CN111759856A

CN111759856A - 异黄芪皂苷ⅱ在制备肿瘤免疫治疗药物中新用途

Info

Publication number: CN111759856A
Application number: CN202010829651.7A
Authority: CN
Inventors: 宋冰冰
Original assignee: Tianjin Qichen Biotechnology Co ltd
Current assignee: Tianjin Qichen Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-08-18
Filing date: 2020-08-18
Publication date: 2020-10-13

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了异黄芪皂苷Ⅱ在制备肿瘤免疫治疗药物中新用途；本发明通过实施例证明异黄芪皂苷Ⅱ促使CD8⁺T细胞分化为CTL细胞，实现杀伤肿瘤细胞的特点，并且异黄芪皂苷Ⅱ不具有细胞毒性，因此异黄芪皂苷Ⅱ可以应用于制备肿瘤免疫治疗药物。

Description

异黄芪皂苷Ⅱ在制备肿瘤免疫治疗药物中新用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及异黄芪皂苷Ⅱ的新用途，特别涉及异黄芪皂苷Ⅱ在制备肿瘤免疫治疗药物中新用途。

背景技术

近年来，治疗肿瘤的研究领域中，利用自身免疫系统抵御肿瘤已经成为新的趋势，通过调节免疫系统，抑制和杀伤肿瘤细胞的方式成为肿瘤的免疫治疗。肿瘤免疫治疗是当前最具前景的肿瘤治疗和研究方向，在免疫应答等方向具有了显著的突破。中药及天然化合物中的天然小分子化合物因为其分子量小、易于合成及给药，拥有广泛的前景。

黄芪皂苷是一种对人类健康有显著保健作用的天然活性物质，已引起国际社会的普遍关注。经科学研究及临床应用证明，黄芪皂苷调节机体免疫功能，有促进骨髓造血机能，使骨髓生长旺盛的作用，对肾实质细胞代谢有明显改善作用。近年来，人们发现天然植物黄芪中含有大量的黄芪皂苷，由于其原料黄芪为中药，来源较广，从中提取黄芪皂苷并且取得了可喜进展。

异黄芪皂苷Ⅱ是从传统中药黄芪分离纯化得到的天然皂苷类成分，具有调节免疫功能；目前研究表明，异黄芪皂苷Ⅱ不具有细胞毒性。然而，异黄芪皂苷Ⅱ是否能够成为肿瘤免疫治疗发挥主要作用的化合物，还没有得到充分研究。

发明内容

本发明提供一种异黄芪皂苷Ⅱ在制备肿瘤免疫治疗药物中新用途，，异黄芪皂苷Ⅱ能够促使CD8⁺T细胞分化为CTL细胞，实现杀伤肿瘤细胞的特点。

本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：

所述药物组合物包含异黄芪皂苷Ⅱ；

所述异黄芪皂苷Ⅱ由中药黄芪分离纯化而成；

所述异黄芪皂苷Ⅱ具有如下结构式（1）

（1）；

所述黄芪皂苷Ⅱ以单体形式提供或者以包含黄芪皂苷Ⅱ的植物提取物形式提供；

所述药物组合物还包含任选的药学可接受的载体和/或赋形剂；

所述药物组合物配制为散剂、片剂、胶囊剂、丸剂、滴丸剂、注射剂、乳剂、混悬剂或酊剂中的任意一种剂型；

异黄芪皂苷Ⅱ在制备肿瘤免疫治疗药物中新用途；

所述肿瘤细胞为直肠癌细胞；

所述异黄芪皂苷Ⅱ提高CD8⁺T细胞表达IFN-γ水平；

所述异黄芪皂苷Ⅱ促进CTL细胞分化。

本发明的有益效果为：

（1）异黄芪皂苷Ⅱ能够提升CD8⁺T细胞中IFN-γ表达水平，由于IFN-γ是激活CTL细胞的细胞因子，表明异黄芪皂苷Ⅱ促进CTL细胞分化；

（2）同时，异黄芪皂苷Ⅱ能够提升CD8⁺T细胞的穿孔素表达率，从而刺激CTL细胞对肿瘤的杀伤。

附图说明

图1为加入异黄芪皂苷Ⅱ后，CD8⁺T细胞表达的IFN-γ的效果对照图；

图2为加入异黄芪皂苷Ⅱ后，CTL细胞表达穿孔素的效果对照图；

图3为加入异黄芪皂苷Ⅱ后，CTL杀伤效率的对照图。

具体实施方式

所述药物组合物包含异黄芪皂苷Ⅱ；

所述异黄芪皂苷Ⅱ由中药黄芪分离纯化而成；

所述异黄芪皂苷Ⅱ具有如下结构式（1）

（1）；

异黄芪皂苷Ⅱ在制备肿瘤免疫治疗药物中新用途；

所述肿瘤细胞为直肠癌细胞；

所述异黄芪皂苷Ⅱ提高CD8⁺T细胞表达IFN-γ水平；

所述异黄芪皂苷Ⅱ促进CTL细胞分化。

实施例一：异黄芪皂苷Ⅱ增强CD8⁺T细胞免疫应答

实验材料：8周雄性C57小鼠（购自维通利华公司），anti-mouse CD3，anti-mouse CD28（BD），IL-2（R&D），PE-anti-mouse CD8a；APC-anti-mouse IFN-γ；Per CP anti-mouseperforin（BD），CFSE染料，丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）；钙离子霉素（ionomycin）（购自sigma公司），胎牛血清，1640培养基，DMEM培养基（Gibco），异黄芪皂苷Ⅱ（sigma）；

试验内容：

1.脾单细胞悬液制备：处死小鼠，取脾，采用200目滤网破碎组织，收集细胞于1640培养液中，1400 r/min离心弃上清，使用红细胞裂解液去除红细胞，收集裂解后细胞加入10%胎牛血清1640培养液备用；

2.使用anti-mouse CD3（10μg/mL）包板过夜；

3.使用anti-mouse CD28（1μg/mL）和IL-2（2ng/mL）刺激细胞。细胞培养体系为10%血清的1640培养液，在刺激细胞同时设置对照组和加药组进行对比，培养条件为37℃，5% CO2培养48小时，更换新鲜的10%血清培养液，休息24小时后，使用PMA（50ng/mL）和Ionomycin（1mg/mL）再刺激6小时；

4.收集细胞后PE-anti-mouse CD8a胞外标记CD8⁺T细胞，使用4%多聚甲醛（sigma）固定、打孔细胞，APC-anti-mouse IFN-γ；Per CP anti-mouse perforin（BD）进行胞内染色，流式细胞仪检测并记录。

实验结果

IFN-γ是毒性T淋巴细胞（CTL细胞）激活必须的细胞因子，在激活同时自身也表达并进行自身再刺激。在表达细胞因子同时会表达出穿孔素针对靶细胞进行杀伤。通过检测CD8+T细胞中，表达IFN-γ比例，表示化合物对CTL细胞激活的效率；因此，全脾细胞中表达IFN-γ的CD8⁺细胞即可检测异黄芪皂苷Ⅱ在调节CTL细胞表达过程中所起到的作用。

如附图1所示，加入异黄芪皂苷Ⅱ后，分析CD8⁺T细胞表达的IFN-γ效果

通过流式细胞仪分析，发现经过药物处理后，CD8⁺T细胞表达IFN-γ水平显著上升。表明异黄芪皂苷Ⅱ具有促进CTL细胞分化，具有调节肿瘤免疫治疗的效果。可以作为进一步研究此化合物作为肿瘤免疫治疗的潜在药物之一。

实施例二：异黄芪皂苷影响CTL细胞杀伤效果

实验材料：8周雄性C57小鼠（购自维通利华公司），anti-mouse CD3；anti-mouse CD28（BD），IL-2（R&D），PE-anti-mouse CD8a；APC-anti-mouse IFN-γ；PerCP anti-mouseperforin（BD），CFSE染料；丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）；钙离子霉素（ionomycin）（购自sigma公司），胎牛血清；1640培养基，DMEM培养基（Gibco），异黄芪皂苷Ⅱ（sigma）；

试验内容

1、脾单细胞悬液制备：处死小鼠，取脾，采用200目滤网破碎组织，收集细胞于1640培养液中，1400 r/min离心弃上清，使用红细胞裂解液去除红细胞，收集裂解后细胞加入10%胎牛血清1640培养液备用。

2、使用anti-mouse CD3（10μg/mL）包板过夜

3、使用anti-mouse CD28（1μg/mL）和IL-2（2ng/mL）刺激细胞。细胞培养体系为10%血清的1640培养液。在刺激细胞同时设置对照组和加药组进行对比。培养条件为37℃，5% CO2培养48小时，更换新鲜的10%血清培养液，休息24小时后，使用PMA（50ng/mL）和Ionomycin（1mg/mL）再刺激6小时。

4、收集细胞后PE-anti-mouse CD8a胞外标记CD8⁺T细胞，使用4%多聚甲醛（sigma）固定、打孔细胞，APC-anti-mouse IFN-γ；PerCP anti-mouse perforin（BD）进行胞内染色。流式细胞仪检测并记录。

实验结果

实施例一的结果显示了异黄芪皂苷Ⅱ具有促进T细胞向CTL分化的能力。为了验证其在肿瘤免疫治疗过程中的潜力，进一步检测异黄芪皂苷Ⅱ对CD8⁺T细胞穿孔素表达的差异。

结果如附图2所示，异黄芪皂苷Ⅱ对CTL细胞表达穿孔素的影响间接体现促使CTL细胞杀伤效果。

通过流式细胞仪分析，发现经过化合物处理后的CD8⁺T细胞除表达更多IFN-γ外，也会上调穿孔素表达率。因此，异黄芪皂苷Ⅱ刺激CTL细胞对肿瘤的杀伤，进一步在利用共培养技术在细胞水平验证其调控免疫杀伤肿瘤的效果。

实施例三：异黄芪皂苷Ⅱ调节CTL杀伤效果

实验材料：8周雄性C57小鼠（购自维通利华公司），anti-mouse CD3；anti-mouse CD28（BD），IL-2（R&D），PE-anti-mouse CD 8a；APC-anti-mouse IFN-γ；PerCP anti-mouseperforin（BD），CFSE染料；丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）；钙离子霉素（ionomycin）（购自sigma公司），胎牛血清；1640培养基；DMEM培养基（Gibco），异黄芪皂苷Ⅱ（sigma）

试验内容

1、脾单细胞悬液制备：处死小鼠，取脾，采用200目滤网破碎组织，收集细胞于1640培养液中，1400 r/min离心弃上清，使用红细胞裂解液去除红细胞，收集裂解后细胞加入10%胎牛血清1640培养液备用；

2、使用anti-mouse CD3（10μg/mL）包板过夜；

3、使用anti-mouse CD28（1μg/mL）和IL-2（2ng/mL）刺激细胞。细胞培养体系为10%血清的1640培养液。在刺激细胞同时设置对照组和加药组进行对比。培养条件为37℃，5% CO2培养48小时；

4、复苏CT26细胞，10%血清的DMEM培养液培养24小时，传代培养，细胞计数。按照1×106个/mL浓度培养过夜；

5、将富集的CD8⁺T细胞与上一步所描述肿瘤共培养；

6、收集所有细胞，检测标记CFSE+细胞数以及荧光强度，综合评价异黄芪皂苷Ⅱ增强CTL应答杀伤肿瘤的效果。

通过前两个实施例，我们发现在蛋白质水平上异黄芪皂苷Ⅱ对CTL细胞具有调控作用。为了在细胞水平验证其调控效果，利用肿瘤/CTL细胞共培养体系进行验证；选择CT26（小鼠直肠癌）细胞系作为靶细胞，将CFSE标记的CT26细胞与异黄芪皂苷Ⅱ刺激24小时后的CD8⁺T细胞共培养，细胞比例为1:1，37℃，5% CO2培养箱培养10小时。收集悬液，1400r/m 离心7分钟弃去细胞碎片，胰蛋白酶消化后收集细胞混匀后使用流式细胞仪检测。

流式分析CFSE+细胞数以及荧光强度，对比对照组与给药组进行分析。通过对比，发现异黄芪皂苷Ⅱ处理后，CTL细胞杀伤肿瘤效率有明显变化，肿瘤标记的CFSE不仅仅荧光强度下降而且CFSE阳性细胞也明显降低；说明给药处理后，CTL杀伤效率有显著增加。

综合实施例一至实施例三的实验，说明异黄芪皂苷Ⅱ的抗肿瘤机制是通过免疫应答调节过程中，CTL细胞的活性强弱进行杀伤。通过提升CD8⁺T细胞的免疫应答，实现肿瘤死亡的方式，因此说明异黄芪皂苷Ⅱ可以提高CTL细胞杀伤肿瘤的作用从而实现肿瘤免疫治疗。

如本文所用的，“药学上可接受的”表示当以通常用药剂量使用时没有实质的毒性作用，从而可被政府或与其相当的国际组织批准或者已被批准用于动物，更特别地用于人，或者被登录在药典上；

本发明药物组合物中可用的“药学上可接受的载体”可以是药物制剂领域中任何常规的载体，特定载体的选择将取决于用于治疗特定患者的给药方式或疾病类型和状态；用于特定给药模式的合适药物组合物的制备方法完全在药物领域技术人员的知识范围内；

例如，可以作为药学可接受的载体包括药学领域常规的溶剂、稀释剂、分散剂、助悬剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、粘合剂、润滑剂、稳定剂、水合剂、乳化加速剂、缓冲剂、吸收剂、着色剂、离子交换剂、脱模剂、涂布剂、矫味剂、和抗氧化剂等。必要时，还可以在药物组合物中加入香味剂、防腐剂和甜味剂等。

在本发明中所述药物组合物还包含任选的药学可接受的载体和/或赋形剂，选自溶剂、稀释剂、分散剂、助悬剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、粘合剂、润滑剂、稳定剂、水合剂、乳化加速剂、缓冲剂、吸收剂、着色剂、香味剂、甜味剂、离子交换剂、脱模剂、涂布剂、矫味剂和抗氧化剂；

在本发明实施方式中，所述药物组合物配制为散剂、片剂、胶囊剂、丸剂、滴丸剂、注射剂、乳剂、混悬剂或酊剂中的任意一种剂型。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围，凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims

1.一种用于治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物包含异黄芪皂苷Ⅱ。

2.根据权利要求1所述用于治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于：所述异黄芪皂苷Ⅱ由中药黄芪分离纯化而成。

3.根据权利要求1所述用于治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于：所述异黄芪皂苷Ⅱ具有如下结构式（1）

（1）。

4.根据权利要求2或3所述用于治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于：所述黄芪皂苷Ⅱ以单体形式提供或者以包含黄芪皂苷Ⅱ的植物提取物形式提供。

5.根据权利要求2或3所述用于治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物还包含任选的药学可接受的载体和/或赋形剂。

6.根据权利要求2或3所述用于治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物配制为散剂、片剂、胶囊剂、丸剂、滴丸剂、注射剂、乳剂、混悬剂或酊剂中的任意一种剂型。

7.异黄芪皂苷Ⅱ在制备肿瘤免疫治疗药物中新用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述肿瘤细胞为直肠癌细胞。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述异黄芪皂苷Ⅱ提高CD8⁺T细胞表达IFN-γ水平。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述异黄芪皂苷Ⅱ促进CTL细胞分化，杀死肿瘤细胞。