CN110099921A - 体干细胞用于降低il-6水平的用途 - Google Patents

Abstract

一种在受试者中降低IL‑6水平的方法，其包括：鉴定需要它的受试者；以及施用给该受试者含有在尺寸上大于2微米并且小于6微米的小细胞的组合物；其中所述小细胞包括下列体干细胞：(i)多能的；和(i)CD349(+)、CD9(+)、Oct4(+)、Nanog(+)、Lgr5(+)、CD66e(+)、CD133(+)或CD34(+)。

Description

体干细胞用于降低IL-6水平的用途

相关申请案的交互参考

这个申请案主张于2016年12月23日所提申的美国临时申请案第62/438,699号的优先权，它的内容由此以它的整体在此被并入本案以做为参考数据。

背景

白细胞介素6(Interleukin 6，IL-6)是一种在发炎和B细胞的成熟中作用的白细胞介素。该蛋白质主要在急性和慢性发炎的地址被产生，其中它被分泌以诱发转录性发炎反应。IL-6涉及广泛的各种不同的发炎疾病，诸如糖尿病(diabetes)和类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)。

1型糖尿病(Type l diabetes)起因于胰脏无法产生足够的胰岛素。胰岛素的缺乏导致高血糖水平。I型糖尿病的病因未知。它一般而言被认为涉及导致对于β细胞的自体免疫反应的遗传和环境因素。终生的胰岛素治疗被需要用于生存。

概要

在一方面，在此所描述的是一种在受试者中降低IL-6水平的方法。该方法包括鉴定需要它的受试者；以及施用给该受试者含有在尺寸上大于2微米并且小于6微米的小细胞的组合物；其中所述小细胞包括下列体干细胞：(i)多能的；和(i)CD349(+)、CD9(+)、Oct4(+)、Nanog(+)、Lgr5(+)、CD66e(+)、CD133(+)或CD34(+)。

在一些实施方案中，该鉴定步骤包括检测在从该受试者所获得的生物样品中的如相较于对照水平之增加的IL-6水平。该被鉴定的受试者可具有与升高的IL-6水平有关的病况或能够通过降低IL-6水平(例如，使用IL-6拮抗剂)而被治疗的病况。例如，该受试者可具有I型糖尿病。

在该被施用给该受试者的组合物中的所述小细胞可进一步包括血小板。例如，75％至85％的所述小细胞可以是血小板以及20％至25％的所述小细胞可以是体干细胞。在一些实施方案中，该组合物含有1000万至5亿受试者干细胞。

在一些实施方案中，该组合物通过包括下列的方法而被制备：提供含有从该受试者或供体受试者所获得的血液样品和二价阳离子螫合剂的混合物；在于2℃与12℃之间的温度下储存该混合物历时3至72小时，由此该混合物分离成上层和下层，其中该上层含有小细胞的群体；以及收集该上层，由此制备该组合物。每毫米的该血液样品1.5至2.0mg的该二价阳离子螫合剂可被混合以该血液样品以获得该混合物。优选地，该二价阳离子螫合剂是EDTA。

选择性地，在获得该血液样品以制备该组合物之前，用于增加干细胞数目的动作在该受试者或供体受试者上被执行。该动作可以是施用有效量的岩藻多糖(fucoidan)或粒细胞集落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor)。

用于制备该组合物的方法可进一步包括，在收集该上层之后，添加药学上可接受的赋形剂至该被收集的上层。备选地，该方法可进一步包括，在收集该上层之后，离心该上层以获得细胞沉淀物。该沉淀物可进一步被清洗并且被悬浮在药学上可接受的赋形剂中。该药学上可接受的赋形剂可以是没有二价离子的药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，该药学上可接受的赋形剂是盐水溶液。

在一些实施方案中，该方法进一步包括，在该施用步骤之后，检测在该施用步骤之后在从该受试者所获得的生物样品中的IL-6水平。

在另一个方面，在此所描述的是一种用于在受试者中降低IL-6的水平的组合物。该组合物含有在尺寸上大于2微米并且小于6微米的小细胞，其中所述小细胞包括下列体干细胞：(i)多能的；和(i)CD349(+)、CD9(+)、Oct4(+)、Nanog(+)、Lgr5(+)、CD66e(+)、CD133(+)或CD34(+)。

一个或多个实施方案的细节在随文所附的附图和下列描述中被提出。所述实施方案的其他特征、目标和优点从描述和附图以及从申请专利范围将是显而易见的。

附图简要说明

图1是显示在被治疗以SB细胞组合物的I型糖尿病病患中的IL-6和HbA1c的水平的图。

详细描述

被意外地发现的是：一种含有某些小体干细胞(例如，Lgr5(+)或CD349(+)细胞)的组合物可在受试者中降低IL-6水平。因此，在此所描述的是用于在受试者中降低IL-6水平、用于治疗与升高的IL-6水平有关的病况或者用于治疗能够通过IL-6拮抗剂而被治疗的病况的方法和组合物。

体干细胞

有各种不同类型的体干细胞，包括全能干细胞(totipotent stem cells)、多能干细胞(pluripotent stem cells)、多潜能干细胞(multipotent stem cells)以及先祖干细胞(progenitor stem cells)(也被称为单能干细胞(unipotent stem cells))。分裂球样干细胞(blastomere-like stem cells，BLSC)是全能或多能体干细胞。极小胚胎样干细胞(very small embryonic-like stem cells，VSEL)是多能体干细胞。SB细胞是多能或多潜能体干细胞。间质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)和造血干细胞(hematopoieticstem cell，HSC)是多潜能体干细胞。

如此处所用的，细胞(诸如干细胞)的尺寸(Z)可意指(1)在细胞生物学的领域或干细胞的领域中细胞的尺寸或代表长度的常规定义，(2)细胞的直径(特别是当该细胞实质上是球形时)，(3)细胞的长轴的长度(特别是当该细胞实质上是椭圆形时)，(4)细胞的宽度(当该细胞的形状具有正方形的近似形状时)，(5)细胞的长度(当该细胞的形状具有矩形的近似形状时)，或者(6)细胞的最大横断面或横向尺寸，该尺寸(Z)(不管直径、长度、宽度或最大横断面或横向尺寸)可例如使用从光学显微镜或从电子显微镜(例如，扫描式电子显微镜(SEM))所获得的细胞影像或使用从流式细胞仪所获得的细胞的数据(例如，二维点、轮廓或密度图)而被测定或测量。从光学显微镜或电子显微镜所获得的细胞的影像可能是该细胞的二维的(2D)横断面或三维的(3D)结构。作为实例，细胞的尺寸(Z)能够通过在从光学显微镜或电子显微镜(例如，SEM)所获得的2D横断面影像中测量细胞的最大横断面或横向尺寸而被获得。

术语“小细胞”(例如，小体干细胞)意指具有尺寸小于6微米(例如，在2.0与6.0微米之间)的细胞。术语“大细胞”意指具有尺寸大于6微米的细胞。

CD349(+)SB细胞是多能或多潜能体干细胞。CD349(+)SB细胞也可以是CD9(+)、Oct4(+)和Nanog(+)，以及CD133(-)、CD90(-)、CD34(-)和Sox2(-)。CD349(+)SB细胞各个具有相等于或小于4、5或6微米的尺寸，诸如在0.1与6.0微米之间、在0.5与6.0微米之间、在1.0与6.0微米之间、在2.0与6.0微米之间、在0.1与5.0微米之间、在0.5与5.0微米之间、在1.0与5.0微米之间、在0.1与4.0微米之间、在0.5与4.0微米之间，或在1.0与4.0微米之间。优选地，该尺寸是大于2微米并且小于6微米。

Lgr5(+)SB细胞也是多能或多潜能体干细胞。它们也可以是Oct4(+)和Nanog(+)，以及CD133(-)、CD66e(-)、CD4(-)、CD8(-)、CD9(-)、CD10(-)、CD11(-)、CD16(-)、CD17(-)、CD18(-)、CD19(-)、CD20(-)、CD21(-)、CD31(-)、CD42(-)、CD63(-)、CD34(-)、Lin(-)、CD38(-)、CD90(-)、CD45(-)、CD349(-)和Sox2(-)。Lgr5(+)SB细胞的尺寸可以是相等于或小于4、5或6微米，诸如在0.1与6.0微米之间、在0.5与6.0微米之间、在1.0与6.0微米之间、在2.0与6.0微米之间、在0.1与5.0微米之间、在0.5与5.0微米之间、在1.0与5.0微米之间、在0.1与4.0微米之间、在0.5与4.0微米之间或在1.0与4.0微米之间。优选地，Lgr5(+)SB细胞在尺寸上是大于2微米并且小于6微米。

分裂球样干细胞(BLSC)是CD66e(+)全能或多能体干细胞。它们各个可具有相等于或小于4、5或6微米的尺寸，诸如在0.1与6.0微米之间、在0.5与6.0微米之间、在1.0与6.0微米之间、在2.0与6.0微米之间、在0.1与5.0微米之间、在0.5与5.0微米之间、在1.0与5.0微米之间、在0.1与4.0微米之间、在0.5与4.0微米之间或在1.0与4.0微米之间。例如，BLSC可具有大于2微米并且小于6微米的尺寸。

极小胚胎样干细胞(VSEL)是多能体干细胞，它可以是CD133(+)或CD34(+)。VSEL也可以是CD45(-)和Lin(-)。例如，VSEL可以是CD133(+)、CD45(-)和Lin(-)，或者CD34(+)、CD45(-)和Lin(-)。VSEL的尺寸可以是相等于或小于4、5或6微米，诸如在0.1与6.0微米之间、在0.5与6.0微米之间、在1.0与6.0微米之间、在2.0与6.0微米之间、在0.1与5.0微米之间、在0.5与5.0微米之间、在1.0与5.0微米之间、在0.1与4.0微米之间、在0.5与4.0微米之间或在1.0与4.0微米之间。VSEL在尺寸上可以是大于2微米并且小于6微米。

间质干细胞(MSC)是多潜能体干细胞。MSC可表现细胞表面标记CD13、CD29、CD44、CD73、CD90和CD105的一个或多个。MSC构成非常异质的群体。一些类型的MSC在尺寸上可能是相等于或小于4、5或6微米，诸如在0.1与6.0微米之间、在0.5与6.0微米之间、在1.0与6.0微米之间、在0.1与5.0微米之间、在0.5与5.0微米之间、在1.0与5.0微米之间、在0.1与4.0微米之间、在0.5与4.0微米之间或在1.0与4.0微米之间。其他类型的MSC在尺寸上可能是大于6、7或10微米。

造血干细胞(HSC)是多潜能体干细胞。它们可以是CD34(+)、cKit(-)、CD38(-)、Lin(-)细胞或CD150(+)、CD244(-)和CD48(-)细胞。HSC在尺寸上可以是相等于或小于4、5或6微米，诸如在0.1与6.0微米之间、在0.5与6.0微米之间、在1.0与6.0微米之间、在0.1与5.0微米之间、在0.5与5.0微米之间、在1.0与5.0微米之间、在0.1与4.0微米之间、在0.5与4.0微米之间或在1.0与4.0微米之间。

用于增加干细胞的动作

如此处所用的动作(X)是对于在活体内(例如，在人类受试者或非-人类受试者)增加一个或多个类型的干细胞的数目可能是有效的动作。动作(X)可包括：

1.服用药物，诸如合成药物或衍生自自然界的化合物；

2.服用草药或中草药，诸如冬虫夏草(Cordyceps sinensis)、人参(ginseng)、枸杞(Lycium Chinense Mill)、灵芝(Ganoderma lucidum)(灵芝(lingzhi))、牛樟芝(Taiwanofungus camphorates)和/或巴西蘑菇(Brazil mushroom)；

3.服用包括下列物质或元素的营养物或膳食补充物(诸如营养丸剂或粉末)：维生素(维生素A、B、B群、B₁₂、D、D₃、E等等)、常量(macro)和/或微量矿物质(trace minerals)(例如，钙、钠、钾、氟、溴、铬、碘、硅、硒、铍、锂、钴、钒和/或镍、多醣、高分子量含有海藻糖的醣蛋白(high molecular weight fucose-containing glycoproteins)、海藻(包括绿藻、蓝绿藻、褐藻等等)、海藻糖、岩藻多糖(fucoidan)(褐藻的主要成分)、寡岩藻多糖(oligofucoidan)、藻类、含有岩藻多糖的褐藻(例如，在日本冲绳生长和生产的褐藻)、日本水云(Japanese Mozuku)、绿藻、蓝绿藻(或蓝藻)、褐藻(包括水云、昆布(kelp)、裙带菜属(undaria)、羊栖菜(sargassum fusiforme)、裙带菜(pinnatifida)等等)、植物性化合物(phytochemical)(例如，异黄酮(isoflavones)或植物雌激素(phytoestrogen))、茄红素(1ycopene)、表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)、绿茶素(green tea essence)、醣质营养素(gluconutrients)(例如木糖、半乳糖、葡萄糖、甘露醣(Mannose)、N-乙酰基葡萄糖胺(N-acetylglucosamine)、N-乙酰基半乳糖胺(N-acetylgalaetosanmine)或N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid))、鱼油、香椿(China toona)(香椿(toona sinensis))，和/或从植物、叶、果实、蔬菜、鱼、海藻或藻类所萃取的营养素；

4.实行素食饮食；

5.服用或吃健康食品或有机食品；

6.服用备选的(非-传统的)医药品；

7.进行备选疗法或治疗，诸如格森疗法(Gerson therapy)或布鲁士癌症治疗(Breuss cancer cure)；

8.进行针灸；

9.进行按摩(诸如足部按摩)；

10.运动，诸如行走、慢跑、跳舞、体操、瑜伽、有氧运动和/或太极拳(中国影子练习))；

11.睡觉(为了测量睡眠质量的目的)；

12.冥想；

13.实行由个人、健康专业人员或医生所设计的健康改善计划或疾病治疗计划；

14.服用某种用于改善在身体的某器官的健康的营养物，例如服用茄红素以改善摄护腺的健康；

15.采取复建计划以治疗伤口，或治疗由手术所造成的创伤，或治疗疾病；

16.服用一种从例如将中药或复数种中药浸泡在液体或酒中历时时间的期间所做出的药液(medicinal liquor)(或被称为药酒(medicinal wine)、药液(medicatedliquor)或药酒(medicated wine))(诸如从将人参浸泡在高酒精浓度米酒历时1个月所做出的人参酒)；

17.服用一个或多个由政府部门或机关(诸如美国食品和药物管理局(U.S.FDA))所核准用于治疗特定疾病(例如，一定类型的癌症、皮肤病、肾脏疾病和/或等等)的药物；

18.服用或进行由政府部门所核准用于治疗特定疾病(例如，一定类型的癌症、皮肤病或肾脏疾病)的治疗或疗法；

19.实行宗教活动，诸如祈求和平或拜神；

20.直接或间接地暴露于日照或阳光下(在早晨，例如在日出前10分钟与在日出后50分钟之间(含有显著数量的红外(IR)光)；或大约中午，例如在11：30AM至12：30PM之间(含有显著数量的紫外(UV)光)；或在下午，例如，在日落前50分钟与在日落后10分钟之间(含有显著数量的红外(IR)光))；

21.暴露于灯光或发光二极管(LED)光，其可包括可见光的全光谱、IR光、红光、绿光、蓝光或UV光，或超过一种上述光的组合；

22.运动或进行用于改善身体自愈的计划、治疗、方法、装置和/或系统，例如，一种在损伤或手术之后被执行用于改善自愈的方法或治疗(例如，高压氧治疗)；

23.喝咖啡(诸如黑咖啡)；

24.喝茶(诸如绿茶、红茶或茉莉花茶(jasmine tea))；

25.喝红酒；

26.服用褪黑激素(melatonin)；

27.聆听音乐(诸如莫扎特或贝多芬的交响曲)；

28.注射含有岩藻多糖或寡岩藻多糖的物质(例如，营养物或补充物)；

29.服用激素补充物或进行激素注射；

30.注射粒细胞集落刺激因子或(G-CSF或GCSF)(它是醣蛋白)；

31.进行GCSF注射的疗程；以及

32.服用含有下列的营养物、营养品、营养流体(nutrient fluid)、营养饮料、营养液(nutrient liquid)或营养食品：(1)各种不同的氨基酸(诸如精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、缬氨酸、脯氨酸、甘氨酸，硒代半胱氨酸，丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸或色氨酸)，(2)均衡氨基酸，或(3)9种用于人体的必需氨基酸(即，组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸)。例如：(a)从红、绿、黑豆的发酵所生产或萃取的产品；(b)从水果或水果的组合(诸如甜菜、苹果、番石榴、奇异果、葡萄、菠萝、红龙果(redpitaya)(火龙果(dragon fruit))、青木瓜、西红柿和/或酪梨等等)的发酵所生产的液体、流体或饮料；(c)一种从例如将中药或复数种中药浸泡在液体或酒中历时一段时间的期间所做出的药液(medicinal liquor)(或被称为药酒(medicinal wine)、药液(medicatedliquor)或药酒(medicated wine))(诸如从将人参浸泡在高酒精浓度米酒历时1个月所做出的人参酒)。

含有干细胞的组合物

一种含有干细胞的组合物(例如，含有干细胞的溶液)可使用下列所描述的示范方法而被制备。

动作(X)(可以是上面所提到的动作(X)的一个)在受试者上被执行。该受试者，例如，是人类(例如，儿童、青少年、成人或老人)或非-人类动物。非人类动物的实例包括灵长类动物(例如，猴子或大猩猩)、狗、囓齿动物(例如，小鼠或豚鼠)、猫、马、乳牛、牛、羊、猪、鸡、鸭、鹅、鸟和大象。

例如，该受试者可摄取干细胞-动员剂(stem cell-mobilization agent)(诸如含有岩藻多糖的化合物)。该含有岩藻多糖的化合物可以是褐藻补充物。该褐藻补充物的丸剂含有80％的水云粉末、15％的结晶纤维素、3％的蔗糖脂肪酸酯以及2％的微小或细微的硅石(silica)(含有二氧化硅)。该水云粉末可从在日本冲绳附近的海洋中生长的水云褐藻(一种海藻)而被萃取。该水云粉末接着被混合以结晶纤维素、蔗糖脂肪酸酯以及微小或细微的硅石(含有二氧化硅)以形成该褐藻补充物的丸剂(含有0.1克的岩藻多糖)。该受试者可摄取20或更多个丸剂(例如，至少30个丸剂)的该褐藻补充物或者2克或更多(诸如至少3克)的岩藻多糖。在另一个实例中，该受试者可被注射以粒细胞集落刺激因子(GCSF)(即，动员剂)，或可进行GCSF注射的疗程。

在动作(X)被执行之后，该受试者等待历时一段时间的期间(例如，预定时间的期间)，诸如在15分钟与60分钟之间、在20分钟与100分钟之间、在30分钟与4小时之间、在60分钟与90分钟之间、在0.5小时与3小时之间、在1小时与6小时之间、在1小时与12小时之间、在12小时与36小时之间，或在36小时与50小时之间。执行动作(X)和等待历时一定期间容许一个或多个特定类型的体干细胞(诸如SB细胞(即，CD349(+)和Lgr5(+)SB细胞))从例如该受试者的骨髓移动至该受试者的外周血液内。该受试者的外周血液因此变得富含该一个或多个特殊类型的体干细胞。该一个或多个特定类型的体干细胞，例如，可以是或可包括一个或多个所述上面所描述的体干细胞。例如，该一个或多个特定类型的体干细胞可以是或可包括在尺寸上小于6微米并且更佳地在尺寸上大于2微米的体干细胞，诸如CD349(+)体干细胞和/或Lgr5(+)体干细胞。

执行动作(X)和等待历时一段期间是选择步骤。换句话说，要做出含有干细胞的组合物，血液样品可从没有首先在受试者上执行任何动作(X)的受试者而被获得。

立即地在上面的等待步骤(若动作(X)和所述待步骤被进行)之后，血液样品被获得自该受试者的外周血液并且被放置至一个或多个含有二价阳离子螫合剂的容器(例如，一袋、一个或多个注射器，或一个或多个管子)内。该血液样品在该容器内被混合以该二价阳离子螫合剂以形成混合物。该二价阳离子螫合剂(例如，抗凝剂)可以是具有重量(例如大于70mg(诸如在90与900mg之间、在120与450mg之间或在150与400mg之间))的乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)(诸如K2EDTA抗凝剂或K3EDTA抗凝剂)。备选地，该二价阳离子螫合剂可以是具有重量(例如，大于70mg(诸如在90与900mg之间、在120和450mg之间或在150和400mg之间))的柠檬酸盐。该血液样品含有复数个细胞，包括在尺寸上小于6微米的小细胞和在尺寸上大于6微米的大细胞。例如，所述小细胞含有血小板和在尺寸上小于6微米的小体干细胞。例如，所述小体干细胞含有该一个或多个特定类型的体干细胞(即，例如，SB细胞)、BLSC(即，CD66e(+)体干细胞)以及VSEL(例如，CD133(+)体干细胞和CD34(+)体干细胞)。例如，所述大细胞含有在尺寸上大于6微米的大体干细胞和谱系细胞(lineage cells)(诸如红细胞和白细胞)。该血液样品可具有大于或相等于45毫升的体积，诸如在60与500毫升之间、在80与250毫升之间或在100与200毫升之间。在一个实例中，该血液样品可在该容器中被混合以每毫升的该血液样品1.5mg或更多(诸如在1.6与2.0mg之间)的该二价阳离子螫合剂(诸如K2EDTA、K3EDTA或柠檬酸盐)以形成该混合物。

其次，该混合物被处理以形成含有干细胞的溶液。该方法可包括用于干细胞活化和纯化/分离的步骤。如此处所用的术语“纯化”或“分离”意指小细胞(例如，在尺寸上大于2微米并且小于6微米的细胞)与大细胞(例如，在尺寸上大于6微米的细胞)的实质分离。

该混合物可在于2摄氏温度(℃)与12℃之间、更佳地在2℃与7℃之间或在4℃的温度下被储存在适合的设备(例如冰箱或其他用于保持东西寒冷的装置)中历时预定时间的期间。该时间的期间可以是在3小时与72小时之间，以及更佳地在3小时与6小时之间、在6小时与72小时之间、在6小时与48小时之间、在16小时与72小时之间、在16小时与48小时之间、在36小时与60小时之间、在48小时与72小时之间，或大约48小时。在该混合物已被储存历时该预定的时间的期间之后，在该混合物中的该一个或多个特定类型的体干细胞(例如，SB细胞)能够通过该二价阳离子螫合剂(诸如K2EDTA、K3EDTA或柠檬酸盐)而被活化，即，该一个或多个特定类型的体干细胞的细胞周期被活化从G0到G1。该活化可能与该二价阳离子螫合剂抑制p53的功能(大概通过螫合Zn²⁺)的能力有关，由此容许该一个或多个特定类型的体干细胞(例如，SB细胞)存在从G0静止期到细胞周期的G1期。由于该p53蛋白质需要Zn²⁺以适当地折迭并且形成功能性蛋白质，通过该二价阳离子螫合剂螯合Zn²⁺可能是关键步骤以活化该一个或多个特定类型的体干细胞(例如，SB细胞)。可能的是：该二价阳离子螫合剂可螯合其他二价离子(例如，Ca²⁺)，由此活化该一个或多个特定类型的体干细胞并且迫使它们增殖和扩展。

当该混合物被储存时，它由于重力而分离成分离层(包括上层和下层)。该上层(或悬浮液)可具有在20与250毫升之间、在40与125毫升之间或在50与100毫升之间的体积。该上层含有血小板、血清以及一个或多个特定类型的小体干细胞(即，例如，SB细胞)、BLSC(即，CD66e(+)体干细胞)和VSEL(例如，CD133(+)体干细胞和CD34(+)体干细胞)。大多数的该血液样品的所述含有谱系细胞和大体干细胞的大细胞(诸如大于95％、98％或99％的该血液样品的所述大细胞)是在该下层。该悬浮液的体积比该血液样品的体积的比率例如可在自三分之一至二分之一的范围。

其次，实质上所有的该上层可被收集或转移至液体容器(诸如袋、注射器或玻璃瓶)以产生含有干细胞的溶液或干细胞混合物。该上层(例如，含有干细胞的溶液)含有包括血小板和小体干细胞的小细胞。在该含有干细胞的溶液中小体干细胞的数目可以是大于或相等于1000万(例如，大于或相等于3000万、大于或相等于5000万、在1000万与5亿之间、在2500万与3亿之间，或在3000万与5亿之间)。该含有干细胞的溶液也可含有该二价阳离子螫合剂(例如，EDTA)和/或生长因子。

此外，该含有干细胞的溶液几乎没有包括或实质上排除大细胞(例如，大体干细胞和谱系细胞)。例如，在该含有干细胞的溶液中大细胞可构成小于5％(例如，小于1％、0.5％或0.01％)的细胞的总数目。例如，在该含有干细胞的溶液(例如，该被收集的上层)中红细胞的数目可以是每毫升小于10⁵或10⁴。优选地，每毫升的该含有干细胞的溶液中红细胞的数目是小于10³。每毫升的该含有干细胞的溶液中白细胞的数目可以是小于10⁴(例如，小于10³)。优选地，每毫升的该含有干细胞的溶液中白细胞的数目是小于10²。

在该含有干细胞的溶液中大于95％(例如，99％或99.99％)的所有所述细胞可以是小细胞。所述小细胞可包括血小板、Lgr5(+)细胞、CD349(+)细胞、CD133(+)细胞、CD34(+)和CD66e(+)细胞。在该含有干细胞的溶液中血小板可构成75％至85％的所述小细胞。大于4％(例如，大于5％或在4.5％与10％之间)的所有所述小细胞可以是Lgr5+体干细胞。在该含有干细胞的溶液中CD349(+)体干细胞可构成大于4％(例如，大于5％或在4.5％与10％之间)的所有所述小细胞。小于2％(例如，小于1％或0.5％)的所述小细胞可以是被组合的CD133(+)细胞和CD34(+)细胞。小于6％(例如，小于5％或4.5％)的所述小细胞可以是CD66e(+)细胞。

任何特定的小细胞也可使用流式细胞术或其他常规技术(例如抗体为基础的技术(诸如抗体-结合的珠子))而从该被收集的上层被进一步分离或消耗。

该被收集的上层可被使用作为含有干细胞的溶液(例如，被施用给受试者或储存)或被进一步处理。例如，它可进一步被纯化(例如，过滤)或被混合以一个或多个额外的组分。具有体积(例如，大于400毫升(诸如在500与900毫升之间))的没有Ca²⁺的适合的细胞介质或溶液可被添加至该被收集的上层以做出含有干细胞的溶液。该没有Ca²⁺的适合的介质或溶液(诸如含有NaCl的溶液)可进一步没有任何二价离子(包括Mg²⁺)。例如，该含有NaCl的溶液可以是正常的盐水(例如，具有0.90％w/v的NaCl，约300mOsm/L或每升9.0克)。

该含有干细胞的溶液可被储存在冷冻储存温度，例如，相等于或少于-70℃或-80℃(例如，在-75℃与-85℃之间)历时延长的时间期间(例如，超过1周、1个月或1年)。当准备使用时，该冷冻的含有干细胞的溶液可被快速地解冻并且，选择性地，被混合以上述没有Ca²⁺的适合的介质或溶液(例如，0.9％NaCl)。

治疗方法

该通过上面所描述的操作程序所生产的含有干细胞的组合物可被使用以在受试者中降低IL-6水平。例如，它可被使用以治疗与升高的IL-6水平有关的病况或能够通过IL-6拮抗剂或通过降低IL-6水平而被治疗的病况。

IL-6水平可意指在从受试者所获得的任何生物样品(例如，血液样品、骨髓样品、尿样品或实体组织样品)中的IL-6蛋白质水平、mRNA水平、cDNA水平或功能性水平。升高的IL-6水平是要比在健康受试者或没有与升高的IL-6水平有关的病况的受试者中被发现的水平或水平的范围更高的水平。例如，在血液中正常的IL-6水平可以是约4.7pg/ml或更低。测量蛋白质、mRNA、cDNA和功能性水平的方法是本领域所熟知，例如，ELISA、蛋白质印迹法以及实时PCR。

在该含有干细胞的组合物被施用给受试者之前，该受试者是否具有升高的IL-6的水平可被测定。备选地或此外，在该组合物被施用之后，在该受试者中的IL-6水平可被测定以监测治疗效力和做出治疗决策。选择性地，在该受试者中的疾病参数或症状(例如，HbAlc或葡萄糖水平)可在施用之前和/或之后被评估。

人类和其他哺乳动物IL-6序列是本领域所知晓，例如，NCBI登录编号NP_000591(人类)、NP_001305024(人类)、NP_036721(小鼠)，以及NP_112445(大鼠)。

在此所描述的该含有干细胞的组合物可经由任何的施用途径而被施用给需要它的受试者，例如，静脉内的、关节内的、结膜的、颅内的、腹膜内的、胸膜内的、肌肉内的、椎管内的或皮下的施用途径。该组合物可含有在1000万与5亿之间的小体干细胞。自体的或同种异体的体干细胞可被使用。该组合物可例如每1-14天、每2-4周、每1-6个月或每2-12个月被施用给受试者历时一段治疗期间(例如，1-36个月或2-10年)或无论何时需要的。

可以该含有干细胞的组合物而被治疗的病况包括I型糖尿病、类风湿性关节炎、动脉粥状硬化(atherosclerosis)，以及抑郁(depression)。

“受试者”意指人类或非-人类动物。“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”意指施用化合物或组合物给具有疾患的受试者，具有治疗、减轻、缓解、补救、推迟疾患的发作，或改善疾患、疾患的症状、继发于疾患的疾病状态或关于疾患的素因的目的。“有效量”意旨能够在经治疗之受试者中产生医学上所欲之结果的化合物或组合物的量。该治疗方法可被单独执行或是与其他药物或疗法并执行。

下列的特定实施例仅被解释为例示说明，并且无论如何没有以任何方式限制本揭示的剩余部分。没有进一步详细阐述，被相信的是：本领域技术人员可根据在此的描述，利用本揭示至它的最大程度。

实施例

100至150ml的外周血液样品是从蒙受I型糖尿病的病患而被获得。含有所述血液样品的EDTA-涂布的管子被储存在4℃历时6至48小时直到血液分离成2个不同的层。该含有SB细胞的顶层被收集并且经由静脉内注射被自体地输送回所述病患内。该病患被施用2个治疗。

在各个治疗之后，在该病患中的IL-6水平和血红蛋白(hemoglobin)A1c(HbAlc)水平被测定。如在图1所显示的，在各个治疗之后这两个水平降低。显著地，在第二次治疗之后，HbAlc水平是低于6.5％。参见图1。具有要比6.5％更高的HbA1c水平的人被认为具有糖尿病。

其他实施方案

在这个说明书所揭示的所有特征可呈任何组合而被组合。在这个说明书所揭示的各个特征能够通过提供相同、等效或相似目的的备选特征而被取代。因此，除非另有明确地说明，被揭示的各个特征仅是一系列的等效或相似特征的实例。

从上面的描述，本领域技术人员可容易地确定所述被描述的实施方案的必要特征，并且没有背离其精神和范畴，可做出所述实施方案的各种不同的变化和修饰以使它适应各种不同的用途和病况。因此，其他实施方案也在申请专利范围内。

Claims (20)

1.一种在受试者中降低IL-6水平的方法，其包括：

鉴定需要它的受试者；以及

施用给该受试者含有尺寸大于2微米并且小于6微米的小细胞的组合物；

其中所述小细胞包括下列体干细胞：(i)多能的；以及(i)CD349(+)、CD9(+)、Oct4(+)、Nanog(+)、Lgr5(+)、CD66e(+)、CD133(+)或CD34(+)。

2.如权利要求1的方法，其中该鉴定步骤包括检测从该受试者获得的生物样品中与对照水平相比增加的IL-6水平。

3.如权利要求2的方法，其中该生物样品是血液样品。

4.如权利要求1的方法，其中该受试者具有与增加的IL-6水平有关的病况或能够通过IL-6拮抗剂治疗的病况。

5.如权利要求4的方法，其中该受试者具有I型糖尿病。

6.如权利要求1-5的任一项的方法，其中所述小细胞进一步包括血小板。

7.如权利要求6的方法，其中75％至85％的所述小细胞是所述血小板以及20％至25％的所述小细胞是所述体干细胞。

8.如权利要求7的方法，其中该组合物含有1000万至5亿的所述体干细胞。

9.如权利要求8的方法，其中该组合物通过包括下列的方法制备：

提供含有从该受试者或供体受试者获得的血液样品和二价阳离子螫合剂的混合物；

在2℃与12℃之间的温度下储存该混合物3至72小时，由此该混合物分离成上层和下层，其中该上层含有小细胞的群体；以及

收集该上层，由此制备该组合物。

10.如权利要求9的方法，其中该二价阳离子螫合剂是EDTA。

11.如权利要求10的方法，其中每毫米该血液样品1.5至2.0mg的二价阳离子螫合剂与该血液样品混合以获得该混合物。

12.如权利要求10的方法，其中在获得该血液样品之前，在该受试者或供体受试者上执行用于增加干细胞数目的动作。

13.如权利要求12的方法，其中该动作是施用有效量的岩藻多糖或粒细胞集落刺激因子。

14.如权利要求10的方法，其中用于制备该组合物的方法进一步包括，在收集该上层之后，添加药学上可接受的赋形剂至收集的上层。

15.如权利要求10的方法，其中用于制备该组合物的方法进一步包括，在收集该上层之后，离心该上层以获得细胞沉淀物。

16.如权利要求15的方法，其中用于制备该组合物的方法进一步包括在药学上可接受的赋形剂中清洗该沉淀物以及悬浮该沉淀物。

17.如权利要求15或16的方法，其中该药学上可接受的赋形剂没有二价离子。

18.如权利要求17的方法，其中该药学上可接受的赋形剂是盐水溶液。

19.如权利要求1-18的任一项的方法，其中该组合物被静脉内施用。

20.如权利要求1-19的任一项的方法，其进一步包括，在该施用步骤之后，检测在该施用步骤之后在从该受试者获得的生物样品中的IL-6水平。