CN107847525A - 用于抑制组蛋白去乙酰酶的组合物及方法 - Google Patents

Abstract

一种抑制组蛋白去乙酰酶活性的方法，其包括对有此需要的接受体受试者施用一种组合物，所述组合物包含有效量的尺寸大于2微米且小于6微米的小型成体干细胞，其中所述小型成体干细胞包括CD349+成体干细胞以及Lgr5+成体干细胞。

Description

用于抑制组蛋白去乙酰酶的组合物及方法

【技术领域】

相关申请案的交叉引用

本申请请求全部均于2015年7月28日提交的美国临时申请第62/197,742号、第62/197,745号、第62/197,753号、第62/197,757号、第62/197,760号、第62/197,770号以及第62/197,782号的优先权。所有的在先申请案的内容，在此完整地并入本文以为参考。

【背景技术】

发明背景

干细胞具有自我更新产生更多的干细胞以及还分化成其它类型的细胞的能力。因此其可以用于治疗各种疾病。

已证明组蛋白去乙酰酶作为用于包括癌症、免疫病症以及神经变性病症的病症的药物标靶。可抑制组蛋白去乙酰酶活性的组合物具有治疗此类病症的巨大的潜力。

【发明内容】

发明概要

在一个方面中，本文描述的是一种抑制组蛋白去乙酰酶活性的方法。所述方法包括对有此需要的接受体受试者施用一种组合物，所述组合物包含有效量的尺寸大于2微米且小于6微米的小型成体干细胞，其中所述小型成体干细胞包括CD349+成体干细胞以及Lgr5+成体干细胞。所述方法可另外包括在所述施用步骤之前或之后(或二者)测定所述接受体受试者中组蛋白去乙酰酶活性的步骤。

所述接受体受试者可能患有自体免疫病症、糖尿病、癌症、神经变性病症或病毒感染。例如，所述接受体受试者可能患有痴呆症、帕金森病、关节炎、强直性脊柱炎或糖尿病。

在一个实施方案中，在所述组合物的全部细胞中，大于95％(如，大于99％或99.99％)可为小型细胞。所述小型细胞可包括一种或多种类型的细胞，包括血小板、Lgr5(+)细胞、CD349(+)细胞、CD133(+)细胞、CD34(+)以及CD66e(+)细胞中的任一种。血小板可占所述组合物的小型细胞的75％至85％。全部的小型细胞中，大于4％(如，大于5％或介于4.5％与10％之间)可为Lgr5+成体干细胞。CD349(+)成体干细胞可占大于所述组合物的全部小型细胞的4％(如，大于5％或介于4.5％与10％之间)。所述小型细胞中，小于2％(如，小于1％或0.5％)可为CD133(+)细胞以及CD34(+)细胞的组合。所述小型细胞中，小于6％(如小于5％或4.5％)可为CD66e(+)细胞。

此外，所述组合物可以基本上排除尺寸大于6微米的大型细胞。例如，大型细胞可占小于所述组合物的细胞总数目的5％(如，小于1％、0.5％或0.01％)。

在一个实施方案中，所述组合物是一种静脉内施用的注射溶液。其还可以包含二价阳离子螯合剂(如，乙二胺四乙酸)。所述注射溶液可用包括下列的工序制得：提供含有血液样品以及二价阳离子螯合剂的混合物；将所述混合物在2℃至12℃的温度贮存3至72小时，因此所述混合物会分出上层以及下层，其中所述上层含有小型成体干细胞；以及收集所述上层，因此制得所述注射溶液。在所述工序中使用的血液样品可从所述接受体受试者或捐献受试者获得。

任选地，在获得用于制备所述注射溶液的血液样品之前，可先在所述接受体受试者或捐献受试者上进行增加干细胞数目的操作。例如，所述操作可以是施用岩藻多糖(fucoidan)或粒细胞集落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor)。

在另一个方面中，在此所述的是一种用于减少受试者中的组蛋白去乙酰酶活性的注射组合物。所述组合物含有有效量的尺寸大于2微米且小于6微米的小型成体干细胞，所述小型成体干细胞包括CD349+成体干细胞以及Lgr5+成体干细胞。

一个或多个实施方案的详细内容述于下面的附图以及说明书中。所述实施方案的其它的特征、目的以及优点，在参考说明书与附图以及权利要求书后，将变得清楚明了。

【附图说明】

图1是显示根据本发明的一个实施方案用于制备干细胞混合物的方法的流程图。

图2是显示褐藻岩藻多糖补充物(每粒)的成分信息的表格。

图3是显示根据本发明的一个实施方案的用于干细胞活化、纯化以及浓缩的方法的流程图。

图4是显示六名受试人在口服褐藻岩藻多糖补充物之前与之后所获得的干细胞数据的图表。

图5A是显示在一个粒细胞集落刺激因子(GCSF或G-CSF)注射疗程之前所获得的流式细胞测量术的数据图。

图5B是显示在一个粒细胞集落刺激因子(GCSF或G-CSF)注射疗程之后所获得的流式细胞测量术的数据图。

图6A是显示前向散射系数(FSC)对侧向散射系数(SSC)的流式细胞测量术点图。

图6B是从流式细胞测量术分析法获得的荧光直方图。

图6C是FSC对SSC流式细胞测量术的点图。

图7A是FSC对SSC流式细胞测量术的点图。

图7B是由流式细胞测量术分析法获得的CD61荧光直方图。

图7C是由流式细胞测量术分析法获得的CD133荧光直方图。

图7D是由流式细胞测量术分析法获得的CD34荧光直方图。

图7E是由流式细胞测量术分析法获得的CD66e荧光直方图。

图7F是由流式细胞测量术分析法获得的CD349荧光直方图。

图7G是从流式细胞测量术分析法获得的Lgr5荧光直方图。

图8是表2中所示的数据的散布图。

【具体实施方式】

详细说明

意外地发现含有某些小型成体干细胞(如，Lgr5(+)以及CD349(+)细胞)的组合物在活体内会抑制组蛋白去乙酰酶(HDAC)的活性。据此，在此所述的是用于抑制组蛋白去乙酰酶的方法以及组合物。

成体干细胞

有各种类型的成体干细胞，包括全能干细胞、多能干细胞、多潜能干细胞以及祖先干细胞(亦称作单潜能干细胞)。分裂球样干细胞(Blastomere-like stem cells，BLSCs)是全能或多能成体干细胞。极小型胚胎样干细胞(VSELs)是多能成体干细胞。SB细胞是多能或多潜能成体干细胞。间质干细胞(MSCs)以及造血干细胞(HSC)是多潜能成体干细胞。

在此使用的细胞(诸如干细胞)的尺寸(Z)可以指(1)细胞生物学领域或干细胞领域中，对细胞的尺寸以及具代表性长度的惯用的定义、(2)细胞的直径，特别是当细胞基本上为球形时、(3)细胞长轴的长度，特别是当细胞基本上为椭球形时、(4)细胞的宽度，当细胞的形状具有大致的正方形形状时、(5)细胞的长度，当细胞的形状为大致的长方形形状时或(6)细胞的最大横截面或横向尺度。尺寸(Z)，不管是直径、长度、宽度或最大横截面或横向尺度，可使用例如从光学显微镜或从电子显微镜(如，扫描式电子显微镜(SEM))获得的细胞图像，或使用从流式细胞测量仪获得的细胞的数据(如，二维点图、等高线或密度图)确定或测得。从光学显微镜或电子显微镜获得的细胞图像可为细胞的二维(2D)横截面或三维(3D)结构。举例而言，细胞的尺寸(Z)可以通过测量从光学显微镜或电子显微镜(如，SEM)获得的2D横截面图像的最大横截面或横向尺寸而得。

术语“小型细胞”(如，小型成体干细胞)意指尺寸小于6微米(如，介于2.0与6.0微米之间)的细胞。术语“大型细胞”意指尺寸大于6微米的细胞。

CD349(+)SB细胞是多能或多潜能成体干细胞。CD349(+)SB细胞亦可为CD9(+)、Oct4(+)与Nanog(+)以及CD133(-)、CD90(-)、CD34(-)与Sox2(-)。各个CD349(+)SB细胞具有的尺寸等于或小于4、5或6微米，诸如0.1至6.0微米、0.5至6.0微米、1.0至6.0微米、2.0至6.0微米、0.1至5.0微米、0.5至5.0微米、1.0至5.0微米、0.1至4.0微米、0.5至4.0微米或1.0至4.0微米。优选地，所述尺寸大于2微米且小于6微米。

Lgr5(+)SB细胞是多能或多潜能成体干细胞。其亦可为Oct4(+)与Nanog(+)以及CD133(-)、CD66e(-)、CD4(-)、CD8(-)、CD9(-)、CD10(-)、CD11(-)、CD16(-)、CD17(-)、CD18(-)、CD19(-)、CD20(-)、CD21(-)、CD31(-)、CD42(-)、CD63(-)、CD34(-)、Lin(-)、CD38(-)、CD90(-)、CD45(-)、CD349(-)以及Sox2(-)。Lgr5(+)SB细胞的尺寸可等于或小于4、5或6微米，诸如0.1至6.0微米、0.5至6.0微米、1.0至6.0微米、2.0至6.0微米、0.1至5.0微米、0.5至5.0微米、1.0至5.0微米、0.1至4.0微米、0.5至4.0微米或1.0至4.0微米。优选地，Lgr5(+)SB细胞的尺寸大于2微米且小于6微米。

分裂球样干细胞(BLSCs)是CD66e(+)全能或多能成体干细胞。其分别可以具有的尺寸等于或小于4、5或6微米，诸如0.1至6.0微米、0.5至6.0微米、1.0至6.0微米、2.0至6.0微米、0.1至5.0微米、0.5至5.0微米、1.0至5.0微米、0.1至4.0微米、0.5至4.0微米或1.0至4.0微米。例如，BLSC可具有大于2微米且小于6微米的尺寸。

极小型胚胎样干细胞(VSELs)是多能成体干细胞，其可为CD133(+)或CD34(+)。VSEL亦可为CD45(-)以及Lin(-)。例如，VSEL可为CD133(+)、CD45(-)以及Lin(-)，或CD34(+)、CD45(-)以及Lin(-)。VSEL的尺寸可以等于或小于4、5或6微米，诸如0.1至6.0微米、0.5至6.0微米、1.0至6.0微米、2.0至6.0微米、0.1至5.0微米、0.5至5.0微米、1.0至5.0微米、0.1至4.0微米、0.5至4.0微米或1.0至4.0微米。VSEL的尺寸可大于2微米且小于6微米。

间质干细胞(MSCs)是多潜能成体干细胞。MSC可表达细胞表面标记CD13、CD29、CD44、CD73、CD90以及CD105中的一种或多种。MSCs构成非常异质的群组。一些类型的MSCs的尺寸可等于或小于4、5或6微米，诸如0.1至6.0微米、0.5至6.0微米、1.0至6.0微米、0.1至5.0微米、0.5至5.0微米、1.0至5.0微米的间、0.1至4.0微米的间、0.5至4.0微米或1.0至4.0微米。其它类型的MSCs的尺寸可大于6、7或10微米。

造血干细胞(HSCs)是多潜能成体干细胞。其可为CD34(+)、cKit(-)、CD38(-)、Lin(-)细胞，或CD150(+)、CD244(-)与CD48(-)细胞。HSCs的尺寸可等于或小于4、5或6微米，诸如0.1至6.0微米、0.5至6.0微米、1.0至6.0微米、0.1至5.0微米、0.5至5.0微米、1.0至5.0微米、0.1至4.0微米、0.5至4.0微米或1.0至4.0微米。

用于增加干细胞的操作

在此所使用的操作(X)是一种可在活体内(例如在受试人或非人受试者内)有效的增加一种或多种类型的干细胞的数量的操作。操作(X)可包括：

1.服用药物，诸如合成药物或天然来源的化合物；

2.服用药草或中药，诸如冬虫夏草(Cordyceps sinensis)、人参(ginseng)、枸杞(Lycium Chinense Mill)、灵芝(Ganoderma lucidum，lingzhi)、牛樟芝(aiwanofunguscamphoratus)和/或巴西蘑菇(Brazil mushroom)；

3.服用营养品或膳食补充物，诸如营养丸或粉，包括下列材料或元素：维生素(维生素A、B、复合维生素B、B₁₂、D、D₃、E等等)、巨量和/或微量矿物质(如，钙、钠、钾、氟、溴、铬、碘、硅、硒、铍、锂、钴、钒和/或镍)、多糖类、高分子量含岩藻糖的糖蛋白、海藻(包括绿藻、蓝绿藻、褐藻等)、岩藻糖、岩藻多糖(褐藻的主要组份)、低聚岩藻多糖、藻类、含岩藻多糖的褐藻(例如，在日本冲绳岛生长以及生产的褐藻)、日本水云(Japanese Mozuku)、绿藻、蓝绿藻(或蓝藻)、褐藻(包括水云(Mozuku)、昆布(kelp)、裙带菜(undaria)、羊栖菜(sargassumfusiforme)、裙带菜(pinnatifida)等)、植物性化合物(如，异黄酮或植物雌激素)、番茄红素(lycopene)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、绿茶素、糖质营养素(如，木糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺或N-乙酰神经胺酸)、鱼油、中国香椿(toonasinensis)和/或从植物、叶子、果实、蔬菜、鱼、海藻或藻类提取而得的营养素；

4.实行素食；

5.服用或食用健康食品或有机食品；

6.采用替代(非传统)医药；

7.接受替代疗法或治疗，诸如Gerson疗法或Breuss癌症疗法；

8.接受针灸；

9.接受按摩治疗，诸如脚部按摩；

10.运动，诸如走路、慢跑、跳舞、体操、瑜珈、有氧运动和/或太极拳(Chineseshadow exercise)；

11.睡觉(为测量睡眠质量的目的)；

12.冥想；

13.实施由个人、医疗专家人员或医生拟定的健康改善计划或疾病治疗计划；

14.服用某些用于改善身体中某些器官的健康的营养素，例如，服用番茄红素，用以改善前列腺的健康；

15.采取用以医治受伤或用以医治手术所导致的伤口或用以治愈疾病的修护计划；

16.服用药酒(或称为药用酒、酒剂或加药的酒)，例如，将一种中药材或多种中药材浸在烈酒或果酒中一段时间制得的药酒，诸如，将人参浸在高酒精浓度的米酒中一个月制得的人参酒；

17.服用一种或多种经政府部门或机构(诸如美国食品药品管理局(U.S.FDA))核准用于治疗特定疾病(如，某种类型的癌症、皮肤病、肾病和/或等等)的药物；

18.采用或接受经政府部门核准用于治疗特定疾病(如，某种类型的癌症、皮肤病或肾病)的治疗或疗法；

19.参与宗教活动，诸如祈求平静或祷告；

20.直接或间暴露于日光(早上，例如日出前10分钟与日出后50分钟之间(含有大量的红外(IR)光))；或中午时分，例如，11：30AM至12：30PM(含有大量的紫外(UV)光)；或下午，例如，日落前50分钟与日落后10分钟之间(含有大量的红外(IR)光))；

21.暴露于灯光或发光二极管(LED)的光，其可包括整个可见光光谱、IR光、红光、绿光、蓝光或UV光，或以上光线中一个以上的组合；

22.执行或接受用于改善身体自我修复的计划、治疗法、方法、装置和/或系统，例如，受伤或手术后进行的用于改善自我修复的方法或治疗法(如，高压氧治疗法)；

23.喝咖啡，诸如黑咖啡；

24.喝茶，诸如绿茶、红茶或茉莉花茶；

25.喝红酒；

26.服用褪黑激素；

27.听音乐，诸如莫扎特或贝多芬的交响曲；

28.注射含有岩藻多糖或低聚岩藻多糖的物质(如，营养品或补充物)；

29.服用激素补充剂或接受激素注射；

30.注射粒细胞集落刺激因子(G-CSF或GCSF)，其是一种糖蛋白；

31.接受一个疗程的GCSF注射；以及

32.服用含有下列的营养素、营养品、营养流体、营养饮料、营养液、营养食品：(1)各种氨基酸(诸如精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、缬氨酸、脯氨酸、甘氨酸、硒半胱氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸或色氨酸)、(2)平衡型氨基酸，或(3)9种人体必需的氨基酸(如，组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸以及缬氨酸)。例如：(a)由红豆、绿豆、黑豆的发酵产生或萃取而得的产物；(b)由水果或水果组合(诸如甜菜、苹果、番石榴(guava)、奇异果(kiwi)、葡萄、菠萝、火龙果(red pitaya)(龙果)、青木瓜、蕃茄和/或鳄梨等)的发酵产生的液体、流体或饮料；(c)如将一种中药材或多种中药材浸在烈酒或果酒中一段时间制得的药酒(或称为药用酒、酒剂或加药的酒)，诸如，将人参浸在高酒精浓度的米酒中一个月制得的人参药酒。

含干细胞的组合物

含干细胞的组合物(如，含干细胞的溶液)可使用图1中所示的流程图所描述的例示性方法制得。

参照图1，在步骤10中，受试者采用或接受操作(X)。其可以是上文提及的操作(X)中的一个。例如，所述受试者为人(如，儿童、青少年、成人或老年人)或非人动物。非人动物的例子包括灵长类动物(如，猴子或大猩猩)、狗、啮齿动物(如，小鼠或豚鼠)、猫、马、母牛、牛、绵羊、猪、鸡、鸭、鹅、鸟以及大象。

例如，在步骤10中，所述受试者可服用干细胞动员剂，诸如含岩藻多糖的化合物。所述含岩藻多糖的化合物可为褐藻补充物。图2示出褐藻补充物的成分。一粒褐藻补充物药丸含有80％的水云粉、15％的结晶纤维素、3％的蔗糖脂肪酸酯以及2％的微或细硅粉(含有二氧化硅)。从生长在日本冲绳岛附近海域中的水云褐藻(一种海藻)中可提取得水云粉。之后将水云粉与结晶纤维素、蔗糖脂肪酸酯以及微或细硅粉(含二氧化硅)混合，以形成褐藻补充物药丸，其含有0.1克的岩藻多糖。在步骤10中，受试者可服用20粒或更多粒(如，至少30粒)的褐藻补充物，或2克或更多(诸如至少3克)的岩藻多糖。在另一个实例中，于步骤10中，受试者可以注射粒细胞集落刺激因子(GCSF)，即，动员剂，或可使其接受一个疗程的GCSF注射。

在步骤10之后，进行步骤11，让受试者等候一段时间(如，一段预定的时间)，诸如介于15分钟与60分钟之间、20分钟与100分钟之间、30分钟与4小时之间、60分钟与90分钟之间、0.5小时与3小时之间、1小时与6小时之间、1小时与12小时之间、12小时与36小时之间或36小时与50小时之间。步骤10与11可使一种或多种特定类型的成体干细胞，诸如SB细胞(即，CD349(+)以及Lgr5(+)SB细胞)，从如受试者的骨髓移动进入受试者的外周血。所述受试者的外周血因此变为富含所述一种或多种特定类型的成体干细胞。例如，所述一种或多种特定类型的成体干细胞可为或可包括以上所述的成体干细胞中的一种或多种。例如，所述一种或多种特定类型的成体干细胞可为或可包括尺寸小于6微米，更优选地尺寸大于2微米的成体干细胞，诸如CD349(+)成体干细胞和/或Lgr5(+)成体干细胞。

步骤10以及11是任选的。换句话说，欲制造含干细胞的组合物，可在没有先在受试者上进行任何操作(X)的情况下，从所述受试者取得血液样品。

在步骤11后立即接着的步骤12中(假如进行了步骤10以及11的话)，从所述受试者的外周血中提取、抽出、取出、获得、收集或衍生出血液样品，然后置于一个或多个含有二价阳离子螯合剂的容器中(如，袋、一个或多个针筒或一个或多各个试管)。使血液样品与容器中的二价阳离子螯合剂混合，形成混合物。所述二价阳离子螯合剂，如，抗凝血剂，可为乙二胺四乙酸(EDTA)，诸如K2 EDTA抗凝血剂或K3 EDTA抗凝血剂，其具有如大于70mg、诸如90至900mg、120至450mg或150至400mg的重量。备选地，所述二价阳离子螯合剂可为具有下述重量的柠檬酸盐：如，大于70mg，诸如90至900mg、120至450mg或150至400mg。所述血液样品含有数种细胞，包括尺寸小于6微米的小型细胞以及尺寸大于6微米的大型细胞。所述小型细胞含有，例如，血小板以及尺寸小于6微米的小型成体干细胞。例如，所述小型成体干细胞含有一种或多种特定类型的成体干细胞(即，例如SB细胞)、BLSCs(即，CD66e(+)成体干细胞)以及VSELs(如，CD133(+)成体干细胞与CD34(+)成体干细胞)。所述大型细胞含有，例如，尺寸大于6微米的大型成体干细胞以及诸如红细胞与白细胞的谱系细胞。所述血液样品的体积可大于或等于45毫升，诸如60至500毫升、80至250毫升或100至200毫升。在一个实例中，血液样品可以每毫升血液样品与1.5mg或更多、诸如1.6至2.0mg的二价阳离子螯合剂(诸如K2 EDTA、K3 EDTA或柠檬酸盐)混合，在容器中形成混合物。

接着，在步骤13中，将所述混合物处理成含干细胞的溶液。所述处理可包括干细胞活化以及纯化/分离的步骤，诸如图3中所述的步骤21以及22。在此所使用的术语“纯化”或“分离”意指小型细胞(如，尺寸大于2微米以及小于6微米的细胞)与大型细胞(如，尺寸大于6微米的细胞)的实质性的分开，如，通过移除混合物或血液样品中的大型细胞，获得所述混合物或血液样品中的小型细胞的操作。

参照图3，于步骤21中，将在步骤12中形成的混合物贮存在2℃至12℃的温度，更佳地2℃至7℃，或在4℃，在适合的设备中(如，冰箱或其它用于保持东西冷度的装置)历时一段预定的时间。该段时间可介于3小时与72小时之间，更优选地3小时与6小时之间、6小时与72小时之间、6小时与48小时之间、16小时与72小时之间、16小时与48小时之间、36小时与60小时之间、48小时与72小时之间或大约48小时。在所述混合物已经贮存一段预定的时间之后，用二价阳离子螯合剂(诸如K2 EDTA、K3 EDTA或柠檬酸盐)活化所述混合物中的一种或多种特定类型的成体干细胞(如，SB细胞)，即，活化所述一种或多种特定类型的成体干细胞的细胞周期，使其从G0进入G1。所述活化涉及二价阳离子螯合剂抑制p53的功能的能力(假设藉由螯合Zn²⁺)，从而使所述一种或多种特定类型的成体干细胞(如，SB细胞)离开其细胞周期的G0静止阶段进入G1阶段。因为p53蛋白需要Zn²⁺才能正确折叠而形成功能蛋白，所以利用二价阳离子螯合剂螯合Zn²⁺可能是活化所述一种或多种特定类型的成体干细胞(如，SB细胞)的关键步骤。也有可能是，二价阳离子螯合剂能够螯合其它二价离子(如，Ca²⁺)，从而活化所述一种或多种特定类型的成体干细胞，迫使其增生以及扩张。

在步骤21中，所述混合物因重力而分成多个分离层，包括上层以及下层。所述上层，或上清液，可具有20至250毫升、40至125毫升或50至100毫升的体积。所述上层含有血小板、血清以及一种或多种特定类型的小型成体干细胞(即，例如SB细胞)、BLSCs(即，CD66e(+)成体干细胞)以及VSELs(如，CD133(+)成体干细胞以及CD34(+)成体干细胞)。下层中是包含血液样品的谱系细胞和大型成体干细胞的大部分大型细胞，如血液样品中大于95％、98％或99％的大型细胞。上清液的体积与血液样品的体积的比率可在三分之一至二分之一的范围内。

接着，在步骤22中，可收集基本上所有的上层，或将其转移至液体容器中，诸如袋、针筒或玻璃瓶，用以产生含干细胞的溶液或干细胞混合物。所述上层，如，含干细胞的溶液，含有小型细胞，其包括血小板以及小型成体干细胞。在该含干细胞的溶液中，小型成体干细胞的数目可大于或等于1千万个(如，大于或等于3千万个、大于或等于5千万个、1千万至5亿个、2千5百万至3亿个或3千万至5亿个)。所述含干细胞的溶液亦可包含二价阳离子螯合剂(如，EDTA)和/或生长因子。

此外，所述含干细胞的溶液几乎不包括或基本上排除大型细胞(如，大型成体干细胞以及谱系细胞)。例如，大型细胞可占小于所述含干细胞的溶液的细胞总数目的5％(如，小于1％、0.5％或0.01％)。例如，所述含干细胞的溶液(如，收集到的上层)中，红细胞的数目可小于10⁵或10⁴个/毫升。优选地，每毫升所述含干细胞的溶液中红细胞的数目小于10³个。每毫升所述含干细胞的溶液中白细胞的数目可小于10⁴个(如，小于10³个)。优选地，每毫升所述含干细胞的溶液中白细胞的数目小于10²个。

所述含干细胞的溶液的全部细胞中，大于95％(如，99％或99.99％)可为小型细胞。所述小型细胞可包括血小板、Lgr5(+)细胞、CD349(+)细胞、CD133(+)细胞、CD34(+)以及CD66e(+)细胞。血小板可占所述含干细胞的溶液中的小型细胞的75％至85％。所述全部的小型细胞中，大于4％(如，大于5％或介于4.5％与10％之间)可为Lgr5+成体干细胞。CD349(+)成体干细胞可占大于所述含干细胞的溶液的全部的小型细胞中的4％(如，大于5％或介于4.5％与10％之间)。所述小型细胞中，小于2％(如，小于1％或0.5％)可为CD133(+)细胞以及CD34(+)细胞的组合。所述小型细胞中，小于6％(如，小于5％或4.5％)可为CD66e(+)细胞。

使用流式细胞测量术或其它常规技术(如，基于抗体的技术，诸如抗体-缀合的珠子)，也可以从收集到的上层中进一步分离出任一种特定的小型细胞。

所收集到的上层可用作含干细胞的溶液(如，施用至受试者或贮存起来)，或进一步处理。例如，可进一步将其纯化(如，过滤)或与一种或多种额外的组分混合。可向所收集到的上层中加入体积如大于400毫升、诸如500至900毫升的适合的无Ca²⁺细胞介质或溶液，用以制造含干细胞的溶液。所述适合的无Ca²⁺介质或溶液，诸如含NaCl溶液，可进一步不含任何的二价离子，包括Mg²⁺。例如，所述含NaCl溶液可为生理盐水(如，具有0.90％w/v的NaCl、约300mOsm/L或每升9.0克的溶液)。

可将所述含干细胞的溶液贮存在冷冻贮存温度下，如，等于或小于-70℃或-80℃(如，-75℃至-85℃)，历时一段很长的时间(如，超过一周、一个月或一年)。当准备使用时，可快速地解冻所述冷冻的含干细胞的溶液，以及任选地与之前所述的适合的无Ca²⁺介质或溶液(如，0.9％NaCl)混合。抑制组蛋白去乙酰酶(HDAC)的活性

通过以上所述的工序产生的含干细胞的溶液或组合物可用于抑制HDAC活性。

例如，可向受试者施用(如，静脉注射)所述含干细胞的组合物，用以抑制或减少所述受试者中的HDAC活性。例如，所述治疗可减少所述受试者至少20％，如，至少30％、40％、50％、60％、70％或更高的HDAC活性。可以向受试者施用自体或同种异体成体干细胞。

HDACs在后生的调节(epigenetic regulation)中扮演关键的角色，其参与许多生物学过程以及疾病。后生修饰是可逆的。然而，其在某些疾病中可能会不平衡或异常。已经表明，HDACs为许多疾病的有前途的药物标靶，包括癌症、神经变性病症、免疫病症、糖尿病以及心血管疾病。见，如，Arguelles等人，Drug Discovery Today，21(3)：499-509(2015)：Abel和Zukin，Curr.Opin.Pharmacol.，8(1)：57-64(2008)；Irwin等人，Drug DevelopmentResearch，77：109-123(2016)；以及Huang，Journal of Cellular Physiology，209：611-616(2006)。因为含干细胞的溶液是HDAC抑制剂，其可用于调整这些过程以及治疗所述疾病。

例如，谱系重编程(亦称作转分化)是一种过程，其中一种成熟的体细胞可在没有经历中间多能状态或祖先细胞类型的情况下转形成另一种成熟的体细胞。所述过程涉及不同后生状态之间的转变。因此，后生的调节在谱系重编程方面扮演关键的角色。因此，向受试者施用本文所述的含干细胞的溶液可调节所述受试者中的谱系重编程。例如，含干细胞的溶液可指导第一类型的终末分化细胞回转或转化为(i)所述第一类型的终末分化细胞上游的体细胞，或(ii)不同类型的终末分化细胞。

据此，在此所述的含干细胞的组合物可用作为HDAC抑制剂，用于治疗，例如，免疫病症(如，自体免疫病症或炎性病症)、神经变性或神经系统病症、病毒感染、癌症或糖尿病。

自体免疫病症或炎性病症包括，但不限于，全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎、舍格伦综合征(Sjogren’s syndrome)、强直性脊柱炎、血小板减少性紫瘢病(thrombocytopenic purpura，)、桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、格雷氏病(Graves’disease)、Grover氏病(Grover’s disease)、多发性硬化症、炎性皮肤病以及炎性肠病。

神经变性疾病包括，例如，精神分裂症(schizophrenia)、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈症、多发性硬化症以及肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症(amyotrophic lateralsclerosis，ALS)。

可治疗的癌症可为，如，淋巴瘤(诸如皮肤T细胞淋巴瘤、周边T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或弥漫性大型B细胞淋巴瘤)、肺癌(诸如非小细胞肺癌或支气管癌)、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、结直肠癌、多发性骨髓瘤、肝癌(诸如肝细胞癌或肝内胆管上皮癌(intrahepatic cholangiocarcinoma))、肾癌、胃癌、皮肤癌(诸如黑色素癌)、甲状腺癌、食道癌、脑癌、胰腺癌、口腔癌、咽喉癌(诸如咽癌或喉癌)、宫颈癌、骨癌、膀胱癌、白血病或原位癌。

病毒感染(或病毒感染引起的疾病)可为HIV感染、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、疱疹病毒感染(如，HCMV、HSV或EBV感染)或HBV感染。

含干细胞的组合物可用于治疗1型糖尿病(或称作糖尿病1型)或2型糖尿病(或称作糖尿病2型)。

利用针对特殊疾病或病症的标准诊断技术，可鉴别出可接受以上所述的疾病或病症中的一种的治疗的受试者。“治疗”意指向患有疾病或病症或具有发生所述疾病或病症风险的受试人施用组合物、药剂或物质(如，含干细胞的溶液)，目的为治愈、减轻、解除、改正、延迟发生、预防或改善所述疾病或病症、所述疾病或病症的症状、所述疾病或病症继发的疾病状态或易患所述疾病或病症的倾向。“有效量”意指在治疗的受试者中能够产生所需要的(医疗)结果的组合物、药剂或物质的量。所述治疗方法可单独进行，或结合其它药物或治疗法一起进行。

在向受试者施用所述含干细胞的组合物之前或之后(或二者)，评估从所述受试者获得的样品(如，外周血样品或受被治疗的疾病影响的组织样品)中的HDAC活性。例如，可分析从样品制得的细胞核提取物或HDAC蛋白中的HDAC活性。施用后HDAC活性减少(如，至少20％、30％、40％、50％、60％、70％或更高)表明所述含干细胞的溶液有效抑制受试者中的HDAC活性。HDAC活性减少亦可表明所述治疗能有效治疗以上所述的病症中的一种。还可以利用在施用所述含干细胞的组合物之后或一个施用疗程期间受试者中的HDAC活性水平做出治疗决定，如继续或中止治疗，或决定治疗频率。用于分析HDAC活性的技术以及试剂是本领域已知的。HDAC活性测定试剂盒也是可商购的。

以下的具体实施例仅作为例示说明的解释，无论如何不能以任何方式用来限制公开内容的剩余部分。据信，根据在此的说明书，本领域技术人员可在没有进一步的详细叙述的情况下，以其最大程度使用本公开内容。在此所引述的所有的公布的完全并入本文以为参考。

实施例

实施例1：干细胞动员剂的作用

使用以上所述的工序，使用从六名受试人取得的外周血样品，制备含干细胞的溶液。亦可见图1以及图3。

受试人C、L、M、W以及Y各口服20粒图2中所述的褐藻补充物药丸。也就是说，受试者C、L、M、W以及Y各口服至少2克的岩藻多糖。受试人P作为对照组，没有服用褐藻补充物。在受试者服用所述丸剂之前以及之后采集样品。

如图4所示，发现在四个受试者中，服用褐藻补充物之后1.5小时的SB细胞(即，CD349(+)SB细胞以及Lgr5(+)SB细胞)的数目显著的增加。在对照受试者中没有发现增加。数据显示出，服用岩藻多糖，如褐藻补充物，可动员SB细胞(如，CD349(+)SB细胞以及Lgr5(+)SB细胞)进入外周血(或血流)并使外周血富含SB细胞。在图4中，0小时代表受试人C、L、M、W以及Y在“服用岩藻多糖前”，且代表受试人P在“对照测试开始时”；1.5小时代表受试人C、L、M、W以及Y在“服用岩藻多糖后1.5小时时”，且亦代表受试人P在“对照组测试开始后1.5小时时”；24小时代表“受试人C、L、M、W以及Y在“服用岩藻多糖后24小时时”，且亦代表受试人P在“对照测试开始后24小时时”。

亦评估GCSF对SB细胞的动员的影响。连续5天，对受试人注射单剂5微克/kg/天的GCSF。在第一次注射之前，从受试者取得第一外周血样品，而在最后注射之后3.5小时，从受试者取得第二外周血样品。相较于第一样品，在第二样品中发现Lgr5+SB细胞数目显著增加。

两个样品的流式细胞测量术数据示于图5A以及5B中。在这两个附图中，区域Q5-LR中的黑点代表Lgr5(+)细胞。在第一外周血样品方面，如图5A所示，区域Q5-LR中Lgr5(+)细胞的数目为区域Q5-UL、Q5-UR、Q5-LL以及Q5-LR中细胞总数目的1.6％。在第二外周血样品方面，如图5B所示，区域Q5-LR中Lgr5(+)细胞的数目为区域Q5-UL、Q5-UR、Q5-LL以及Q5-LR中细胞总数目的8％。因此，GCSF可动员SB细胞(特别是Lgr5(+)细胞)进入外周血(或血流)，并使外周血富含SB细胞。

以上所述的数据显示，服用褐藻补充物或接受一个疗程的GCSF注射可动员SB细胞进入受试者的外周血。

实施例2：含干细胞的溶液中的细胞

依照以上所述以及图1与图3中例示说明的方法，使用从受试者取得的外周血样品制备含干细胞的溶液。分析所述含干细胞的溶液中的细胞含量。

以图6A与6B中所示的数据为基础，计算每毫升所述含干细胞的溶液中红细胞的数目。图6A是用流式细胞测量仪分析10微升(μl)所述含干细胞的溶液所获得的。红细胞(即，CD235a(+)细胞)显示在图6A的区域R3中；图6A的区域R3中全部的细胞数目为25000个。图6B显示图6A的区域R3中全部细胞中CD235a的荧光强度的分布。在图6B中，荧光直方图被垂直线2a(即，参考值)分成具有低荧光强度的区域V3-L以及具有高荧光强度的区域V3-R。图6B的区域V3-R代表CD235a染色为阳性的细胞，即，红细胞；图6B的区域V3-L代表CD235a染色为阴性的细胞。图6B的结果表明，图6A的区域R3中的红细胞数目占图6A的区域R3中全部细胞数目的百分比为0.1％。将区域R3中全部细胞数目，即，25000个，乘以图6A的区域R3中的红细胞的数目占图6A的区域R3中全部细胞数目的百分比，即0.1％，得到在10微升的所述含干细胞的溶液中的红细胞的数目为25个。从10微升的所述含干细胞的溶液中的红细胞的数目计算每毫升所述含干细胞的溶液中的红细胞的数目，并且发现等于2500。

以图6C中流式细胞测量术数据为基础，计算每毫升所述含干细胞的溶液中白细胞的数目。图6C中的流式细胞测量术数据是通过分析50微升(μl)所述含干细胞的溶液所获得的。在图6C中，区域R1是白细胞(WBC)圈选(gating)。以图6C中流式细胞测量术数据为基础，计算每50微升所述含干细胞的溶液中的白细胞的数目，并且发现等于30个。因此，从50微升所述含干细胞的溶液中的白细胞数目，计算每毫升所述含干细胞的溶液中的白细胞数目，并且发现等于600个。

图7A显示前向散射(FSC)对侧向散射(SSC)的流式细胞测量术点图，其是以流式细胞测量仪分析5.6微升(μl)的所述含干细胞的溶液而得。在图7A中，区域R5代表尺寸小于6微米且大于2微米的细胞。也就是说，区域R5中全部细胞的尺寸均大于2微米且小于6微米。图7B显示图7A的区域R5中全部细胞中CD61荧光强度的分布。在图7B中，荧光直方图被垂直线(即，参考值)分成具有低荧光强度的区域V1-L以及具有高荧光强度的区域V1-R。图7B的区域V1-R代表CD61染色为阳性的细胞，即，血小板；图7B的区域V1-L代表CD61染色为阴性的细胞。7B的结果表明，区域R5中血小板的数目为区域5中全部细胞的80.5％。

图7C显示图7A的区域R5中全部细胞中的CD133荧光强度的分布。图7C中，荧光直方图被垂直线(即，参考值)分成具有低荧光强度的区域V3-L以及具有高荧光强度的区域V3-R。图7C的区域V3-R代表CD133染色为阳性的细胞，即VSELs；图7C的区域V3-L代表CD133染色为阴性的细胞。图7C的结果表明，区域R5中CD133(+)细胞的数目的百分比为区域R5中全部细胞的数目的0.3％。图7D显示图7A的区域R5中全部细胞中CD34荧光强度的分布。在图7D中，荧光直方图被垂直线(即，参考值)分成具有低荧光强度的区域V1-L以及具有高荧光强度的区域V1-R。图7D的区域V1-R代表CD34染色为阳性的细胞，即VSELs；图7D的区域V1-L代表CD34染色为阴性的细胞。图7D的结果表明，区域R5中CD34(+)细胞的数目为该区域中全部细胞的数目的0.4％。

图7E显示图7A的区域R5中全部细胞中CD66e荧光强度的分布。在图7E中，荧光直方图被垂直线(即，参考值)分成具有低荧光强度的区域V2-L以及具有高荧光强度的区域V2-R。图7E的区域V2-R代表CD66e染色为阳性的细胞，即BLSCs；图7E的区域V2-L代表CD66e染色为阴性的细胞。图7E的结果表明，区域R5中CD66e(+)细胞的数目为该区域中全部细胞的数目的4％。

图7F显示图7A的区域R5中全部细胞中CD349荧光强度的分布。在图7F中，荧光直方图被垂直线(即，参考值)分成具有低荧光强度的区域V3-L以及具有高荧光强度的区域V3-R。图7F的区域V3-R代表CD349染色为阳性的细胞，即SB-1细胞；图7F的区域V3-L代表CD349染色为阴性的细胞。图7F的结果表明，区域R5中CD349(+)细胞的数目为该区域中全部细胞的数目的5.6％。

图7G显示图7A的区域R5中全部细胞中Lgr5荧光强度的分布。在图7G中，荧光直方图被垂直线(即，参考值)分成具有低荧光强度的区域V2-L以及具有高荧光强度的区域V2-R。图7G的区域V2-R代表Lgr5染色为阳性的细胞，即SB-2细胞；图7G的区域V2-L代表Lgr5染色为阴性的细胞。图7G的结果表明，区域R5中Lgr5(+)细胞的数目为该区域中全部细胞的数目的5.4％。

实施例3：用于抑制HDAC活性的含干细胞的溶液

用从十个受试人采取的外周血样品制备含干细胞的溶液。受试者分别摄取20粒图2中所述的褐藻补充物药丸。在摄入后1.5小时，从每名受试者抽取150毫升外周血样品。各血液样品取20毫升(之后称作“20毫升血液样品”)通过流式细胞测量仪进行分析，以获得样品中特定成体干细胞的数目。所述特定成体干细胞是尺寸大于2微米且小于6微米的小型成体干细胞，包括Lgr5(+)成体干细胞、CD349(+)成体干细胞、CD66e(+)成体干细胞、CD133(+)成体干细胞以及CD34(+)成体干细胞。依照以上所述的程序处理各种剩下的外周血样品，以获得约65毫升的含干细胞的溶液。各含干细胞的溶液含有所述小型成体于细胞。以相应的20毫升血液样品中成体于细胞的数目为基础，计算或评估各含干细胞的溶液中成体干细胞的数目。

使含干细胞的溶液分别与500毫升盐水混合。这十位受试人分别静脉内注射包含其各自的干细胞的溶液。表1显示各种含干细胞的溶液中成体干细胞的数目。

表1

测定从这十位受试人每一位的外周血样品获得的纯化的有核细胞中的HDAC活性。从针对每名受试者进行的二次相同的实验，计算出平均HDAC活性。如以下表2所示，发现在静脉内注射所述含干细胞的溶液后48小时，各受试者中的HDAC活性显著减少(至少22％)。

图8是表2中所示的平均HDAC活性的散布图(带线性回归线)。如图8所示，静脉内注射所述含干细胞的溶液之前的平均HDAC活性，与注射后48小时对应的HDAC活性减少的百分比之间的判定系数(即，R²)大如0.7346，其表明这两个变量之间的关系很强。该图显示出，注射前HDAC活性越高，注射后48小时的HDAC活性的减少百分比越高。

以上所述的数据表明，所述含干细胞的溶液可显著地减少受试人中的HDAC活性。

表2

实施例4：用于抑制患者中HDAC活性的含干细胞的溶液

对各名具有神经变性病症、自体免疫病症或糖尿病的患者，以使用以上所述的工序制备的包含其各自的干细胞的溶液进行治疗。

针对各名患者，取得在治疗之前以及之后的HDAC活性以及临床评估。结果显示在下表3、4以及5中。结果显示出，在施用含干细胞的溶液后，HDAC活性减少，且患者的临床评估有相应的改善。

表3

表4

表5

其它实施方案

所有在此说明书中所公开的特征可以任意组合方式进行结合。在此说明书中所公开的各个特征可用提供相同、相等或相似目的的替代特征取代。因此，除非明确说明，否则所公开的各个特征仅是通用系列的相等或相似特征的例子。

从以上的说明，熟本领域技术人员可轻易地弄清所述的实施方案的主要特征，以及在不背离其精神和范围的情况下，可以对实施方案做出各种的改变以及改进，以便使其适合各种用途以及条件。因此，其它实施方案亦落在权利要求书内。

Claims (22)

1.一种抑制组蛋白去乙酰酶活性的方法，其包括对有此需要的接受体受试者施用组合物，所述组合物包含有效量的尺寸大于2微米且小于6微米的小型成体干细胞，其中所述小型成体干细胞包括CD349(+)成体干细胞和Lgr5(+)成体干细胞。

2.权利要求1的方法，其进一步包括在所述施用步骤之前，测定所述接受体受试者中的组蛋白去乙酰酶活性。

3.权利要求2的方法，其进一步包括在所述施用步骤之后，测定所述接受体受试者中的组蛋白去乙酰酶活性。

4.权利要求1的方法，其进一步包括在所述施用步骤之前以及之后，测定所述接受体受试者中的组蛋白去乙酰酶活性。

5.权利要求4的方法，其中所述测定步骤通过测量从所述接受体受试者获得的外周血样品中的有核细胞中的组蛋白去乙酰酶活性进行。

6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述组合物是经静脉内施用的注射溶液。

7.权利要求6的方法，其中所述组合物包含1千万至5亿个所述小型成体干细胞。

8.权利要求7的方法，其中所述组合物包含二价阳离子螯合剂。

9.权利要求8的方法，其中所述注射溶液是以包括下列的工序制得：

提供包含血液样品以及二价阳离子螯合剂的混合物；

将所述混合物在2℃至12℃的温度贮存3至72小时，由此所述混合物分离成上层以及下层，其中所述上层含有所述小型成体干细胞；以及

收集所述上层，由此制得所述注射溶液。

10.权利要求9的方法，其中所述血液样品是从所述接受体受试者或捐献受试者获得的。

11.权利要求10的方法，其中在获得所述血液样品之前，对所述接受体受试者或捐献受试者进行增加干细胞数目的操作。

12.权利要求11的方法，其中所述操作是施用岩藻多糖或粒细胞集落刺激因子。

13.权利要求9的方法，其中以每毫升所述血液样品1.5至2.0mg二价阳离子螯合剂向所述血液样品中加入二价阳离子螯合剂，以获得所述混合物。

14.权利要求13的方法，其中所述二价阳离子螯合剂是乙二胺四乙酸(EDTA)。

15.权利要求9的方法，其中所述用于制备所述注射溶液的工序进一步包括，在收集所述上层之后，向所收集到的上层中加入药学上可接受的赋形剂。

16.权利要求15的方法，其中所述药学上可接受的赋形剂是盐水溶液。

17.权利要求6的方法，其中所述小型成体干细胞包括CD133(+)细胞、CD34(+)细胞以及CD66e(+)细胞。

18.权利要求6的方法，其中所述接受体受试者具有自体免疫病症、糖尿病、癌症、神经变性病症或病毒感染。

19.权利要求18的方法，其中所述接受体受试者具有痴呆症、帕金森病、关节炎、强直性脊柱炎或糖尿病。

20.一种用于减少受试者中的组蛋白去乙酰酶活性的注射组合物，其中所述组合物包含有效量的尺寸大于2微米且小于6微米的小型成体干细胞，所述小型成体干细胞包括CD349(+)成体干细胞以及Lgr5(+)成体干细胞。

21.权利要求20的注射组合物，其中所述受试者具有自体免疫病症、糖尿病、癌症、神经变性病症或病毒感染。

22.权利要求21的注射组合物，其中所述受试者具有痴呆症、帕金森病、关节炎、强直性脊柱炎或糖尿病。