ、前記（ｉｉ）
と前記（ｉｉｉ）との間の距離ｂ、ならびに前記（ｉｉ
ｉ）と前記（ｉｖ）との間の距離ｃがｂ＜ａ＜ｂ＋ｃ
（但し、ａ、ｂおよびｃ＞０）を満たすものである、ク
ロマトグラフ測定法用試験片。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、クロマトグラフ測
定法用試験片および該試験片を用いた被検物質の検出方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】感染性病原体等の検査、または感染症を
始めとする種々の疾患の診断分野において、被検物質を
高感度かつ再現性よく測定するために、酵素免疫法（Ｅ
ＩＡ法）、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）等の免
疫測定法が汎用されている。しかしながら、かかる方法
は、特別な施設が必要である。さらに、前記測定法は、
操作時間または検出時間が長く、洗浄工程も有するた
め、結果がでるまでに時間がかかるという欠点を有す
る。

【０００３】迅速かつ簡便に免疫化学的検査を行なえる
方法として、免疫クロマトグラフ法が注目されている。
当該方法は、例えば、以下の工程を経る。被検試料液中
に存在する被検物質に特異的に結合しうる特異的結合物
質１を固定化した試験片上の固定相において、該被検物
質に特異的に結合しうる特異的結合物質２と標識物質と
を含む標識複合体と該被検物質とからなる複合体を特異
的結合物質１により捕捉する。次いで固定相に捕捉され
た該複合体中の標識物質を検出することにより、被検試
料液中の被検物質の存在を確認する。

【０００４】また、近年、免疫クロマトグラフ法を用い
て被検物質を定量的に測定するシステムが開発されてい
る。かかるシステムを用いると、例えば、糖尿病患者が
自分自身で容易に血中グルコース濃度を測定することが
できる。このシステムでは、指先を尖刺して血液を採取
し、得られた血液を被検試料液として試験片に導入し、
固定相に捕捉されたグルコースと標識複合体とからなる
複合体の標識物質の量を該グルコース量として付属の測
定装置で測定することにより血中グルコース濃度を求め
る。

【０００５】しかしながら、前記のように尖刺といった
方法では常に一定の量で血液を採取するのは難しく、た
とえば、同一血液を用いて複数回の試験を実施するよう
な場合、該システムに導入される血液の量は各回で増減
する可能性がある。導入される血液の正確な量は不明で
あるため、実際に測定されたグルコース量を基に、予め
既知濃度のグルコース試料を用いて作成した検量線を用
いて被検試料である血液中のグルコース濃度を算出する
が、導入される血液量が少ないと形成される複合体の量
が少なくなって血中のグルコース濃度が低値となり、一
方、該血液量が多いと高値となる。従って、複数回の結
果にバラツキを生じ、その場合、血中グルコース濃度を
正確には測定することができない。すなわち、従来のシ
ステムでは被検試料液の導入量によって該試料液中の被
検物質の濃度が変動するため、被検物質濃度を正確に定
量することは困難であった。

【０００６】また、従来のシステムでは被検試料液中に
存在する夾雑物が測定に影響し、定量性を妨げる一因と
なっていた。たとえば、採取した血液を試料受領部に導
入し、次いで同部に標識複合体を導入するといった構成
を有する試験片が多いが、かかる試験片を用いた場合、
試料受領部が血球で目詰まりし、標識複合体の展開が妨
げられて固定相に到達し難くなるため定量性を欠く。ま
た、血液と標識複合体とを混合して導入する場合も同様
に目詰まりを生ずるため定量性を欠く。

【０００７】一方、被検物質が核酸である場合には、被
検試料中の当該物質の存在の検出および定量をクロマト
グラフ方式にて簡便かつ迅速に行なう方法は、これまで
なかった。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、迅速かつ簡
便に、しかも導入する被検試料液量が変動しても該試料
液中の被検物質濃度を定量的に測定できるクロマトグラ
フ測定法用試験片を提供することを目的とする。また、
本発明は、被検試料液中の夾雑物の影響を受けることな
く被検試料液中の被検物質濃度を定量的に測定できるク
ロマトグラフ測定法用試験片を提供することを目的とす
る。

【０００９】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、〔１〕
（ｉ）吸水パッド部、（ｉｉ）被検試料液受領部、
（ｉｉｉ）被検物質に特異的に結合しうる第１の特異的
結合物質を固定化してなる固定相、ならびに（ｉｖ）被
検物質に特異的に結合しうる第２の特異的結合物質と標
識物質とを有してなる標識複合体を導入するための標識
複合体受領部、を、この順に吸水性基材上に有してなる
クロマトグラフ測定法用試験片であって、前記（ｉ）と
前記（ｉｉ）との間の距離ａ、前記（ｉｉ）と前記（ｉ
ｉｉ）との間の距離ｂ、ならびに前記（ｉｉｉ）と前記
（ｉｖ）との間の距離ｃがｂ＜ａ＜ｂ＋ｃ（但し、ａ、
ｂおよびｃ＞０）を満たすものである、クロマトグラフ
測定法用試験片、ならびに〔２〕 前記〔１〕に記載の
クロマトグラフ測定法用試験片を用いる被検物質の検出
方法であって、（ａ）被検試料液受領部に被検試料液を
導入する工程、（ｂ）標識複合体受領部に標識複合体を
導入する工程、（ｃ）吸水性基材上で被検試料液および
標識複合体を展開する工程、ならびに（ｄ）固定相に捕
捉された該被検物質と該標識複合体とからなる複合体に
含まれる標識物質を検出する工程、を含み、標識物質が
検出された場合、被検試料液中に被検物質が存在すると
判定する、被検物質の検出方法、に関する。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明のクロマトグラフ測定法用
試験片（以下、試験片という）は、（ｉ）吸水パッド
部、（ｉｉ）被検試料液受領部、（ｉｉｉ）被検物質に
特異的に結合しうる第１の特異的結合物質を固定化して
なる固定相、ならびに（ｉｖ）被検物質に特異的に結合
しうる第２の特異的結合物質と標識物質とを有してなる
標識複合体を導入するための標識複合体受領部、を、こ
の順に吸水性基材上に有してなる試験片であって、前記
（ｉ）と前記（ｉｉ）との間の距離ａ、前記（ｉｉ）と
前記（ｉｉｉ）との間の距離ｂ、ならびに前記（ｉｉ
ｉ）と前記（ｉｖ）との間の距離ｃがｂ＜ａ＜ｂ＋ｃ
（但し、ａ、ｂおよびｃ＞０）を満たすものであること
を１つの大きな特徴とする。

【００１１】吸水性基材からなる、従来のクロマトグラ
フ測定法用試験片を用いた被検物質濃度の測定は、一般
に以下のようにして行われる。たとえば、その被検試料
液受領部に被検試料液を導入すると、該被検試料液は固
定相に向かって概ね一方向にのみ毛細管現象により自然
に展開されて固定相に達する。被検試料液中に被検物質
が存在すると、該被検物質は該固定相において捕捉され
る。次いで、捕捉された被検物質の量を、たとえば、当
該被検物質に特異的に結合しうる標識複合体を用いて測
定し、得られた値を基に被検物質濃度を求める。この場
合、被検物質濃度は固定相に捕捉された被検物質量に依
存して決まり、当該被検物質量は固定相を通過する被検
試料液量によるため、根本的には被検試料液の導入量に
より決まる。従って、定量的な測定を可能にするために
は、被検試料液を一定量で導入する必要があった。一
方、本発明の試験片は前記するような特徴的な構成を有
することから、従来のように被検試料液の導入量を一定
にする必要はない。すなわち、本発明の試験片によれ
ば、被検試料液の導入量が一定でなくとも被検物質濃度
を定量的に測定することができる。

【００１２】本発明の試験片では、被検試料液受領部に
被検試料液を導入すると、該被検試料液は毛細管現象に
より吸水性基材上を固定相の向きと吸水パッド部の向き
に分かれて等しい速度で展開する。本発明の試験片は、
（ｉ）吸水パッド部と（ｉｉ）被検試料液受領部との間
の距離ａ、および（ｉｉ）被検試料液受領部と（ｉｉ
ｉ）固定相との間の距離ｂが、ｂ＜ａを満たすものであ
るため、被検試料液は先に固定相に達し、次いで吸水パ
ッド部に達することになる。吸水パッド部は被検試料液
の吸収性に優れるため、被検試料液が吸水パッド部に接
触すると、該試料液は吸水パッド部の向きへのみ展開す
るようになり、以後、固定相に被検試料液が供給される
ことはない。一方、被検試料液の展開は毛細管現象によ
り行なわれるので、導入する被検試料液の量が増減して
もその展開速度は変化することがない。従って、本発明
の試験片では、導入する被検試料液の量が増減しても固
定相に供給される被検試料液の量は実質的に一定となる
ため、被検試料液中の被検物質の濃度を定量的に求める
ことが可能となる。

【００１３】また、本発明の試験片においては、吸水性
基材上、標識複合体受領部は固定相を挟んで被検試料液
受領部とは反対側に別個独立に存在しており、（ｉｉ）
被検試料液受領部と（ｉｉｉ）固定相との間の距離ｂ、
および（ｉｉｉ）固定相と（ｉｖ）標識複合体受領部と
の間の距離ｃが、ａ＜ｂ＋ｃを満たす。従って、標識複
合体が被検試料液受領部を通過することはなく、また、
標識複合体と被検試料液との接触も実質的に生じない。
それゆえ、本発明の試験片によれば、被検試料液中の夾
雑物の影響を受けることなく被検試料液中の被検物質濃
度を定量的に測定することができる。

【００１４】なお、本明細書において（ｉ）吸水パッド
部と（ｉｉ）被検試料液受領部との間の距離ａとは、吸
水性基材上、被検試料液の展開方向における（ｉ）吸水
パッド部と（ｉｉ）被検試料液受領部との間隔の内、最
短部分の長さをいう。図１に距離ａがどの部分の長さを
指すものか、２つの具体例を示す。また、距離ｂおよび
距離ｃについても距離ａの場合と同様である。

【００１５】距離ａ、ｂおよびｃの関係は、本発明の試
験片を用いて被検試料液中の被検物質濃度の測定を行う
際に要する時間の短縮化ならびに検出感度といった観点
から適宜調整されえ、距離ａが、好ましくは１０〜２５
ｍｍ、より好ましくは１０〜２０ｍｍ、距離ｂが、好ま
しくは５〜１５ｍｍ、より好ましくは５〜１０ｍｍ、お
よび距離ｂと距離ｃの合計ｂ＋ｃが、好ましくは１５〜
３５ｍｍ、より好ましくは１８〜２８ｍｍである関係を
満たすのが好適である。本発明の特に好適な態様では、
距離ａは１６ｍｍ、距離ｂは８ｍｍ、距離ｂと距離ｃの
合計ｂ＋ｃは２３ｍｍである。前記吸水パッド部、被検
試料液受領部、固定相および標識複合体受領部は、吸水
性基材上、かかる距離ａ、ｂおよびｃの関係を満たすよ
うに配置されるのが望ましい。

【００１６】本発明の試験片は、その測定原理において
免疫学的反応を利用する場合には免疫クロマトグラフ測
定法用として、一方、それ以外の場合には、クロマトグ
ラフ測定法用として利用される。

【００１７】本発明の試験片として用いられる吸水性基
材としては、水性の液体を吸収可能な性質を有する基材
であれば特に限定されるものではない。本発明において
は、展開時に被検物質と特異的結合物質との充分な反応
を行うための時間を確保できるような適度な吸水性を有
する吸水性基材が好ましい。かかる吸水性基材の具体例
としては、例えば、不織布、濾紙、ガラス繊維布、ガラ
スフィルター、ニトロセルロース、ナイロンメンブレ
ン、多孔質膜等が挙げられる。

【００１８】吸水性基材の吸水性の程度は、たとえば、
厚さ１ｍｍ×幅５ｍｍ×長さ１００ｍｍの吸水性基材の
片端部を水に１分間浸漬した場合に、水に浸漬された部
分とされない部分との境界位置からの吸水距離が０．５
〜５ｃｍであるのが好ましい。また、吸水性の程度は、
ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアル
コール、ヒドロキシエチルセルロース等の親水性重合体
を、たとえば、吸水性基材の表面に被覆する、もしくは
吸水性基材に含浸させることにより適宜調整することも
できる。

【００１９】吸水性基材の形状は、前記各液を展開でき
る形状であれば特に限定されるものではなく、たとえ
ば、矩形のシート状（片状）やロッド状等の形状が好ま
しい。また、その大きさとしては特に限定されるもので
はないが、本発明の試験片を用いる被検物質濃度の測定
時における操作性の観点から、好ましくは２〜２０ｍｍ
×５０〜１００ｍｍ、より好ましくは３〜１０ｍｍ×５
０〜８０ｍｍである。

【００２０】（ｉ）吸水パッド部は、被検試料液の試験
片における展開を、その水性液体の吸収力により促進さ
せうる手段であり、所望の大きさに加工した吸水パッド
を吸水性基材上に設置することにより作製することがで
きる。吸水パッドとしては水性液体の吸収性に優れる材
料が好適であり、被検試料液を吸収できるものであれば
特に制限されない。具体的には、ガラスフィルター、ニ
トロセルロース、吸水性ポリマー、多孔質材料等が挙げ
られる。

【００２１】（ｉｉ）被検試料液受領部は、被検試料液
を導入するための部分であり、試験片を構成する吸水性
基材そのものの所定の面積を有する一部分であってもよ
いし、吸水性基材上に新たに滴下パッドを設置して形成
してもよい。後者の場合における滴下パッドの素材は、
滴下された被検試料液を溢れさせることなく吸収し、か
つ被検試料液を吸水性基材上に滞りなく供給できるもの
であれば特に制限されない。具体的には、ポリエステル
不織布、血球分離膜、ガラスフィルター、ニトロセルロ
ース、ナイロンメンブレン、多孔質材料等が挙げられ
る。

【００２２】（ｉｉｉ）固定相は、後述する、たとえ
ば、抗原、ハプテン、抗体、核酸等の、被検物質に対す
る第１の特異的結合物質を、試験片として使用する吸水
性基材上に固定化することにより形成することができ
る。固定化方法としては、たとえば、公知の物理的吸着
法、共有結合法等が挙げられる。また、固定相に使用す
る特異的結合物質と親水性重合体とを含む溶液を吸水性
基材上の所望の範囲に塗布した後、該親水性重合体を凝
固させる凝固溶剤に当該吸水性基材を浸漬することで固
定相を形成することもできる。なお、親水性重合体とし
ては前記例示のものが挙げられ、凝固溶剤としては、ア
セトン、エタノール、メタノール、エーテル等が挙げら
れる。

【００２３】また、固定相としては、被検物質の存在を
検出可能な範囲で標識複合体と被検物質とからなる複合
体を捕捉できる量以上で該特異的結合物質が固定化され
てなるものが好ましい。固定相における該特異的結合物
質の固定化量は、被検物質とその特異的結合物質との組
み合わせにより適宜決定されえ、一概には決定できない
が、通常、特異的結合物質を好ましくは０．００５〜５
ｍｇ／ｃｍ² の範囲で均一に固定化して固定相を形成す
るのが好ましい。

【００２４】なお、固定相を形成した後の吸水性基材
は、 被検対象でないタンパク質等の当該基材上への非特
異的な吸着の防止、 展開の容易性、ならびに固定化した
特異的結合物質の保存安定性の観点から、公知の方法に
従ってブロッキング剤、界面活性剤および糖を含有する
溶液（以下、処理液という）に浸漬し、乾燥して用いる
のが好ましい。かかる操作は、本発明の所望の効果の発
現が阻害されない限り、固定相形成後から試験片の使用
時までの任意の時点で行うことができる。

【００２５】使用するブロッキング剤としては、ウシ血
清アルブミン、カゼイン、ゼラチン、スキムミルク等の
吸水性基材に対し吸着性を有するタンパク質が挙げられ
る。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン（１０）
オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビ
タンモノラウレート、ポリオキシエチレンアルキルアリ
ルエーテルリン酸エステル、ポリオキシエチレンアルキ
ルエーテルリン酸エステル、ポリオキシエチレンアルキ
ルフェニルエーテル等が挙げられる。糖としては、サッ
カロース、トレハロース等が挙げられる。なお、前記処
理液中のブロッキング剤の含有量は、好ましくは０．１
〜１０重量％である。前記処理液中の界面活性剤の含有
量は、好ましくは０．０１〜１重量％である。前記処理
液中の糖の含有量は、好ましくは０．１〜１０重量％で
ある。

【００２６】（ｉｖ）標識複合体受領部は、被検物質に
特異的に結合しうる第２の特異的結合物質と標識物質と
を有してなる標識複合体を導入するための部分であり、
前記被検試料液受領部と同様にして作製することができ
る。また、標識複合体受領部の一態様としては、試験片
を構成する吸水性基材上に液体との接触により展開可能
に標識複合体を直接的に保持させてなるもの、または、
たとえば、前記滴下パッドに使用するパッドに標識複合
体を同様にして予め保持させておき、当該パッドを吸水
性基材上に適宜貼り合わせ、液体との接触により展開可
能に標識複合体を間接的に保持させてなるものが含まれ
る。標識複合体を吸水性基材上に直接的に保持させる方
法としては、標識複合体を吸水性基材上に塗布した後に
乾燥固定させる方法が挙げられる。また、標識複合体を
パッドに保持させる方法としては、前記例示したような
滴下パッドに標識複合体を含浸させ、乾燥固定する方法
が挙げられる。

【００２７】本明細書にいう固定相および標識複合体を
形成するのに使用されうる特異的結合物質としては被検
物質に特異的に結合し得る物質であればよく、例えば、
被検物質に応じてサンドイッチ型の免疫測定法において
汎用される公知の物質から選択され、特に限定されるも
のではない。たとえば、抗原、ハプテン、抗体、核酸、
エフェクター、レセプター、酵素、酵素補助因子、酵素
阻害剤等が挙げられる。被検物質との特異的結合性に優
れ、高感度の検出が得られるという観点から、特異的結
合物質としては、抗原、ハプテンまたは抗体が好まし
い。なお、被検物質が核酸の場合、該核酸と相補的な塩
基配列を有する核酸プローブが好適に用いられる。

【００２８】特異的結合物質として好適な抗原およびハ
プテンとしては、クラミジア・トラコマティス、溶連
菌、百日咳菌、ヘリコバクター・ピロリ、レプトスピ
ラ、トレポネーマ・パリダム、トキソプラズマ・ゴンデ
ィ、ボレリア等の各種微生物抗原、マイコプラズマ脂質
抗原、ＨＡ抗原、ＨＢｃ抗原、ＨＢｅ抗原、ＨＢｓ抗
原、ＨＣＶ抗原、ＨＩＶ抗原および前記抗原に由来する
ハプテン等が挙げられる。

【００２９】また、抗体としては、モノクロナール抗体
やポリクロナール抗体を使用することができる。具体的
には、抗大腸菌抗体、抗リステリア菌抗体、抗サルモネ
ラ菌抗体、抗カンピロバクター菌抗体、抗ウェルシュ菌
抗体、抗腸炎ビブリオ菌抗体、抗ベロトキシン抗体、抗
ヒトトランスフェリン抗体、抗ヒトアルブミン抗体、抗
ヒト免疫グロブリン抗体、抗マイクログロブリン抗体、
抗ＣＲＰ抗体、抗トロポニン抗体、抗ＨＧＣ抗体、抗ク
ラミジア・トラコマティス抗体、抗ストレプトリジンＯ
抗体、抗へリコバクター・ピロリ抗体、抗β−グルカン
抗体、抗ＨＢｅ抗体、抗ＨＢｓ抗体、抗アデノウィルス
抗体、抗ＨＩＶ抗体、抗ロタウィルス抗体、抗ＲＦ抗体
等が挙げられる。

【００３０】前記核酸プローブは、ＤＮＡからなるもの
であっても、ＲＮＡからなるものであってもよい。たと
えば、前記抗原として例示された各種微生物、マイコプ
ラズマ、各種ウィルスに由来する核酸成分に相補的な塩
基配列を有するＤＮＡもしくはＲＮＡプローブが挙げら
れる。核酸プローブは、天然由来のものでも、生物学的
方法および／または化学的方法により作製されたもので
あってもよく、また、修飾核酸（たとえば、アセチル化
された塩基を含むもの）、核酸アナログ〔たとえば、ペ
プチド核酸（ＰＮＡ）〕等であってもよい。さらに、任
意の配列や修飾を有する核酸を合成した市販品も好適に
用いられる。核酸プローブの塩基数としては少なくとも
５塩基長程度であり、好ましくは５〜１００塩基長、よ
り好ましくは１５〜５０塩基長であるが、数千塩基長で
あってもよい。

【００３１】また、本明細書において「相補的」とは、
核酸プローブの塩基配列が、ストリンジェントな条件下
で被検物質としての核酸にハイブリダイズできる程度に
は当該核酸の相補鎖に充分に類似していることをいう。
当該類似の程度としては、好ましくは８０％以上、より
好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９５％以上で
ある。かかる「類似の程度」は、前記核酸の相補鎖と核
酸プローブの塩基配列との間の配列同一性を求めること
により評価することができる。配列同一性とは２つの配
列間の塩基の配列類似性をいい、２つの適切にアライン
メントされた配列を比較することにより決定する。具体
的には、両方の配列に存在する同一の塩基を決定して適
合部位の数を決定し、次いで比較対象の配列領域内の塩
基の総数で前記適合部位の数を割り、得られた数値に１
００を乗じて配列同一性（％）を算出する。かかる配列
同一性は、たとえば、ＢＬＡＳＴネットワークサービス
を利用して適宜求めることが可能である。

【００３２】本明細書においてストリンジェントな条件
としては、非特異的なハイブリダイゼーション反応を有
意に低下させる条件であれば特に限定されない。核酸の
ハイブリダイゼーションを行うためのストリンジェント
な条件については、たとえば、成書（モレキュラー ク
ローニング（Molecular Cloning）第３版、ザンブルー
ク（Sambrook）とラッセル（Russell）著、コールドス
プリングハーバー）等に記載されている。プローブの長
さ、塩基組成、ハイブリダイズする配列間の配列同一
性、温度、およびイオン強度等の要素が、核酸ハイブリ
ッドの安定性に影響する。たとえば、中ストリンジェン
シーまたは高ストリンジェンシー等のストリンジェント
な条件は、被検物質としての核酸と特異的結合物質とし
ての核酸プローブの特性に応じて、経験的に決定するこ
とができる。

【００３３】なお、本明細書において「第１の特異的結
合物質」と「第２の特異的結合物質」とは単に記載上に
おいて区別するものであり、特異的結合物質である点で
は区別されるものではない。本発明の所望の効果の発現
の観点から、使用される特異的結合物質は、被検物質に
応じて選択することができる。たとえば、以下のように
第１の特異的結合物質と第２の特異的結合物質とを組み
合わせて用いるのが好適である。たとえば、第２の特異
的結合物質が抗体の場合、第１の特異的結合物質として
は同じ抗体または当該抗体に対する抗原の別のエピトー
プを認識する抗体を使用する。第２の特異的結合物質が
抗原またはハプテンの場合、第１の特異的結合物質とし
ては同じ抗原またはハプテン、あるいは第２の特異的結
合物質とは異なるが被検物質と特異的に結合しうる抗
原、抗体、ハプテン等を使用する。また、被検物質が核
酸である場合、たとえば、第１の特異的結合物質および
第２の特異的結合物質として使用される核酸プローブの
組としては、ストリンジェントな条件下、互いにハイブ
リダイズすることはなく、かつ被検物質としての核酸に
は互いに別個の部分でハイブリダイズしうる核酸プロー
ブの組を使用することができる。

【００３４】標識複合体に使用しうる標識物質として
は、たとえば、着色粒子、磁性粒子、酵素、蛍光色素
や、³²Ｐ、³⁵Ｓ、³ Ｈ等のラジオアイソトープ等が挙げ
られる。中でも検出容易性の観点から、着色粒子、酵素
または蛍光色素が好ましい。本発明の試験片を用いる被
検物質濃度の測定では、かかる標識物質から発せられる
シグナルを何らかの方法により検出して、そのレベルを
測定することにより固定相に捕捉された標識物質の量を
求め、ひいては被検試料液中の被検物質濃度を求める。

【００３５】本明細書において着色粒子とは着色された
粒子であって、シグナルを当該粒子から直接的に発せら
れる色として検出しうる粒子をいう。たとえば、当該粒
子としては、金コロイド粒子やセレニウムコロイド粒子
のような金属コロイド粒子や、着色された水分散型高分
子粒子などが挙げられる。水への分散性に優れ、また第
２の特異的結合物質や酵素等の固定化容易性の観点か
ら、水分散型高分子粒子からなるものが好ましい。

【００３６】金属コロイド粒子は入手容易性および安定
性等の観点より、金コロイド粒子が好ましい。また、第
２の特異的結合物質やリガンド等の固定化容易性および
検出の容易性の観点から、その粒径（平均粒径）は５〜
８０ｎｍが好ましく、１０〜５０ｎｍがより好ましい。
当該粒径は、たとえば、透過型電子顕微鏡観察下で各粒
子の絶対粒径を測定し、得られた測定値を平均すること
により求められる。

【００３７】水分散型高分子粒子は、たとえば、公知の
方法に従い、不飽和二重結合を有する単量体の一又は二
以上を乳化重合することによって調製することができ
る。かかる単量体としては、たとえば、エチレン、プロ
ピレン等のオレフィン系単量体、酢酸ビニル、塩化ビニ
ル等のビニル系単量体、スチレン、メチルスチレン、ク
ロロスチレン等のスチレン系単量体、アクリル酸メチル
等の（メタ）アクリル酸エステル系単量体、ブタジエン
等のジエン系単量体等が好適に用いられる。

【００３８】また、本発明に用いられる水分散型高分子
粒子としては、上記単量体の単独重合体や共重合体から
なるものの他、その表面に第２の特異的結合物質や酵素
等を固定化するためのリガンドやスペーサーの導入を目
的として、得られる粒子に官能基やイオン性基を付与し
たものでもよく、また粒子の水性媒体中での分散安定性
を高めるなどの目的で、改質用単量体を共重合してなる
ものであってもよい。

【００３９】そのような官能基やイオン性基としては、
たとえば、カルボキシル基、水酸基、グリシジル基、ア
ミノ基、ホルミル基、カルバモイル基、イソチオシアナ
ート基、アジドカルボニル基、ヒドラジド基、酸無水物
基等を挙げることができ、中でもカルボキシル基が好ま
しい。これらの官能基等を有する水分散型高分子粒子を
調製するには、単量体成分として、たとえば、アクリル
酸、メタクリル酸のようなカルボキシル基を有する単量
体、たとえば、ヒドロキシアクリレート、２−ヒドロキ
シエチルアクリレートのような水酸基を有する単量体、
たとえば、グリシジルメタクリレートのようなグリシジ
ル基を有する単量体を、所望により他の共重合性単量体
と乳化重合させることによって、それぞれカルボキシル
基、水酸基およびグリシジル基を有する粒子として得る
ことができる。また所望の単量体成分を重合させた後、
得られた粒子に官能基を導入することもできる。

【００４０】また、前記改質用単量体としては、たとえ
ば、アクリル酸、メタクリル酸、２，２，２−トリフル
オロエチルメタクリレートなどのフッ素化メタクリル酸
エステル、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ア
クリルアミド、スチレンスルホン酸ナトリウム、スルホ
プロピル（メタ）アクリレートナトリウム塩、Ｎ−ビニ
ル−２−ピロリドン、２−ヒドロキシエチルアクリレー
ト、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、グリシジル
メタクリレートなどが用いられる。

【００４１】水分散型高分子粒子の着色は、たとえば、
スダンブルーやスダンレッドＩＶ、スダンＩＩＩ、オイ
ルオレンジ、キニザリングリーンなどに代表される顔料
や染料、また種々の蛍光色素・顔料を、当該粒子製造時
に任意に添加することで行うことができる。着色された
水分散型高分子粒子を標識物質として用いた場合、それ
が直接的に発する色として、目視または機器〔たとえ
ば、クロマトスキャナー（スキャニングデンシトメー
タ）〕により迅速、簡便にシグナルを検出することがで
きる。目視確認の容易性の観点からは、青色、赤色、緑
色またはオレンジ色等に着色された水分散型高分子粒子
が好ましく、分散安定性や被検物質の検出感度の調整の
容易性などの観点から、青色または赤色に着色されたも
のがより好ましい。

【００４２】本発明においては、市販されている種々の
着色された水分散型高分子粒子も好適に使用することが
できる。市販されている水分散型高分子粒子としては、
たとえば、ｐ−クロロスチレンの単独重合体または共重
合体、スチレン−ブタジエン共重合体、スチレン−アク
リロニトリル−ブタジエン共重合体などの、スチレンま
たはその誘導体を単量体成分として含んでなる単独重合
体または共重合体を挙げることができる。また、（メ
タ）アクリル酸の長鎖アルキルエステルまたはその誘導
体からなる単独重合体や、これらと（メタ）アクリル酸
メチルや（メタ）アクリル酸エチル、グリシジル（メ
タ）アクリレート等との共重合体も本発明において用い
られる。さらに、スチレンまたはその誘導体と、（メ
タ）アクリル酸エステルまたはその誘導体との共重合体
も用いられる。また、ゴム、ナイロン、ポリウレタン、
微結晶質セルロース等を用いてもよい。

【００４３】なお、本発明の水分散型高分子粒子として
は、前記するような単独重合体または共重合体の１種か
らなるものであっても、２種以上からなるものであって
もよい。

【００４４】水分散型高分子粒子は、その使用時や保存
時に融着や凝集を起こさないものが好ましい。従って、
当該粒子としては所望のガラス転移点を有するように選
択された単量体から構成されたものがよい。当該ガラス
転移点としては、好ましくは１０℃以上、より好ましく
は室温（１５℃）以上である。ガラス転移点は、たとえ
ば、示差走査熱量計で測定できる。

【００４５】このような水分散型高分子粒子の粒径（平
均粒径）は、分散性、第２の特異的結合物質やリガンド
等の固定化性の観点から、好ましくは３μｍ以下、より
好ましくは２μｍ以下であり、第２の特異的結合物質や
リガンド等を固定する際の精製の容易性の観点から、好
ましくは０．０１μｍ以上、より好ましくは０．１μｍ
以上である。すなわち、水分散型高分子粒子の粒径とし
ては、好ましくは０．０１〜３μｍ、より好ましくは
０．１〜２μｍである。なお、当該粒径は、金属コロイ
ド粒子と同様の方法により測定できる。

【００４６】前記磁性粒子とは、水分散型高分子粒子中
に磁性体を分散させたり、核として導入したものであ
り、任意の粒径を有する市販品が一般に入手可能であ
る。

【００４７】標識物質として酵素を用いる場合、シグナ
ルは、その基質に対する当該酵素の作用により生ずる産
物から発せられる。本発明に用いうる酵素として好適に
は、公知の酵素免疫測定法において標識として常用され
る酵素を挙げることができる。たとえば、ペルオキシダ
ーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファタ
ーゼ、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、エス
テラーゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼ等が挙げられる。
中でも、より高感度で安定な検出を達成する観点から、
ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼが好ま
しい。

【００４８】また、当該酵素の基質としては、酵素反応
産物の検出が可能であれば特に限定されるものではない
が、迅速、簡便に当該産物の検出を行いうる観点から発
色性基質が好ましい。かかる発色性基質は、使用する酵
素に応じ、公知の酵素免疫測定法において用いられる発
色性基質から適宜選択することができる。

【００４９】発色性基質としては、たとえば、酵素がペ
ルオキシダーゼの場合、ペルオキシダーゼと過酸化水素
との組み合わせにより反応して発色しうる基質であれば
よく、たとえば、２，２’−アジノ−ビス（３−エチル
ベンズチアゾリン）−６−スルホン酸、ｏ−フェニレン
ジアミン、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジ
ン（以下、ＴＭＢという) 、ｏ−ジアニジジン、３，
３’−ジアミノベンジジン、３−アミノ−９−エチルカ
ルバゾール、４−クロロ−１−ナフトール等が挙げら
れ、発色性および無毒性という観点からＴＭＢが好まし
い。

【００５０】また、標識物質として使用しうる蛍光色素
としては、フルオレセイン、テトラメチルローダミン、
Ｃｙ３、Ｃｙ５等が挙げられる。

【００５１】標識複合体は前記のような標識物質と第２
の特異的結合物質とを直接的にまたは間接的に結合する
ことにより得られる。間接的に結合させる場合とは、た
とえば、標識物質と第２の特異的結合物質との結合を任
意の物質を介して行うような場合をいう。たとえば、標
識物質として酵素を使用する場合、たとえば、前記水分
散型高分子粒子を介して酵素と第２の特異的結合物質と
を結合することにより標識複合体を得てもよい。

【００５２】標識複合体の調製は以下に示すようにして
行う。たとえば、標識物質と第２の特異的結合物質との
結合は、任意の物質間の結合方法として一般に公知であ
る、共有結合、物理的吸着もしくはイオン結合を利用す
る方法を用いて好適に行うことができる。結合安定性の
観点から、共有結合を利用する方法を採用するのが好ま
しい。

【００５３】たとえば、標識物質等に存在する官能基や
イオン性基を介して直接結合する、または水溶性カルボ
ジイミドや他の炭素数ｌ〜１２の炭素鎖基を有する二官
能性の有機化合物をスペーサーとして介在させて結合す
る。また、たとえば、リガンドを標識物質に結合してお
き、一方、当該リガンドに結合しうる化合物（以下、リ
ガンド結合化合物という）を第２の特異的結合物質に結
合し、当該リガンドとリガンド結合化合物との結合を利
用して両者を結合させることも可能である。かかるリガ
ンド−リガンド結合化合物の組み合わせの好適な例とし
ては、ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビ
ジン、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）−抗ＤＩＧ抗体、ＦＩ
ＴＣ−抗ＦＩＴＣ抗体等が挙げられる。中でも、ビオチ
ン−ストレプトアビジン、ＤＩＧ−抗ＤＩＧ抗体の組み
合わせは、それらが結合して形成される複合体の安定性
が高く、より好適に用いられる。たとえば、標識物質と
して酵素を用いる場合、なんらかのスペーサーを介在さ
せることにより固定化標識複合体における自由度を高め
ることができ、酵素反応の効率を高める観点から好まし
い。

【００５４】また、たとえば、前記水分散型高分子粒子
を介して標識物質と第２の特異的結合物質とを結合する
場合、たとえば、（標識物質）−（水分散型高分子粒
子）−（第２の特異的結合物質）の形を有する標識複合
体を得る場合、当該標識複合体は標識物質と水分散型高
分子粒子との間および水分散型高分子粒子と第２の特異
的結合物質との間を、前記するようにして結合すること
により調製することができる。

【００５５】標識複合体は、第２の特異的結合物質を標
識物質へ結合させた後、たとえば、膜分離法や濾過、遠
心分離法等の慣用の分離法によって、たとえば、結合を
行った反応場である溶媒等から分離精製することにより
得られ、たとえば、水中に浸漬して、または凍結乾燥し
て保存される。

【００５６】また、本発明の一態様として、本発明の試
験片を用いる被検物質の検出方法（以下、検出方法とい
う）を提供する。

【００５７】前記試験片の被検物質受領部に被検試料液
を導入すると、直ちに展開され、当該試料液中に被検物
質が存在する場合には、当該被検物質は固定相において
捕捉される。ここで、前記標識複合体を用いて、捕捉さ
れた被検物質につき、単にその存在のみを検出すれば、
被検試料液中の被検物質の存在が明らかになる。また、
前記標識複合体を用いて、捕捉された被検物質につき、
その量を測定すれば、被検試料液中の被検物質濃度を定
量的に求めることができる。

【００５８】従って、本発明の検出方法によれば、被検
試料液中の被検物質の存在確認および該物質の濃度の定
量的な測定を行うことができる。

【００５９】具体的には、当該検出方法は、本発明の前
記試験片を用いる被検物質の検出方法であって、（ａ）
被検試料液受領部に被検試料液を導入する工程、（ｂ）
標識複合体受領部に標識複合体を導入する工程、（ｃ）
吸水性基材上で被検試料液および標識複合体を展開する
工程、ならびに（ｄ）固定相に捕捉された該被検物質と
該標識複合体とからなる複合体に含まれる標識物質を検
出する工程、を含むものである。そして、固定相におい
て標識物質が検出された場合、被検試料液中に被検物質
が存在すると判定する。一方、標識物質の検出の際に当
該物質の量を測定しておけば、被検物質の濃度を求める
ことができる。

【００６０】本発明の検出方法においては、本発明の試
験片の被検試料液受領部に導入し、該試験片上で展開す
る成分（以下、展開対象成分という）を毛細管現象によ
り自然展開させるため、当該展開対象成分は水を媒体と
する溶液や分散液等であるのが好適である。たとえば、
そのような形態で提供された被検試料液を、被検試料液
受領部に導入〔工程（ａ）〕し、次いで標識複合体受領
部に標識複合体を導入〔工程（ｂ）〕すると、それらは
直ちに吸水性基材上で展開〔工程（ｃ）〕される。

【００６１】被検試料液の導入は本発明の所望の効果が
得られるように行われる。たとえば、導入は滴下等によ
り適宜行えばよく、その際の滴下量も本発明の所望の効
果が得られれば特に限定されるものではない。

【００６２】標識複合体の導入は、たとえば、標識複合
体含有液を滴下することにより行なうことができる。ま
た、標識複合体受領部が吸水性基材上に標識複合体を液
体との接触により展開可能に保持させてなるものである
場合、標識複合体の導入は、当該受領部に水や緩衝液等
の液体を滴下することにより行なうことができる。

【００６３】なお、固定相に供給される被検試料液の量
を一定に保つ観点から、標識複合体の導入は、被検試料
液が被検試料液受領部に導入された後に行なわれるのが
好ましく、試験片上で展開された被検試料液が吸水パッ
ド部に接触した後に行なわれるのがより好ましい。

【００６４】被検試料液が試験片上で展開され固定相に
達すると、被検試料液に被検物質が含まれる場合、被検
物質に特異的に結合しうる第１の特異的結合物質を固定
化してなる固定相において、被検物質に特異的に結合し
うる第２の特異的結合物質と標識物質とを有してなる標
識複合体と該被検物質とからなる複合体が捕捉される。

【００６５】標識複合体と被検物質とからなる前記複合
体は、例えば、免疫学的反応等により第２の特異的結合
物質と被検物質とが結合し、〔標識複合体〕−〔被検物
質〕からなる複合体として形成される。また、該複合体
の固定相における捕捉は、例えば、免疫学的反応等によ
り第１の特異的結合物質と該複合体中の被検物質とが結
合し、〔標識複合体〕−〔被検物質〕−〔第１の特異的
結合物質〕からなる複合体が形成されることにより生ず
る。

【００６６】なお、被検物質が核酸であって、特異的結
合物質として核酸プローブを使用するような場合には、
ストリンジェントな条件下で展開対象成分を展開するの
が好ましい。

【００６７】工程（ｄ）では、前記被検試料液と標識複
合体を展開して一定時間経過後、固定相に捕捉された該
被検物質と該標識複合体とからなる複合体に含まれる標
識物質を検出する。標識物質として着色粒子を用いた場
合、固定相で捕捉された標識複合体から発せられる色を
検出することにより被検物質の存在を検出することがで
きる。検出用の標識物質として酵素を用いた場合、固定
相で捕捉された標識複合体中の酵素の作用により生じる
産物を検出することにより被検物質の存在を検出するこ
とができる。この場合、好ましくは標識として使用する
酵素に応じた発色性基質を、本発明の所望の効果が得ら
れうるよう、適宜、酵素基質液として試験片に導入す
る。また、標識物質として、蛍光物質を用いた場合、標
識複合体から生じる蛍光を検出することにより被検物質
の存在を検出することができる。また、各場合に、単に
固定相における標識複合体の存在を検出するのみではな
く、その量を、各場合に応じた適切な機器等（たとえ
ば、蛍光顕微鏡やクロマトスキャナ等）により測定すれ
ば、被検試料液中の被検物質濃度を定量的に求めること
もできる。

【００６８】なお、本発明の検出方法により被検試料液
中の被検物質の濃度を測定する場合、かかる検出方法に
よれば、被検試料液の導入量を一定にせずとも一定量の
被検試料液を固定相に導入することができ、従って、被
検試料液の導入量に依存することなく定量的に被検物質
濃度を求めることができるので、被検試料液の場合と同
様の操作を被検物質を既知濃度で含む対照試料を用いて
別途行ない、予め検量線を作成しておけば、当該検量線
を用いて迅速かつ簡便に被検試料液中の被検物質濃度を
定量的に求めることができる。

【００６９】本発明の試験片を用いて検出されうる被検
物質としては、特異的結合物質との間で、例えば、免疫
学的反応（すなわち抗原抗体反応）により、いわゆるサ
ンドイッチ型の免疫複合体を形成しうるものや、核酸ハ
イブリッドを形成しうるもの等、本発明において使用さ
れる第１の特異的結合物質と第２の特異的結合物質の両
者に結合しうるものであれば特に制限されない。たとえ
ば、細菌（特に大腸菌Ｏ１５７、メチシリン耐性黄色ブ
ドウ球菌等の病原性細菌) 、放線菌、酵母、カビ、ウィ
ルス（特にＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ等）等の微生物また
はそれらに対する抗体、細菌等が産生する毒素、あるい
は腫瘍マーカー抗原等の生体試料中の抗原性ペプチド、
前記微生物由来の核酸等が挙げられる。

【００７０】被検試料液とは前記被検物質について試験
するための被検試料を含む液体をいい、特に限定される
ものではない。たとえば、食品抽出液、培養液、血液、
血清、尿、便、汗、唾液等が挙げられる。また、それら
を適切な希釈溶媒（例えば、任意の緩衝液、生理食塩
水、培養液等）によって希釈した希釈液であってもよ
い。被検試料は液体試料であっても、固体試料であって
もよい。固体試料の場合、たとえば、該固体試料を適宜
粉砕し、リン酸緩衝液、生理的食塩水等の溶媒に溶解ま
たは希釈することにより被検試料液を調製することがで
きる。

【００７１】さらに本発明の別の態様として、本発明の
検出方法において有用な被検物質の検出用キットを提供
する。当該キットとしては、本発明の試験片を含んでな
るものを挙げることができる。さらに、当該キットに
は、任意にその他の構成物、たとえば、被検試料を入手
する手段や、標識複合体含有液、緩衝液等の適当な試
薬、本発明の検出方法を実施するための説明書等を含め
てもよい。

【００７２】

【実施例】以下、実施例を挙げてより具体的に本発明を
説明するが、本発明はかかる実施例に限定されるもので
はない。

【００７３】製造例１：標識複合体含有液の調製 １）ラテックス粒子懸濁液の作製 スチレン５０ｇと、アクリル酸０．５ｇと、トリエチレ
ングリコールメタクリレート０．２ｇと、蒸留水４４０
ｇとからなる混合液を窒素ガス雰囲気下で７５℃に維持
し、攪拌しながら、重合開始剤としての過硫酸カリウム
０．２５ｇを蒸留水１０ｇに溶解した水溶液を加え、１
０時間重合を行った。その結果、カルボキシル化された
水分散型高分子粒子としてカルボキシル化ポリスチレン
ラテックス粒子（平均粒子径：０．２μｍ）を得た。

【００７４】得られたカルボキシル化ポリスチレンラテ
ックス粒子（以下、ラテックス粒子という）を緩衝液
（０．０１Ｍホウ酸緩衝液、ｐＨ８．２）に固形分濃度
が１０重量％になるように分散して、ラテックス粒子懸
濁液を得た。

【００７５】２）ラテックス粒子の着色 スダンブルー０．４２ｇと、キニザニングリーン０．０
８ｇと、トルエン１２ｇとからなる混合液に、ドデシル
硫酸Ｎａ ０．３ｇと蒸留水６０ｇとを添加し、攪拌し
ながら超音波をかけて１０分間懸濁させた。上記１）の
ラテックス粒子懸濁液１２ｇを添加し、一晩攪拌した。
その後トルエンを除去し、緩衝液（０．０１Ｍホウ酸緩
衝液、ｐＨ８．２）で洗浄した後に固形分が１０重量％
になるように分散し、着色ラテックス粒子懸濁液を得
た。

【００７６】３）固定化 本製造例では、特異的結合物質として抗体（抗ベロ毒素
１型抗体）を、上記２）で作製した着色ラテックス粒子
（標識物質）に以下のようにして固定化した。

【００７７】前記２）で得られた着色ラテックス粒子懸
濁液３ｍｌに、水溶性カルボジイミド〔同仁化学研究所
製、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド塩酸塩、１０ｍｇ／ｍ１、０．０１Ｍホ
ウ酸緩衝液（ｐＨ８．２）〕０．６ｍ１と、緩衝液
（０．０１Ｍホウ酸緩衝液、ｐＨ８．２）１．８ｍｌ
と、抗ベロ毒素１型抗体〔トキシンテクノロジー社、２
ｍｇ／ｍｌ、０．０１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２）〕
２．１ｍｌとを加えて、４℃で１６時間反応させた。次
いで得られた反応物について、洗浄液として０．０１Ｍ
ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２）を用いて遠心分離操作を用
いて洗浄を行い、前記０．０１Ｍホウ酸緩衝液で固形分
濃度２．５重量％に調製し、抗体固定化着色ラテックス
粒子懸濁液（標識複合体懸濁液）を得た。

【００７８】得られた標識複合体においてラテックス粒
子乾燥重量１ｇ当たりの抗体（分子量約１．６×１
０⁵ ）の固定化量は２５．０ｍｇであった。

【００７９】４）標識複合体含有液の調製 前記３）で得られた標識複合体懸濁液を緩衝液（０．０
１Ｍホウ酸緩衝液、ｐＨ８．２）で希釈して、標識複合
体含有液を調製した。希釈比（体積比）は、標識複合体
懸濁液：緩衝液＝１：１００とした。

【００８０】製造例２：被検試料液の調製 被検物質としてベロ毒素１型（ナカライテスク社製）を
用いた。該物質を緩衝液（組成：０．２Ｍ ＮＨ₄ Ｃ
ｌ、０．９重量％ＮａＣｌ、０．１重量％ウシ血清アル
ブミン、ｐＨ８．０）で２０ｎｇ／ｍｌに調製し、被検
試料液とした。

【００８１】実施例１：免疫クロマトグラフ測定法用試
験片の作製 本実施例においては、本発明の試験片の一例として、図
２に示す免疫クロマトグラフ測定法用試験片を作製し
た。当該試験片は、約６〜１５ｍｍ×８７ｍｍの大きさ
を有する。また、当該試験片は、吸水パッド部１、被検
試料液受領部２、固定相３、標識複合体受領部４および
吸水性基材５からなる。なお、試験片の下に示す、途中
に点を配してなる線分は、被検試料液の展開方向におけ
る長さの尺度を示す。当該試験片は、以下に示すように
して作製した。

【００８２】抗ベロ毒素１型抗体溶液〔トキシンテクノ
ロジー社、１ｍｇ／ｍｌ、０．０１Ｍリン酸緩衝液、
０．９重量％ＮａＣｌ含有、ｐＨ７．２〕１．５μｌを
ニトロセルロースメンブレン〔ワットマン社製、孔径１
２μｍ、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）サポー
ト付、６ｍｍ×６０ｍｍ〕の図２の３に示す箇所に、デ
ィスペンサーを用いてライン状（６ｍｍ×１ｍｍ）に塗
布し、固定相を形成したメンブレンを得た。

【００８３】得られたメンブレンを、ウシ血清アルブミ
ン（オリエンタル酵母社製、１重量％）と、プライサー
フＡ２１２Ｅ（第一工業製薬社製、０．１重量％) と、
サッカロース（和光純薬工業社製、１重量％）とを含む
水溶液中に２０分間浸漬させた。次いで、得られたメン
ブレンを、室温で１６時間乾燥させた。

【００８４】図２の２に示す箇所にポリエステル製不織
布（７×６ｍｍ、厚さ１ｍｍ）を貼り合わせ、被検試料
液受領部を作製した。また図２の４に示す箇所にポリエ
ステル製不織布（７×１２ｍｍ、厚さ１ｍｍ）を貼り合
わせ、標識複合体受領部を作製した。さらに図２の１に
示す箇所に吸水パッド部としてガラス繊維製不織布（ワ
ットマン社製、ＧＦ／Ｂ、１５×３０ｍｍ、厚さ１ｍ
ｍ）を貼り合わせた。

【００８５】したがって、ａは１６ｍｍであり、ｂは８
ｍｍであり、ｃは１５ｍｍである。前記のようにして得
られた試験片は一例であり、かかる試験片にのみ限定さ
れるものではない。

【００８６】比較例１：クロマトグラフ測定法用試験片
の作製 本比較例においては、図３に示す試験片を作製した。当
該試験片は、約６〜１５ｍｍ×６７ｍｍの大きさを有す
る。また、当該試験片は、吸水パッド部１、固定相３、
被検試料液受領部兼標識複合体受領部６および吸水性基
材５からなる。なお、試験片の下に示す、途中に点を配
してなる線分は、試験片の被検試料液の展開方向におけ
る長さの尺度を示す。当該試験片は、以下に示すように
して作製した。

【００８７】抗ベロ毒素１型抗体溶液〔トキシンテクノ
ロジー社、１ｍｇ／ｍｌ、０．０１Ｍリン酸緩衝液、
０．９重量％ＮａＣｌ含有、ｐＨ７．２〕１．５μｌを
ニトロセルロースメンブレン〔ワットマン社製、孔径１
２μｍ、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）サポー
ト付、６ｍｍ×４０ｍｍ〕の図３の３に示す箇所にディ
スペンサーを用いてライン状（６ｍｍ×１ｍｍ）に塗布
し、固定相を形成したメンブレンを得た。

【００８８】得られたメンブレンを、実施例１と同様に
浸漬処理し、乾燥させた。

【００８９】図３の６に示す箇所にポリエステル製不織
布（７×１２ｍｍ、厚さ１ｍｍ）を貼り合わせ、被検試
料液受領部兼標識複合体受領部を作製した。さらに図３
の１に示す箇所に吸水パッド部としてガラス繊維製不織
布（ワットマン社製、ＧＦ／Ｂ、１５×３０ｍｍ、厚さ
１ｍｍ）を貼り合わせ、試験片を得た。

【００９０】したがって、固定相と被検試料液受領部兼
標識複合体受領部との間の距離は１５ｍｍであり、被検
試料液受領部兼標識複合体受領部と吸水パッドとの間の
距離は１０ｍｍである。

【００９１】実施例２および比較例２ 製造例２で得た被検試料液２０、３０または５０μｌ
を、実施例１または比較例１で作製した試験片の被検試
料液受領部に滴下した。展開した被検試料液が吸水パッ
ド部に接触した後、標識複合体受領部に前記製造例１で
得た標識複合体含有液１００μｌを滴下した。試験はｎ
＝４で行なった。

【００９２】いずれの試験片を用いた場合も、一定時間
後、固定相において着色ラテックス粒子に由来するシグ
ナル（色）が観察され、被検試料液中の被検物質の存在
が明らかとなった。

【００９３】また、標識複合体含有液の滴下から２０分
後、試験片の固定相における色としてのシグナルのレベ
ルをクロマトスキャナ（島津製作所製、ＣＳ−９００
０）で測定した。条件は光束０．４×５ｍｍ、スイング
幅５ｍｍ、測定ピッチ０．２ｍｍのリニア走査とし６１
０ｎｍにおける反射光を測定した。測定値とＣＶ値を表
１に示す。なお、ＣＶ値とは、標準偏差／平均値×１０
０を示す。

【００９４】

【表１】

【００９５】表１に示されるように、比較例１に比べて
実施例１の測定値は被検試料液の量が増減しても一定で
かつＣＶ値も低かった。したがって、実施例１の試験片
を用いると、滴下する被検試料液の量にかかわらず被検
試料液の濃度が同じであれば検出される被検物質の量が
一定となるため、被検試料液の量が増減しても被検試料
液の濃度を定量的に検出可能であることがわかる。ま
た、実施例１の試験片を用いると、被検試料液中の夾雑
物の影響を受けることなく被検試料液中の被検物質濃度
を定量的に測定可能であることがわかる。よって、予め
既知濃度の被検試料液を用いて検量線を作成しておけ
ば、被検試料液の量が増減しても被検試料液の濃度を定
量的に求めることができる。

【００９６】

【発明の効果】本発明のクロマトグラフ測定法用試験片
は、滴下する被検試料液の量が増減しても被検試料液中
の被検物質濃度を定量的に測定できるという優れた効果
を奏する。また、被検試料液中の夾雑物の影響を受ける
ことなく被検試料液中の被検物質濃度を定量的に測定で
きるという優れた効果を奏する。したがって、本発明の
クロマトグラフ測定法用試験片は、定量測定が望まれる
分野で幅広く使用することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、距離ａがどの部分の長さを指すものか
を示す、２つの具体例である。

【図２】図２は、実施例１で作製した試験片の平面図で
ある。

【図３】図３は、比較例１で作製した試験片の平面図で
ある。

【符号の説明】

１ 吸水パッド部 ２ 被検試料液受領部 ３ 固定相 ４ 標識複合体受領部 ５ 吸水性基材 ６ 被検試料液受領部兼標識複合体受領部

フロントページの続き (72)発明者 田中 康進 大阪府茨木市下穂積１−１−２ 日東電工 株式会社内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ｉ）吸水パッド部、（ｉｉ）被検試料
   液受領部、（ｉｉｉ）被検物質に特異的に結合しうる第
   １の特異的結合物質を固定化してなる固定相、ならびに
   （ｉｖ）被検物質に特異的に結合しうる第２の特異的結
   合物質と標識物質とを有してなる標識複合体を導入する
   ための標識複合体受領部、を、この順に吸水性基材上に
   有してなるクロマトグラフ測定法用試験片であって、前
   記（ｉ）と前記（ｉｉ）との間の距離ａ、前記（ｉｉ）
   と前記（ｉｉｉ）との間の距離ｂ、ならびに前記（ｉｉ
   ｉ）と前記（ｉｖ）との間の距離ｃがｂ＜ａ＜ｂ＋ｃ
   （但し、ａ、ｂおよびｃ＞０）を満たすものである、ク
   ロマトグラフ測定法用試験片。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のクロマトグラフ測定法
   用試験片を用いる被検物質の検出方法であって、（ａ）
   被検試料液受領部に被検試料液を導入する工程、（ｂ）
   標識複合体受領部に標識複合体を導入する工程、（ｃ）
   吸水性基材上で被検試料液および標識複合体を展開する
   工程、ならびに（ｄ）固定相に捕捉された該被検物質と
   該標識複合体とからなる複合体に含まれる標識物質を検
   出する工程、を含み、標識物質が検出された場合、被検
   試料液中に被検物質が存在すると判定する、被検物質の
   検出方法。
3. 【請求項３】 標識複合体に用いられる担体がラテック
   ス粒子である請求項２記載の検出方法。