CN103800309A - 金精三羧酸在制备靶向趋化因子受体的药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及金精三羧酸（ATA）作为非选择性趋化因子受体抑制剂的用途。ATA可以抑制CCR2、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR9、CXCR4、CXCR5、CXCR6等趋化因子受体介导的细胞信号转导及细胞迁移。此外，本发明还提供了ATA在制备用于预防和/或治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。本发明提供的趋化因子受体抑制剂ATA可用于治疗包括多发性硬化症、类风湿性关节炎、红斑狼疮和炎症性肠病等在内的多种自身免疫性疾病。

Description

金精三羧酸在制备靶向趋化因子受体的药物中的用途
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及金精三羧酸在制备靶向趋化因子受体的药物中的用途，进而涉及金精三羧酸在制备预防和/或治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。 
背景技术
多发性硬化症（Multiple sclerosis，MS）是一种发生在中枢神经系统中的自身免疫性疾病，表现为中枢神经系统的脱髓鞘及神经退行性病变。实验性自身免疫性脑脊髓炎（Experimental Autoimmune Encephalomyelitis，EAE）的病理特征与MS相似，是研究MS的理想动物模型。被广泛接受的观点认为，CD4+T细胞的过度活化，尤其是辅助型T细胞1（T helper-1cell,Th-1）或者辅助型T细胞17（T helper-17cell,Th-17）两种亚群的过度活化，是导致这种疾病的直接原因。在EAE动物模型中，血脑屏障的完整性被破坏，外周致炎性CD4+T细胞向中枢神经系统中浸润，并引起其他免疫细胞的聚集，激活小胶质细胞，最终导致神经髓鞘脱落，轴突损伤，影响神经冲动的传导并可致瘫痪。 
T细胞的活化和分化需要抗原递呈细胞（antigen-presenting cells，APCs）的参与。树突状细胞（dendritic cells，DC）是专职的抗原递呈细胞，其在EAE的发病过程中发挥了非常重要的作用。外周组织中的未成熟DC，尤其是与周围环境接触的组织，像皮肤和黏膜中的DC，一旦遇到抗原，未成熟DC即会将它们扑捉，加工成小肽，由主要组织相容性复合物分子将其递呈到细胞表面。同时，来自病原体或炎症因子的信号启动DC的成熟过程，进一步加强它们的抗原递呈能力。成熟DC携带抗原，从组织中迁出，到达次级淋巴器官。在这里，DC通过细胞与细胞的接触和细胞因子的分泌，刺激T细胞的增殖和分化，从而启动抗原特异性免疫反应。 
成熟DC细胞向次级淋巴器官的迁移以及致病性T细胞向中枢神经系统的迁移很大程度上受趋化因子的调控。趋化因子可被广泛的分为两大类：诱导表达的趋化因子和组成性表达的趋化因子。组成性表达的趋化因子诱导基本的白细胞迁移转运，形成次级淋巴器官的构成体系，而诱导表达的趋化因子主要招募白细胞对生理应激产生反应，刺激炎性细胞向炎症组织的迁移。许多研究已经证明，在EAE的过程中多种趋化因子的表达会上调。通过趋化因子的特异抗体干预其功能后，能很好地抑制或缓解EAE的病情。趋化因子根据其N末端非常保守的半胱氨酸残基被分为四类：CXC，因其临近的两个半胱氨酸残基 之间有一个氨基酸残基；CC，两个保守的半胱氨酸残基紧邻；CX3C，两个保守的半胱氨酸残基之间被3个氨基酸残基隔开；C，此类趋化因子N末端只有一个保守的半胱氨酸残基。其中，CXC和CC是两类最主要的趋化因子家族。因此，本发明人以这两类趋化因子的受体作为主要的研究对象。趋化因子通过趋化因子受体来发挥其功能，一种趋化因子可以成为多个趋化因子受体的配体，一个趋化因子受体也可以有多个趋化因子配体。趋化因子受体是一类具有七次跨膜结构的G蛋白偶联受体，且大部分与Gαi偶联，其转导的信号可被百日咳毒素所抑制。趋化因子受体，在很多细胞中表达，如T细胞、中性粒细胞、单核细胞、单核细胞来源的巨噬细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞等参与炎症和免疫反应的细胞，不仅如此，在小胶质细胞、星形胶质细胞、神经元和内皮细胞等中枢神经系统的细胞中也有表达。不同的免疫细胞，其表面特异性高表达的趋化因子受体也有所不同，如成熟DC高表达CCR7，Th1细胞高表达CCR5和CXCR3，而Th17细胞特异性高表达CCR6。因此，可以通过干预这些趋化因子受体的功能，抑制相应的细胞向炎症部位的迁移，达到缓解EAE病情的目的。 
发明内容
本发明人致力于研究自身免疫性疾病的发病原因和机理，以及趋化因子受体抑制剂在治疗自身免疫性疾病中的用途。在化合物筛选中，发明人发现金精三羧酸（Aurintricarboxylic acid，ATA）可以抑制多种趋化因子受体介导的细胞信号转导及细胞迁移，这些趋化因子受体包括CCR2，CCR4，CCR5，CCR6，CCR7，CCR9，CXCR4，CXCR5，CXCR6。ATA是一种蛋白-核酸相互作用的抑制剂，因此能够抑制许多涉及DNA或RNA的酶类。其铵盐被称作铝试剂，用来检测水、生物组织和食物中的铝含量。此外，ATA被发现可通过阻断HIV外壳蛋白gp120和CD4分子的结合发挥抗HIV活性。本发明中，发明人发现ATA能显著减轻小鼠EAE模型的临床症状及病理改变。炎症细胞的过度激活及对组织的浸润是许多自身免疫疾病（包括多发性硬化症、类风湿性关节炎、红斑狼疮、炎症性肠病等）的共同特征。机制研究显示，ATA并不直接影响致病性Th1或Th17细胞的分化，而是通过抑制抗原递呈的DC细胞向脾脏内的迁移聚集，从而减少T细胞的活化和分化；ATA还能抑制致病性T细胞向中枢神经系统中的迁移浸润，从而缓解疾病。 
因此，本发明的一个目的是提供ATA或含有ATA的药物组合物在制备靶向趋化因子受体的药物中的用途。 
本发明的另一个目的是提供ATA或含有ATA的药物组合物在制备用于预防和/或治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。 
本发明中，优选地，所述趋化因子受体包括CCR2，CCR4，CCR5，CCR6，CCR7，CCR9，CXCR4，CXCR5，CXCR6。 
本发明中，优选地，所述趋化因子受体为选自CCR2，CCR4，CCR5，CCR6，CCR7，CCR9，CXCR4，CXCR5和CXCR6中的一种或多种。 
本发明中，优选地，金精三羧酸同时靶向3个以上的所述趋化因子受体。 
本发明中，优选地，所述自身免疫性疾病包括多发性硬化症、类风湿性关节炎、红斑狼疮、炎症性肠病（inflammatory bowel disease）。 
此外，本发明还提供了一种预防和/或治疗自身免疫性疾病的方法，所述方法包括向需要其的对象施用治疗有效量的ATA或含有ATA的药物组合物。 
本发明中，优选地，所述含有ATA的药物组合物包含治疗有效量的金精三羧酸和任选的可药用载体。 
本发明与现有趋化因子抑制剂相比，具有如下优点； 
ATA可同时靶向包括CCR2，CCR4，CCR5，CCR6，CCR7，CCR9，CXCR4，CXCR5，CXCR6等在内的多个趋化因子，同时抑制DC细胞向二级淋巴器官的迁移及致病性T细胞向中枢神经系统的迁移，在自身免疫病发病的多个环节同时起到抑制作用，与靶向单个趋化因子的药物相比，可能具有更好的疗效。 
附图说明
图1显示ATA抑制趋化因子受体的功能。其中： 
A为显示ATA的分子结构式的图。 
B为显示ATA抑制趋化因子激起的钙流反应的图。稳定表达Gα16及各个受体（CCR6、CCR7、CXCR4、S1P1、KOR或β2AR）的HEK293或CHO细胞系，与染料fluo4-AM孵育45分钟后，先和ATA预孵育10分钟，然后再用相应配体（30nM）刺激，记录钙信号。数据来自三次独立实验，每次实验三复孔，表示为平均值±标准误差（mean±SEM）。 
C为显示ATA抑制趋化因子诱导的细胞趋化的图。分离自雌性C57/B6小鼠的脾细胞，用10μg/ml LPS刺激48小时后加入到
Figure BDA00002410564100031
穿膜小室夹层培养体系的上层小室内，上下层小室以带微孔的膜隔开；SDF-1、CCL19、CCL20或S1P（均为30nM）等能诱导细胞迁移的因子加入到下层小室内；不同浓度的ATA被加入到上层及下层小室。3小时后，从上层小室迁移到下层小室的细胞通过流式细胞仪计数。数据来自三次独立实验，每次实验三复孔，表示为平均值±标准误差。 
D为显示ATA抑制趋化因子受体内吞的图。表达CXCR4、CCR6或S1P1受体的细胞在ATA存在或不存在的情况下，以相应的配体刺激后，进行受体免疫荧光染色，观察其定位情况。无尾箭头所指为受体定位于膜上，有尾箭头所指为受体内吞后进入胞内形成的内吞点。 
图2显示ATA减轻EAE的临床症状及组织损伤。其中： 
用MOG35-55免疫雌性C57/B6小鼠诱导EAE，从免疫后第3天（A）、第12天（C）起每天一次腹腔给药至实验结束；或从第3天开始，给药至第12天（B）；对照组给予磷酸缓冲液，每天记录临床评分。数据表示为平均值±标准误差（每组为6只小鼠）。###p＜0.001，#p＜0.05（双方向方差检验（two-way ANOVA test））；与对照组相比，*p＜0.05， **p＜0.01（曼-惠特尼检验（Mann-Whitney test））。D和E为正常或免疫后对照组及ATA给药组（20mg/kg，第3天给药，至实验结束）的小鼠腰髓组织石蜡切片的H&E染色（D）及快蓝染色（E）图片。F为正常或免疫后对照组及ATA给药组（20mg/kg，第3天给药，至实验结束）的小鼠腰髓组织冰冻切片的CD45+细胞免疫荧光染色图片，图片中左下角的图片为中央方框的放大图像。G-I为对D-F中细胞浸润总数、脱髓鞘面积及CD45+细胞浸润数目进行的定量分析，数据以平均值±标准误差表示。每组取3只小鼠，每只小鼠脊髓取10块切片进行分析，与对照组比较，***p＜0.001（史蒂顿特氏t检验（Student’st-test））。 
图3显示ATA抑制体内但不影响体外T细胞分化。其中： 
A：EAE免疫后第12天，对照组及ATA给药组（20mg/kg/天，第3天给药至第12天）小鼠脾脏中CD4+T细胞、CD11c+DC、Th1（IFN-γ）细胞和Th17（IL-17+）细胞比例的流式分析；B：EAE免疫后第12天，对照组及ATA给药组（20mg/kg/天，第3天给药至第12天）小鼠的脾细胞用MOG35-55重刺激48小时后收集上清，用ELISA检测IL-17a、IFN-γ、IL-6和TNF-α的含量；数据表示为平均值±标准误差（每组为6只小鼠），与对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001（史蒂顿特氏t检验）；C和D：在分化因子及各种浓度ATA存在下，来源于6-8周龄小鼠脾内幼稚型CD4+T细胞在体内向Th1（C）或Th17（D）分化的状况，数据来自三次独立实验，表示为平均值±标准偏误差；E：向分离自8-10周龄小鼠脾内的DC加入不同浓度的ATA或喜树碱（0-30μM），培养18小时，annexin V/碘化丙啶（PI）染色，流式分析其凋亡情况。数据来自三次独立实验，每次实验三复孔，表示为平均值±标准误差。 
图4显示ATA抑制趋化因子介导的DC的迁移，但不影响DC的其他功能。其中： 
A：将分离自EAE免疫后第12天的小鼠脾内的DC加入到
Figure BDA00002410564100051
穿膜小室夹层培养体系的上层小室内，上下层小室以带微孔的膜隔开；将30nM CCL19加入到下层小室内；将10μM ATA加入到上层及下层小室。3小时后，从上层小室迁移到下层小室的细胞通过流式细胞仪计数。数据来自三次独立实验，每次实验三复孔，表示为平均值±标准误差。与CCL19未处理组比较，###p<0.001；与ATA未处理组比较，***p＜0.001（史蒂顿特氏t检验）。 
B和C：将分离自EAE免疫后第12天的未经ATA治疗的小鼠脾脏的CD4+T细胞用CFSE标记，在MOG35-55（25μg/ml）存在或不存在的条件下，与分离自EAE免疫后第12天的对照组或ATA给药组（20mg/kg/天，第3天给药至第12天）的CD11c+DC共培养72小时，用流式检测CD4+T细胞的增殖（B）或用ELISA方法检测上清中IL-17a、IFN-γ、IL-6和TNF-α等细胞因子的含量（C）。 
D-H：CD4+T细胞和CD11c+DC均分离自EAE免疫后第12天的未经ATA治疗的小鼠脾脏，CD4+T细胞用CFSE标记后，在MOG35-55（25μg/ml）及ATA（10μM）存在或不存在条件下，共培养72小室，用流式测CD4+T细胞的增殖（D）或ELISA测上清中IL-17a，IFN-γ、IL-6和TNF-α等细胞因子的含量（E-H）。数据来自三次独立实验，表示为平均值±标准误差。 
图5显示ATA阻断致炎性T细胞向中枢神经系统浸润。其中： 
A：用37-70%硅石胶态悬浮液(
Figure BDA00002410564100052
)分离出EAE免疫后第18天小鼠（ATA 20mg/kg/天，第3天给药至第18天）的中枢神经系统浸润细胞，并用流式仪分析CD4+T细胞、Th1（IFN-.γ）细胞和Th17（IL-17+）细胞的数目。数据表示为平均值±标准误差（每组为5只小鼠），与对照组比较，**p＜0.05（史蒂顿特氏t检验）。 
B：EAE免疫后第18天（ATA20mg/kg/天，第3天给药至第18天），对照组和ATA给药组小鼠血液中CD4+T细胞、CD11c+DC、Th1（IFN-.γ）细胞和Th17（IL-17+）细胞的比例流式分析结果。数据表示为平均值±标准误差（每组为6只小鼠），与对照组比较，**p＜0.05（史蒂顿特氏t检验）。 
C：正常组或免疫后第18天对照组及ATA给药组（20mg/kg/天，第3天给药至第18天）小鼠脑部脉络丛CD45+细胞免疫荧光染色图片。 
D：对C图中CD45+细胞浸润数目进行的定量分析，数据以平均值±标准误差表示。每组取3只小鼠，每只小鼠取5块切片进行分析，与对照组比较，**p＜0.01（史蒂顿特氏t检验）。 
具体实施方式
在下文中，将参照附图，结合举例说明本发明的实施例来更加详细地描述本发明，但其不以任何形式限制本发明。 
实施例 
材料与方法 
实验动物： 
C57BL/6雌鼠购自上海实验动物中心（上海，中国）并饲养于上海药物研究所实验动物室SPF级实验室，维持光-暗12小时循环交替，给以充足的食料和洁净饮水，至8周龄开始实验。所有实验均获得批准，并按照上海药物研究所动物管理与使用委员会的指引进行。 
试剂： 
CCR2，CCR4，CCR5，CCR6，CCR7，CCR9，CXCR4，CXCR5，CXCR6，S1P1，DOR，KOR，β2AR和Gα16质粒均购自Missouri S&T cDNA资源中心。金精三羧酸（ATA），脂多糖，Hochest33342，福斯高林（forskolin），GLP-1，U50488和异丙肾上腺素均购自Sigma-Aldrich。抗小鼠CD3（145-2C11）单克隆抗体，抗小鼠CD28（37.51）单克隆抗体和抗小鼠IFN-γ（R4-6A2）单克隆抗体均购自BD Pharmingen。藻红蛋白-蓝色素7（Phycoerythrin-cyanine 7，PE-Cy7）抗小鼠CD4（RM4-5），别藻蓝素（Allophycocyanin，APC）抗小鼠CD8a（53-6.7），别藻蓝素（Allophycocyanin，APC）抗小鼠IFN-γ（XMG1.2），藻红蛋白（Phycoerythrin，PE）抗小鼠CD11c（N418）和抗小鼠CD45（30-F11）购自eBiosciences。抗myc和抗HA单克隆抗体购自Cell Signaling Technology。Alexa Fluor 488羊抗小鼠IgG抗体，Alexa Fluor 488羊抗大鼠IgG抗体和Fluo-4AM购自Invitrogen。重组MCP-1，TARC，RANTES，MIP-3α，MIP-3β，TECK，SDF-1，CXCL13和CXCL16购自PeproTech。重组鼠IL-12，重组鼠IL-6，重组人TGF-β1，重组鼠IL-1β，重组鼠IL-23和重组鼠TNF-α购自R&D Systems。 
细胞系： 
实验涉及的各种稳定表达受体和Gα16的细胞系均由实验室内部构建。具体步骤如下：HEK293或CHO细胞经胰酶消化后，离心，加入200μl电转液（ATP 200g/L,MgCl2·6H2O120g/L,KH2PO4 12g/L,NaHCO3 1.2g/L），以100-200万细胞/200μl电转液的浓度加入受体质粒和Gα16质粒各2μg，混匀，用Scientz-2C基因导入仪（宁波新芝生物科技有限公 司）进行电击。电击后的细胞转入培养板或培养皿中继续培养细胞，24小时后即可以用于钙流实验进行检测。培养皿中的细胞24小时后加入抗生素进行筛选，并挑选阳性克隆细胞，建立单克隆细胞系。 
实施例1：EAE诱导及小鼠给药 
雌性C57BL/6小鼠皮下注射200μgMOG35-55（MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK,购自吉尔生化）辅以完全弗氏佐剂及5mg/ml热灭活结核杆菌（H37Ra菌株，购自DifcoLaboratories）。免疫当天为第0天。第0天及第2天每只小鼠腹腔注射百日咳毒素200ng（Calbiochem）。每天为小鼠评分，评分按“5分制”标准如下：0分，无临床症状；1分，尾部瘫痪；2分，后肢轻度瘫痪（单侧或双侧后肢无力，不完全瘫痪）；3分，截瘫（双侧后肢完全瘫痪）；4分，截瘫并前肢无力或瘫痪；5分，濒死状态或死亡。 
小鼠给药： 
EAE给药组：从免疫后第3天或第12天起经腹腔注射给予ATA（10-20mg/kg），直至实验结束；或从免疫后第3天起给药（经腹腔注射给予ATA（10-20mg/kg））至第12天。溶解ATA的溶剂为含有0.4%二甲亚砜（Dimethyl Sulfoxide,DMSO）的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）。 
EAE对照组：从免疫后第3天或第12天起经腹腔注射给予溶剂对照，即含有0.4%二甲亚砜的磷酸盐缓冲液。 
实施例2：组织病理与免疫荧光分析 
将实施例1中EAE给药组和EAE对照组的疾病小鼠麻醉，经PBS灌流及4%多聚甲醛灌流固定。取出的脊髓组织样品在4%多聚甲醛中固定过夜。固定的脊髓组织样品经石蜡包埋后，用苏木精和伊红（hematoxylin and eosin,H&E）染色分析炎症细胞浸润，用快蓝染色分析脊髓脱髓鞘现象。脊髓和脑的冰冻切片用抗小鼠CD45一抗及相应荧光二抗染色；细胞核用Hochest 33342室温染色10分钟，切片用荧光封片剂（Dako）封片。 
实施例3：中枢神经系统浸润细胞分离 
将实施例1中EAE给药组和EAE对照组的疾病小鼠的脊髓及脑组织放在40μm滤网上碾碎，获得的细胞悬液在4℃，500g离心10分钟后，用8ml 37%
Figure BDA00002410564100071
试剂重悬，小心加入到4ml 70%试剂中，在25℃780g条件下离心25分钟。收集位于37%~70%
Figure BDA00002410564100073
中间层细胞并进行流式检测。 
实施例4：流式细胞检测 
将取自实施例1中EAE给药组和EAE对照组的疾病小鼠的脾细胞或取自实施例3中的浸润到小鼠中枢神经系统的细胞进行表面染色。细胞与荧光标记的抗小鼠CD4，CD11c抗体，4℃孵育30分钟。对于胞内染色，细胞先与12-十四酸佛波酯-13-乙酸盐(phorbol 12-myristate 13-acetate)(50ng/ml;Sigma)、伊屋诺霉素(ionomycin)(750ng/ml;Sigma)和布雷菲德菌素A(brefeldin A)(3.0μg/ml;Sigma)混合后在37℃孵育5小时，细胞重悬于固定/通透液(Cytofix/Cytoperm试剂盒;BD Pharmingen)中，胞内IL-17a和IFN-γ染色按产品说明操作。结果用Guava easyCyteTM 8HT流式细胞仪和GuavaSoft软件进行分析。 
实施例5：CD4+T细胞分离和体外分化 
用磁珠(
Figure BDA00002410564100081
Mouse CD4 Cell Negative Isolation kit;Invitrogen)分离6-8周龄正常雌性C57BL/6小鼠脾中幼稚型CD4+T细胞，分离后的CD4+T细胞加入抗CD3(2μg/ml;145-2C11;BD Pharmingen)和抗CD28(2μg/ml;37.51;BD Pharmingen)抗体激活后分别加入IL-12(10ng/ml;R&D)和抗-IL-4(10μg/ml;11B11;BD Pharmingen)诱导分化为Th1细胞，或加入抗-IL-4、抗-IFN-γ(10μg/ml;BD Pharmingen)及含TGF-β1(3ng/ml)、IL-6(30ng/ml;eBioscience)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor)(10ng/ml;R&D)、IL-23(10ng/ml;R&D)和IL-1β(10ng/ml;R&D)的Th-17“分化因子组合”来诱导分化为Th-17细胞。在上述分化过程中，同时加入各种浓度（0-30μM）的ATA以评估其对T细胞分化的影响。三天后收集细胞进行胞内IFN-γ、IL-17a的染色。 
实施例6：DC分离及DC-T细胞共培养实验 
用MACS磁珠(Miltenyi Biotec)分选来源于实施例1中EAE对照组小鼠（免疫后第12天）或EAE给药组小鼠（ATA，20mg/kg/天，第3天给药至第12天）脾脏中的CD11c+DC细胞后，与CFSE标记的来源于EAE对照组小鼠（免疫后第12天）脾脏中的CD4+T细胞以3:1的比例混合，在MOG35-55（25μg/ml）存在或不存在的条件下，培养72小时；或CD4+T细胞和DC细胞均分离自EAE对照组小鼠（免疫后第12天），在共培养体系中加入ATA（10μM），培养72小时后，流式细胞仪检测CD4+T细胞的增殖情况，ELISA方法检测上清液中细胞因子IFN-γ,IL-17a,IL-6和TNF-α的含量(Dakewe,Shenzhen,China)。 
实施例7：DC凋亡实验 
将分选自8-10周龄正常C57BL/6小鼠脾脏中的CD11c+DC与ATA（0-30μM）或喜树碱（0-30μM）在37℃孵育18小时。收集细胞进行Annexin V/碘化丙啶染色。早期凋 亡表现为Annexin V阳性，碘化丙啶阴性，晚期凋亡表现为Annexin V和碘化丙啶双阳性，用流式细胞仪检测。 
实施例8：趋化实验 
体外趋化实验采用5μm孔径穿膜小室（
Figure BDA00002410564100091
Corning）。从实施例1中的EAE对照组小鼠（免疫后第12天）中提取全脾细胞或DC细胞，并且将该细胞用含10μg/ml LPS的RPMI-1640培养液培养48小时，细胞洗后用含0.5%BSA的RPMI-1640培养液稀释成密度为1×107细胞/ml悬液。将各种趋化因子受体的相应配体（SDF-1、CCL19、CCL20或S1P（均为30nM））加入到下层小室内而将100μl细胞悬液加入到上层小室内。对于趋化阻滞实验，各种浓度的ATA（0-100μM）被加入到下层小室及上层小室内。正常培养3小时后从上层小室迁移至下层小室内的脾细胞用流式细胞仪计数。 
实施例9：钙流实验 
将稳定表达各种G蛋白偶联受体（包括CCR2，CCR4，CCR5，CCR6，CCR7，CCR9，CXCR4，CXCR5和CXCR6）和Gα16的HEK293细胞株（如上所述由实验室自行构建）接种在96孔板里，培养24小时后，将细胞与2μM fluo 4-AM染料在37℃孵育45分钟，移去染料，加入50μL含不同浓度ATA（0-100μM）或者1%DMSO（阴性对照）的HBSS，室温孵育10min，然后再用相应配体（SDF-1、CCL19、CCL20，S1P等（均为30nM））作为激动剂进行刺激，记录钙信号。用Flex Station 3微孔板检测仪（Molecular Devices）读数。检测仪在指定时间点，可自动将25μl激动剂（终浓度30nM）加入到反应体系中，同时用485nm的光激发并于525nm波段检测细胞内钙离子浓度变化引起的染料荧光强度的变化。 
实施例10：受体内吞实验 
将稳定表达Myc-CXCR4、EGFP-CCR6或HA-S1P1的HEK293细胞株（如上所述由实验室自行构建）接种在盖玻片上，培养过夜。细胞先用ATA（0-30μM）预孵育10分钟，后用相应的配体（SDF-1、CCL20或S1P）30nM刺激30分钟。然后，将细胞用4%多聚甲醛固定，0.3%TritonX-100破膜后，用抗myc或HA标签的抗体4℃孵育过夜，相应的Alexa Fluor 488二抗室温孵育1小时，Hochest33342染核后，用荧光共聚焦显微镜（Olympus FV10i confocal microscope）拍照。 
数据处理 
数据用GraphPad Prism软件分析处理。非线性回归分析产生剂量依赖曲线并计算半数抑制浓度（IC50）。数据表示为平均值±标准误差，EAE小鼠处理组间统计学差异用 双方向方差检验（two-way ANOVA test）分析，时间点内EAE评分统计学差异用曼-惠特尼检验（Mann-Whitneytest）分析。其他数据分析（如基因表达，细胞因子生成后病理学统计分析）用史蒂顿特氏t检验分析。p<0.05为有统计学意义。 
结果 
ATA抑制多种趋化因子受体的功能 
趋化因子受体是一类G蛋白偶联受体（GPCR），它们对细胞的迁移有非常重要的作用，对EAE的发病机制也有一定的贡献。在筛选趋化因子受体拮抗剂时，发明人发现ATA（图1A）能抑制多种趋化因子导致的细胞信号转导和迁移。首先，实施例9中，发明人利用稳定表达Gα16和各类GPCR（其中趋化因子受体包括：CCR2，CCR4，CCR5，CCR6，CCR7，CCR9，CXCR4，CXCR5或CXCR6；非趋化因子受体包括：S1P1，DOR，KOR，GLP-1R和β2AR）的细胞系检测了ATA对GPCR介导的钙流反应的抑制作用。Gα16是一类泛宿主性的G蛋白，常与G蛋白偶联受体偶联，启动下游钙信号通路。实施例9的结果显示，ATA剂量依赖性地抑制大多数趋化因子受体介导的钙流反应，仅CCR2除外（图1B，下表1）。但是对于其他非趋化因子受体，ATA则没有显示出抑制效应（图1B，下表1）。 
实施例8中，发明人随后检测了ATA对几个不同趋化因子受配体对如CCL19/CCR7，CCL20/CCR6或SDF-1/CXCR4介导的脾细胞迁移活性的影响。实施例8的结果显示，ATA剂量依赖性的抑制CCL19，CCL20或SDF-1所诱导的脾细胞的迁移，其IC50分别为0.24，3.36，11.46μM（图1C，下表1）；S1P1受体在淋巴细胞迁出次级淋巴器官过程中发挥了重要作用，但ATA并不影响S1P1介导的细胞趋化（图1C，下表1）。 
受体内吞是GPCR被其配体刺激后的一种常见现象。实施例10中，发明人也检测了ATA对配体刺激后的CXCR4，CCR6和S1P1受体内吞效应的影响。表达CXCR4，CCR6或S1P1受体的细胞与ATA预孵育10分钟后，再用相应的配体SDF-1，CCL20或S1P刺激30分钟，然后进行受体免疫荧光染色。实施例10的结果显示，未经配体刺激地细胞，受体都定位在细胞膜上，配体刺激后，受体内吞至胞内（图1D）；加入ATA处理后，配体刺激导致的CXCR4和CCR6受体内吞显著减少；但ATA不影响S1P1受体的内吞（图1D）。综上所述，ATA抑制许多趋化因子受体的功能，但不影响其他的GPCR的功能。 
ATA减轻EAE的临床症状及病理学特征 
实施例1中，用MOG35-55免疫8-9周的雌性C57BL/6小鼠诱导EAE，从第3天或第 12天起开始腹腔注射ATA(10或20mg/kg)至实验结束，或者在第3天到第12天给药。溶剂对照为含0.4%DMSO的PBS。EAE的临床评分数据见图2A-2C和下表2。ATA剂量依赖性地缓解EAE的临床评分（图2A），并显著降低疾病的最高临床评分和累计临床评分（图2A，下表2）。当仅第3天到第12天给药时，ATA也能够在EAE疾病发生的起始和高峰阶段降低其严重程度，但在20天后疾病的分数又有上升的趋势，表明药物的移除导致了疾病的再次发生（图2B）。在疾病开始之后（第12天起）给药，20mg/kg ATA仍能有效减轻EAE的严重程度（图2C，表2），表明该药物不仅有预防效果，也能达到治疗疾病的目的。 
实施例2中，发明人分析了免疫21天后脊髓的病理切片。实施例2的研究结果显示，相较于对照组，ATA给药可明显减少白细胞对脊髓的浸润（图2D和2G）；快蓝染色显示对照组的EAE小鼠脊髓白质出现广泛的脱髓鞘现象，而给予ATA后，脱髓鞘现象明显减少（图2E和2H）；冰冻切片免疫荧光染色的结果显示，ATA给药后能明显减少EAE小鼠脊髓中CD45+细胞的数量（图2F和2I）。 
ATA减少疾病起始阶段脾脏内DC和效应T细胞的比例 
CD4+T细胞的活化，增殖和分化是EAE疾病发生的前提。实施例4中，发明人利用流式分析检测了EAE免疫后第12天，小鼠脾脏内各细胞亚群的比例。与对照组相比，ATA给药组小鼠的CD11c+DC和EAE中两种主要效应T细胞Th1和Th17细胞的比例显著下降（图3A）。与此结果一致，给药组小鼠脾细胞在体外用MOG35-55重刺激，上清中的细胞因子(包括IFN-γ,IL17,IL6和TNF-α)也有显著性减少（图3B）。 
发明人随后进一步验证ATA是否是通过直接影响Th1或Th17细胞的分化，而使脾脏中这两种细胞比例减少的。实施例5中，用免疫磁珠从6-8周龄雌性C57BL/6小鼠脾细胞中分选出幼稚型CD4+T细胞，用抗-CD3和抗-CD28抗体激活后加入不同分化因子及各种浓度的ATA，将细胞诱导分化为Th1或Th17细胞。三天后收集细胞进行胞内IFN-γ、IL-17a的染色。流式分析后发现ATA并不直接影响Th1（图3C）或Th17(图3D)的体外分化。体内Th1或Th17的分化很大程度上受到DC的影响，既然ATA不直接影响Th1或Th17的分化，那么这些细胞在体内的减少很可能是因为CD11c+DC的减少所引起（图3A）。实施例7中，发明人检测了ATA是否会促进DC的凋亡，从而使脾脏中DC的含量减少。图3E显示，I型拓扑异构酶抑制剂喜树碱剂量依赖性的促进DC的凋亡，但ATA却没有这种效应，说明ATA对DC的凋亡没有促进作用。 
ATA抑制DC的迁移，但不影响其其他功能 
DC在外周组织中捕获、加工并向MHC分子递呈抗原。DC随后向次级淋巴器官中迁移，并在这些器官中，向幼稚型T细胞递呈抗原，促使它们向Th1或Th17分化，从而启动抗原特异性免疫反应。因为ATA不会促进DC的凋亡，那么它很有可能是抑制了DC向脾脏的迁移。实施例8中，发明人用趋化实验研究ATA对于DC迁移的作用。CCR7是成熟DC上高表达的介导DC迁移的主要的趋化因子受体。结果显示，ATA（10μM）能够完全抑制CCR7的配体CCL19所诱导的EAE免疫后第12天小鼠脾脏中分离的获得的DC的趋化效应（图4A）。 
实施例6中，发明人为了进一步验证ATA是否影响DC向CD4+T细胞的抗原递呈及其细胞因子的分泌，设计了DC-CD4+T细胞共培养实验。CD4+T细胞分离自对照组小鼠，用CFSE标记后，与分离自对照组EAE或ATA给药组EAE小鼠的CD11c+DC共培养72小时。来自ATA给药组EAE小鼠的DC与来自对照组EAE小鼠的DC具有相同的刺激CD4+T细胞增殖（图4B）及促进它们分泌细胞因子的能力（图4C）。同时，发明人设计了另一个实验，将均分离自对照组EAE小鼠的CD4+T细胞和CD11c+DC共培养，并向培养体系中加入ATA（10μM），72小时后分别用流式和ELISA检测CD4+T细胞的增殖（图4D）及它们细胞因子的分泌（图4E-4H）。结果显示，CD4+T细胞和CD11c+DC共培养能显著增强CD4+T细胞的增殖及其细胞因子的产生。MOG35-55重刺激能进一步加强这种效应。但ATA并不影响该系统中CD4+T细胞的增殖及它们细胞因子的分泌。综上所述，ATA在EAE上展现出来的保护作用是通过抑制DC向脾脏内的迁移聚集，从而减少了T细胞的活化和分化。 
ATA阻断致病性淋巴细胞向中枢神经系统的浸润 
ATA在疾病开始之后也表现除了一定的治疗效果（图2C）。所以发明人进一步验证了ATA是否会影响致病性T细胞向中枢神经系统浸润的过程。利用流式分析技术对免疫后第18天CNS白细胞浸润情况的进行检测，ATA给药后，CD4+T细胞和两个主要致病细胞Th1和Th17细胞的数目显著性减少（图5A）。然而，同时发现血液中Th17细胞的比例，与对照组相比，ATA给药组有显著性上升（图5B）。这个有趣的现象表明ATA可能抑制了致炎性T细胞向CNS中的浸润，从而导致Th17细胞在血液中的积累。脉络丛形成了血脑屏障的一部分，T细胞穿过脉络丛进入中枢神经系统是EAE病情起始的关键一步。有文献报道，CCL20/CCR6介导的Th17细胞向CNS的浸润触发了EAE的开始。CCR6基因敲除小鼠的CD45+细胞不能穿过血脑屏障，积聚在脉络丛中。图5C和5D显示，与对照组相比，ATA给药组EAE小鼠脉络丛中有更多的CD45+细胞的聚集，这些 都说明了ATA同时还会抑制致病性T细胞向CNS的浸润，从而缓解EAE的病情。 
讨论 
趋化因子是一类与白细胞迁移和炎症反应相关的细胞因子，根据它们的结构性质可被分为两个大的家族（CXC和CC）和两个小的家族（C和CX3C）。趋化因子受体下游信号通过异源三聚体G蛋白传递。G蛋白能够调节多种信号传导通路，包括细胞内钙离子，丝裂酶原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK），PLCβ，PI3K，Ras和Rho GTPases等。这些转导信号被认为负责细胞的运动及免疫细胞的运输。 
抗原进入外周组织后，未成熟DC在病原体或炎症因子诱导下慢慢成熟。携带抗原的成熟DC迁出外周组织到达次级淋巴器官，并在此刺激T细胞的增殖和分化。DC成熟过程中，其表面表达的趋化因子受体类型会改变。决定携带抗原的成熟DC在T细胞富集区域积累的趋化因子受体CCR7的表达会逐渐上调。最近的研究也表明CXCR4和CCR7介导的信号协同调节DC向脾白髓迁移。抑制DC迁移的药物已经用于治疗自身免疫疾病。例如，环孢霉素A（CyclosporinA，CsA）在临床上是一种非常重要的有效的免疫抑制剂，用于治疗器官移植，变应性紊乱，自身免疫疾病和急性炎症。CsA主要通过抑制DC在LPS刺激下产生PGE2，进而干预了趋化因子受体的表达，损伤DC的迁移能力。发明人的数据显示，ATA非特异性地抑制趋化因子受体的功能，且它对于抑制CCL19/CCR7介导的DC趋化的活性也是最好的。这表明抑制DC向次级淋巴器官的归巢也许是治疗自身免疫疾病的一种有效方法。 
淋巴细胞向CNS的浸润是EAE这种神经退行性疾病发生的另外一个关键步骤，它也是由趋化因子受体所调节。白细胞从血液向血管外渗出是一个多步骤的过程。在这一级联反应中的关键一步是循环中的白细胞表面表达的趋化因子受体与血管内皮细胞表面的趋化因子结合，启动细胞内信号，导致整合素活化，白细胞阻滞及外渗。最近的证据表明表达IL-17的Th17细胞是EAE中最重要的致炎性T细胞。Th17细胞高表达趋化因子受体CCR6，并且其配体CCL20在健康的及EAE小鼠的脉络丛细胞上高表达。Reboldi等报道CCR6+Th17细胞穿过脉络丛上皮细胞进入CNS的过程对于EAE的起始是非常重要的。CCR6基因敲除后能阻滞Th17细胞的浸润，减轻EAE的病情。发明人也证明了ATA抑制CCL20/CCR6介导的脾细胞的趋化，并减少致炎性T细胞向CNS的浸润。 
许多其他的趋化因子受体在EAE发病过程中的作用也有报道，而ATA作为一个多趋化因子受体的非特异性抑制剂正是其对EAE有治疗效果的原因。值得注意的是ATA已经被报道可通过抑制CD4与病毒包膜糖蛋白gp120的结合来抑制HIV的进入。众所周知， CCR5和CXCR4是HIV入侵的共受体。通过发明人的数据显示，ATA也许还通过抑制CCR5和CXCR4来阻挡HIV进入CD4+T细胞。 
本发明公开了ATA抑制趋化因子受体功能的活性，并公开了ATA通过抑制CCL19/CCR7介导的DC向次级淋巴器官的归巢及CCL20/CCR6介导的Th17细胞进入CNS的过程，可以达到治疗EAE的目的。 
表1：ATA抑制趋化因子受体介导的钙流反应及细胞迁移。其中： 
通过钙流和趋化实验检测ATA在多种趋化因子受体和其他GPCR上的抑制活性。数据来自三次独立实验，每次实验三复孔，表示为平均值±标准误差。 
【表1】 
a数据表示为平均值±标准误差; 
NA：未检测 
表2：ATA减轻EAE临床评分。其中： 
ATA不同给药剂量及给药方式对EAE病情临床评分的影响统计表。 
【表2】 
Figure BDA00002410564100151
a平均值±标准误差; 
***p<0.001,**p<0.01,*p<0.05(史蒂顿特氏t检验)。 

Claims (10)

1.金精三羧酸或含有金精三羧酸的药物组合物在制备靶向趋化因子受体的药物中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其中，所述靶向趋化因子受体的药物为趋化因子受体抑制剂。
3.如权利要求1或2所述的用途，其中，所述趋化因子受体包括CCR2，CCR4，CCR5，CCR6，CCR7，CCR9，CXCR4，CXCR5，CXCR6。
4.根据权利要求3所述的用途，其中，所述趋化因子受体为选自CCR2，CCR4，CCR5，CCR6，CCR7，CCR9，CXCR4，CXCR5和CXCR6中的一种或多种。
5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，金精三羧酸同时靶向3个以上的所述趋化因子受体。
6.金精三羧酸或含有金精三羧酸的药物组合物在制备用于预防和/或治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。
7.如权利要求6所述的用途，其中所述自身免疫性疾病选自多发性硬化症、类风湿性关节炎、红斑狼疮和炎症性肠病。
8.如权利要求1-7中任一项所述的用途，其中，所述含有金精三羧酸的药物组合物包含治疗有效量的金精三羧酸和任选的可药用载体。
9.一种预防和/或治疗自身免疫性疾病的方法，所述方法包括向需要其的对象施用治疗有效量的金精三羧酸或含有金精三羧酸的药物组合物。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述自身免疫性疾病选自多发性硬化症、类风湿性关节炎、红斑狼疮和炎症性肠病。
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