CN103804470B - 一种特异性靶向肿瘤淋巴管的新型多肽tmvp1的获得及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种特异性靶向肿瘤淋巴管的新型多肽序列，以及该导向性多肽在肿瘤淋巴转移早期诊断和靶向治疗中的具体用途，属于肿瘤的生物治疗领域。利用细菌鞭毛随机肽库技术筛选、裸鼠乳腺原位抑制肿瘤体内验证等技术，获得可特异性靶向肿瘤淋巴管的导向性多肽：LARGR，命名为“TMVP1”。该导向性多肽具有以下突出的技术特征：对于乳腺癌原位移植模型内的肿瘤淋巴管有很好的靶向识别效应；可作为药物载体携带药物进行抗肿瘤治疗，有效抑制淋巴管生成的密度与肿瘤的转移。该导向性多肽在肿瘤淋巴转移的早期诊断中具有独特的实用价值，同时也为靶向阻遏肿瘤淋巴管的生成与转移提供了一种全新的诊断和治疗应用途径。
Description
一、技术领域：
本发明涉及一种特异性靶向肿瘤淋巴管的新型多肽TMVP1的获得及应用，其技术特征在于：利用细菌鞭毛随机肽库技术体外对重组活性蛋白VEGFR-3的胞外区进行筛选，通过化学合成多肽进行体内外功能验证，获得了一段特异性靶向肿瘤淋巴管的五肽“TMVP1”。发明内容属于肿瘤的生物治疗领域。
二、背景资料：
肿瘤淋巴管生成介导的淋巴道转移是大多数实体瘤播散的早期事件，是其难以根治和高病死率的重要原因。长期以来由于缺乏淋巴内皮特异性标记物和淋巴管生成模型使得对肿瘤淋巴管生成的研究相对滞后于肿瘤血管生成。随着淋巴管生成分子机制及更多相关因子研究的不断深入，抗淋巴管生成途径有望成为继肿瘤手术、放化疗之后，一种用于肿瘤转移预防和治疗的新途径。明确恶性肿瘤组织中淋巴管内皮细胞的特异性标记物，进而针对淋巴管内皮细胞探索早期靶向阻断肿瘤淋巴转移新方法，达到阻断恶性肿瘤淋巴道转移的目的，具有重要的理论和现实意义。
长期以来，大多数关于肿瘤转移的研究都集中于肿瘤的血道转移，事实上绝大多数恶性肿瘤，尤其是实体瘤转移的早期主要是通过淋巴道进行，相关前哨淋巴结的转移情况决定了肿瘤患者的临床分期、治疗方案的制订和预后的评估。因而，针对肿瘤淋巴道转移的诊断和治疗在肿瘤转移的诊断和治疗中占有绝对重要的地位。明确肿瘤淋巴管内皮细胞(LECs)的分子标志及生物学行为的变化是研究癌症淋巴道转移机制及开展分子靶向治疗的前提。既往因为缺乏淋巴管的特异性标记物，在鉴定组织中的淋巴管、分离纯化淋巴管内皮细胞上存在技术上的困难，鉴别淋巴管的方法只局限于形态学和繁琐的差别染色法，因此淋巴系统在分子生物学方面的研究始终没有长足的进步，近年来仅发现了数种相对特异表达于淋巴管内皮的特异性标志物LYVE-1、podoplanin、prox-1、VEGFR-3，但尚未发现绝对特异的淋巴管标志物。多项研究报告证明VEGF-C／VEGFR-3信号通道可介导实体瘤内及肿瘤周边新生淋巴管生成，促进肿瘤细胞易于移动、浸润并促使肿瘤细胞易于转移，VEGF-C／VEGFR-3信号通道是肿瘤淋巴管生成的中心性环节，对该信号途径的阻滞研究有望成为抗肿瘤淋巴转移治疗新的有效手段。同时，针对肿瘤新生淋巴管生成机制而研制出的特异性拮抗剂亦有望成为肿瘤靶向治疗的一种新方法，而这正是目前该领域面临的主要难题。
肿瘤分子靶向治疗是利用具有一定特异性的载体，将药物或其他杀伤肿瘤细胞的活性物质选择性地运送到肿瘤部位，把治疗作用或药物效应尽量限定在特定的靶细胞、组织或器官内，而不影响正常细胞、组织或器官的功能，从而提高疗效、减少毒副作用的一种方法，又称为“导弹治疗”。靶向性多肽是目前认为比较理想的一种肿瘤靶向性治疗的载体，它们具有：①血浆清除速度快、高亲和力、高特异性；②良好的组织穿透性，能被肿瘤细胞摄取；③易于化学合成并且低免疫原性的特点，可减少、避免上述单克隆抗体的不足。因而近年来，许多学者将目光转向应用肽库技术寻找能与肿瘤细胞、肿瘤血管内皮细胞特异性结合的短肽，以达到靶向肿瘤的目的。肽库技术是将基因型、表型及分子结合活性与噬菌体／细菌的可扩增性结合在一起，是一种高效的筛选技术。目前已成功的应用于抗原表位分析、单抗筛选、蛋白质功能拮抗多肽或模拟多肽的确定等方面。Arap W等对乳腺癌荷瘤小鼠进行肽库筛选后获得一系列与肿瘤血管特异性结合的短肽，其中的RGD序列被证实可与αV整合素结合。将RGD序列与阿霉素交联后应用于荷瘤小鼠，发现药物的抗肿瘤疗效显著增加而毒性作用明显减少。Laakkonen P等利用噬菌体肽库筛选获得靶向乳腺癌肿瘤及其淋巴结转移灶的导向性多肽LyP-1，为早期诊断肿瘤及其转移灶靶向性治疗奠定了基础。
淋巴管生成是一个复杂的生物学过程，在众多肿瘤转移过程中淋巴管转移也是的重要扩散途径。肿瘤细胞播散到区域淋巴结是大多实体肿瘤进展的早期，也是肿瘤分期和预后的重要的决定因素。淋巴管生成被认为是肿瘤细胞转移到区域淋巴结过程中发挥了举足轻重的作用。因此，通过开发抗淋巴管生成的药物来靶向肿瘤的淋巴管，以阻止某些肿瘤淋巴管的生成并靶向抑制肿瘤细胞经淋巴管转移可能构成一种新的肿瘤分子靶向治疗模式。临床应用中可以将效应片段如免疫毒素、病毒载体与多价的靶向分子联用，以克服效应片段的低肿瘤渗透性，非特异性毒性和免疫原性等问题。研制开发出的靶向性抗肿瘤淋巴管生成与转移的新型生物制剂，可有效抑制恶性肿瘤新生淋巴管的生成及转移；同时减轻对正常组织的毒副作用，从根本上改善基因治疗的安全性问题，对高效、安全的靶向性治疗药物的研发具有指导意义，可望推动恶性肿瘤分子靶向治疗的发展与进程。
三、发明内容：
基于以上技术背景和重大的医疗需求，本发明将公开一种特异性靶向肿瘤淋巴管的新型多肽TMVP1的筛选方法和序列。通过该方案获得的靶向性多肽TMVP1具有体外对淋巴管内皮细胞靶向识别效应、体内靶向识别恶性肿瘤淋巴管、携带效应片段后可特异性抑制肿瘤淋巴管生成与转移等明显优势，而对正常的细胞或组织没有明显的毒副作用，可以弥补目前肿瘤转移诊断和治疗领域的不足之处，为将来肿瘤转移的生物靶向治疗提供新的选择。
本发明的理论基础基于肿瘤淋巴管、细胞表面存在特殊分子标记。这些分子标记可能是我们已知的肿瘤转移相关抗原，也可能是一些未知抗原。若能找到与之特异性结合的配体，即可以此进行肿瘤及其转移的早期诊断和靶向阻遏。而导向性多肽是目前认为比较理想的一种肿瘤诊断和靶向性治疗的载体。尽管已经有许多导向肽的研究结果，其中部分已经进入临床试验，取得较好疗效，但是针对肿瘤淋巴管的导向性多肽筛选却鲜有报道。
利用细菌鞭毛随机肽库技术筛选肿瘤导向性多肽有以下几个优点：①库容量大，可达到108～109，属于高通量筛选；②可事先不必知道筛选物质的结构等信息；③操作简单，可重复性强，不似噬菌体肽库易发生污染。因此，在本发明中采用了细菌鞭毛随机肽库技术，体外对重组活性蛋白VEGFR-3的胞外区进行四轮正负筛选，通过化学合成多肽进行体外和体内验证，获得了一段特异性靶向肿瘤淋巴管的五肽序列：LARGR，命名为“TMVP1”。
与现有的导向性多肽相比，本发明达到了以下效果：
1TMVP1能在体外对表达VEGFR-3的淋巴管内皮细胞LEC具有良好的靶向识别效应，有望成为靶向阻遏肿瘤淋巴管的生成与转移的一种全新的诊断和治疗工具；
2对于乳腺癌原位移植模型、角膜微袋肿瘤生长模型及模式生物-斑马鱼体内的肿瘤淋巴管也有很好的靶向识别效应，有望成为定向阻遏肿瘤淋巴管的生成的有效治疗工具；
3TMVP1可直接穿透细胞膜，进入胞浆和胞核，有利于其作为药物载体携带药物进行抗肿瘤治疗；
4TMVP1本身没有毒性作用，但连接效应片段后有明显的抑制肿瘤淋巴管生成与转移效应，可有效抑制淋巴管生成的密度与肿瘤的转移。其作为一种有效的抗肿瘤药物和基因治疗载体，可发挥抗肿瘤的协同作用。
四、附图说明：
图1、激光共聚焦显微镜观察多肽与表达VEGFR-3的HLECs特异性结合；
图2、多肽在乳腺癌组织中淋巴管与血管中内的表达；
附图3：TMVP1在小鼠角膜肿瘤微袋模型中对肿瘤新生淋巴管的靶向识别效应；
附图4：TMVP1对模式生物斑马鱼中新生淋巴管的靶向识别效应；
附图5：TMVP1-DKK体外对新生淋巴管的抑制作用；
附图6、TMVP1-DKK抑制斑马鱼淋巴管的发育；
附图7、多肽对小鼠角膜肿瘤及新生淋巴管的抑制效应；
附图8、TMVP1-DKK对乳腺原位肿瘤及新生淋巴管生成的靶向抑制作用
五、具体实施方式：
以下结合附图和实施方式对本发明作进一步的详细描述。
(一)TMVP1的筛选
1.细菌鞭毛肽库体外正负筛选对肿瘤转移相关抗原VEGFR-3的胞外区蛋白和人的IgG蛋白
①取一支肽库原液，室温融化后置无菌锥形瓶中，加入IMC培养基(含100μg／ml氨卞青霉素)50ml，250rpm25℃摇菌过夜约16小时；
②取部分过夜培养的菌液测OD260，根据1OD260≈1×109cells，取含1×1010细胞的菌液，加入50mlIMC培养基(含100μg／ml氨卞青霉素)中，加入色氨酸500μl，250rpm25℃摇菌6小时，以诱导细菌鞭毛肽库表达；
③人的IgG蛋白10g／ml(1mlddH2O)包被60mm细胞培养用平皿，温柔旋转，室温1小时；
④封闭：在加入肽库前1小时，去除蛋白，加入新鲜配置的封闭液，含：
置于水平摇床，室温封闭1小时；
⑤在肽库诱导即将结束时，取一支试管，加入
取出10ml诱导后肽库菌液，加入上管，漩涡混匀；
⑥去除IgG蛋白平皿中封闭液，加入10mlddH2O轻轻漂洗一遍，弃去；加入上述肽库菌液，水平摇床50rpm轻柔混匀1分钟，室温1小时；同时，取出另一平皿，用VEGFR-3的胞外区蛋白10μg／ml(1mlddH2O)包被，温柔旋转，室温1小时。
⑦1小时后，弃去VEGFR-3蛋白包被的平皿中封闭液，吸出IgG蛋白平皿中菌液(此即为IgG蛋白未结合的肽库菌液)加入，水平摇床50rpm轻柔混匀1分钟，室温1小时；
⑧弃去VEGFR-3蛋白包被平皿中肽库菌液(此即为未与VEGFR-3蛋白包被结合的肽库菌液)，加入洗涤液10ml，水平摇床50rpm轻柔洗涤5分钟，重复洗涤共5次，以去除未与VEGFR-3蛋白结合的肽库菌液，洗涤液配制如下：
IMC培养基(含100μg／ml氨卞青霉素) 47.5ml
20％α-甲酰甘露糖甙 2.5ml
⑨最后一次洗涤后去除洗液，平皿置于漩涡振荡器上振荡30秒，加入IMC培养基(含100μg／ml氨卞青霉素)10ml涮洗，吸出培养基，置于50ml离心管中250rpm25℃摇菌过夜；
⑩重复上述正负筛选共4次，最后一轮筛选后的摇菌过夜培养产物倍比稀释，涂于RMG平板，25℃倒置培养；观察平板，稀释至104之平板克隆数量多，大小适中，易于挑取，从中随机挑取100个克隆，摇菌扩增，保种后送测序。
2.计算机分析测序结果
将测序结果中编码多肽的核苷酸序列翻译成氨基酸序列，利用计算机分析获得重复2～3次以上的三肽以上多肽序列。
3.化学合成对VEGFR-3的胞外区重组蛋白的亲和力最强的重复性短肽
①由上述实验获得对VEGFR-3的胞外区重组蛋白具有最强亲和力的克隆，其共同具有一段5肽重复序列，命名TMVP1；
②设计一段多肽，在TMVP1的N端和C端分别加上一个甘氨酸和一个半胱氨酸，并利用两个半胱氨酸氧化成二硫键，形成环肽结构，使TMVP1具有更稳定的空间构象。
③化学合成TMVP1肽，并在N端修饰FITC，将TMVP1的5个氨基酸序列随意重新排列，加上同样空间结构，并在N端修饰FITC作为阴性对照肽。
④用无菌水溶解合成的FITC-TMVP1和FITC-错序肽，浓度为10mM，分装后-20℃保存；
⑤在多肽TMVP1和抗菌肽D(KLAKLAK)2间添加两个甘氨酸GG作为柔性连接子，以减少肽段之间的相互作用。序列如下：GCGNVVRQGC-GG-(KLAKLAK-KLAKLAK)d，(KLAKLAK-KLAKLAK)d用右旋氨基酸，简称为TMVP1-DKK。
4.ELISA方法验证TMVP1对VEGFR-3蛋白的亲和性
①取VEGFR-3蛋白2μg，加入100μl H2O稀释后，每空100ng，包被于ELISA平板，室温1h；
封闭液：5％BSA
洗涤液：(PBST PH7.4)PBS100ml,加入Tween-2050μl即成。
②弃去孔内液体，封闭液每孔100μl，37℃，40min；
③弃去封闭液，加入不同浓度的FITC标记的TMVP1及对照肽(错序肽)，同时设PBS作为阴性对照；
④PBS清洗3次，每次3min；
⑤弃去孔内液体，DMSO溶解20min，检测FITC的吸光度值。
(二)TMVP1在体外对淋巴管内皮细胞LEC的靶向识别效应研究
1.通过化学方法合成TMVP1多肽，并且在N端以FITC修饰，简称为FITC-TMVP1，为使多肽的构象更加稳定，在TMVP1的N端和C端分别加连一个半胱氨酸和一个甘氨酸，两个半胱氨酸氧化成二硫键形成环肽结构。
2.将多肽的氨基酸序列进行重排，以及形成相同的环肽结构，同时N端加FITC修饰，简称FITC-对照肽，以此肽作为阴性对照的多肽。
3.HLEC生长至90％融合度时消化传代，在预先准备好的12孔板的载玻片上滴加HLEC细胞，过夜培养，待细胞贴壁并长至50％融合度。
4.更换培养基，每孔加入ECM培养基1ml，FITC修饰的多肽溶液1μl，在37℃避光继续培养4小时。
5.吸弃培养基，并用细胞用的PBS轻柔漂洗5次，每次3分钟，取出细胞爬片避光晾干，从-20℃冰箱取出的冰无水乙醇∶丙酮(1∶1)固定液固定爬片10分钟，再以PBS洗3次。
6.以抗荧光淬灭封片液或者甘油封片，激光共聚焦显微镜观察拍照。
以上实验在相同的条件下重复3次。
实验结果显示，激光共聚焦显微镜观察拍照。可见FITC-TMVP1与LEC细胞结合，显示强胞浆及膜荧光染色；而TMVP1相同的氨基酸序列随意重新排列后相应的错序肽与LEC细胞无结合，仅可见一些背景染色(如图1所示)；实验结果表明，TMVP1肽特异性的与人淋巴管内皮细胞相结合。
(三)TMVP1在体内对肿瘤及新生淋巴管靶向识别效应研究
1.利用小鼠乳腺癌原位移植模型验证TMVP1对肿瘤及新生淋巴管的靶向性
①培养扩增人乳腺癌细胞MDA-MB-231，加入1.5m10.25％的胰酶，室温消化2分钟，或置于37℃培养箱内；收集后重悬计数；
②随后加入5-7ml的无血清培养基终止消化，并将细胞悬液转到15ml离心管中；
③室温800rpm离心5分钟，吸弃培养基加入新的无血清培养基重悬后计数；
④配成100μl含1×106-1×107个细胞悬液；
⑤在4-5周龄BALB／C-nu的小鼠乳腺皮下脂肪垫处，注射入100μl细胞悬液；
⑥注射完毕后，与小镊子夹住注射点数秒，防止细胞漏出
⑦每3天观察测量肿瘤大小，并作记录；
⑧待小鼠肿瘤生长至0.5-1.0cm时，在乳腺癌荷瘤小鼠尾静脉注入10mM FITC-TMVP160μl-100μl，并于不同时段将小鼠快速处死后，用10ml注射器在左心室注射5mlPBS冲洗后，随后取小鼠的肿瘤组织行快速冰冻切片；
⑨在观察前，先用冰无水乙醇∶丙酮(1∶1)固定切片，置于荧光显微镜观察拍照后，再行下一步的血管淋巴管相关标记物的染色。游离的FITC作为阴性对照，FITC标记的错序肽作为阴性对照肽，每实验组设小鼠3只。
2.小鼠角膜微袋肿瘤模型进一步验证TMVP1对不同肿瘤及新生淋巴管的靶向性
①先在雌性C57BL／6小鼠大腿内侧，注射1×106的TC-1细胞，待肿瘤生长至7-8mm时，将小鼠处死后取下新鲜肿瘤组织(原位移植的瘤源)，置于装有无菌生理盐水的小皿中，在无菌条件下分离瘤体，将肿瘤组织剪切成体积约0.4mm3的小块；
②准备要进行实验的C57BL／6小鼠，接下来就是要麻醉好小鼠，在待手术的小鼠腹腔注射70～100μl3％的戊巴比妥钠麻醉后；
③将麻醉好的小鼠固定在显微镜载物台上，于眼睛局部用一滴速眠新作角膜局麻，并静止20～30秒；
④用眼科弯镊固定小鼠眼球，确保眼角的皮肤在镊子和眼球之间，避免损伤角膜及周围的软组织；
⑤使用角巩膜切开刀，先在小鼠眼球下方距离角巩缘约1mm的免膜上切开一约0.7mm的横向切口，然后换用尖刀沿着切口轻轻纵向分离进入角膜实质层，制作一约1.2mm左右；
⑥通过手术将上述预先准备好的移植瘤源小块接种至上述角膜微袋内；
⑦移植手术完毕后，每天滴氯霉素眼药水于眼睛手术的局部预防感染；
⑧移植后第7天后，将小鼠麻醉后置于体式显微镜下观察拍照；
⑨并于第7天、14天分别在荷瘤小鼠尾静脉注入10mMFITC-TMVP1100μl～120μl，体内循环16-24h后，再于体式荧光显微镜下观察照相拍照；初步观察多肽在角膜的肿瘤内靶向分布情况；
⑩观察毕迅速取出局部角膜组织，2％-4％的多聚甲酵4℃避光固定过夜，免疫荧光对相关的脉管抗体进行染色后，激光共聚焦显微镜下观察。
3.斑马鱼显微注射
①琼脂板的制备：在确定显微注射前，琼脂糖粉剂用专门培养液Egg Water溶解，并配制成1.5％的琼脂糖液后，于微波炉中加热煮沸后室温稍冷却，缓慢倒入预先准备好的干净方形培养皿中，在皿的底部先倒入一层约0.1cm的琼脂糖液，待其凝固后，再继续倒入直至培养皿高度的2／3处，在胶的表面将准备好的焦卵板校具放入，放入过程应小心注意防止产生气泡。室温待琼脂糖溶液完全凝固后，将鱼卵模具小心的取出，所形成的胶板即为鱼卵注射槽，4℃冰箱保存备用。
②斑马鱼交配：在用鱼的前一天傍晚，将原先分缸喂养的处于性成熟期的雄性、雌性斑马鱼，中间以隔板隔开并配对放入有网箱的交配缸中，此时应将将交配缸避光遮盖过夜。次日，准备好显微注射相关工作后，掀掉遮盖布，在光照刺激五分钟后，取下交配缸中的中间挡板，两鱼会面后进行交配产卵，收聚胚胎用于注射。
③毛细管注射针的准备：带内糟的毛细管由拉针仪拉出注射粗细合适的针尖，并在体视显微镜下观察并用刀片切出整齐平滑而大小合适的针尖口。每管中加入2-3μl的FITC标记的多肽溶液。在显微注射仪装好玻璃显微注射针，收集发育时期处于24～48hpf期的斑马鱼胚胎，将鱼卵置于琼脂板的凹槽中并按顺序排放整齐；为便于注射的操作，在显微镜下用牙科细小探针把胚胎排成相同的方向，加入少许的培养液以保证同时在凹槽中胚胎湿润。调好注射仪的注射压和平衡压，将装有胚胎的琼脂板置于显微镜下，在胚胎的细胞或鱼的卵黄囊内通过显微镜把显微注射针内的溶液注入，每个胚胎的注射量大约为2nl。
4.应用斑马鱼模式生物进一步验证多肽在新生淋巴管靶向性的初步效应
①收集斑马鱼所产的卵，置于装有Egg water小培养皿中28.5℃培养，死亡的胚胎随后在普通体视显微镜下观察并将其丢弃。依据实验的目的收聚不同时相的胚胎并行一定的处理；
②本研究主要是对多肽在斑马鱼体内及脉管的靶向分布情况进行初步验证，待24hpf后收集鱼卵，将鱼卵置于12孔板中，每孔约15-20枚鱼卵；
③在48hpf斑马鱼的培养液中加入不同浓度的FITC-TMTT2，继续培养24h后荧光显微镜下观察多肽的分布；
④在3dpf后的胚胎经过发育已自行破膜而出了，待鱼卵自然完全破膜后，更换孔板内的培养液，通过显微注射的方法注入不同浓度的FITC-多肽溶液，继续培养不同时间点观察多肽的分布，分别显微镜下观察、拍照；
⑤本实验是要收集胚胎进行加药处理后观察发育及脉管生成的变化，所以在24hpf时候开始将培养液更换为含有0.003％2-苯硫脲(phenylthiourea，PTU)的Egg water来抑制黑色素的形成，这样斑马鱼的躯体没有黑色素沉积，能保持胚胎较透明的状态并且以便进一步清晰观察发育及形态的变化；
⑥记录不同时间点的斑马鱼发育的形态及脉管的发育情况。
5.荧光体视显微镜观测照相
Tg(flkl：EGFP)为转基因的带有绿色荧光的斑马鱼，可以采用荧光体视显微镜进行观测，照相观察前先用三卡因对斑马鱼胚胎进行麻醉，在高清透明的载玻片上滴加适量的3％甲基纤维素，鱼卵置于3％的甲基纤维素上，摆好照相所需的体位，调整光圈进行观测照相。
6.切片的HE染色
7.切片的免疫荧光
①冰冻组织切片用固定液(冷丙酮∶乙醇为1∶1)-20℃固定10-15min；
②PBS洗3次，血清封闭30分钟，吸取去不洗；
③加入兔单克隆抗LYVE1、CD31抗体(工作效价1∶100)，置于湿盒内4℃冰箱过夜；
④次日PBS洗3次后，加荧光素Cy3标记的二抗(工作效价1∶50)，避光后，置于湿盒内37C温育30分钟；PBS洗3次。
⑤复染胞核：将玻片置于适当比例(1∶1000)DAP1染液，避光于黑暗湿盒20min；PBS洗3次，每次5min。
⑥脱水，烘干，防荧光退灭剂或碳酸钠缓冲甘油封片。实验同时设PBS代替一抗的阴性对照。
⑦在激光共聚焦显微镜成像系统下成像。
实验结果显示：
1.利用小鼠乳腺癌原位移植模型验证TMVP1对肿瘤及新生淋巴管的靶向性
在FITC-TMVP1组的肿瘤组织及脉管内可见绿色荧光的表达，而在对照组只可见些许的背景荧光；进一步的免疫荧光方法对组织进行脉管的标记染色，可见到LYVE1与VEGFR-3阳性的区域也有绿色荧光的表达，如图2所示；另外，如图2所示，在组织切片行血管的特异性标记物CD34染色发现，CD34阳性的区域没有多肽及LYVE1的染色。
2小鼠角膜微袋肿瘤模型进一步验证TMVP1对肿瘤及新生淋巴管的靶向性
如图3所示，肿瘤的微袋角膜内可见很强的荧光积聚，而在没有任何处理的角膜则只有背景荧光表达；在体观察照相完毕，后然后迅速取出局部角膜组织，2％-4％的多聚甲醛4C避光固定过夜，免疫荧光方法对全角膜进行淋巴管特异标抗体LYVE1标记及血管内皮标记抗体CD34等相关的脉管进行染色，激光共聚焦显微镜下观察。结果显示，在LYVE1的染色脉管上也可以见到绿色荧光的表达，如图3所示。
3.应用斑马鱼模式生物进一步验证多肽在新生淋巴管靶向性的初步效应
如图4所示，在斑马鱼胸导管发育的部位(箭头所指细小管道)有明显的荧光表达；而在胸导管下方的荧光考虑为多肽经斑马鱼消化道及排泄管所致；在48hpf斑马鱼的培养液中加入不同浓度的FITC-TMVP1，继续培养24h后荧光显微镜下观察也有类似的多肽荧光分布。
(四)TMVP1-DKK的肿瘤靶向治疗及淋巴管新生的靶向阻遏作用
1.体外淋巴管成管及发芽试验验证TMVP1-DKK对淋巴管新生的影响
①准备Matrigel：在培养的前一天，将Matrigel从-20℃冰箱取出置于4℃冰箱过夜。
②准备细胞：收获处于分裂期HLEC。
③取60ul的Matrigel：ECM按1∶4混匀后加到96孔板中，37℃作用30min，使胶凝固；每孔加入约1×104个LEC于胶表面。
④加入不同浓度的TMVP1-DKK、TMVP1及rhVEGF-C融合蛋白，置37℃、5％C02培养箱中孵育培养4h-8h，期间倒置显微镜观察并拍照记录。
⑤6h后，胶原胶固定于2.5％戊二酵，显微镜下观察计算形成的管状结构。
淋巴内皮细胞分别分为：空对照组、rhVEGF-C融合蛋白5ng／ml、rhVEGF-C+TMVP1-KLA组及TMVP1-KLA组；实验重复三次。ImagePro Plus5.0软件分别计算体外成管试验中管样结构的长度。
2.小鼠乳腺癌原位移植模型验证多肽对肿瘤及新生淋巴管生长的影响
①培养扩增人乳腺癌细胞MDA-MB-231，加入1.5m10.25％的胰瞎，室温消化2分钟，或置于37℃培养箱内；收集后重悬计数；
②随后加入5-7ml的无血清培养基终止消化，并将细胞悬液转到15ml离心管中；
③室温800rpm离心5分钟，吸弃培养基加入新的无血清培养基重悬后计数；
④配成100ul含1×106-1×107个细胞悬液；
⑤在4-5周龄BALB／c-nu的小鼠乳腺皮下脂肪垫处，注射入100ul细胞悬液；
⑥注射完毕后，与小镊子夹住注射点数秒，防止细胞漏出
⑦细胞移植后第3天开始每3天观察测量肿瘤大小，并作记录；将小鼠分成两组，每组6只；
⑧第五天开始每隔一天腹腔注射100uM的TMVP1-DKK多肽及无菌水，每次注射前有游标卡尺测量瘤体大小及天平测量小鼠的体重，并做好标记和记录，按(长×宽)2／2计算瘤体大小；
⑨治疗3周以后，取对照组及治疗组的小鼠测量瘤体大小，照相后将小鼠处死并取下原位瘤体，再次测量瘤体的大小称重；
⑩取下的瘤体分别给予快速冰冻切片及固定后行石蜡切片，通过免疫组化对相应的血管及淋巴管进行染色；观察治疗前后肿瘤的变化及淋巴管数目的改变；再行进一步的分析统计；
3.角膜肿瘤模型验证多肽对肿瘤及新生淋巴管的抑制效应
①先在雌性C57BL／6小鼠大腿内侧，注射1×106的TC-1细胞，待肿瘤生长至7-8mm时；
②将小鼠处死后取下新鲜肿瘤组织(原位移植的瘤源)，置于装有无菌生理盐水的小皿中，在无菌条件下分离瘤体，将肿瘤组织剪切成体积约0.4mm3的小块；
③准备要进行实验的C57BL／6小鼠，接下来就是要麻醉好小鼠，在待手术的小鼠腹腔注射70ul～100ul3％的戊巴比妥钠麻醉后；
④将麻醉好的小鼠固定在显微镜载物台上，于眼睛局部用一滴速眠新作角膜局麻，并静止20～30秒；
⑤用眼科弯镊固定小鼠眼球，确保眼角的皮肤在镊子和眼球之间，避免损伤角膜及周围的软组织；
⑥使用角巩膜切开刀，先在小鼠眼球下方距离角巩缘约1mm的角膜上切开一约0.7mm的横向切口，然后换用尖刀沿着切口轻轻纵向分离进入角膜实质层，制作一约1.2mm左右的切口；
⑦通过手术将上述预先准备好的移植瘤源小块接种至上述角膜微袋内；角膜微袋制作及瘤源组织移植如图1所示；
⑧移植手术完毕后，每天滴氯霉素眼药水于眼睛手术的局部预防感染；
⑨移植第3天开始，将小鼠麻醉后置于体式显微镜下观察照相拍照；将移植后的小鼠分成两组，每组6只；
⑩并第四天开始每隔一天尾静脉注射150uM的TMVP1-DKK多肽及无菌水，于第14天、21天分别再于体式显微镜下观察照相拍照；初步观察多肽治疗后对角膜移植肿瘤及脉管的变化情况；体式显微镜下观察照相拍照后，迅速取出局部角膜组织，2％-4％的多聚甲酸4℃固定过夜，行切片免疫组化对相关的脉管抗体进行染色后，正置显微镜观察照相。
4.斑马鱼模式生物进一步验证多肽对新生淋巴管靶向阻遏效应
①收集斑马鱼所产的卵，置于装有Egg water小培养皿中28.5℃培养，随后在普通体视显微镜下观察并将死亡的胚胎丢弃。依据实验的目的收聚不同时相的胚胎并行一定的处理；
②本研究主要是对多肽在斑马鱼体内及脉管的靶向分布情况进行初步验证，待24hpf后收集鱼卵，将鱼卵置于12孔板中，每孔约15-20枚鱼卵；
③本实验是要收集胚胎进行加药处理后观察发育及脉管生成的变化，所以在24hpf时候开始将培养液更换为含有0.003％2-苯硫脲(phenylthiourea，PTU)的Egg water来抑制黑色素的形成，这样躯体没有黑色素沉积，能保持胚胎较透明的状态并且以便进一步清晰观察发育及形态的变化；
④在2dpf后的胚胎经过发育已慢慢自行破膜而出了，在2dpf、3dpf、4dpf分别更换孔板内的培养液，移液器定量后，加入不同浓度的TMVP1-DKK、TMVP1；
⑤轻轻摇匀后，再将孔板置于28.5℃的培养箱中继续培养；
⑥本实验是对胚胎进行加药处理后观察发育及脉管生成的变化，在培养过程中分别在加药后24h、48h、72h三个时间点观察，由于在5pdf后淋巴管已经完全发育成熟，所以只观察到5dpf，在此期间分别显微镜下观察、拍照；
⑦记录不同时间点的斑马鱼发育的形态及脉管的发育情况，
5.荧光体视显微镜观测照相步骤
实验所用的斑马鱼为转基因的Tg(flkl：EGFP)带有绿色荧光的斑马鱼，在加药处理后可以采用荧光体视显微镜进行观测更加方便快捷，照相观察前先用三卡因对斑马鱼胚胎进行麻醉，在普通透明的载玻片上滴加3％的甲基纤维素，鱼卵置于3％的甲基纤维素上，摆好所需的体位，调整光圈进行观测照相。
实验结果显示：
1.TMVP1-DKK对体外新生淋巴管成管的影响
与淋巴内皮细胞空白组及rhVEGF-C阳性对照组对比，添加了TMVP1-DKK及TMVP1-DKK+rhVEGF-C组所形成的淋巴管新芽及管腔样结构明显减少，有的细胞只形成球形或者已经处于凋亡状态，对照组则没有类似的效应；对照组细胞形成的管腔样结构明显增多，而且随着培养时间的增加(8h)，这些管腔结果可以从各种不同方向形成互相连接，最后形成复杂的闭合的三维淋巴管网，经过ImageProPlus5.0软件分别计算体外成管试验中管样结构所占面积和长度，结果如图5所示(P<0.01)。
2.初步验证多肽TMVP1-DKK对斑马鱼脉管发育的影响
高浓度的多肽10μM、20μM对早期的胚胎发育的影响较大，以致于在等不到淋巴管观察的时间，斑马鱼便发生发育障碍或者死亡，而在2uM及5uM的浓度可见明显的斑马形态的变化，出现心包积液及胸导管分离的情况，如图6所示；整个鱼的发育过程没有很大的影响，在低浓度的处理后在荧光体式显微镜下进行淋巴管的观察，可以观察到淋巴管的生成受到抑制。正常未处理的鱼腹部可见三条管腔伴行，即位于上面的主动脉(DA)、最下方的后主静脉(PCV)及之间的淋巴管(LY)；淋巴管发育表现为中间的淋巴管发生缺陷，只可见两边的主动脉和腹主静脉。如图6所示：在6dpf的Tg(FLK1：GFP)胚胎中，在对照组高倍镜下可以观察到在主动脉和腹主静脉之间有一条沿主动脉分布的细小的不规则的管腔，即淋巴管(LY)，图6箭头所指部位；而在TMVP1-DKK处理组，可以见到心包腔部位已出现肿大的改变，高倍镜下观察只见主动脉和腹主静脉，并发现淋巴管缺如，没有形成连续的管腔，图6标记星号的部位。
3.多肽对小鼠角膜肿瘤及新生淋巴管的抑制效应
镜下可见，多肽处理组的小鼠角膜肿瘤明显小于对照组，如图7所示；免疫组化对淋巴管特异标抗体LYVE1标记及血管内皮标记抗体CD31进行染色；经分析，处理组的肿瘤组织内淋巴管的数目明显少于对照组，图7所示，而且治疗后的组织核排列紧密，管腔分布少，对照组的组织较为疏松，管腔结构较多。
4.多肽对乳腺原位肿瘤生长及新生淋巴管生成的作用
治疗3周后，TMVP1-DKK处理组的肿瘤体积及重量明显较对照组小，如图8所示；处理后小鼠肿瘤的组织切片行免疫组化染色，观察两组间组织内部淋巴管数目的差异，结果显示处理组LYVE1阳性管腔的染色明显较对照组少，差异有显著性，图8所示。
Claims (3)
1.一种特异性靶向肿瘤淋巴管的新型多肽，其命名为TMVP1，该多肽的氨基酸序列为LARGR，具备靶向恶性肿瘤内部淋巴管的特异性。
2.根据权利要求1所述的氨基酸序列LARGR作为引导肽在制备用于高表达VEGFR-3肿瘤及其转移灶的诊断标记物和治疗药物中的应用。
3.权利要求1所述的氨基酸序列LARGR作为引导肽在制备基因治疗载体中的用途。
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