CN108992440A - 去甲斑蝥素在制备治疗破骨细胞过度激活相关疾病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了本发明提供的去甲斑蝥素在制备治疗破骨细胞过度激活相关疾病药物中的应用。相对于现有技术，本发明提供了去甲斑蝥素治疗破骨细胞过度激活相关疾病的新用途，去甲斑蝥素可通过下调p‑ERK和p‑p38的磷酸化水平，进而抑制破骨细胞的分化过程，表明去甲斑蝥素能够治疗破骨细胞过度激活相关疾病。
Description
技术领域
本发明涉及去甲斑蝥素的新应用，特别涉及去甲斑蝥素在制备治疗破骨细胞过度激活相关疾病药物中的应用。
背景技术
破骨细胞是细胞内唯一的“噬骨”细胞。该细胞属于高度分化的多核细胞，直径可达100μm。活化的破骨细胞具有明显极化特性，破骨细胞极化时细胞核向细胞顶端移动，该侧在骨表面的对侧，称为基侧膜，同时在贴近骨表面的一侧其细胞膜会折叠形成大量的微细的指状突出，称为皱褶缘，它可以增加该侧细胞膜的表面积以便细胞向骨表面释放大量的降解酶和酸性质粒。位于破骨细胞皱褶缘的外围有一个封闭带，它能够紧紧的吸附在骨表面，将细胞覆盖的骨表面区域包括皱褶缘在内的区域封闭起来形成一个密闭的微环境，从而构成一个有利于骨吸收的局部密闭腔隙。在生理状况下，破骨细胞引发的骨吸收与成骨细胞引起的骨形成共同维持着骨代谢稳态。当破骨细胞功能过度活跃时，骨吸收亢进，将会导致一系列骨吸收过度活跃所致疾病，如骨质疏松症、骨溶解、类风湿性关节炎、骨关节炎、骨髓炎、牙周炎、多发性骨髓瘤、Paget’s病、恶性肿瘤的高钙血症、成骨不全、牙槽骨缺失、免疫抑制治疗或长期使用糖皮质激素的引起的骨质丢失等。靶向抑制破骨细胞的活性和功能是治疗此类疾病最有效的策略之一。目前针对临床上常用的抑制破骨细胞过度激活的药物主要包括双膦酸盐(Bisphosphonate)、雌激素(Estrogen)及其受体调节剂(SERMs)、降钙素(Calcitonin)等，其中双膦酸盐类药物应用最广泛。已有的这些药虽然有一定效果，但仍有不同程度的局限，比如唑来膦酸(双膦酸盐类)可能会引发肾毒性和心脏毒性等副作用；迪诺塞麦(Denosumab)长期使用可能对免疫系统功能产生潜在影响，且价格昂贵，并不适用于大多数家庭。因此研发更为经济且副作用小的药物是必不可少的。
斑蝥素(Cantharidin，CTD)是从鞘翅目芫著科昆虫斑蝥中提取的有效成分，对肝癌、肺癌、食管癌、结肠癌等有一定的治疗效果，但是对泌尿系统有较强的刺激作用，去甲斑蝥素(Norcantharidin，NCTD)是将斑蝥素去1、2位甲基去除后人工合成的，同样具有抗癌作用，但其副作用相对于斑蝥素较低，已有文献报道去甲斑蝥素具有抑制肿瘤血管生成和抗骨髓瘤的作用，但其对破骨细胞的影响尚未见任何报道。
发明内容
发明目的：为解决上述技术问题，本发明目的在于提供了去甲斑蝥素(NCTD)制备治疗破骨细胞过度激活相关疾病药物中的应用。
技术方案：本发明提供了去甲斑蝥素在制备治疗破骨细胞过度激活相关疾病药物中的应用。
所述破骨细胞过度激活相关疾病为骨质疏松症、骨溶解、类风湿性关节炎、骨关节炎、骨髓炎、牙周炎、多发性骨髓瘤、Paget’s病、恶性肿瘤的高钙血症、成骨不全、牙槽骨缺失、免疫抑制治疗或长期使用糖皮质激素的引起的骨质丢失。
所述去甲斑蝥素能够通过下调p-ERK和p-p38的磷酸化水平抑制MAPK信号通路。
所述药物是以所述去甲斑蝥素作为单一成分所制成的药物。
所述药物是以所述去甲斑蝥素作为活性成分，加上药学上可接受的辅料所制成的药物。
所述药物选自注射剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊或口服液所述药物选自注射剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊或口服液，但不限于上述剂型。
本发明所述去甲斑蝥素在治疗破骨细胞过度激活相关疾病时，可以单独使用，也可以与其他药物配合同时使用，或者与其他药物一起制成复方制剂使用，都可以达到治疗类风湿性关节炎的目的。
本发明在制备不同剂型时加入所需的各种常规辅料(即药学上可接受的辅料)，例如稀释剂、黏合剂、崩解剂、助流剂、润滑剂、矫味剂、包合材料、吸附材料等以常规的制剂方法制备成任何一种常用的制剂，例如可以是注射剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、缓释剂等。
本发明明确了NCTD对破骨细胞分化的抑制作用，并进一步阐明了分子机制。结果显示，NCTD可通过下调p-ERK和p-p38的磷酸化水平，进而抑制破骨细胞的分化过程。这些结果强有力提示，NCTD对破骨细胞过度激活相关疾病(如骨质疏松症、骨溶解、类风湿性关节炎、骨关节炎、骨髓炎、牙周炎、多发性骨髓瘤、Paget’s病、恶性肿瘤的高钙血症、成骨不全、牙槽骨缺失、免疫抑制治疗或长期使用糖皮质激素的引起的骨质丢失等)具备潜在的治疗作用。
技术效果：相对于现有技术，本发明提供了去甲斑蝥素治疗破骨细胞过度激活相关疾病的新用途，NCTD可通过下调p-ERK和p-p38的磷酸化水平，进而抑制破骨细胞的分化过程，表明去甲斑蝥素能够治疗破骨细胞过度激活相关疾病。
附图说明
图1：去甲斑蝥素对BMMs细胞活性的影响。(A)去甲斑蝥素结构式。(B)NCTD(0μM、5μM、10μM、20μM、40μM、80μM、160μM、320μM)处理BMMs 48h后，检测OD 490mm。(C)NCTD对BMMs的半抑制浓度(显著性差异：*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001vs RANKL处理但NCTD未处理组)
图2：NCTD明显抑制破骨细胞分化(A,B)在96孔板中用含有RANKL、M-CSF和不同浓度的NCTD(0μM、1μM、2.5μM、5μM、10μM)诱导BMMs分化形成破骨细胞，并进行TRAP染色。(C)TRAP+阳性细胞计数(细胞核数量大于等于3)。(D)每个破骨细胞平均面积统计。(显著性差异：*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vs RANKL处理但NCTD未处理组)
图3：NCTD在破骨细胞形成早期发挥抑制作用。在破骨细胞形成的不同时间点用5μM NCTD处理细胞，TRAP染色后比较破骨细胞数目和面积。(A)各药物处理组TRAP染色代表性图片；(B)不同药物处理组破骨细胞数目和面积统计。(显著性差异：*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001vs Control)
图4：去甲斑蝥素对BMMs细胞凋亡影响。(A)BMMs分别用0μM、2.5μM、5μM和10μM的NCTD处理24h，Annexin V-FITC/PI染色检测细胞凋亡情况。
图5：NCTD能抑制破骨细胞形成过程中标志性基因的表达。分别用不同浓度NCTD处理细胞，RANKL诱导5天后提取总RNA，用Q-PCR检测CTSK(A)、CTR(B)、TRAP(C)、NFATc1(D)、c-Fos(E)表达量。(*P<0.05,**P<0.01和***P<0.001vs RANKL处理但NCTD未处理组)
图6：NCTD抑制RANKL刺激的MAPK信号通路激活(A)BMMs无血清饥饿3h，用不同浓度NCTD处理1h后，分别用RANKL(100ng/ml)刺激15min，提取细胞总蛋白，进行Western Blot检测。(B)实验重复3次后，对实验结果进行灰度分析。(显著性差异：*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001vs RANKL处理但NCTD未处理组)
具体实施方式
下面结合附图进一步描述本发明的技术解决方案。
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例
一、实验耗材
去甲斑蝥素(NCTD，纯度≥98％)，购自成都曼斯特公。α-MEM购自美国Gibco公司；胎牛血清购自美国Invitrogen公司；小鼠重组RANKL and M-CSF购自R&D公司；MTS试剂购自Sigma-Aldrich公司；Trizol试剂、PrimeScript反转录试剂以及SYBR Premix Ex Taq试剂购自日本TaKaRa公司；抗体p-ERK，p-p38，p-JNK，ERK，p38，JNK，IκBα和GAPDH购自Cellsignaling technology公司。抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒购自Sigma-Aldrich公司。
二、实验方法
2.1小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMM)的克隆和培养
颈椎脱臼法将8周C57BL/6小鼠处死，75％酒精浸泡消毒5min后，在超净工作台中分离小鼠两条股骨和胫骨，剔除多余组织，剪开股骨和胫骨两端，用1ml注射器吸取α-MEM细胞培养基，反复冲洗至骨髓腔发白。收集含有骨髓细胞的冲洗液，2000rpm离心5min后，用10ml含有M-CSF的α-MEM细胞培养基重悬细胞，接种于两个10cm培养皿中培养；待细胞贴壁换液，同时将未贴壁细胞用PBS清洗掉，继续培养2-3天后用于破骨细胞的诱导分化实验。
2.2 MTT法检测NCTD对细胞活力的影响
取对数生长期的BMM细胞，加入终浓度为0μM、5μM、10μM、20μM、40μM、80μM、160μM、320μM的NCTD，每个浓度设3个复孔，培养48h后用MTT比色法测定细胞活力。
2.3 NCTD对破骨细胞分化的影响
BMMs细胞计数后，按照8x103个/孔接种于96孔板中，细胞贴壁后加入含有RANKL(100ng/ml)、M-CSF(30ng/ml)和不同浓度NCTD(0μM、1μM、2.5μM、5μM、10μM)的培养基，诱导BMMs形成破骨细胞，在5-7天形成巨型泡状多核细胞后进行TRAP染色，统计每个浓度每个孔破骨细胞数量(细胞核数量≥3)和面积。
2.4 NCTD抑制破骨细胞分化的作用阶段
用5μM NCTD在不同的时间段处理BMMs细胞，探究NCTD在破骨细胞形成的哪个阶段产生抑制作用。药物处理时间段分别是：全程药物处理(5天)；早期药物处理(诱导前2天加药)；后期药物处理(诱导后3天加药)；药物预处理(RANKL刺激前12个小时加药处理)。对处理后的细胞进行TRAP染色，统计药物处理不同阶段破骨细胞数量(细胞核数量≥3)和面积。
2.5 NCTD对BMMs凋亡影响
不同浓度的NCTD(0μM、2.5μM、5μM、10μM)处理BMMs细胞48h后，收集细胞,根据Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(凯基公司，南京)说明书操作，采用流式细胞术检测NCTD对BMMs凋亡的影响。
2.6 Q-PCR检测破骨细胞分化标志性基因的表达
用不同浓度的NCTD、100ng/ml的RANKL和30ng/ml的M-CSF处理BMM细胞5天后，提取细胞总RNA，按照TaKaRa反转录试剂盒所给说明书进行逆转录。用TaKaRa(SYBR Premix ExTaq)试剂盒将体系所需引物、模板、酶和无RNA酶水加入八连管中，在实时定量PCR仪上进行检测。相关基因主要包括：CTSK、CTR、TRAP、NFATc1和c-Fos。
引物序列：
2.7 Western blotting检测蛋白表达
BMMs细胞分别不同浓度(0μM、2.5μM、5μM、10μM)的NCTD处理，加入RANKL刺激15min，收集细胞，加入预冷的细胞裂解液提取蛋白，用聚丙烯酰胺电泳分离蛋白，以GAPDH作为内参统计结果。
2.8数据统计
所有实验均重复3次以上，数据采用均数±标准差(mean±SD)表示，采用orign8.0、Image J等软件分析统计数据。用单因素(ANOVA)方差分析各组均数，用post hoc检验做两两比较，认为P<0.05为有统计学差异，P<0.01为显著差异，P<0.001为极显著差异。
四、实验结果
3.1对BMM细胞活性的影响
MTT法检测结果显示，从20μM开始，NCTD对BMMs活性开始有影响(图1B)。通过GraphPad Prism软件分析得出NCTD对BMMs半抑制浓度(IC50)为59.73μM(图1C)。本发明后续实验所用最高浓度为10μM。
3.2 NCTD对破骨细胞分化的影响
不同浓度的NCTD处理BMM细胞，并RANKL诱导培养5天，TRAP染色并统计破骨细胞数目和面积，结果显示，NCTD能够明显抑制破骨细胞的生成，且呈剂量依赖性关系(图2)。
3.3 NCTD在破骨细胞形成早期阶段发挥抑制作用
用5μM的NCTD在不同时间段处理BMM细胞，结果显示：NCTD预处理组在一定程度上可抑制破骨细胞形成，破骨细胞数量和大小相较对照组均有明显差异；早期药物处理组也能够显著改变破骨细胞数量和面积，但晚期药物处理组对破骨细胞面积没有明显影响。需要注意的是，全程给药组、预处理+全程给药组对破骨细胞分化抑制最为明显(图3)。上述结果提示，NCTD在破骨细胞分化的早期发挥抑制作用，长期给药效果更好。
3.4 NCTD对BMMs凋亡的影响
用不同浓度NCTD(0μM、2.5μM、5μM、10μM)处理BMMs细胞48h后，通过流式细胞仪检测NCTD对BMMs凋亡的影响。检测结果显示，NCTD在所测浓度不会引起细胞凋亡。
3.5 NCTD抑制破骨细胞形成相关标志性基因的表达
为进一步检测NCTD对破骨细胞分化的影响，本发明采用Q-PCR分析了破骨细胞分化过程中重要的marker基因表达，主要包括：CTSK、CTR、TRAP、NFATc1和c-Fos。结果显示，NCTD能呈浓度依赖地抑制CTSK、CTR、TRAP、NFATc1和c-Fos的表达，进一步确证了NCTD对破骨细胞的分化抑制作用(图5)。
3.6 NCTD抑制RANKL刺激的MAPK信号通路的激活
综上可知，NCTD能够抑制破骨细胞的形成且不会影响细胞增殖和凋亡。为了进一步阐明NCTD抑制BMMs分化的作用机理，本发明对MAPK和NF-κB相关通路进行了分析。Western Blot检测发现：RANKL刺激15min之后，MAPK通路中的两个家族成员细胞外信号调节激酶(ERK)和p38激酶的磷酸化明显增加；相对应的，加入RANKL和NCTD的共同处理组，其磷酸化程度明显受到抑制。但NCTD对于MAPK家族另一个成员c-Jun氨基端激酶(JNK)没有明显抑制作用(图6A和6B)。
除了MAPK信号通路外，本发明还发现检测了NCTD对NF-κB信号通路的影响，结果显示NCTD并没有抑制IκBα的降解。
以上结果说明，NCTD对破骨细胞分化的抑制作用是通过抑制MAPK(p38和ERK)信号通路来实现的。
五、结论
本发明采用体外细胞培养，首先检测去甲斑蝥素对BMM细胞的毒性，发现在10μM浓度及以下时，对骨髓来源的单核巨噬细胞(BMM细胞)无毒性作用。在后续的实验中，所用去甲斑蝥素的浓度低于10μM。随后本发明通过TRAP染色检测了去甲斑蝥素对RANKL诱导的破骨细胞分化的抑制作用。结果发现，去甲斑蝥素对体外培养的破骨细胞形成有抑制作用，且随着去甲斑蝥素的药物浓度的增加其抑制作用越明显。进一步检测去甲斑蝥素对破骨细胞分化抑制的阶段时发现，去甲斑蝥素在破骨细胞分化早期抑制作用明显，长期加药效果最好，晚期给药抑制效果最不理想。通过检测破骨细胞分化过程中最重要的两个转录因子(NFATc1和c-fos)和破骨分化标志性基因(CTSK、CTR和TRAP)的表达，进一步明确了去甲斑蝥素对破骨细胞的抑制作用。
RANKL是众所周知的破骨细胞分化过程中重要的细胞因子。在M-CSF存在条件下，RANKL与破骨细胞前体细胞表面的RANK结合，可通过多种信号通路影响破骨细胞的生成。在众多的信号通路中，MAPK和NF-κB信号通路是最经典也是最重要的信号通路。MAPK通路包含三个家族成员，分别是细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun N-末端激酶(JNK)和p38激酶。在本发明中，NCTD能明显下调RANKL刺激的ERK和p38的磷酸化水平，但对JNK的磷酸化没有影响。另外，检测IκBα的降解，发现NCTD对RANKL激活的NF-κB信号通路没有明显影响。
综上，本发明明确了NCTD对破骨细胞分化的抑制作用，并进一步阐明了分子机制。结果显示，NCTD可通过下调p-ERK和p-p38的磷酸化水平，进而抑制破骨细胞的分化过程。这些结果强有力提示，NCTD对破骨细胞过度激活相关疾病(如骨质疏松症、骨溶解、类风湿性关节炎、骨关节炎、骨髓炎、牙周炎、多发性骨髓瘤、Paget’s病、恶性肿瘤的高钙血症、成骨不全、牙槽骨缺失、免疫抑制治疗或长期使用糖皮质激素的引起的骨质丢失等)具备潜在的治疗作用。
Claims (7)
1.去甲斑蝥素在制备治疗破骨细胞过度激活相关疾病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的去甲斑蝥素在制备治疗破骨细胞过度激活相关疾病药物中的应用，其特征在于，所述破骨细胞过度激活相关疾病为骨质疏松症、骨溶解、类风湿性关节炎、骨关节炎、骨髓炎、牙周炎、多发性骨髓瘤、Paget’s病、恶性肿瘤的高钙血症、成骨不全、牙槽骨缺失、免疫抑制治疗或长期使用糖皮质激素的引起的骨质丢失。
3.根据权利要求1所述的去甲斑蝥素在制备治疗破骨细胞过度激活相关疾病药物中的应用，其特征在于，所述去甲斑蝥素能够抑制MAPK信号通路。
4.根据权利要求3所述的去甲斑蝥素在制备治疗破骨细胞过度激活相关疾病药物中的应用，其特征在于，所述去甲斑蝥素通过下调p-ERK和p-p38的磷酸化水平抑制MAPK信号通路。
5.根据权利要求1所述的去甲斑蝥素在制备治疗破骨细胞过度激活相关疾病药物中的应用，其特征在于，所述药物是以所述去甲斑蝥素作为单一成分所制成的药物。
6.根据权利要求1所述的去甲斑蝥素在制备治疗破骨细胞过度激活相关疾病药物中的应用，其特征在于，所述药物是以所述去甲斑蝥素作为活性成分，加上药学上可接受的辅料所制成的药物。
7.根据权利要求4所述的去甲斑蝥素在制备治疗破骨细胞过度激活相关疾病药物中的应用，其特征在于，所述药物选自注射剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊或口服液。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20181214 |
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