CN105497896A - 一种肿瘤耐药的靶点及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肿瘤耐药的靶点及其应用，本发明中揭示了伏隔核1(NAC1)对肿瘤药物治疗的影响，并由此提供了NAC1抑制剂在降低或消除肿瘤化疗耐药性的药物中的用途、它作为肿瘤耐药标志物及其作为耐药肿瘤预测、诊断以及耐药肿瘤药物设计和筛选的靶点的应用。本发明为克服肿瘤耐药、提高疗效提供新的机理，为抗肿瘤耐药提供新的靶点。

Description

一种肿瘤耐药的靶点及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学和肿瘤防治领域，更具体而言，本发明涉及预测、诊断和治疗肿瘤耐药性领域。

背景技术

恶性肿瘤是危害人类健康的一类疾病，化疗是目前治疗恶性肿瘤的主要手段之一。然而，肿瘤对化疗药物产生耐药性已成为影响肿瘤治疗效果的一大障碍。对肿瘤耐药发生机制的研究和寻找开发逆转耐药的药物是当前肿瘤防治研究领域的重点和难点。

BTB/POZ家族基因NACC1基因编码细胞转录因子NAC1(nucleusaccumbens-1，伏隔核1)的表达，其定位于人染色体区Ch19p13.2。NAC1在多种肿瘤中(例如卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、乳腺癌和结肠癌等)过表达NAC1。BTB结构域(也称为POZ结构域)是介导蛋白相互作用的重要结构域，NAC1的BZB结构域(1-129氨基酸序列)是形成NAC1二聚体复合物所必需的，形成的NAC1二聚体复合物可以参与多种生物功能调控：例如基因转录调控、泛素途径的蛋白降解、细胞形态、增殖和凋亡等等。

为了逆转肿瘤耐药，提高化疗疗效，本领域迫切需要通过多种方式研究肿瘤耐药发生的机制、肿瘤耐药的关键基因靶点，并根据这些靶点设计治疗肿瘤耐药的新药，从而引导肿瘤耐药靶向性治疗。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有肿瘤药物及其应用中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明的一个目的是提供一种肿瘤耐药的关键基因靶点及蛋白靶点，为逆转肿瘤耐药、提高化疗疗效提供更为有效的工具。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种肿瘤耐药的靶点，其所述靶点为核转录因子伏隔核1和/或其参与的自噬途径。

本发明的另一个目的是提供一种伏隔核1抑制剂在降低和/或消除肿瘤治疗中的耐药性的药物中的应用。

作为本发明所述伏隔核1抑制剂在降低和/或消除肿瘤治疗中的耐药性的药物中的应用的一种优选方案，其中：所述伏隔核1抑制剂包括：抗伏隔核1的抗体、针对伏隔核1编码序列的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、伏隔核1介导的自噬途径抑制剂。

作为本发明所述伏隔核1抑制剂在降低和/或消除肿瘤治疗中的耐药性的药物中的应用的一种优选方案，其中：所述抗伏隔核1的抗体包括：对抗伏隔核1或其活性片段具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体。

作为本发明所述伏隔核1抑制剂在降低和/或消除肿瘤治疗中的耐药性的药物中的应用的一种优选方案，其中：所述抗伏隔核1的抗体还包括具有免疫活性的抗体片段。

作为本发明所述伏隔核1抑制剂在降低和/或消除肿瘤治疗中的耐药性的药物中的应用的一种优选方案，其中：所述具有免疫活性的抗体片段包括：Fab'或(Fab)2片段、抗体重链、抗体轻链、遗传工程改造的单链Fv分子或嵌合抗体。

本发明的还一个目的是提供一种药物组合物，其包括：如权利要求2所述的伏隔核1抑制剂以及药学上能够接受的载体。

作为本发明所述药物组合物的一种优选方案，其中：所述药学上能够接受的载体包括：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇中的一种或几种。

本发明的再一个目的是提供一种筛选抗耐药的肿瘤治疗药物的方法，其包括：提供表达伏隔核1的肿瘤细胞系、肿瘤培养物或荷瘤动物；将候选药物与提供的所述肿瘤细胞系、肿瘤培养物或荷瘤动物接触，作为给药组；检测给药组中伏隔核1的表达水平，并与未给予候选药物的对照肿瘤细胞系、肿瘤培养物或荷瘤动物的NAC1表达水平进行比较，如果检测结果显示，给药组伏隔核1的表达水平显著低于对照组，则表明该候选药物是抗耐药的肿瘤治疗药物。

本发明的有益效果：

(1)揭示了NAC1与肿瘤耐药性之间的关系，为设计和筛选耐药肿瘤药物提供了新的途径和靶点；

(2)提供了通过抑制NAC1及其相关信号传导途径来提高肿瘤对肿瘤治疗的敏感性的新方法，从而起到了提高肿瘤治疗效果、减少肿瘤治疗剂用量、缓解患者痛苦的积极作用，具有临床的实用性。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施方式对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

本发明中提供了一种新的肿瘤耐药标志物：在肿瘤组织中高表达并导致肿瘤耐药的核转录因子伏隔核1(nucleusaccumbens-1，NAC1)，将该蛋白作为靶点，可设计出针对该蛋白及其相关分子的预测、诊断肿瘤耐药试剂盒、筛选针对该蛋白及其相关分子的治疗肿瘤耐药的药物。

本发明的主要目的之一就是为了提供一种肿瘤耐药的关键基因靶点及蛋白靶点，为逆转肿瘤耐药、提高化疗疗效提供更为有效的工具。本发明的另一个主要目的是根据这些靶点设计预测、诊断肿瘤耐药试剂盒、筛选针对该蛋白及其相关分子信号通路的治疗肿瘤耐药的药物。本发明的目的之一是提供一种逆转肿瘤耐药的关键靶点NAC1，针对该靶点及其相关信号通路，如自噬激活抑制剂，设计药物和治疗方案，下调肿瘤中NAC1表达或抑制其功能，能够有效治疗耐药肿瘤。

在本发明的一个实施方式中，所述NAC1来自人或其它真核生物，例如小鼠、大鼠、牛或猴等，且它们之间具有高度的保守性。

在本发明的一个实施方式中，所述抑制剂选自:抗NAC1的抗体、针对NAC1编码序列的RNA干扰分子或反义寡核苷酸。

在另一个优选例中，所述NAC1相关信号通路抑制剂选自：自噬抑制剂氯喹。

在本发明的另一个实施方式中，所述抑制剂是选自下组的RNA干扰分子:shRNA、siRNA、miRNA或dsRNA，更优选这些RNA干扰分子是针对NAC1序列的干扰分子，更优选所述shRNA的序列为：GAGGAAGAACUCGGUGCCCUUCUCCAU。

在本发明的另一个实施方式中，所述肿瘤选自:卵巢癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、乳腺癌、、乳腺癌、结肠癌、优选卵巢癌。

在本发明的另一个实施方式中，所述肿瘤治疗所采用的治疗剂选自:烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、植物类抗癌药或免疫制剂。

在一个优选例中，所述治疗剂选自：顺铂、卡铂、环磷酰胺、氮烯咪胺、异环磷酰胺、盐酸氮芥/苯丙氨酸氮芥、5-氟脲嘧啶、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、环胞苷、博来霉素、更生霉素、红必霉素、阿霉素、黄胆素、长春碱、长春新碱、三尖杉酯碱、足叶乙甙、门冬酰胺酶、维甲酸。

在另一个优选例中，所述治疗剂优选为铂类药物：顺铂或卡铂。

在本发明的第二方面中，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含:

(i)NAC1抑制剂；

(ii)肿瘤治疗剂；

(iii)药学上可接受的载体或赋形剂。

在一个优选例中，所述肿瘤治疗剂是化疗剂。

在本发明的第三方面中，提供了一种药盒，所述药盒包含:

(A)容纳有NAC1抑制剂的容器；

(B)容纳肿瘤治疗剂的容器和(C)使用说明书。

在一个优选例中，本发明的药物组合物或药盒中所包含的抑制剂选自:抗NAC1的抗体、针对NAC1编码序列的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、自噬抑制剂氯喹。

在另一个优选例中，本发明的药物组合物或药盒中所包含的抑制剂为选自下组的RNA干扰分子:shRNA、siRNA、miRNA或dsRNA，优选为shRNA或siRNA，更优选序列为针对NAC1的26个碱基序列：GAGGAAGAACUCGGUGCCCUUCUCCAU。

在另一个优选例中，所述的自噬抑制剂氯喹作用于NAC1介导的自噬激活信号通路

在另一个优选例中，所述肿瘤选自卵巢癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、乳腺癌、结肠癌，更优选卵巢癌。

在另一个优选例中，所述治疗剂选自:铂类、顺铂、卡铂、环磷酰胺、氮烯咪胺、异环磷酰胺、盐酸氮芥/苯丙氨酸氮芥、5-氟脲嘧啶、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、环胞苷、博来霉素、更生霉素、红必霉素、阿霉素、黄胆素、长春碱、长春新碱、三尖杉酯碱、足叶乙甙、门冬酰胺酶、维甲酸。

发明人通过长期而深入的研究发现：NAC1在多种妇科肿瘤组织中高表达，并通过体内、体外实验证实了NAC1是肿瘤发生化疗抵抗的关键分子。过表达的NC1可优先启动一系列抗凋亡生物过程，抑制细胞凋亡，引起肿瘤耐药。采用诸如RNA干扰的方法下调NAC1表达，或转染无NAC1功能的NAC1突变体，可降低或消除肿瘤的耐药性。在此基础上，本发明人完成了本发明。

本发明中首次揭示了NAC1是一种肿瘤耐药相关蛋白，其在肿瘤组织中异常高表达，优先启动一系列抗凋亡蛋白过程，抑制细胞凋亡，引起肿瘤耐药。

基于本发明的上述发现，本领域普通技术人员可将NAC1或其参与的自噬途径作为靶点，设计或筛选抗耐药的肿瘤药物。例如，本领域普通技术人员可根据已知的NAC1序列设计或筛选出NAC1的抑制剂，将其与化疗药物共同给予肿瘤患者，从而改善肿瘤对治疗药物的耐药性、提高肿瘤治疗的成功率、减少肿瘤治疗药物的用量、以及减轻患者的痛苦。

NAC1抑制剂包括但不限于：抗NAC1的抗体、针对NAC1编码序列的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、NAC1介导的自噬途径抑制剂。例如本发明实施例中所提供针对NAC1的26个碱基序列：GAGGAAGAACUCGGUGCCCUUCUCCAU。

本发明的抑制剂包括对NAC1或其活性片段具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab'或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体,如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。

就siRNA而言，随着siRNA研究的深入，已有公司可商业化提供siRNA的设计和合成服务。

显然，通过上述的商业途径和服务，本领域研究人员只需提供靶基因序列，就可以获得高质量的siRNA。

此外，本领域普通技术人员也可采用本领域中已知的方法和软件来自行设计和筛选siRNA。

因此，只要本领域普通技术人员获知了靶基因NAC1的序列，他们就可以通过商业途径很容易地获得针对该靶基因的小分子干扰RNA，也可以根据本领域中已知的原理，采用已知的软件和方法来获得具有抑制作用的小分子干扰RNA。

本发明提供了一种药物组合物，它含有有效量的所述NAC1抑制剂，以及药学上可接受的载体。本发明的药物组合物可用于通过抑制NAC1的表达或与自噬抑制剂结合，改善肿瘤耐药性，提高肿瘤治疗药物在肿瘤治疗中的有效性。

本发明的药物组合物中药学上可接受的载体，包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。

本发明药物组合物中抑制剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：本发明抑制剂配合使用的肿瘤治疗剂的种类和用量；抑制剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

本发明药物组合物的给药方式没有特别的限制，可以是全身的或局部的。优选的，本发明的药物组合物可通过静脉注射的方式给予对象。当所述抑制剂为RNA或寡核苷酸时，也可采用基因治疗的手段进行给药，比如可直接将抑制剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带蛋白质或多肽类抑制剂的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性抑制剂蛋白。

可将肿瘤治疗药物与本发明的抑制剂配制在同一药物组合物中，或以单独的形式提供于药盒中。优选肿瘤治疗药物与本发明的抑制剂在联合使用时可产生协同效果，例如针对NAC1的shRNA与顺铂的联合使用可对卵巢癌治疗产生协同作用。本领域普通技术人员可根据本发明中的常规手段(例如参考本发明实施例中所揭示的方法)对这些组合进行筛选。

筛选抗耐药的肿瘤治疗药物的方法：

本发明中还提供了一种以NAC1为靶点，筛选抗耐药的肿瘤治疗药物(例如肿瘤治疗药物)的方法，所述方法包括:

(a)提供表达NAC1的肿瘤细胞系、肿瘤培养物或荷瘤动物；

(b)将候选药物与步骤(a)中提供的肿瘤细胞系、肿瘤培养物或荷瘤动物接触，作为给药组；

(C)检测给药组中NAC1的表达水平，并与未给予候选药物的对照肿瘤细胞系、肿瘤培养物或荷瘤动物的NAC1表达水平进行比较；如果检测结果显示，给药组NAC1的表达水平显著低于对照组，则表明该候选药物是抗耐药的肿瘤治疗药物。

本发明的方法可用于从化合物库中筛选出针对肿瘤的非耐药性抗肿瘤药物，可作为化合物筛选评估的一个重要指标。本发明的方法也可用于临床中对肿瘤患者的个性化治疗的预测和诊断中，筛选出针对个体具有最佳肿瘤治疗效果的抗肿瘤药物。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (9)

1.一种肿瘤耐药的靶点，其特征在于，所述靶点为核转录因子伏隔核1和/或其参与的自噬途径。

2.一种伏隔核1抑制剂在降低和/或消除肿瘤治疗中的耐药性的药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的伏隔核1抑制剂在降低和/或消除肿瘤治疗中的耐药性的药物中的应用，其特征在于，所述伏隔核1抑制剂包括：抗伏隔核1的抗体、针对伏隔核1编码序列的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、伏隔核1介导的自噬途径抑制剂。

4.根据权利要求3所述的伏隔核1抑制剂在降低和/或消除肿瘤治疗中的耐药性的药物中的应用，其特征在于，所述抗伏隔核1的抗体包括：对抗伏隔核1或其活性片段具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体。

5.根据权利要求4所述的伏隔核1抑制剂在降低和/或消除肿瘤治疗中的耐药性的药物中的应用，其特征在于，所述抗伏隔核1的抗体还包括具有免疫活性的抗体片段。

6.根据权利要求5所述的伏隔核1抑制剂在降低和/或消除肿瘤治疗中的耐药性的药物中的应用，其特征在于，所述具有免疫活性的抗体片段包括：Fab'或(Fab)2片段、抗体重链、抗体轻链、遗传工程改造的单链Fv分子或嵌合抗体。

7.一种药物组合物，其特征在于，包括：如权利要求2所述的伏隔核1抑制剂以及药学上能够接受的载体。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药学上能够接受的载体包括：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇中的一种或几种。

9.一种筛选抗耐药的肿瘤治疗药物的方法，其特征在于，包括：

提供表达伏隔核1的肿瘤细胞系、肿瘤培养物或荷瘤动物；

将候选药物与提供的所述肿瘤细胞系、肿瘤培养物或荷瘤动物接触，作为给药组；

检测给药组中伏隔核1的表达水平，并与未给予候选药物的对照肿瘤细胞系、肿瘤培养物或荷瘤动物的NAC1表达水平进行比较，如果检测结果显示，给药组伏隔核1的表达水平显著低于对照组，则表明该候选药物是抗耐药的肿瘤治疗药物。