WO1999020301A1 - Tumorvakzine - Google Patents

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WO1999020301A1
WO1999020301A1 PCT/EP1998/006546 EP9806546W WO9920301A1 WO 1999020301 A1 WO1999020301 A1 WO 1999020301A1 EP 9806546 W EP9806546 W EP 9806546W WO 9920301 A1 WO9920301 A1 WO 9920301A1
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WO
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tumor
ifn
cells
liposomes
vaccine according
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PCT/EP1998/006546
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English (en)
French (fr)
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Ernst Wagner
Ralf Kircheis
Daan J. A. Crommelin
Maaike Van Slooten
Gert Storm
Original Assignee
Boehringer Ingelheim International Gmbh
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    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21Interferons [IFN]
    • A61K38/217IFN-gamma
    • AHUMAN NECESSITIES
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    • AHUMAN NECESSITIES
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    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
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    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511Organic adjuvants
    • A61K2039/55555Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers

Definitions

  • the invention relates to the field of immunotherapy for tumor diseases.
  • Interferon- ⁇ , (IFN- ⁇ ) IL-12, and GM-CSF have been shown to be promising (Rosenberg, 1991; Dranoff, 1993; Zatloukal, 1993; Ferrantini, 1994; Lamont, 1996; Clary, 1996).
  • Cytokines are pleiotropic mediators that naturally serve for communication between cells that are close to each other. They act over short distances.
  • the modern idea and the desired principle of a tumor vaccine is the induction of a systemic immune reaction directed against the tumor with the help of a simultaneous, targeted supply of relevant tumor antigens and immune mulatmatic cytokines, but not via the high-dose systemic administration of cytokines, but rather over longer periods Local high cytokm doses at the site of vaccination (paracnnes concept) (Pardoll, 1995; Jaffe et al., 1996).
  • cytokines Local application of the cytokines is, however, technically problematic, especially because of the rapid diffusion of the cytokines (within minutes) into the surrounding tissues or into the bloodstream, coupled with an often extremely short half-life (inactivation) into biological fluids (Eppstem, 1982 ; Kedar et al., 1994; Koppenhagen, 1997).
  • the approach using gene-modified tumor cells takes into account the physiological, parak ⁇ nen mode of action of the cytokines, the cytokm dose has emerged as a further decisive parameter. It was shown that to stimulate an immune response, the cytokines have to be administered within a therapeutically effective dose window, too low but also too high cytokine doses were not effective (Zatloukal et al., 1995; Schmidt et al., 1995). On the other hand, it is often difficult to use gene modification of tumor cells, especially primary tumor cells, to achieve gene expression exactly within this effective dose window.
  • DE-A1 44 11 425 describes a cellular tumor vaccine which contains cytokines in depot form. Specifically, IL-2 is proposed as the cytokm, whereby requirements regarding the dose and the release kinetics of the cytokm are not considered.
  • WO 94/21808 describes a tumor vaccine from autologous, cytokine gene-transfected cells, from which it is shown, inter alia, that the protective action of cytokines (IL-2, IFN- ⁇ and GM-CSF) is dose-dependent, it being shown that not necessarily with the highest dose the best protective effect is achieved, but an optimally effective dose window is not defined.
  • cytokines IL-2, IFN- ⁇ and GM-CSF
  • the object of the present invention was to provide an alternative tumor vaccine which is simple to produce and which makes it possible to release the immunostimulating cytokine in a targeted manner over a longer period of time at the site of the vaccination in the therapeutically effective dose range.
  • a tumor vaccine based on tumor antigens which is characterized in that it contains, as an effective component, in addition to a tumor antigen source, a delivery system with delayed release of active ingredient for IFN- ⁇ , the effective IFN- ⁇ dose being 50 ng up to 5 ⁇ g and the release period is half an hour to 8 days.
  • the IFN- ⁇ dose is preferably 100 ng to 2 ⁇ g, in particular 100 ng to 1 ⁇ g.
  • a release period from half an hour to 2 to 3 days has proven to be beneficial, but longer release periods of up to 8 days have also shown a favorable antitumor effect.
  • At least about 75% of the effective IFN- ⁇ dose is released in a release period of one hour to 3 days.
  • IFN- ⁇ should be released as soon as possible, but at the latest one hour after application of the vaccine.
  • tumor vaccine means that IFN- ⁇ and tumor antigen source are available essentially simultaneously.
  • the delivery system with delayed release of active substance is referred to below as the "slow release system”.
  • the slow release system is preferably in the form of liposomes.
  • Liposomes are synthetic lipid vesicles that consist of one or more concentric lipid layers that enclose watery compartments. Water-soluble substances can be enclosed in the watery compartments, and liposoluble substances can be incorporated into the lipid layers. Since these vesicles are versatile due to their structure, their biodegradability and their low toxicity, they have been increasingly used in recent years as carriers of various therapeutic agents, including for tumor therapeutics.
  • Liposomes are divided into two main categories.
  • the first category is the uni- or multilamellar "conventional" liposomes. Because of their rapid uptake by the reticuloendothelial system, these liposomes have a relatively short half-life.
  • the liposomes are modified in order to reduce non-specific interactions with cells of the reticuloendothelial system when using the liposomes and to prevent undesired rapid degradation.
  • the liposomes are preferably modified with covalently coupled polyethylene glycol (PEG) ("PEGylated”; Mo ⁇ et al., 1991; Chonn et al., 1992; Woodle et al., 1994).
  • PEG polyethylene glycol
  • the amount of PEG used is between 2 and 10% PEG-coupled lipid in the liposome (m / m)
  • Molecular weight of PEG preferably between 750 and 5000 D (Klibanov et al., 1990; Blume et al., 1990; Mayhew et al., 1992; Papahadjopoulos et al., 1991; Senior et al., 1991; Mo ⁇ et al. , 1991; Yoshioka, 1991).
  • the liposomes can also be modified with other groups, such as amphiphilic vinyl polymers, in order to extend their half-life in vivo.
  • biodegradable ones are used for the incorporation of IFN- ⁇ polymeric materials in the form of microsphere (Maulding, 1987; Golumbek et al., 1993; Johnson et al., 1996; Lee et al., 1997; Cleland, 1997; Cleland and Jones, 1996) or mini pellets (Fu iwara et al. , 1990; Marumo et al., 1997); these can also be modified to extend the half-life.
  • compositions containing tumor antigens which are suitable for triggering a specific immune response in the treated individual can serve as the tumor antigen source of the vaccine according to the invention.
  • the tumor antigens are in the form of tumor cells.
  • the tumor cells of the vaccine can be autologous or allogeneic tumor cells.
  • the tumor cells of the vaccine are autologous. These are cells that are taken from the patient to be treated, inactivated, if necessary, ex vivo, mixed with the IFN- ⁇ -releasing slow-release system and then re-administered to the patient (methods for producing autologous tumor vaccines are known to the person skilled in the art and described, inter alia, in WO 94/21808, to the disclosure of which reference is made.)
  • the tumor cells are allogenic, ie they do not originate from the patient to be treated (Barth et al., 1994; Morton et al., 1992).
  • allogeneic cells which are generally used to form established tumor cell lines Preference will be given above all if economic considerations play a role; the production of individual vaccines for each individual patient is labor-intensive and costly, moreover, difficulties arise in the ex vivo cultivation of the tumor cells in individual patients, so that tumor cells are not obtained in sufficient numbers to be able to produce a vaccine.
  • a mixture of cells from several allogeneic is preferred as the tumor antigen source
  • Lysates of tumor cells such as e.g. by Mitchell, et al., 1993.
  • the tumor antigen source consists of tumor cells, in particular allogeneic tumor cells, which are loaded with peptides which are derived from tumor antigens.
  • a tumor vaccine which can be used according to the invention as an antigen source in connection with the IFN- ⁇ slow release formulation has been described by Buschle et al., 1997; as an alternative to tumor cells, it is also possible to use antigen-presenting cells, for example dendritic cells which are loaded with the tumor antigen peptides, as described in DE-A1 196 07 044 or by Buschle et al., 1997.
  • tumor antigens and tumor-associated antigens were identified and isolated (for example described by Wolfel et al., 1994 a) and 1994 b); Carrel et al., 1993; Lehmann et al., 1989; Tibbets et al., 1993; or the published international applications WO 92/20356, WO 94/05304, WO 94/23031, WO 95/00159), was the prerequisite for using tumor antigens as such as immunogens, as described, for example, by Anchim et al., 1996, described.
  • the tumor antigens are present in the form of tumor antigens as such in order to trigger a cellular immune response as is required for the elimination of tumor cells carrying tumor antigens (Bakker et al., 1994; Cox et al.,
  • the tumor antigens can be in the form of proteins or in the form of Tu orantigen-derived peptides.
  • Peptides which are suitable as an antigen source in the context of the present invention are given by Melief et al., 1996.
  • the source of antigen may also be in the form of a slow release formulation.
  • a tumor vaccine based on tumor antigens for example in the form of tumor cells, in combination with a "slow release" system in which IFN- ⁇ is built in, has the advantage over tumor vaccines from gene-modified tumor cells that express IFN- ⁇ exact control of the cytokine release at the vaccination site and thus a reproducible and exact dosage of the cytokine. Furthermore, the labor and thus the cost of production is significantly lower.
  • mice with vaccines consisting of irradiated tumor cells and muIFN- ⁇ -liposomes can induce a systemic immune response which the animals before a
  • the protective effect depends not only on the IFN- ⁇ dose but also on the delayed release of the cytokine.
  • the vaccine according to the invention can contain one or more other cytokines in addition to IFN- ⁇ , e.g. Interleukm-2 (IL-2), IL-4, IL-12, IFN- ⁇ IFN-ß, IFN- ⁇
  • IL-2 Interleukm-2
  • IL-4 Interleukm-2
  • IL-12 Interleukin-12
  • IFN- ⁇ IFN-ß IFN- ⁇
  • the cytokm which may additionally be present in the vaccine can be present in the same or in a different slow-release system as IFN- ⁇ .
  • the cytokm can also be made available at the application site by using tumor cells (preferably allogeneic) which are transfected with the corresponding cytokm gene as the tumor antigen source.
  • the vaccine may also contain non-specific immunostimulating adjuvants, such as LPS
  • the ratio of antigen: IFN- ⁇ dose suitable for an efficient antitumor effect is first determined.
  • a suitable procedure for this is that, based on a suboptimal amount of antigen with regard to the formation of an antitumor response (in the case of an optimal antigen dose of about 10 ⁇ tumor cells, for example about 10 ⁇ cells), the amount of IFN- ⁇ is determined by titration in which the anti-tumor effect is increased.
  • the formulation generally contains about 10 ⁇ to 10 ⁇ , preferably 10 ⁇ to 10 ⁇ cells when tumor cells are used as the source of the antigen; if a cell-free antigen source is used, the amount of tumor antigens or peptides derived therefrom is dimensioned such that an immune response is triggered which is approximately equivalent to the immune response triggered by the abovementioned tumor cell number.
  • liposomes is used as a representative for all preparations which allow delayed release of proteins, for example microsphere or Mini pellets:
  • IFN- ⁇ m is morphed into various liposome preparations, free IFN- ⁇ is separated off and the IFN- ⁇ content of the liposomes is determined, for example by means of ELISA, HPLC or by means of Lowry protein determination method (Lowry et al., 1951).
  • the absolute degree of loading of the liposomes with IFN- ⁇ is not critical for the biological effectiveness of the vaccine according to the invention; what is important is the dose available in a certain period of time. However, it has proven to be advantageous if the IFN- ⁇ concentration in the liposome preparation is at least about 10 ⁇ g / ml, preferably more than 20 ⁇ g / ml. (With a low absolute degree of loading of the liposomes, the desired immunomodulatory effect of IFN- ⁇ in the vaccine can be achieved by increasing the proportion of liposome preparation in the vaccine).
  • At least 90% of the IFN- ⁇ m is included in the liposomes, i.e. that at most 10% of the protein is adsorbed on the outside of the liposomes.
  • An advantageous production method for such "alternative" liposomes is to reduce or prevent the non-specific electrostatic interaction which leads to the adsorption of IFN- ⁇ by providing a washing step with a saline solution (for example NaCl). The concentration of Ions must be sufficient to compete with the protein for binding to the liposomes.
  • the next step is to determine the release kinetics of the liposomes.
  • the incorporation or release kinetics of the cytokines depends on the charge, the hydrophilic / hydrophobic character of the cytokine on the one hand, and on the chemical and physical chemical characteristics of the liposomes on the other hand dependent.
  • the most important characteristics of the liposomes that determine the release kinetics are their size, the number of lipid layers (un ⁇ - / mult ⁇ lamellar), charge and fluidity of the lipid layers. These in turn are determined by the chemical composition of the lipid layers (Eppste, 1982; Koppenhagen, 1997).
  • the principle of suitable tests for determining the release kinetics is based on incubating the IFN- ⁇ -loaded liposomes in a physiological buffer system, which contains serum for the purpose of simulating in vivo conditions, and determining the IFN- ⁇ concentration in the supernatant at certain time intervals , e.g. by means of ELISA.
  • a physiological buffer system which contains serum for the purpose of simulating in vivo conditions
  • determining the IFN- ⁇ concentration in the supernatant at certain time intervals e.g. by means of ELISA.
  • specific tests are described with which the release kinetics of the therapeutic agent can be determined.
  • the release kinetics are preferably determined in vivo.
  • test animals are given the appropriate injection volume, which, for reasons of demonstrability, expediently has a higher IFN- ⁇ content than the intended effective dose of the vaccine. Then blood is taken from the test animals at defined intervals and the IFN- ⁇ content is determined, e.g. with ELISA.
  • the mm vivo release kinetics can be determined by using a liposome preparation is applied in which the liposomes and the IFN- ⁇ contained therein have a different radioactive label. After the injection, samples are taken from the vaccination site at defined intervals and the
  • the absolute values provide information about liposomes / IFN- ⁇ still present at the vaccination site; a proportional decrease in the two values suggests that the IFN- ⁇ is still encapsulated in the liposomes.
  • the effective combination of tumor antigens / IFN- ⁇ contained in the tumor vaccine according to the invention is such that a cytotoxic T-cell response and / or a humoral immune response is triggered which eliminates the tumor cells or provides protection against tumor formation in the case of prophylactic use .
  • Suitable tests are available to the person skilled in the art to determine the extent of the immune response and to determine an optimal dosage of tumor antigen / IFN- ⁇ on the basis of the test results.
  • Test animal (which is obtained by treating the animal with antibodies that deplete CD4 or CD8 cells) no immune response occurs (Coligan et al., 1991).
  • a cellular immune response can also be demonstrated by demonstrating a delayed-type hypersensitivity (DTH) response in immunized animals.
  • DTH delayed-type hypersensitivity
  • peptides are injected into the sole of the foot of mice and the swelling of the injected site is measured (Grohman et al., 1995; Puccetti et al., 1994).
  • antigens are injected intradermally and the redness or swelling of the injected area is measured.
  • the induction of a humoral immune response by antigens or peptides derived therefrom which are foreign antigens for the organism or antigens which are expressed in low concentration by the organism to be treated can be determined by detecting specific antibodies in the serum.
  • the enzyme Lmked Immunoassay is the method for determining antibody titer in serum.
  • the specific antibodies are detected with a color reaction after binding to the peptide used for immunization.
  • An alternative method is the Western blot. Specific serum antibodies bind to the peptide immobilized on a membrane. Bound antibodies are finally detected using a color reaction (Coligan et al., 1991).
  • the immunomodulatory effect of the vaccine is measured in animal experiments.
  • Established tumor models in which irradiated tumor cells induce at least a low immune response or tumor models in which tumor antigen peptide sequences recognized by immune cells are known can be used for this purpose.
  • the vaccine will vary in Ratios of tumor antigen source / IFN- ⁇ slow release system applied. Protection against tumor growth is a measure of the effectiveness of the tumor vaccine.
  • the injection volume is generally 50 ⁇ l to 2 ml.
  • the vaccine according to the invention is generally in the form of a suspension in a pharmaceutically acceptable carrier, preferably a watery carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier e.g. Water, buffered water, salt solution (0.4%), glycine solution (0.3%), hyaluronic acid and similar known carriers can be used.
  • the composition may also contain pharmaceutically acceptable excipients such as buffering substances and inorganic salts to achieve normal osmotic pressure and / or effective lyophilization. Examples of such additives are sodium and potassium salts, e.g. Chlorides and phosphates, sucrose, glucose, protein hydrolyzates, dextran, polyvinyl pyrrolidone or polyethylene glycol.
  • the compositions can be sterilized using conventional techniques, e.g. by means of stone filtration. The composition can be filled in this form immediately or lyophilized and mixed with a sterile solution before use.
  • Tumor vaccines in the form of two separate formulations (tumor antigen source and IFN- ⁇ slow-release formulation) which are combined before administration.
  • the tumor vaccine according to the invention can be administered prophylactically or therapeutically.
  • the route of application is preferably intradermal, subcutaneous or intramuscular.
  • Fig. 1 Determination of the release kinetics of muIFN- ⁇ from liposomes in vi tro
  • Fig. 2 Immunization of mice with a vaccine from tumor cells and muIFN- ⁇ (1st experiment)
  • Fig. 3 Immunization of mice with a vaccine from tumor cells and muIFN- ⁇ (2nd experiment)
  • Fig. 4 Determination of the cytotoxic activity of T lymphocytes after immunization with a
  • association efficiency was found to be only 20% at a 1: 0 molar ratio, while it increased to more than 95% at a 1: 4, 4: 1 or 9: 1 molar ratio.
  • the liposomes containing IFN- ⁇ were stable at 4 ° C for at least one month. After 30 days, an IFN- ⁇ activity of more than> 80%, determined by HPLC, was detected. The 20% decrease in activity is apparently due to a breakdown of IFN- ⁇ ; Protein determination according to Lowry et al., 1951, showed that no significant amounts of protein were released from the liposomes (storage of free IFN- ⁇ at 4 ° C. also shows a loss of activity of 20%).
  • Recombinant murine IFN- ⁇ was made in 10 mM
  • IFN- ⁇ -containing liposomes in PBS / 10% FCS buffer (approx. 0.5-1 ml liposomes per ml buffer) at 37 ° C., which simulates a m vivo environment, incubated over the time periods indicated in Fig. 1. After incubation, the samples were dissolved with sucrose spiked and centrifuged to separate the liposomes and the released protein. The lower phase was separated from the liposomes and frozen at -20 ° C until the IFN- ⁇ content was determined. The IFN- ⁇ content was determined using an ELISA (BIO Source).
  • the mouse melanoma cell line B16F10 comes from the NIH DCTDC tumor repository.
  • the cells were grown in T175 culture bottles in DMEM, 10% FCS, 2 mM glutamine.
  • B16F10 melanoma cells (1-2 x 10 7 cells per T175 culture bottle) were dosed with ⁇ -rays
  • the cells were trypsinized with a trypsin / EDTA solution, washed in 3 washing steps with culture medium, PBS and Ringer's solution and to a concentration of 4 ⁇ 10 ⁇ cells per ml (m Ringer's solution) set.
  • the cell suspension was mixed in equal volumes with liposome suspensions containing muIFN- ⁇ in different concentrations (100 ⁇ g / ml, 20 ⁇ g / ml, 4 ⁇ g / ml, 0.8 ⁇ g / ml and 0 ⁇ g / ml).
  • the finished vaccines thus contained a tumor cell concentration of 2 ⁇ 10 ′′ cells per ml and concentrations of liposomally encapsulated muIFN- ⁇ correspondingly: 50 ⁇ g / ml, 10 ⁇ g / ml, 2 ⁇ g / ml, 0.4 ⁇ g / ml and 0 ⁇ g / ml .
  • mice Syngeneic C57B1 / 6 mice (female, age: 8 weeks) were immunized by subcutaneous injection of the vaccines into the right rear flank. The fur had been shaved off on both back flanks. The injection volume was 100 ul per mouse. Thus, 2 ⁇ 10 ⁇ B16 cells and correspondingly 5 ⁇ g, 1 ⁇ g, 200 ng or 40 ng liposomally encapsulated muIFN- ⁇ were administered per mouse per immunization. 8 mice were immunized per dose group.
  • mice were immunized with the following control vaccines:
  • mice received a booster immunization with the same vaccines used for the first immunization.
  • mice After a further week, the animals were exposed to the highly tumorigenic dose of 1 x 10 ⁇ B16 cells, which was applied at a site which was removed (contralateral) from the immunization site. In addition, a group (8 animals) of non-immunized mice was exposed to the tumor cells in the same way.
  • mice Eight weeks after the tumor cell implantation, all (8/8) of the non-immunized mice had developed tumors. In contrast, 4 of 8 and 3 of 8 animals of the groups which had been immunized with irradiated cells and mu IFN- ⁇ liposomes containing 200 ng and 1 ⁇ g mu IFN- ⁇ were protected. A similar protective effect (3/8 tumor-free animals) was found for animals that had been immunized with IFN- ⁇ -gene-modified cells.
  • mice Syngeneic C57B1 / 6 mice (female, age: 9 weeks) were immunized by subcutaneous injection of the vaccines into the right rear flank. The fur had been shaved off on both back flanks. The injection volume was 100 ul per mouse. 2 x 10 ⁇ B16 cells and liposomally encapsulated mu IFN- ⁇ were administered per mouse in doses of 4 ⁇ g, 1 ⁇ g, 200 ng or 40 ng per immunization. 8 mice were immunized per dose group.
  • mice were immunized with the following control vaccines:
  • mice were boosted with the same vaccines as used for the first immunization.
  • mice After a further week, the animals were exposed to the highly tumorigenic dose of 1 x 10 ⁇ B16 cells, that was applied at a location that was located (contralateral) from the immunization site. In addition, a group (8 animals) of non-immunized mice were exposed to the tumorigenic cells in the same way.
  • mice Eight weeks after the tumor cell implantation, all (8/8) of the non-immunized mice had developed tumors. In contrast, 4 out of 8 and 3 out of 8 animals of the groups which had been immunized with irradiated cells and muIFN- ⁇ liposomes containing 1 ⁇ g and 200 ng muIFN- ⁇ were protected. A similar protective effect (4/8 tumor-free animals) was found for animals which had been immunized with muIFN- ⁇ -gene-modified cells.
  • mice (female, age: 9 weeks) were immunized by subcutaneous injection of the vaccines into the right rear flank. The fur had been shaved off on both back flanks. The injection volume was 100 ul per mouse. There were 2 x 10 ⁇ per mouse
  • one group was immunized only with irradiated B16 cells and another group was injected with buffer only
  • mice Four mice were immunized per group.
  • mice received a booster immunization with the same vaccines used for the first immunization.
  • splenocytes were isolated, pooled within each group and restimulated for 5 days in vitro with irradiated B16 cells.
  • CTL activity cytotoxic activity of the splenocytes (effector cells) against B16 cells (target cells) was measured using a europium release assay (Blomberg et al., 1993).
  • the CTL activity (expressed as% specific lysis (Zatloukal et al., 1993)) was determined for various effector: target ratios (100: 1, 50: 1, 25: 1) and is shown in FIG. 4.
  • Splenocytes from mice which had been immunized with irradiated B16 cells and muIFN- ⁇ -liposomes in the optimal dose range (300 ng muIFN- ⁇ ) showed a clear cytotoxic activity against B16 cells
  • muIFN- ⁇ liposomes were shown to be an efficient adjuvant in a cellular tumor vaccine and free muIFN- ⁇ did not induce protection against lethal tumor challenge, it was assumed that encapsulation in liposomes resulted in prolonged presence of the cytome at the site of action .
  • the release of muIFN- ⁇ liposomes was therefore investigated to show that the liposomes remain at the injection site, the site of the antigen presentation.
  • MuIFN- ⁇ -liposomes were prepared as described in Example 2a, with the difference that the final concentration of MuIFN- ⁇ was 5 ⁇ g / ml.
  • 125 I-labeled muIFN- ⁇ was used (the specific activity corresponded to that of the 125 I-labeled huIFN- ⁇ described in the following example, as was the mixing ratio to unlabeled muIFN - ⁇ ).
  • the whereabouts of the liposomes To be able to follow the injection site was used in an alternative approach in the preparation of the lipid film in addition to PC and PG l ⁇ , 2 ⁇ (n) - [ 3 H] - cholesteryl ether, specific activity: 46 mCI (1.71 Tbq) / i ⁇ iMol (Amersham) (10 ⁇ l).
  • Example 2e Analogous to that described in Example 2e, the mouse was subcutaneously injected with a single dose of 100 ⁇ l liposomes ([ 125 I] -muIFN- ⁇ -liposomes or [ 3 H] -liposomes) or free [ 125 I] -muIFN- ⁇ ( 5 ⁇ g / ml) injected. In contrast to Example 2e, no cells were added. The mice were killed at various times (see FIG. 5). The injection site was divided into three parts. Each piece was placed in a glass scintillation tube and 3 ml of Soluene-350 (Packard) was added to dissolve the samples at 40 ° C for three days.
  • Soluene-350 Packard
  • Fig. 5 shows the percentage of the dose remaining at the injection site (ID), based on the total injected dose. It turned out that that liposomally encapsulated muIFN- ⁇ remains at the injection site longer than the free one.
  • the liposomes (40 ⁇ mol / ml) were produced by the film method, essentially as described in Example 1 or Example 2, with PC and PG being mixed in a molar ratio of 9: 1.
  • the films were hydrogenated by hand rubbing the flasks.
  • [ 125 I] -huIFN- ⁇ had shown during the first hours, which can probably be attributed to the fact that this portion immediately detaches from the liposomes and disappears from the vaccination site, "alternative" liposomes were produced which had less protein ( ⁇ 10%) contained adsorbed on the outer membrane.
  • lipid films consisting of PC and PG in a molar ratio of 9: 1 with a very small volume of huIFN- ⁇ in 10% sucrose (10 mM Na-succinate buffer, pH 5.0), for example 0.5 ⁇ l; 500 ⁇ g / ml, hydrogenated. This resulted in a very viscous, gel-like mass of highly concentrated liposomes.
  • liposomes were combined in one
  • the "free" [ 125 I] -huIFN- ⁇ solution (10 kBq / mouse) was prepared by adding 52 ⁇ l of [ 125 I] -huIFN- ⁇ stock solution (120 ⁇ Ci / ml) to 2.3 ml (50 ⁇ g / ml ) HuIFN- ⁇ in 5% glucose (10 mM Na succinate buffer, pH 5.0).
  • mice were injected with the two liposome preparations or the free solution containing huIFN- ⁇ , and the remaining injection dose was measured as described in Example 4.
  • the result of the measurements is shown in FIG. 6, the percentage of the dose remaining at the injection site (ID), based on the total dose injected, being indicated. It was found that the liposomally encapsulated huIFN- ⁇ remains at the injection site longer than the free one, the "alternative" liposomes showing even more favorable properties with regard to the delayed release.
  • B16 B16F10 melanoma cells irradiated with a dose of 50 Gy
  • IFN / B16 with the gene for IFN-gamma transfected B16F10 melanoma cells irradiated with 50 Gy Table II
  • B16 B16F10 melanoma cells irradiated with a dose of 50 Gy
  • IFN / B16 gene transfected with IFN-gamma, B16F10 irradiated with 50 Gy
  • IL-12 a key cytokine in immune regulation. Immunol Today 5: 214-217

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Abstract

Eine Tumorvakzine auf der Grundlage von Tumorantigenen enthält als wirksamen Bestandteil neben einer Tumorantigenquelle ein Abgabesystem mit verzögerter Wirkstoff-Freisetzung für IFN- gamma , wobei die wirksame IFN- gamma -Dosis 50 ng bis 5 mu g beträgt, die während eines Zeitraums von mehreren Stunden bis zu mehreren Tagen freigesetzt wird. Das Abgabesystem für IFN- gamma besteht bevorzugt aus Liposomen, die Tumorantigenquelle bevorzugt aus allogenen Tumorzellen.

Description

Tumorvakzine
Die Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Immuntherapie von Tumorerkrankungen.
Die meisten malignen Tumore entgehen erfolgreich einer Kontrolle durch das Immunsystem, obwohl eine Vielzahl von ihnen tumorassoziierte Antigene exprimiert (van der Bruggen, 1991; Brichard, 1993; Gaughler, 1994; Coulie, 1994) . Es hat sich gezeigt, daß neben der Präsentation der geeigneten Antigene zusätzlich bestimmte Adjuvantien notwendig sind, um eine effektive Stimulierung des Immunsystems zu erzielen (Zier, 1995).
Anfängliche Studien zielten ab auf eine Stimulierung des Immunsystems durch Vakzinierung mit inaktivierten Tumorzellen in Kombination mit unspezifischen Immunstimulatoren, wie BCG oder anderen bakteriellen Adjuvantien und führten in einigen Fällen zu einer Verbesserung der Überlebensrate von Patienten mit malignen Tumoren (Berd, 1990; Barth, 1994; Morton, 1992). Die Wirkung dieser Adjuvantien ist allerdings nicht direkt, sondern verläuft über die Ausschüttung einer Kaskade von endogenen Zytokinen und Mediatoren und ist daher einerseits nicht spezifisch, andererseits kaum reproduzierbar. Dies erschwert eine Anwendung dieser unspezifischen Adjuvantien in einer pharmazeutischen Zusammensetzung. In moderneren Ansätzen werden direkt die immunstimulierenden Zytokine als Adjuvantien eingesetzt (Rosenberg, 1988, Rosenberg, 1989) . Unter den immunstimulierenden Zytokinen haben sich vor allem Interleukin-2 (IL-2), Interferon-α (IFN-α),
Interferon-γ, (IFN-γ) IL-12, und GM-CSF (Granulozyten- Makrophagen stimulierender Faktor) als erfolgversprechend gezeigt (Rosenberg, 1991; Dranoff, 1993; Zatloukal, 1993; Ferrantini, 1994; Lamont, 1996; Clary, 1996) .
Bei der Erprobung verschiedener Zytokine hat sich gezeigt, daß ihre Wirkung stark von Parametern wie 1) Ort und Art der Applikation; 2) Dosis und 3) Wirkdauer abhangig ist. So hatte z.B. eine systemische Applikation von rekombinantem IL-2 weniger die erwünschte Induktion einer antitumoralen Immunantwort als vielmehr schwere toxische Nebenwirkungen, sogar therapiebedingte Todesfalle, zur Folge (Rosenstein et al., 1986; Rosenberg et al-, 1989; Perez et al., 1991). Die schweren Nebenwirkungen resultieren aus einer Verwendung der Zytokine unter Nichtbeachtung ihrer physiologischen Wirkungsmechanismen. Zytokine sind pleiotrope Mediatoren, die natürlicherweise zur Kommunikation zwischen nahe beieinander gelegenen Zellen dienen, sie wirken über geringe Entfernungen. Freisetzung und Wirkort der Zytokine liegen also unter physiologischen Bedingungen lokal eng beieinander (Pardoll, 1995) . Um bei einer systemischen Applikation genügend hohe Konzentrationen des Zytokins am angestrebten Zielort zu erreichen, müssen hohe Dosen appliziert werden (Rosenberg et al., 1989), die zu ausgeprägten Wirkungen auch an unerwünschten Zielorten fuhren.
Die moderne Idee und das angestrebte Prinzip einer Tumorvakzine ist die Induktion einer systemischen, gegen den Tumor gerichteten Immunreaktion mit Hilfe eines gleichzeitigen, gezielten Angebotes von relevanten Tumorantigenen und lmmunst mulatoπschen Zytokinen, jedoch nicht über die hochdosierte systemische Gabe von Zytokinen, sondern vielmehr über längere Zeiträume wirkende, lokal hohe Zytokmdosen am Vakzinierungsort (paraknnes Konzept) (Pardoll, 1995; Jaffe et al., 1996) .
Eine lokale Anwendung der Zytokine ist jedoch technisch problematisch, vor allem wegen des schnellen Wegdiffundierens der Zytokine (innerhalb von Minuten) m die umgebenden Gewebe bzw. in den Blutkreislauf, gepaart mit einer oft extrem geringen Halbwertszeit ( Inaktivierung) m biologischen Flüssigkeiten (Eppstem, 1982; Kedar et al., 1994; Koppenhagen, 1997).
In den letzten Jahren konnte gezeigt werden, daß eine lokale, auf den Vakzinierungsort begrenzte, und über einen längeren Zeitraum wirkende Zytokmfreisetzung durch eine Injektion von Tumorzellen, die mit dem das Zytokm kodierenden Gen transfiziert und so zu Zytokm- Produzenten gemacht worden sind, erreicht werden kann
(Fearon et al . , 1990; Gansbacher et al., 1990; Rosenberg et al., 1992; Dranoff et al., 1993). In Tiermodellen wurde gezeigt, daß Vakzine auf der Basis von Zytokm- genmodiflzierten Tumorzellen eine systemische, spezifisch gegen den Tumor gerichtete Immunantwort induzieren können, die die Tiere vor einem hochtumoπgenen Tumorchallenge schützt (Zatloukal et al., 1993; Zatloukal et al., 1995; Schmidt et al., 1995; Schweighoffer et al., 1996). In einigen Fallen konnten sogar kleine, bereits vor der Vakzinierung etablierte Tumore beseitigt werden (Clary et al., 1996; Clary et al., 1997) . Obwohl mit dem Ansatz unter Verwendung von genmodifizierten Tumorzellen der physiologischen parakπnen Wirkungsweise der Zytokine Rechnung getragen wird, hat sich die Zytokmdosis als ein weiterer entscheidender Parameter herausgestellt. So wurde gezeigt, daß für die Stimulierung einer Immunantwort die Zytokine innerhalb eines therapeutisch wirksamen Dosisfensters appliziert werden müssen, zu niedrige, aber auch zu hohe Zytokmdosen waren nicht effektiv (Zatloukal et al., 1995; Schmidt et al., 1995). Andererseits ist es oftmals schwierig, mit Hilfe der Genmodifizierung von Tumorzellen, speziell von primären Tumorzellen, eine Genexpression genau innerhalb dieses effektiven Dosisfensters zu erreichen.
In der DE-Al 44 11 425 wird eine zellulare Tumorvakzine beschrieben, die Zytokine in Depotform enthalt. Konkret wird als Zytokm IL-2 vorgeschlagen, wobei Erfordernisse hinsichtlich der Dosis und der Freisetzungskinetik des Zytokms nicht berücksichtigt werden.
In der WO 94/21808 wird eine Tumorvakzine aus autologen, Zytokmgen-transflzierten Zellen beschrieben, von der u.a. gezeigt wird, daß die Schutzwirkung von Zytokinen (IL-2, IFN-γ und GM-CSF) dosisabhangig ist, wobei gezeigt wird, daß nicht unbedingt mit der höchsten Dosis die beste Schutzwirkung erreicht wird, ein optimal wirksames Dosisfenster wird jedoch nicht definiert.
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, eine alternative, einfach herzustellende Tumorvakzine bereitzustellen, die es ermöglicht, das immunstimulierende Zytokin gezielt am Ort der Vakzinierung im therapeutisch wirksamen Dosisbereich über einen längeren Zeitraum freizusetzen.
Diese Aufgabe wurde erfmdungsgemaß gelost mit einer Tumorvakzine auf der Grundlage von Tumorantigenen, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie als wirksamen Bestandteil neben einer Tumorantigenquelle ein Abgabesystem mit verzögerter Wirkstoff-Freisetzung für IFN-γ enthalt, wobei die wirksame IFN-γ-Dosis 50 ng bis 5 μg und der Freisetzungszeitraum eine halbe Stunde bis 8 Tage betragt.
Bevorzugt betragt die IFN-γ-Dosis 100 ng bis 2 μg, insbesondere 100 ng bis 1 μg.
Als gunstig hat sich ein Freisetzungszeitraum ab einer halben Stunde bis zu 2 bis 3 Tagen erwiesen, es zeigten jedoch auch längere Freisetzungszeitraume von bis zu 8 Tagen eine gunstige Antitumorwirkung.
Bevorzugt werden mindestens ca. 75 % der wirksamen IFN-γ-Dosis in einem Freisetzungszeitraum von einer Stunde bis 3 Tage freigesetzt.
Die Freisetzung von IFN-γ sollte möglichst sofort, spätestens jedoch eine Stunde nach Applikation der Vakzine einsetzen. Wesentlich für die Wirksamkeit der Tumorvakzine ist in jedem Fall, daß IFN-γ und Tumorantigenquelle im wesentlichen gleichzeitig zur Verfugung stehen.
Das Abgabesystem mit verzögerter Wirkstoff-Freisetzung wird im folgenden als "Slow Release System" bezeichnet.
Grundsatzlich sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung samtliche Slow Release Systeme geeignet, die die geforderten Bedingungen hinsichtlich Dosierung und Freisetzung von IFN-γ erfüllen.
Bevorzugt liegt das Slow-Release-System in Form von Liposomen vor.
Liposomen sind synthetische Lipidvesikel, die aus einer oder mehreren konzentrischen Lipidschichten bestehen, die wasserige Abteilungen umschließen. In die wasserigen Abteilungen können wasserlösliche Substanzen eingeschlossen, in die Lipidschichten fettlosliche Substanzen eingebaut werden. Da diese Vesikel aufgrund ihrer Struktur, ihrer biologischen Abbaufahigkeit und ihrer geringen Toxizitat vielseitig verwendbar sind, wurden sie in den letzten Jahren zunehmend als Trager verschiedenster therapeutischer Wirkstoffe, u.a. für Tumortherapeutika, verwendet.
Liposomen werden in zwei Hauptkategorien eingeteilt. Zur ersten Kategorie zahlen die uni- oder multilamellaren "konventionellen" Liposomen. Diese Liposomen haben aufgrund ihrer raschen Aufnahme durch das retikuloendotheliale System eine relativ kurze Halbwertszeit . Um bei der Anwendung der Liposomen m vivo unspezifische Interaktionen mit Zellen des retikuloendothelialen Systems zu verringern und einen unerwünscht raschen Abbau zu verhindern, sind die Liposomen in einer Ausfuhrungsform der Erfindung modifiziert. Bevorzugt sind die Liposomen mit kovalent gekoppeltem Polyethylenglykol (PEG) modifiziert ( "PEGyliert" ; Moπ et al., 1991; Chonn et al., 1992; Woodle et al . , 1994). Die Menge des eingesetzten PEG betragt zwischen 2 und 10 % PEG-gekoppeltem Lipid im Liposom (m/m) , das
Molekulargewicht von PEG bevorzugt zwischen 750 und 5000 D (Klibanov et al., 1990.; Blume et al., 1990; Mayhew et al., 1992; Papahadjopoulos et al., 1991; Senior et al . , 1991; Moπ et al., 1991; Yoshioka, 1991). Die Liposomen können auch mit anderen Gruppierungen, wie amphiphilen Vmylpolymeren, modifiziert sein, um deren Halbwertszeit m vivo zu verlangern.
Der Stand der Technik stellt eine große Vielfalt von Liposomen und Herstellungsmethoden dafür zur Verfugung, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, stellvertretend sei verwiesen auf die US Patente 4,485,045 und 4,544,545; Epstein et al., 1985; Hwang et al., 1980; EP 0 036 676; EP 0 052 322; EP 0 088 046; EP 0 102 324; EP 0 142 641; EP 0 143 949; DE 3,218,121; Eppste , 1982; Bergers et al . , 1993; Kedar et al.,
1994; Herrmann und Stricker, 1995; Koppenhagen, 1997. Die Auswirkung der Inkorpierung von IFN-γ in Liposomen auf dessen biologische Wirkung wurde u.a. von Mellors et al., 1989, und Saravolac et al., 1996, beschrieben.
Als Alternative für Liposomen als Slow Release System kommen für den Einbau von IFN-γ biologisch abbaubare polymere Materialien in Form von Mikrospharen (Maulding, 1987; Golumbek et al., 1993; Johnson et al . , 1996; Lee et al., 1997; Cleland, 1997; Cleland und Jones, 1996) oder Minipellets (Fu iwara et al . , 1990; Marumo et al., 1997) m Betracht; diese können ebenfalls, zwecks Verlängerung der Halbwertszeit, modifiziert sein.
Als Tumorantigenquelle der erfmdungsgemaßen Vakzine können sämtliche Tumorantigene enthaltenden Zusammensetzungen dienen, die geeignet sind, im behandelten Individuum eine spezifische Immunantwort auszulosen.
In einer Ausfuhrungsform der Erfindung liegen die Tumorantigene m Form von Tumorzellen vor.
Bei den Tumorzellen der Vakzine kann es sich um autologe oder allogene Tumorzellen handeln.
In einer Ausfuhrungsform der Erfindung sind die Tumorzellen der Vakzine autolog. Dabei handelt es sich um Zellen, die dem zu behandelnden Patienten entnommen werden, ex vivo gegebenenfalls inaktiviert, mit dem IFN-γ freisetzenden Slow-Release-System vermischt und danach dem Patienten wieder verabreicht werden (Methoden zur Herstellung von autologen Tumorvakzmen sind dem Fachmann bekannt und u.a. in der WO 94/21808, auf deren Offenbarung Bezug genommen wird, beschrieben.)
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung sind die Tumorzellen allogen, d.h. sie stammen nicht von dem zu behandelnden Patienten (Barth et al . , 1994; Morton et al., 1992) . Der Verwendung von allogenen Zellen, die im allgemeinen Form von etablierten Tumorzellinien zur Verfügung stehen, wird vor allem dann der Vorzug gegeben, wenn arbeitsökonomische Überlegungen eine Rolle spielen; die Herstellung von individuellen Vakzinen für jeden einzelnen Patienten ist arbeits- und kostenaufwendig, außerdem treten bei einzelnen Patienten Schwierigkeiten bei der ex vivo Kultivierung der Tumorzellen auf, so daß Tumorzellen nicht in ausreichend großer Zahl erhalten werden, um eine Vakzine herstellen zu können. Bevorzugt wird als Tumorantigenquelle eine Mischung von Zellen aus mehreren allogenen
Tumorzellinien verwendet. Tumorvakzine aus allogenen Tumorzellen sind Stand der Technik, derartige Vakzinen wurden u.a. von Adler et al., 1995 und Hayashi et al., 1993; Oratz et al., 1989; Morton et al . , 1989; Bystryn et al., 1986, beschrieben.
Als Antigenquelle können auch Lysate von Tumorzellen, wie z.B. von Mitchell, et al., 1993, beschrieben, verwendet werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung besteht die Tumorantigenquelle aus Tumorzellen, insbesondere allogenen Tumorzellen, die mit Peptiden beladen sind, die von Tumorantigenen abgeleitet sind. Eine Tumorvakzine, die erfindungsgemäß als Antigenquelle in Verbindung mit der IFN-γ-Slow Release-Formulierung verwendet werden kann, wurde von Buschle et al., 1997, beschrieben; als Alternative zu Tumorzellen können auch Antigen-präsentierende Zellen verwendet werden, z.B. dendritische Zellen, die mit den Tumorantigenpeptiden beladen sind, wie in der DE-Al 196 07 044 oder von Buschle et al., 1997, beschrieben. Die Identifizierung und Isolierung von Tumorantigenen und Tumor-assoznerten Antigenen (TAs) bzw. davon abgeleiteter Peptide (z.B. beschrieben von Wolfel et al., 1994 a) und 1994 b) ; Carrel et al., 1993; Lehmann et al., 1989; Tibbets et al., 1993; oder den veröffentlichten internationalen Anmeldungen WO 92/20356, WO 94/05304, WO 94/23031, WO 95/00159 beschrieben) , war die Voraussetzung dafür, Tumorantigene als solche als Immunogene zu verwenden, wie z.B. von Anchim et al., 1996, beschrieben.
In einer Ausfuhrungsform der Erfindung liegen die Tumorantigene in Form von Tumorantigenen als solchen vor, um eine zellulare Immunantwort auszulosen, wie sie zur Elimmierung von Tumorantigen tragenden Tumorzellen erforderlich ist (Bakker et al . , 1994; Cox et al.,
1994) . Die Tumorantigene können in Form von Proteinen oder in Form von Tu orantigen-abgeleiteten Peptiden vorliegen .
Ein Beispiel für eine zeilfreie Tumorvakzine auf der Grundlage von Tumorantigenen oder davon abgeleiteten Peptiden, die als Antigenquelle im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet ist, wurde von Schmidt et al., 1996, sowie in der WO 97/30721 beschrieben, auf diese Offenbarungen wird hiermit Bezug genommen. Eine Übersicht über Krebsvakzine auf der Grundlage von
Peptiden, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Antigenquelle geeignet sind, wird von Melief et al., 1996, gegeben.
Die Antigenquelle kann gegebenenfalls ebenfalls in Form einer Slow-Release-Formulierung vorliegen. Eine Tumorvakzine auf der Grundlage von Tumorantigenen, z.B. in Form von Tumorzellen, in Kombination mit einem "slow release" System, m das IFN-γ eingebaut ist, hat gegenüber Tumorvakzinen aus gen-modifizierten Tumorzellen, die IFN-γ exprimieren, den Vorteil einer exakten Steuerung der Zytokinfreisetzung am Vakzinierungsort und damit einer reproduzierbaren und genauen Dosierung des Zytokins. Ferner ist der Arbeitsund somit Kostenaufwand für die Herstellung wesentlich geringer.
Die Ergebnisse der im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Versuche zeigen, daß die Immunisierung von Mausen mit Vakzinen, bestehend aus bestrahlten Tumorzellen und muIFN-γ-Liposomen eine systemische Immunantwort induzieren kann, die die Tiere vor einer
Tumorentwicklung schützt. Dieser Schutzeffekt zeigt eine klare Abhängigkeit von der IFN-γ Dosis. Der für eine Immunisierung wirkungsvollste Dosisbereich wurde im Bereich von 100 ng bis 1 μg muIFN-γ gefunden.
Es konnte gezeigt werden, daß der Schutzeffekt außer von der IFN-γ-Dosis auch von der verzögerten Freisetzung des Zytokins abhangig ist.
Dabei war die verzögerte Freisetzung von Liposomen- verkapseltem muIFN-γ hinsichtlich der Anti- Tumorschutzwirkung ebenso effizient wie muIFN-γ, das von genmodifizierten Zellen exprimiert wurde. Freies muIFN-γ, zugemischt zu den bestrahlten Zellen, bewirkte einen weitaus geringeren bzw. überhaupt keinen Schutz. Sowohl Menge an eingebautem IFN-γ als auch dessen Freisetzung am Wirkungsort sind von Große, Form, Struktur und chemischer Zusammensetzung des jeweils gewählten Slow-release Systems abhangig.
Gegebenenfalls kann die erfmdungsgemaße Vakzine neben IFN-γ ein oder mehrere weitere Zytokine enthalten, z.B. Interleukm-2 (IL-2), IL-4, IL-12, IFN-α IFN-ß, IFN-ω
TNF-α. Das gegebenenfalls zusätzlich m der Vakzine enthaltene Zytokm kann in demselben oder in einem verschiedenen Slow-Release System vorliegen wie IFN-γ. Das Zytokm kann auch dadurch am Applikationsort verfugbar gemacht werden, daß als Tumorantigenquelle Tumorzellen (vorzugsweise allogene) verwendet werden, die mit dem entspechenden Zytokm-Gen transfiziert sind.
Derartige modifizierte Tumorzellen sowie Verfahren zu ihrer Herstellung wurden u.a. in der WO 95/09655, WO 95/31107, WO 93/10219, WO 93/07906 und WO 94/21808 sowie von Belli et al . , 1997 beschrieben.
Gegebenenfalls enthalt die Vakzine zusätzlich unspezifische immunstimulierende Adjuvantien, wie LPS
(L popolysaccharid) oder BCG (Bacillus Calmette Guerin) .
Die Formulierung der Vakzine kann zweckmäßig wie folgt vorgenommen werden:
Im allgemeinen wird zunächst das für eine effiziente Antitumorwirkung geeignete Verhältnis von Antigen: IFN-γ- Dosis ermittelt. Eine dazu geeignete Vorgehensweise besteht darin, daß ausgehend von einer im Hinblick auf die Ausbildung einer Antitumor-Antwort suboptimalen Menge an Antigen (im Falle einer optimalen Antigendosis von ca. 10^ Tumorzellen z.B. ca. 10^ Zellen) durch Titration diejenige Menge an IFN-γ ermittelt wird, bei der der Antitumoreffekt eine Steigerung erfahrt.
Danach wird die definitive Menge an Antigen optimiert.
Um eine wirksame Antigendosis zur Verfugung zu stellen, enthalt die Formulierung im Falle der Verwendung von Tumorzellen als Antigenquelle im allgemeinen ca. 10^ bis lO^, vorzugsweise 10^ bis 10^ Zellen; im Falle der Verwendung einer zeilfreien Antigenquelle wird die Menge an Tumorantigenen bzw. davon abgeleiteten Peptiden so bemessen, daß eine Immunantwort ausgelost wird, die der durch die oben genannte Tumorzellzahl ausgelosten Immunantwort etwa äquivalent ist.
Gegebenenfalls kann m einem weiteren Schritt überprüft werden, ob die Beifügung eines weiteren Zytokms oder eines weiteren unspezifischen Adjuvans eine Steigerung der Antitumorwirkung heroeifuhrt.
Um ein hinsichtlich der IFN-γ-Dosis und Freisetzungskinetik den Anforderungen entsprechendes Slow Release System auszuwählen, wird zweckmäßig wie folgt vorgegangen (im folgenden wird der Begriff "Liposomen" stellvertretend für alle Praparationen verwendet, die eine verzögerte Abgabe von Proteinen erlauben, z.B. Mikrospharen oder Minipellets):
Um die Beladungseffizienz der Liposomen mit IFN-γ zu testen, wird IFN-γ m verschiedene Liposomenpraparationen mkorpiert, freies IFN-γ abgetrennt und der IFN-γ-Gehalt der Liposomen bestimmt, z.B. mittels ELISA, HPLC oder mittels der Proteinbestimmungsmethode nach Lowry (Lowry et al., 1951) . Für die biologische Wirksamkeit der erfmdungsgemaßen Vakzine ist der absolute Beladungsgrad der Liposomen mit IFN-γ nicht kritisch, wesentlich ist die in einem bestimmten Zeitraum verfugbare Dosis. Es hat sich jedoch als vorteilhaft erwiesen, wenn die IFN-γ -Konzentration m der Liposomenpraparation mindestens etwa 10 μg/ml, vorzugsweise mehr als 20 μg/ml betragt. (Bei geringem absolutem Beladungsgrad der Liposomen kann die gewünschte immunmodulatorische Wirkung von IFN-γ in der Vakzine erzielt werden, indem der Anteil der Liposomenpraparation in der Vakzine erhöht wird) .
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform befinden sich mindestens 90% des IFN-γ m den Liposomen eingeschlossen, d.h. daß höchstens 10% des Proteins an der Außenseite der Liposomen adsorbiert sind. Eine vorteilhafte Herstellungsmethode für derartige „alternative" Liposomen besteht darin, die unspezifische elektrostatische Wechselwirkung, die zur Adsorption von IFN-γ fuhrt, zu verringern bzw. zu verhindern, indem man einen Waschschritt mit einer salzhaltigen Losung (z.B. NaCl) vorsieht. Die Konzentration der Ionen muß ausreichend sein, um mit dem Protein um die Bindung an die Liposomen zu konkurrieren.
In einem nächsten Schritt wird die Freisetzungskinetik der Liposomen bestimmt.
Im Falle von Liposomen ist der Einbau bzw. die Freisetzungskinetik der Zytokine von der Ladung, dem hydrophilen/hydrophoben Charakter des Zytokins einerseits, und von den chemischen und physiko- chemischen Charakteristika der Liposomen andererseits abhangig. Wichtigste Charakteristika der Liposomen, die die Freisetzungskinetik bestimmen, sind deren Große, Anzahl der Lipidschichten (unι-/multιlamellar) , Ladung und Fluiditat der Lipidschichten. Diese wiederum werden bestimmt durch die chemische Zusammensetzung der Lipidschichten (Eppste , 1982; Koppenhagen, 1997).
Das Prinzip geeigneter Tests für die Bestimmung der Freisetzungskinetik beruht darauf, die IFN-γ-beladenen Liposomen m einem physiologischen Puffersystem, welches zwecks Simulation von in vivo Bedingungen Serum enthalt, zu mkubieren und in bestimmten Zeitabstanden im Überstand die IFN-γ-Konzentration zu bestimmen, z.B. mittels ELISA. In der Fachliteratur für die jeweiligen Slow Release Systeme sind jeweils spezifische Tests beschrieben, mit denen die Freisetzungskinetik des Therapeutikums bestimmt werden kann.
Vorzugsweise wird zusatzlich zu den in vi tro Tests die Freisetzungskinetik in vivo bestimmt. Analog zur letztlich für die therapeutische Anwendung vorgesehenen Applikationsform (Vakzinierungsort, Applikationsroute) wird Versuchstieren das entsprechende Injektionsvolumen, das aus Gründen der Nachweisbarkeit zweckmäßig einen höheren IFN-γ-Gehalt aufweist als die vorgesehene wirksame Dosis der Vakzine, verabreicht. Dann wird den Versuchstieren m definierten Zeitabstanden Blut abgenommen und der IFN-γ-Gehalt bestimmt, z.B. mit ELISA.
Alternativ kann die m m vivo Freisetzungskinetik bestimmt werden, indem eine Liposomenpraparation appliziert wird, in der die Liposomen und das darin enthaltene IFN-γ eine unterschiedliche radioaktive Markierung aufweisen. Nach der Injektion werden in definierten Zeitabstanden Proben aus der Vakzinierungsstelle entnommen und die
Restradioaktivitaten bestimmt. Die absoluten Werte geben Aufschluß über noch an der Impfstelle vorhandene Liposomen/IFN-γ; eine proportionale Abnahme der beiden Werte laßt darauf schließen, daß das IFN-γ noch in den Liposomen verkapselt ist.
Die in der erfindungsgemaßen Tumorvakzine enthaltene wirksame Kombination Tumorantigene/IFN-γ liegt derart vor, daß eine zytotoxische T-Zell-Anwort und/oder eine humorale Immunantwort ausgelost wird, die die Tumorzellen eliminiert bzw. im Fall der prophylaktischen Anwendung einen Schutz vor Tumorbildung gewahrleistet.
Dem Fachmann stehen geeignete Tests zur Verfugung, um das Ausmaß der Immunantwort festzustellen und auf Grundlage der Testergebnisse eine optimale Dosierung an Tumorantigen/IFN-γ zu ermitteln.
Die Auslosung einer zellularen Immunantwort kann durch den Nachweis antigenspezifischer CTLs bestätigt werden (Coligan et al., 1991) . Ein weiterer Nachweis für das Vorliegen einer zellularen Immunantwort ist dann gegeben, wenn m Abwesenheit von T-Zellen in einem
Versuchstier (welche dadurch erzielt wird, daß man das Tier mit Antikörpern benandelt, die CD4- oder CD8-Zellen depletieren) keine Immunantwort auftritt (Coligan et al., 1991) . Eine zellulare Immunantwort kann auch durch den Nachweis einer "delayed-type hypersensitivity" (DTH) -Reaktion in immunisierten Tieren gezeigt werden. Hierzu werden Peptide m die Fußsohle von Mausen injiziert und die Anschwellung der injizierten Stelle gemessen (Grohman et al., 1995; Puccetti et al., 1994). Zur Messung der DTH-Reaktion im Patienten werden diesem Antigene intradermal injiziert und die Rötung bzw. die Anschwellung der injizierten Stelle gemessen.
Die Induktion einer humoralen Immunantwort durch Antigene bzw. davon abgeleitete Peptide, die Fremdantigene für den Organismus sind bzw. Antigene, die vom zu behandelnden Organismus m geringer Konzentration exprimiert werden, kann durch Nachweis von spezifischen Antikörpern im Serum bestimmt werden. Eine geeignete
Methode zur Antikorpertiterbestimmung im Serum ist der Enzyme Lmked Immunoassay (ELISA) . Dabei werden die spezifischen Antikörper nach Bindung an das zur Immunisierung verwendeten Peptids mit einer Farbreaktion nachgewiesen. E ne alternative Methode ist der Western Blot . Hierbei binden spezifische Serumantikorper an das auf einer Membran immobilisierte Peptid. Gebundene Antikörper werden schließlich wiederum mit einer Farbreaktion nachgewiesen (Coligan et al., 1991).
Im nächsten Schritt wird die immunmodulatorische Wirkung der Vakzine im Tierversuch gemessen. Hierzu können u.a. etablierte Tumormodelle, bei denen bestrahlte Tumorzellen zumindest eine geringe Immunantwort induzieren, oder Tumormodelle, bei denen von Immunzellen erkannte Tumorantigen-Peptidsequenzen bekannt sind, eingesetzt werden. Die Vakzine wird in variierenden Verhaltnissen Tumorantigenquelle/IFN-γ-Slow Release System appliziert. Der Schutz vor Tumorwachstum ist ein Maß für die Wirksamkeit der Tumorvakzine.
Das Injektionsvolumen betragt im allgemeinen 50 μl bis 2 ml.
Die erfmdungsgemaße Vakzine liegt im allgemeinen als Suspension in einem pharmazeutisch annehmbaren Trager vor, vorzugsweise einem wasserigen Trager. Als wasserige Trager können z.B. Wasser, gepuffertes Wasser, Salzlosung (0.4 %) Glycinlosung (0.3 %), Hyaluronsaure und ähnliche bekannte Trager verwendet werden. Die Zusammensetzung kann außerdem pharmazeutisch annehmbare Hilfsstoffe enthalten, wie Puffersubstanzen sowie anorganische Salze, um einen normalen osmotischen Druck und/oder eine wirksame Lyophilisierung zu erreichen. Beispiele für derartige Zusätze sind Natrium- und Kaliumsalze, z.B. Chloride und Phosphate, Saccharose, Glukose, Protemhydrolisate, Dextran, Polyv ylpyrrolidon oder Polyethylenglycol . Die Zusammensetzungen können mittels herkömmlicher Techniken sterilisiert werden, z.B. mittels Steπlfiltration. Die Zusammensetzung kann in dieser Form unmittelbar abgefüllt oder auch lyophilisiert und vor dem Gebrauch mit einer sterilen Losung gemischt werden.
Gegebenenfalls liegt liegt die erfmdungsgemaße
Tumorvakzine in Form zweier getrennter Formulierungen vor (Tumorantigenquelle und IFN-γ-Slow-Release- Formulierung) , die vor αer Verabreichung vereinigt werden. Die erfindungsgemäße Tumorvakzine kann prophylaktisch oder therapeutisch verabreicht werden. Die Applikationsroute ist bevorzugt intradermal, subkutan oder intramuskulär.
Figurenübersicht
Fig. 1: Bestimmung der Freisetzungskinetik von muIFN-γ aus Liposomen in vi tro
Fig. 2: Immunisierung von Mäusen mit einer Vakzine aus Tumorzellen und muIFN-γ (1. Experiment)
Fig. 3: Immunisierung von Mäusen mit einer Vakzine aus Tumorzellen und muIFN-γ (2. Experiment)
Fig. 4: Bestimmung der zytotoxischen Aktivität von T-Lymphozyten nach Immunisierung mit einer
Vakzine aus Tumorzellen und muIFN-γ
Beispiel 1
Einbau von humanem IFN-γ in Liposomen
Optimierung der chemischen Zusammensetzung und Herstellungsmethode der Liposomen
Da die Assoziation von IFN-γ und Liposomen in erster Linie ladungsabhängig ist, wurden Vorversuche mit humanem IFN-γ durchgeführt, in denen die Ladung der Liposomen variiert wurde. Es wurde festgestellt, daß mit steigender negativer Ladung der Liposomen die Effizienz der Inkapsulierung bzw. Assoziation von IFN-γ zunimmt.
Für diese Versuche wurde das molare Verhältnis der negativen und neutralen Phospholipide (Ei- Phosphatidylcholin (PC) und Ei-Phosphatidylglycerin (PG) ) verändert .
Es wurde festgestellt, daß die Assoziationseffizienz bei einem molaren Verhältnis von 1:0 lediglich 20 % betrug, wahrend sie bei einem molaren Verhältnis von 1:4, 4:1 oder 9:1 auf mehr als 95 % anstieg.
Weiterhin wurde festgestellt, daß die Gegenwart von Salz im Hydratationsmedium wahrend der Inkapsulierung die Effizienz des Einbaus von IFN-γ in Liposomen verringert; z.B. verringerte sich bei einem Verhältnis von PC:PG=9:1 nach Zugabe von 0.9 % NaCl die Einbaurate von 90 % auf 35 %) . Deshalb wurde anstelle der physiologischen Kochsalzlosung eine 5 % Glukoselosung zugesetzt, um eine isotonische Losung (Isotonie ist für die Applikation notwendig) zu erhalten.
Für die subkutane (s.c.) Verabreichung werden große, nicht großendefinierte ("unsized") Liposomen (multilamellare Vesikel) verwendet, weil für eine optimale immunstimulierende Wirkung bei der prophylaktischen oder therapeutischen Anwendung der Impfung die Bildung eines s.c. Depots erforderlich ist und nur große Liposomen wahrend längerer Zeit an der Injektionsstelle bleiben. Ein zusätzlicher Einbau von Cholesterin
(PC: PG:Cholesterin=5 : 1 : 4) in den Lipid-Bilayers, der die Liposomen steifer macht, beeinflußte weder Einbaurate noch Freisetzungskinetik von IFN-γ.
Stabilitätsuntersuchungen von Liposomen
(PC: PG:Cholesterin=5: 1: ) bei 4°C zeigten keine veränderte Stabilität.
Die IFN-γ enthaltenden Liposomen zeigten sich bei 4°C mindestens einen Monat lang stabil. Nach 30 Tagen wurde eine IFN-γ-Aktivität von mehr als >80 %, bestimmt mittels HPLC, nachgewiesen. Die 20 % Abnahme der Aktivität ist offensichtlich auf einen Abbau von IFN-γ zurückzuführen; die Proteinbestimmung nach Lowry et al., 1951, ergab, daß keine nennenswerten Mengen an Protein aus den Liposomen freigesetzt wurden (die Lagerung von freiem IFN-γ bei 4°C zeigt ebenfalls einen Verlust der Aktivität von 20 %) .
Beispiel 2
Induktion einer systemischen Immunantwort gegen Melanomzellen durch Immunisierung mit Vakzinen, bestehend aus einer Mischung aus bestrahlten Tumorzellen und muIFN-γ-Liposomen
a) Herstellung von muIFN-γ-Liposomen:
Rekombinantes murines IFN-γ wurde in 10 mM
Succinatpuffer (10 mM Natriumsuccinat , pH=5, 5% Glukose) auf eine Konzentration von 100 μg/ml verdünnt. Die Liposomen wurden durch Hydrierung eines Lipidfilmes wie folgt hergestellt: Es wurden Ei-Phosphatidylchol (EPC, Lipoid GmbH, Ludwigshafen) und Ei- Phosphatidylglyzerm (EPG, Lipoid GmbH, Ludwigshafen) (m einem molaren Verhältnis von 9:1) m
5 Volumenanteilen Äthanol/Methanol (=Losungsmιttel) gelost. (100 μmol Lipid entspricht 75 mg, entsprechend wurden 0.9 x 40 x 0.75 mg/ml EPC und 0.1 x 40 x 0.75 mg/ml EPG verwendet.) Das organische Losungsmittel wurde unter Vakuum in einem Drehkolben evaporiert. Der somit erhaltene dünne Lipidfilm wurde mit der IFN-γ-Losung durch Schwenken des Kolbens mit Glasperlen abgelost. Bei dieser Methode bilden sich größtenteils multilamellare Liposomen (MVL) , in die das IFN-γ eingeschlossen ist bzw. an denen em Teil des
IFN-γ gegebenenfalls adsorbiert ist. Nicht-emgebautes bzw. nicht-adsorbiertes IFN-γ wurde durch Ultrazentrifugation bei 250 000 x g wahrend 60 mm in 10 mM Succmatpuffer, pH=5, 10% Saccharose abgetrennt. Die Liposomen enthielten ca. 86 μg IFN-γ/ml und
36 μmol/ml Phospholipide . Sie wurden bei 4°C gelagert.
b) Bestimmung der Freisetzungskinetik des muIFN-γ aus den Liposomen m vitro
Zur Bestimmung der Freisetzungskinetik von IFN-γ aus den Liposomen wurden IFN-γ-enthaltende Liposomen in PBS/10%FCS-Puffer (ca. 0.5 - 1 ml Liposomen pro ml Puffer) bei 37 °C, was eine m vivo Umgebung simuliert, über die m Fig.l angegeben Zeitspannen mkubiert. Nach Inkubation wurden die Proben mit Saccharoselosung versetzt und zentrifugiert , um die Liposomen und das freigesetzte Protein zu trennen. Die untere Phase wurde von den Liposomen getrennt und bis zur Bestimmung des IFN-γ Gehaltes bei -20°C eingefroren. Der Gehalt an IFN-γ wurde mit Hilfe eines ELISA (BIO Source) bestimmt.
Es wurde eine verzögerte Freisetzung des Zytokins aus den Liposomen gefunden. Ein Großteil des Zytokins wird innerhalb des 1. Tages freigesetzt. Die Freisetzung setzt sich jedoch über mehrere Tage fort und ist noch nach 8 Tagen detektierbar (Fig.l).
c) Maus-Melanomzellen
Die Maus-Melanomzellinie B16F10 (Fidler et al . , 1975) stammt vom NIH DCTDC Tumor Repository. Die Zellen wurden in T175 Kulturflaschen in DMEM, 10% FCS, 2 mM Glutamin gezüchtet .
d) Vorbereitung der Vakzinen
B16F10 Melanomzellen (1-2 x 107 Zellen pro T175 Kulturflasche) wurden mit γ-Strahlen einer Dosis von
50 Gy bestrahlt, um eine weitere Vermehrung der Zellen zu unterbinden. 2-6 h nach Bestrahlung wurden die Zellen mit einer Trypsin/EDTA-Losung trypsiniert, in 3 Waschschritten mit Kulturmedium, PBS und Ringer 's Losung gewaschen und auf eine Konzentration von 4 x 10^ Zellen pro ml (m Ringer' s Losung) eingestellt. Die Zellsuspension wurde zu gleichen Volumenteilen mit Liposomensuspensionen, enthaltend muIFN-γ in verschiedenen Konzentrationen (100 μg/ml, 20 μg/ml, 4 μg/ml, 0.8 μg/ml und 0 μg/ml) gemischt. Die fertigen Vakzinen enthielten somit eine Tumorzellkonzentration von 2 x 10" Zellen pro ml und Konzentrationen von liposomal verkapselten muIFN-γ von entsprechend: 50 μg/ml, 10 μg/ml, 2 μg/ml, 0.4 μg/ml und 0 μg/ml.
e) Immunisierung der Mäuse
1. Experiment:
Syngene C57B1/6 Mäuse (weiblich, Alter: 8 Wochen) wurden durch subkutane Injektion der Vakzinen in die rechte hintere Flanke immunisiert. Das Fell war dazu an beiden hinteren Flanken abrasiert worden. Das Injektionsvolumen war 100 μl pro Maus. Somit wurden pro Maus 2 x 10^ B16-Zellen und entsprechend 5 μg, 1 μg, 200 ng oder 40 ng liposomal verkapseltes muIFN-γ pro Immunisierung appliziert. Pro Dosisgruppe wurden 8 Mäuse immunisiert.
Parallel dazu wurden Gruppen von jeweils 8 Mäusen mit folgenden Kontrollvakzinen immunisiert :
- bestrahlte B16-Zellen
- bestrahlte B16-Zellen + Leer (=placebo) liposomen
- bestrahlte B16-Zellen + freies u IFN-γ 5μg/ml - mu IFN-γ-genmodifizierte, bestrahlte B16-Zellen (die Transfektion wurde mit dem Adenovirus-unterstützten Gentransfersystem auf Grundlage der rezeptorvermittelten Endozytose, wie in der WO 94/21808 und von Zatloukal et al., 1995, beschrieben, durchgeführt; die mu IFN-γ Freisetzung betrug 120 ng pro 24 h) .
Eine Woche nach der ersten Immunisierung erhielten die Mause eine Boosterimmunisierung mit denselben Vakzinen, wie sie für die erste Immunisierung verwendet worden war.
Nach einer weiteren Woche wurden die Tiere der hochtumorigenen Dosis von 1 x 10^ B16-Zellen ausgesetzt, die an einer Stelle appliziert wurde, die entfernt (contralateral) von der Immunisierungsstelle lag. Zusatzlich wurde eine Gruppe (8 Tiere) von nicht- lmmunisierten Mausen auf gleiche Weise den tumoπgenen Zellen ausgesetzt.
Acht Wochen nach der Tumorzellimplantation hatten alle (8/8) der nicht immunisierten Mause Tumore entwickelt. Demgegenüber waren 4 von 8 bzw. 3 von 8 Tieren der Gruppen, die mit bestrahlten Zellen und mu IFN-γ- Liposomen, enthaltend 200 ng bzw. 1 μg mu IFN-γ, immunisiert worden waren, geschützt. Em ähnlicher Schutzeffekt (3/8 tumorfreie Tiere) wurde für Tiere gefunden, die m t mu IFN-γ-genmodiflzierten Zellen immunisiert worden waren.
Em lediglich margmaler (nicht signifikanter) Effekt (1 von 8 geschützten Tieren) wurde für bestrahlte Zellen + Liposomen, enthaltend 40 ng mu IFN-γ-, bestrahlte Zellen + freies mu IFN-γ (5 μg) sowie für bestrahlte Zellen + Leerliposomen gefunden. Bestrahlte Zellen allem oder bestrahlte Zellen + Liposomen, enthaltend 5 μg mu IFN-γ, hatten keinen Schutzeffekt. Die Entwicklung der Tumore in den Tieren ist in Tabelle I. und Fig.2 zusammengefaßt.
2. Experiment:
Syngene C57B1/6 Mäuse (weiblich, Alter: 9 Wochen) wurden durch subkutane Injektion der Vakzinen in die rechte hintere Flanke immunisiert. Das Fell war dazu an beiden hinteren Flanken abrasiert worden. Das Injektionsvolumen war 100 μl pro Maus. Es wurden pro Maus 2 x 10^ B16-Zellen sowie liposomal verkapseltes mu IFN-γ in Dosen von 4 μg, 1 μg, 200 ng oder 40 ng pro Immunisierung appliziert. Pro Dosisgruppe wurden 8 Mäuse immunisiert .
Parallel dazu wurden Gruppen von jeweils 8 Mäusen mit folgenden Kontrollvakzinen immunisiert :
- bestrahlte B16-Zellen
- bestrahlte B16-Zellen + Leer (=placebo) liposomen
- bestrahlte B16-Zellen + freies muIFN-γ 4 μg/ml - bestrahlte B16-Zellen + freies muIFN-γ 1 μg/ml
- bestrahlte B16-Zellen + freies muIFN-γ 200 ng/ml
- muIFN-g-genmodifizierte, bestrahlte B16-Zellen (die muIFN-γ Freisetzung betrug 200 ng pro 24 h) .
Eine Woche nach der ersten Immunisierung erhielten die Mäuse eine Boosterimmunisierung mit denselben Vakzinen, wie sie für die erste Immunisierung verwendet worden war.
Nach einer weiteren Woche wurden die Tiere der hochtumorigenen Dosis von 1 x 10^ B16-Zellen ausgesetzt, die an einer Stelle appliziert wurde, die entfernt (contralateral) von der Immunisierungsstelle lag. Zusatzlich wurde eine Gruppe (8 Tiere) von nicht- immunisierten Mausen auf gleiche Weise den tumorigenen Zellen ausgesetzt.
Acht Wochen nach der Tumorzellimplantation hatten alle (8/8) der nicht immunisierten Mause Tumore entwickelt. Demgegenüber waren 4 von 8 bzw. 3 von 8 Tieren der Gruppen, die mit bestrahlten Zellen und muIFN-γ- Liposomen, enthaltend 1 μg bzw. 200 ng muIFN-γ, immunisiert worden waren, geschützt. Ein ahnlicher Schutzeffekt (4/8 tumorfreie Tiere) wurde für Tiere gefunden, die mit muIFN-γ-genmodifizierten Zellen immunisiert worden waren.
Ein geringer Schutzeffekt (1 von 8 Tieren geschützt) wurde für bestrahlte Zellen + Liposomen, enthaltend 40 ng muIFN-γ und für bestrahlte Zellen + freies muIFN-γ (1 μg) gefunden. Bestrahlte Zellen oder bestrahlte Zellen + muIFN-γ-Liposomen, enthaltend 4 μg muIFN-γ sowie Vakzine, bestehend aus bestrahlten Zellen + freies muIFN-γ (4 μg oder 200 ng) hatten keinen Schutzeffekt. Die Entwicklung der Tumore in den Tieren ist in Tabelle II. und Fig.3 zusammengefaßt.
Beispiel 3
Bestimmung der zytotoxischen Aktivität von T-Lymphozyten vakzinierter Tiere Syngene C57B1/6 Mause (weiblich, Alter: 9 Wochen) wurden durch subkutane Injektion der Vakzinen in die rechte hintere Flanke immunisiert. Das Fell war dazu an beiden hinteren Flanken abrasiert worden. Das Injektionsvolumen war 100 μl pro Maus. Es wurden pro Maus 2 x 10^
B16-Zellen sowie liposomal verkapseltes muIFN-γ in Dosen von 3.8 μg (=hohe Dosis) und 300 ng (optimale Dosis) pro Immunisierung appliziert. Parallel dazu wurde eine Gruppe nur mit bestrahlten B16-Zellen immunisiert und eine weitere Gruppe wurde nur mit Puffer injiziert
(Kontrollgruppe). Pro Gruppe wurden 4 Mause immunisiert.
Eine Woche nach der ersten Immunisierung erhielten die Mause eine Boosterimmunisierung mit denselben Vakzinen, wie sie für die erste Immunisierung verwendet worden war.
Nach 13 Tagen wurden die Tiere getötet und die Milzen entnommen. Die Splenozyten wurden isoliert, innerhalb einer jeden Gruppe gepoolt und 5 Tage in vi tro mit bestrahlten B16-Zellen restimuliert. Am 6. Tag wurde die zytotoxische Aktivität (CTL Aktivität) der Splenozyten (Effektorzellen) gegen B16-Zellen (Targetzellen) mit Hilfe eines Europium-Freisetzungs-Assays (Blomberg et al., 1993) gemessen. Die CTL-Aktivitat (ausgedruckt als % spezifische Lyse (Zatloukal et al., 1993)) wurde für verschiedene Effektor : Target-Verhaltnisse (100:1, 50:1, 25:1) bestimmt und ist in Fig.4 gezeigt. Splenozyten von Mausen, die mit bestrahlten B16-Zellen und muIFN-γ- Liposomen im optimalen Dosisbereich (300 ng muIFN-γ) immunisiert worden waren, zeigten eine deutliche zytotoxische Aktivität gegenüber B16-Zellen
(10 % spezifische Lyse) gegenüber einer ganz geringen background-Aktivitat bei Kontrolltieren bzw. Tieren, die nur mit bestrahlten B16-Zellen immunisiert worden waren. Die Erhöhung der muIFN-γ Dosis auf 3.8 μg (bereits hohe Dosis) führte zu einer Verringerung der CTL-Aktivitat im Vergleich zur optimalen Dosis.
Beispiel 4
Bestimmung der Freisetzungskinetik von muIFN-γ am Vakzinierungsort
Nachdem sich gezeigt hatte, daß muIFN-γ-Liposomen em effizientes Adjuvans m einer zellularen Tumorvakzine sind und freies muIFN-γ keinen Schutz gegen eine letale Tumorchallenge induzierte, wurde angenommen, daß die Emkapselung m Liposomen in einer verlängerten Anwesenheit des Zytokmes an der Wirkungsstelle resultiert. Es wurde daher die Freisetzung von muIFN-γ- Liposomen untersucht um zu zeigen, daß die Liposomen an der Injektionsstelle, der Stelle der Antigenprasentation, verbleiben. Es wurden muIFN-γ- Liposomen hergestellt, wie in Beispiel 2a beschrieben, mit dem Unterschied, daß die Endkonzentration von muIFN-γ 5 μg/ml betrug.
Um den Verbleib von muIFN-γ an der Injektionsstelle verfolgen zu können, wurde 125I-markιertes muIFN-γ verwendet (die spezifische Aktivität entsprach der des im folgenden Beispiel beschriebenen 125I-markιerten huIFN-γ, ebenso das Mischungsverhältnis zu nicht- markiertem muIFN-γ) . Um den Verbleib der Liposomen an der Injektionsstelle verfolgen zu können, wurde in einem alternativen Ansatz bei der Zubereitung des Lipidfilms zusatzlich zu PC und PG lα,2α (n)-[3H]- cholesterylether, spezifische Aktivität: 46 mCI (1.71 Tbq) /iτiMol (Amersham) verwendet (10 μl).
Analog wie im Beispiel 2e beschrieben, wurde den Mausen subkutan in die rechte hintere Flanke eine Einzeldosis von 100 μl Liposomen ( [125I] -muIFN-γLiposomen oder [3H] -Liposomen) oder freiem [125I] -muIFN-γ (5 μg/ml) injiziert. Im Unterschied zu Beispiel 2e wurden keine Zellen zugemischt. Nach verschiedenen Zeitpunkten (s. Fig. 5) wurden die Mause getötet. Die Injektionsstelle wurde in drei Teile geteilt. Jedes Stuck wurde in ein Glasscintillationsrohrchen gegeben und 3 ml Soluene-350 (Packard) zugefugt, um die Proben wahrend drei Tagen bei 40°C aufzulösen. 500 μl der gelosten Probe wurden in ein sauberes Glasrohrchen pipettiert und 250 μl H202 zugegeben, wobei die Rohrchen nach Aufhören des Schäumens geschlossen wurden. Die Proben wurden 24 h gebleicht, dann wurde die Zugabe von 250 μl H202 zweimal wiederholt, bis die Proben farblos waren. Schließlich wurde Hionic-Fluor (Packard) als Scintillationsflussigkeit beigegeben und die Proben wurden in einem Vortex gemischt. Die [125I]- Radioaktivität wurde nach 24 h in einem Packard multi- prias-2γ-Counter, die [3H] -Radioaktivität wurde in einem Philips PW 4700 Liquid Scmtillation Counter gemessen. Fig. 5 zeigt den Prozentsatz der an der Injektionsstelle verbleibenden Dosis (ID) , bezogen auf die insgesamt injizierte Dosis. Es zeigte sich, daß das liposomal verkapselte muIFN-γ länger am Injektionsort verbleibt als das freie.
Beispiel 5
Bestimmung der Freisetzungskinetik von huIFN-γ am Vakzinierungsort
a ) Herstellung " konventioneller" huIFN-γ-Liposomen
Die Liposomen (40 μMol/ml) wurden hergestellt nach der Filmmethode, im wesentlichen wie in Beispiel 1 bzw. Beispiel 2 beschrieben, wobei PC und PG in einem molaren Verhältnis von 9:1 gemischt wurden. Für die Herstellung von [125I] -huIFN-γ-Liposomen wurden 3.5 ml (50 μg/ml) huIFN-γ in 5 % Glukose (10 mM Na-Succinat- Puffer, pH 5.0) plus 79 μl [125I] -huIFN-γ (spezifische Aktivität: 13.8 μCi/ml; 10 kBq/Maus) zugegeben. Die Filme wurden durch handisches Schuttein der Kolben hydriert .
b ) Herstellung "alternativer" huIFN-γ-Liposomen
Da die "konventionelle" Liposomenformulierung in Vorversuchen die Freisetzung eines hohen Anteils von
[125I] -huIFN-γ wahrend der ersten Stunden gezeigt hatte, was vermutlich darauf zurück zu führen ist, daß dieser Anteil sich sofort von den Liposomen ablost und von der Impfstelle verschwindet, wurden "alternative" Liposomen hergestellt, die weniger Protein (< 10 %) an der äußeren Membran adsorbiert enthalten. Dazu wurden Lipidfilme, bestehend aus PC und PG in einem molaren Verhältnis von 9:1, mit einem sehr kleinen Volumen von huIFN-γ in 10 % Saccharose (10 mM Na-Succinat-Puffer, pH 5.0), z.B. 0.5 μl; 500 μg/ml, hydriert. Dabei entstand eine sehr viskose, gelartige Masse aus hochkonzentrierten Liposomen. Nach 30 min wurden diese auf die übliche injizierbare Konzentration verdünnt (40 mM Gesamtlipid; 5 μg/ml huIFN-γ) und in 0.9 % NaCl in 10 mM Na-Succinat pH 5, gewaschen. Indem das Salz die negativen Ladungen der Lipidmembran abschirmt, vermeidet oder verhindert es die elektrostatische Wechselwirkung mit dem positiv geladenen huIFN-γ. Das nicht-eingekapselte huIFN-γ wurde durch Ultrazentrifugation entfernt. Nach zwei Waschvorgängen wurden die Liposomen in 10 % Saccharosepuffer aufgenommen. Der Einbau von [125I] -huIFN-γ wurde vorgenommen, wie in a) beschrieben.
Um den Anteil von Liposom-gebundenem Protein zu bestimmen, der an der Außenseite der Liposomen adsorbiert ist, wurden die Liposomen in einer
Trypsinlösung inkubiert: zu 100 ml (100 mg/ml) der liposomalen Dispersion wurden 20 ml (1 mg/ml) Trypsin in phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7.4, gegeben (100 mg/ml Trypsin war ausreichend, um 250 mg/ml Protein abzubauen). Nach einer 1 h Inkubation bei 37 °C wurde die enzymatische Reaktion während der Extraktion der Proben abgebrochen; die Menge an verkapseltem huIFN-γ wurde mittels HPLC bestimmt; sie betrug >90 %. c) Herstellung von freies huIFN-γ enthaltender Lösung
Die "freie" [125I ] -huIFN-γ-Losung (10 kBq/Maus) wurde durch Hinzufugen von 52 μl [125I] -huIFN-γ-Stammlosung (120μ Ci/ml) zu 2.3 ml (50 μg/ml) huIFN-γ in 5 % Glukose (10 mM Na-Succinat-Puffer, pH 5.0) hergestellt.
d) in vivo Versuch
Den Mausen wurden, wie in den vorigen Beispielen beschrieben, die beiden Liposomenpraparationen bzw. die freies huIFN-γ enthaltende Losung injiziert und die verbleibende Injektionsdosis gemessen, wie in Beispiel 4 beschrieben. Das Ergebnis der Messungen ist in Fig. 6 dargestellt, wobei der Prozentsatz der an der Injektionsstelle verbleibenden Dosis (ID), bezogen auf die insgesamt injizierte Dosis, angegeben ist. Es zeigte sich, daß das liposomal verkapselte huIFN-γ langer am Injektionsort verbleibt als das freie, wobei die „alternativen" Liposomen noch gunstigere Eigenschaften hinsichtlich der verzögerten Freisetzung zeigten.
Tabelle I
Figure imgf000036_0001
B16 = mit einer Dosis von 50 Gy bestrahlte B16F10 Melanomzellen IFN/B16 = mit dem Gen für IFN-gamma transfizierte, mit 50 Gy bestrahlte B16F10 Melanomzellen Tabelle II
Figure imgf000037_0001
B16 = mit einer Dosis von 50 Gy bestrahlte B16F10 Melanomzellen
IFN/B16 = mit dem Gen für IFN-gamma transfizierte, mit 50 Gy bestrahlte B16F10
Melanomzellen Literatur
Adler, A. , et al., (1995), Cancer Biother 10(3): 211-224 Anchini, A. , Mortarini, R., Maccalli, C, Squarcina, P., Fleischbauer, K. , Mascheroni, L., and Parmiani, G. (1996), J. Immunol. 156: 208-217
Bakker, A.B.H., et al., (1994), J. Exp . Med. 179: 1005-1009 Barth, A. , Hoon, D., Foshag, L., Nizze, J. , Famatiga,
E., Okun, E. and Morton, D. (1994), Cancer Res. 54: 3342-3345
Belli, F., et al . , (1997), Cancer Immunol Immunother 44 (4) : 197-203 Berd, D., Maguire HC, McCue P. (1990), J. Clin. Oncol. 8: 1858-1863
Bergers, J.J., Den Otter, W., Dullens, H.F.J.,
Kerkvliet, C.T.M., and Crommelin, D.J.A. (1993), Pharmaceut. Research 10, 12: 1715-1721 Blomberg, K. und Ulfstedt, A.C., (1993), J. Immunol. Methods 160: 27-34
Blume et al, (1990), Biochim Biophys. Acta 1029: 91-7
Brichard, V., Van Pel, A. , Wolfel, T., Wolfel, C,
DePlaen, E., Lethe, B., Coolie, P., Boon, T. (1993), J. Exp. Med. 178: 489-495
Buschle, M., et al., (1997), Proc. Nat. Acad. Sei. USA 94 (7) : 3256-3261
Bystryn, J.C., et al., (1986), J Biol Response Mod 5 (3) : 211-224 Carrel, S. und Johnson, J.P., 1993, Current Opinion in Oncology 5, 383-389
Chonn, A. ; Semple, S. C . ; Cullis, P. R. , (1992), J Biol Chem 267: 18759-65 Clary, B.M., Coveney, E., Blazer, D.G., Philip, R. , and Lyerly, H.K. (1996), Surgery 120: 174-181
Clary, B.M., Coveney, Philip, R. , Blazer, D.G.,
Morse, M., Gilboa, E., and Lyerly, H.K. (1997), Cancer Gene Therapy 4: 97-104
Cleland, J.L. und Jones, A.J., ( 1996) , Pharm. Res. 13(10): 1464-1475
Cleland, J.L., ( 1997 ), Pharm. Biotechnol . 10:1-43
Coligan, J.E., et al., (1991), Current Prot . in Immunol., Kapitel 3, Wiley, New York
Coulie, P., Brichard, V., Van Pel, A. , Wolfel, T.,
Schneider, J. , Traversari, C, Mattei, S., De Plaen, E., Lurquin, C, Szikora, J-p . , Renauld, J-c, Boon, T. (1994), J. Exp. Med. 180: 35-42 Cox, A.L., et al., (1994), Science 264: 716-719
Dranoff, G., Jaffee, E., Lazenby, A. , Golumbek, P., Levitsky, H., Brose, K. , Jackson, V., Hamada, H. , Pardoll, D. and Mulligan, R.C. (1993), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 3539-43 Eppstein, D.A. (1982), J. Interferon Research 2, 1: 117-125
Epstein et al . , (1985), Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 82: 3688-3692
Fearon, E.R., Pardoll, D.M., Itaya, T., Golumbek, P., Levitsky, H., Simons, J.W., Karasuyama, H.,
Vogelstein, B. and Frost, P. (1990), Cell 60: 397-403
Ferrantini, M. , Giovarelli, M. , Modesti, A. , Musiani, P., Modica, A. , Venditti, M. , Peretti, E., Lollini, P.-L., Nanni, P., Forni, G., and Belardelli, F. (1994), J. Immunol. 153: 4604-4615
Fidler et al., (1975), Cancer Res. 35: 218-234
Fujiwara, T., Sakagami, K. , Matsuoka, J. , Shiozaki, S., Uchida, S., Fujioka, K. , Takada, Y., Onoda, T., and Orita, K. (1990), Cancer Research 50: 7003-7007 Gansbacher, B., Zier, K. , Daniels, B., Cronin, K. ,
Bannerji, R. , and Gilboa, E. (1990), J. Exp. Med. 172: 1217-1224
Gaughler , B., Van den Eynde, B., van der Bruggen, P., Romero, P., Gaforio, JJ. , De Plaen, E., Lethe, B., Brasseur, F., Boon, T. (1994), J. Exp. Med.179: 921-930
Golumbek, P.T., Azhari, R. , Jaffee, E.M., Levitsky, H.I., Lazenby, A. , Leong, K. , and Pardoll, D.M. (1993), Cancer Research 53(24): 5841-5844
Grohmann, U. et al., (1995), Eur . J. Immunol. 25, 2797-2802
Hayashi, Y., et al., (1993), Cancer 72(3): 750-759
Herrmann, J. und Stricker, H., (1995), Eur. J. Pharm. Biopharm. 41 (6) : 361-368
Hwang et al . , (1980), Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 77: 4030-4034
Jaffee, E.M., Thomas, M.C., Huang, A.Y.C., Hauda, K.M., Levitsky, H.I. and Pardoll, D.M. (1996), Journal of Immunotherapy 19 (3) : 176-183
Johnson, O.F., Cleland, J.L., Lee, H.J., Charnis, M. ,
Duenas, E., Jaworowicz, W., Shepard, D., Shahzamani, A., Jones, J.S., and Putney, SD. (1996),. Nature Medicine 2, 7: 795-799 Kedar, E., Rutkowski, Y., Braun, E., Emanuel, N. and Barenholz, Y. (1994), J. Immunother. 16: 47-59
Klibanov et al, (1990), FEBS Letters 268: 235
Koppenhagen, F.J., (1997), Liposomes as delivery system for rekombinant interleukin-2 in anticancer immunotherapy, Thesis Utrecht Universitiy.
Lamont, A.G., and Adorini, L. (1996). IL-12: a key cytokine in immune regulation. Immunol Today 5: 214-217
Lee, H.J., et al., (1997), J. Pharmacol . Exp. Ther. 281(3) : 1431-1439 Lehmann, J.M., et al., (1989), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 9891-9895
Longo, W.E. und Goldberg, E.P., (1985), Methods Enzymol. 112: 18-26 Lowry, O.H., et al., (1951), J. Biol. Chem. 193: 265-275
Marumo, K. , et al., (1997), Int. J. Urol . 4(1): 55-61
Maulding, H.V., (1987), J. of Controlled Release 6: 167-176
Mayhew et al, (1992), Int. J. Cancer 51: 1-8 Melief, C. JM. et al., (1996), Current Opinion in Immunology (8), 651 - 657
Mellors, J.W., et al., (1989), Infect . Immun. 57(1): 132-137
Mitchell, M.S., et al., (1993), Ann. NY Acad. Sei. 12; 690: 153-166
Mori, A. ; Klibanov, A. L.; Torchilin, V. P . ; Huang, L., (1991), FEBS Lett 284: 263-6
Morimoto, Y. und Fujimoto, S., (1985), Crit . Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 2(1): 19-36 Morton, D.L., et al., (1989), Semin Surg Oncol 5(6): 420-425
Morton, D., Foshag L., Hoon D., Nizze J. , Famatiga E.m Wanek L., Chang C, Davtyan D., Gupta R. and Elashoff R. (1992), Ann Surg 216: 463-482 Oratz, R. , et al . , (1989), J Biol Response Mod 8(4): 355-358
Papahadjopoulos et al, (1991), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 11460-4
Pardoll, D.M. (1995), Ann. Rev. Immunol. 13: 399-415. Perez, E.A., Scudder, S.A., Meyers, F.A. , Tanaka, M.S., Paradise, C. and Gandara, D.R. (1991), J. Immunother. 10: 57-62 Puccetti, P. et al., (1994), Eur. J. Immunol. 24, 1446-1452
Rosenberg, SA. (1988). Immunotherapy of patients with advanced cancer using interleukin-2 alone or in combination with lymphokine activated killer cells. In Important Advances in Oneology, ed. V de Vita, S Hellman, SA Rosenberg, pp. 217-257. Philadelphia : JB Lippincott .
Rosenberg, SA., Lotze, MT . , Yang, JC, Aebersold, PA., Lineham, WM., Seipp, CA., Withe, DE. (1989), Ann. Surg. 210: 474-485
Rosenberg, S.A. (1991), Cancer Res. 51: 5074-5079.
Rosenberg, S.A., Anderson, W.F., Blaese, M.R.,
Ettinghausen, S.E., Hwu, P. et al . (1992), Human Gene Therapy 3: 75-91
Rosenstein, M. , Ettighausen, S.E. and Rosenberg, S.A. (1986), J. Immunol. 137: 1735-1742
Saravolac, E.G., et al., (1996), Antiviral Res. 29(2-3): 199-207 Schmidt, W., Schweighoffer, T., Herbst, E., Maass, G. , Berger, M., Schilcher, F., Schaffner, G. and Birnstiel, M.L. (1995), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92: 4711-4714
Schmidt, W., et al., (1996), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93 (18) : 9759-9763
Schmidt, W., et al., (1997), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94 (7) : 3262-3267
Schweighoffer, T., Berger, M., Buschle, M., Schmidt, W., and Birnstiel, M.L. (1996), Cytokines Mol. Ther. 2: 185-192
Senior, J. ; Delgado, C; Fisher, D. ; Tilcock, C;
Gregoriadis, G., (1991), Biochim Biophys Acta 1062: 77-82
Tibbets, L.M., et al., (1993), Cancer, Jan. 15., Vol.71, 2, 315-321 Torchilin, V. P.; Klibanov, A. L.; Huang, L.; S, 0. D. ; Nossiff, N. D.; Khaw, B. A. , (1992), Faseb J 6: 2716-9
Torchilin, V. P., et al . , (1994), Biochim Biophys Acta 1195: 181-184
Torchilin, V. P., und Papisov, M. I., (1994), J Liposome Res 4 (1) : 725-739 van der Bruggen, PC, Traversari, C, Chomez, P.,
Lurquin, C, DePlaen, E., Van den Eynde, B., Knuth, A., Boon, T. (1991), Science 264, 1643-1650
Willmott, N., et al., (1989), J. Pharm. Pharmacol . 41 (7) : 433-438
Woodle, M. C; Newman, M. S.; Cohen, J. A.,(1994), J Drug Target 2: 397-403 Wolfel, T. et al., (1994) a) , Int. J. Cancer 57, 413-418
Wolfel, T. et al . , (1994) b) , Eur. J. Immunol. 24, 759-764
Yoshioka, (1991), Biomaterials 12: 861-4 Zatloukal, K. , Schmidt, W., Cotten, M., Wagner, E., Stingl, G. und Birnstiel, M.L. (1993), Gene 135: 199-207
Zatloukal, K. , Schneeberger , A. , Berger, M. , Schmidt,
W., Kosik, F., Kutil, R. , Cotten, M. , Wagner, E., Buschle, M., Maass, G., Payer, E., Stingl, G. and
Birnstiel, M.L. (1995), J. Immunol. 154, 3406-3419
Zier, K. and B. Gansbacher. (1995), Hum. Gene Ther. 6:1259-1265

Claims

Patentansprüche
1. Tumorvakzine auf der Grundlage von Tumorantigenen, dadurch gekennzeichnet, daß sie als wirksamen Bestandteil neben einer Tumorantigenquelle ein Abgabesystem mit verzögerter Wirkstoff-Freisetzung für IFN-γ enthalt, wobei die wirksame IFN-γ-Dosis 50 ng bis 5 μg und der Freisetzungszeitraum eine halbe Stunde bis 8 Tage betragt.
2. Tumorvakzine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die wirksame IFN-γ-Dosis 100 ng bis 2 μg betragt.
3. Tumorvakzine nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die wirksame IFN-γ-Dosis 100 ng bis 1 μg betragt.
4. Tumorvakzine nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Freisetzungszeitraum eme halbe Stunde bis 2 bis 3 Tage betragt.
5. Tumorvakzine nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß ca. 75% der IFN-γ-Dosis binnen eines Zeitraums zwischen einer Stunde und 3 Tagen freigesetzt werden.
6. Tumorvakzine nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Abgabesystem mit verzögerter Wirkstoff-Freisetzung aus Liposomen besteht .
7. Tumorvakzine nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Liposomen >90 % des IFN-γ eingeschlossen und <10 % außen adsorbiert enthalten.
8. Tumorvakzine nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Abgabesystem mit verzögerter Wirkstoff-Freisetzung aus Mikrospharen besteht .
9. Tumorvakzine nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Abgabesystem mit verzögerter Wirkstoff-Freisetzung aus Minipellets besteht .
10. Tumorvakzine nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Tumorantigenquelle aus Tumorzellen besteht.
11. Tumorvakzine nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Tumorzellen allogene Tumorzellen sind.
12. Tumorvakzine nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Tumorzellen mit von
Tumorantigenen abgeleiteten Peptiden beladen sind.
13. Tumorvakzine nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Tumorantigenquelle aus Antigen-prasentierenden Zellen besteht, die mit Tumorantigenpeptiden beladen sind.
14. Tumorvakzine nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Tumorantigenquelle aus Tumorantigenen als solchen oder davon abgeleiteten Peptide besteht.
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003528924A (ja) * 2000-03-31 2003-09-30 パーデュー・リサーチ・ファウンデイション リガンド免疫原複合体を用いる処置方法
WO2008031126A1 (en) * 2006-09-11 2008-03-20 Ralf Kircheis Multi-component tumour vaccine
CN100475264C (zh) * 2004-09-28 2009-04-08 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 含干扰素或其类似物的注射用缓释微球及其制备方法
CN100528224C (zh) * 2004-09-27 2009-08-19 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 含干扰素α-1b的注射用缓释微球及其制备方法
WO2011101465A1 (en) 2010-02-19 2011-08-25 Intercell Ag Ic31 nanoparticles
CN102631671A (zh) * 2012-04-05 2012-08-15 倪国颖 提高疫苗诱导的细胞毒性t细胞反应的治疗性疫苗

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT1699480E (pt) * 2003-12-30 2011-08-30 Mologen Ag AGENTE TERAPjUTICO ANTI-TUMORAL ALOGÉNICO
WO2008137705A1 (en) * 2007-05-04 2008-11-13 Boris Skurkovich Prevention of cancers by immunization

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4411425A1 (de) * 1994-04-05 1995-10-19 Falkenberg Frank W Prof Dr Verfahren zur Herstellung einer Tumorvakzine für die Aktive Spezifische Immuntherapie (ASI)
WO1995031107A1 (en) * 1994-05-13 1995-11-23 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Immunotherapeutic strategies for the treatment of cancer

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19607044A1 (de) * 1996-02-24 1997-08-28 Boehringer Ingelheim Int Tumorvakzine und Verfahren zu ihrer Herstellung

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4411425A1 (de) * 1994-04-05 1995-10-19 Falkenberg Frank W Prof Dr Verfahren zur Herstellung einer Tumorvakzine für die Aktive Spezifische Immuntherapie (ASI)
WO1995031107A1 (en) * 1994-05-13 1995-11-23 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Immunotherapeutic strategies for the treatment of cancer

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BERGERS JJ ET AL: "Vesicles for tumour-associated antigen preparation to induce protective immunity: preparation, characterization and enhancement of the immune response by immunomodulators", JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE, vol. 29, no. 3, 1994, pages 317 - 327, XP002095611 *
FUJIOKA K ET AL: "Long-acting delivery system of interferon: IFN minipellet", JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE, vol. 33, no. 2, February 1995 (1995-02-01), pages 317-323, XP004037635 *
GOLUMBEK PAUL T ET AL: "Controlled release, biodegradable cytokine depots: a new approach in cancer vaccine design", CANCER RESEARCH, vol. 53, 15 December 1993 (1993-12-15), pages 5841 - 5844, XP002095609 *
HERRMANN J ET AL: "INTERFERON-Y LIPOSOMES: DRUG BINDING PROPERTIES AND ANTIVIRAL IN VITRO ACTIVITY", EUROPEAN JOURNAL OF PHARMACEUTICS AND BIOPHARMACEUTICS, vol. 41, no. 6, 1 December 1995 (1995-12-01), pages 361 - 368, XP000543052 *
PORGADOR A ET AL: "Antimetastatic vaccination of tumor-bearing mice with two types of IFN-gamma gene-inserted tumor cells", JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 150, no. 4, 15 February 1993 (1993-02-15), pages 1458 - 70, XP002095608 *
VAN SLOOTEN, MAAIKE L. (1) ET AL: "Liposomal encapsulation of cytokines to achieve paracrine cytokine delivery in tumor vaccine development.", JOURNAL OF LIPOSOME RESEARCH, (FEB., 1998) VOL. 8, NO. 1, PP. 118, XP002095610 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003528924A (ja) * 2000-03-31 2003-09-30 パーデュー・リサーチ・ファウンデイション リガンド免疫原複合体を用いる処置方法
CN100528224C (zh) * 2004-09-27 2009-08-19 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 含干扰素α-1b的注射用缓释微球及其制备方法
CN100475264C (zh) * 2004-09-28 2009-04-08 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 含干扰素或其类似物的注射用缓释微球及其制备方法
WO2008031126A1 (en) * 2006-09-11 2008-03-20 Ralf Kircheis Multi-component tumour vaccine
WO2011101465A1 (en) 2010-02-19 2011-08-25 Intercell Ag Ic31 nanoparticles
US8765148B2 (en) 2010-02-19 2014-07-01 Valneva Austria Gmbh 1C31 nanoparticles
US9248180B2 (en) 2010-02-19 2016-02-02 Valneva Austria Gmbh IC31 nanoparticles
CN102631671A (zh) * 2012-04-05 2012-08-15 倪国颖 提高疫苗诱导的细胞毒性t细胞反应的治疗性疫苗
CN102631671B (zh) * 2012-04-05 2014-11-26 倪国颖 提高疫苗诱导的细胞毒性t细胞反应的治疗性疫苗

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