WO1999020301A1

WO1999020301A1 - Tumorvakzine

Info

Publication number: WO1999020301A1
Application number: PCT/EP1998/006546
Authority: WO
Inventors: Ernst Wagner; Ralf Kircheis; Daan J. A. Crommelin; Maaike Van Slooten; Gert Storm
Original assignee: Boehringer Ingelheim International Gmbh
Priority date: 1997-10-18
Filing date: 1998-10-15
Publication date: 1999-04-29
Also published as: CA2307639A1; DE19746173A1; JP2001520203A; EP1023082A1

Abstract

Eine Tumorvakzine auf der Grundlage von Tumorantigenen enthält als wirksamen Bestandteil neben einer Tumorantigenquelle ein Abgabesystem mit verzögerter Wirkstoff-Freisetzung für IFN- gamma , wobei die wirksame IFN- gamma -Dosis 50 ng bis 5 mu g beträgt, die während eines Zeitraums von mehreren Stunden bis zu mehreren Tagen freigesetzt wird. Das Abgabesystem für IFN- gamma besteht bevorzugt aus Liposomen, die Tumorantigenquelle bevorzugt aus allogenen Tumorzellen.

Description

Tumorvakzine

Die Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Immuntherapie von Tumorerkrankungen.

Die meisten malignen Tumore entgehen erfolgreich einer Kontrolle durch das Immunsystem, obwohl eine Vielzahl von ihnen tumorassoziierte Antigene exprimiert (van der Bruggen, 1991; Brichard, 1993; Gaughler, 1994; Coulie, 1994) . Es hat sich gezeigt, daß neben der Präsentation der geeigneten Antigene zusätzlich bestimmte Adjuvantien notwendig sind, um eine effektive Stimulierung des Immunsystems zu erzielen (Zier, 1995).

Anfängliche Studien zielten ab auf eine Stimulierung des Immunsystems durch Vakzinierung mit inaktivierten Tumorzellen in Kombination mit unspezifischen Immunstimulatoren, wie BCG oder anderen bakteriellen Adjuvantien und führten in einigen Fällen zu einer Verbesserung der Überlebensrate von Patienten mit malignen Tumoren (Berd, 1990; Barth, 1994; Morton, 1992). Die Wirkung dieser Adjuvantien ist allerdings nicht direkt, sondern verläuft über die Ausschüttung einer Kaskade von endogenen Zytokinen und Mediatoren und ist daher einerseits nicht spezifisch, andererseits kaum reproduzierbar. Dies erschwert eine Anwendung dieser unspezifischen Adjuvantien in einer pharmazeutischen Zusammensetzung. In moderneren Ansätzen werden direkt die immunstimulierenden Zytokine als Adjuvantien eingesetzt (Rosenberg, 1988, Rosenberg, 1989) . Unter den immunstimulierenden Zytokinen haben sich vor allem Interleukin-2 (IL-2), Interferon-α (IFN-α),

Interferon-γ, (IFN-γ) IL-12, und GM-CSF (Granulozyten- Makrophagen stimulierender Faktor) als erfolgversprechend gezeigt (Rosenberg, 1991; Dranoff, 1993; Zatloukal, 1993; Ferrantini, 1994; Lamont, 1996; Clary, 1996) .

Bei der Erprobung verschiedener Zytokine hat sich gezeigt, daß ihre Wirkung stark von Parametern wie 1) Ort und Art der Applikation; 2) Dosis und 3) Wirkdauer abhangig ist. So hatte z.B. eine systemische Applikation von rekombinantem IL-2 weniger die erwünschte Induktion einer antitumoralen Immunantwort als vielmehr schwere toxische Nebenwirkungen, sogar therapiebedingte Todesfalle, zur Folge (Rosenstein et al., 1986; Rosenberg et al-, 1989; Perez et al., 1991). Die schweren Nebenwirkungen resultieren aus einer Verwendung der Zytokine unter Nichtbeachtung ihrer physiologischen Wirkungsmechanismen. Zytokine sind pleiotrope Mediatoren, die natürlicherweise zur Kommunikation zwischen nahe beieinander gelegenen Zellen dienen, sie wirken über geringe Entfernungen. Freisetzung und Wirkort der Zytokine liegen also unter physiologischen Bedingungen lokal eng beieinander (Pardoll, 1995) . Um bei einer systemischen Applikation genügend hohe Konzentrationen des Zytokins am angestrebten Zielort zu erreichen, müssen hohe Dosen appliziert werden (Rosenberg et al., 1989), die zu ausgeprägten Wirkungen auch an unerwünschten Zielorten fuhren.

Die moderne Idee und das angestrebte Prinzip einer Tumorvakzine ist die Induktion einer systemischen, gegen den Tumor gerichteten Immunreaktion mit Hilfe eines gleichzeitigen, gezielten Angebotes von relevanten Tumorantigenen und lmmunst mulatoπschen Zytokinen, jedoch nicht über die hochdosierte systemische Gabe von Zytokinen, sondern vielmehr über längere Zeiträume wirkende, lokal hohe Zytokmdosen am Vakzinierungsort (paraknnes Konzept) (Pardoll, 1995; Jaffe et al., 1996) .

Eine lokale Anwendung der Zytokine ist jedoch technisch problematisch, vor allem wegen des schnellen Wegdiffundierens der Zytokine (innerhalb von Minuten) m die umgebenden Gewebe bzw. in den Blutkreislauf, gepaart mit einer oft extrem geringen Halbwertszeit ( Inaktivierung) m biologischen Flüssigkeiten (Eppstem, 1982; Kedar et al., 1994; Koppenhagen, 1997).

In den letzten Jahren konnte gezeigt werden, daß eine lokale, auf den Vakzinierungsort begrenzte, und über einen längeren Zeitraum wirkende Zytokmfreisetzung durch eine Injektion von Tumorzellen, die mit dem das Zytokm kodierenden Gen transfiziert und so zu Zytokm- Produzenten gemacht worden sind, erreicht werden kann

(Fearon et al . , 1990; Gansbacher et al., 1990; Rosenberg et al., 1992; Dranoff et al., 1993). In Tiermodellen wurde gezeigt, daß Vakzine auf der Basis von Zytokm- genmodiflzierten Tumorzellen eine systemische, spezifisch gegen den Tumor gerichtete Immunantwort induzieren können, die die Tiere vor einem hochtumoπgenen Tumorchallenge schützt (Zatloukal et al., 1993; Zatloukal et al., 1995; Schmidt et al., 1995; Schweighoffer et al., 1996). In einigen Fallen konnten sogar kleine, bereits vor der Vakzinierung etablierte Tumore beseitigt werden (Clary et al., 1996; Clary et al., 1997) . Obwohl mit dem Ansatz unter Verwendung von genmodifizierten Tumorzellen der physiologischen parakπnen Wirkungsweise der Zytokine Rechnung getragen wird, hat sich die Zytokmdosis als ein weiterer entscheidender Parameter herausgestellt. So wurde gezeigt, daß für die Stimulierung einer Immunantwort die Zytokine innerhalb eines therapeutisch wirksamen Dosisfensters appliziert werden müssen, zu niedrige, aber auch zu hohe Zytokmdosen waren nicht effektiv (Zatloukal et al., 1995; Schmidt et al., 1995). Andererseits ist es oftmals schwierig, mit Hilfe der Genmodifizierung von Tumorzellen, speziell von primären Tumorzellen, eine Genexpression genau innerhalb dieses effektiven Dosisfensters zu erreichen.

In der DE-Al 44 11 425 wird eine zellulare Tumorvakzine beschrieben, die Zytokine in Depotform enthalt. Konkret wird als Zytokm IL-2 vorgeschlagen, wobei Erfordernisse hinsichtlich der Dosis und der Freisetzungskinetik des Zytokms nicht berücksichtigt werden.

In der WO 94/21808 wird eine Tumorvakzine aus autologen, Zytokmgen-transflzierten Zellen beschrieben, von der u.a. gezeigt wird, daß die Schutzwirkung von Zytokinen (IL-2, IFN-γ und GM-CSF) dosisabhangig ist, wobei gezeigt wird, daß nicht unbedingt mit der höchsten Dosis die beste Schutzwirkung erreicht wird, ein optimal wirksames Dosisfenster wird jedoch nicht definiert.

Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, eine alternative, einfach herzustellende Tumorvakzine bereitzustellen, die es ermöglicht, das immunstimulierende Zytokin gezielt am Ort der Vakzinierung im therapeutisch wirksamen Dosisbereich über einen längeren Zeitraum freizusetzen.

Diese Aufgabe wurde erfmdungsgemaß gelost mit einer Tumorvakzine auf der Grundlage von Tumorantigenen, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie als wirksamen Bestandteil neben einer Tumorantigenquelle ein Abgabesystem mit verzögerter Wirkstoff-Freisetzung für IFN-γ enthalt, wobei die wirksame IFN-γ-Dosis 50 ng bis 5 μg und der Freisetzungszeitraum eine halbe Stunde bis 8 Tage betragt.

Bevorzugt betragt die IFN-γ-Dosis 100 ng bis 2 μg, insbesondere 100 ng bis 1 μg.

Als gunstig hat sich ein Freisetzungszeitraum ab einer halben Stunde bis zu 2 bis 3 Tagen erwiesen, es zeigten jedoch auch längere Freisetzungszeitraume von bis zu 8 Tagen eine gunstige Antitumorwirkung.

Bevorzugt werden mindestens ca. 75 % der wirksamen IFN-γ-Dosis in einem Freisetzungszeitraum von einer Stunde bis 3 Tage freigesetzt.

Die Freisetzung von IFN-γ sollte möglichst sofort, spätestens jedoch eine Stunde nach Applikation der Vakzine einsetzen. Wesentlich für die Wirksamkeit der Tumorvakzine ist in jedem Fall, daß IFN-γ und Tumorantigenquelle im wesentlichen gleichzeitig zur Verfugung stehen.

Das Abgabesystem mit verzögerter Wirkstoff-Freisetzung wird im folgenden als "Slow Release System" bezeichnet.

Grundsatzlich sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung samtliche Slow Release Systeme geeignet, die die geforderten Bedingungen hinsichtlich Dosierung und Freisetzung von IFN-γ erfüllen.

Bevorzugt liegt das Slow-Release-System in Form von Liposomen vor.

Liposomen sind synthetische Lipidvesikel, die aus einer oder mehreren konzentrischen Lipidschichten bestehen, die wasserige Abteilungen umschließen. In die wasserigen Abteilungen können wasserlösliche Substanzen eingeschlossen, in die Lipidschichten fettlosliche Substanzen eingebaut werden. Da diese Vesikel aufgrund ihrer Struktur, ihrer biologischen Abbaufahigkeit und ihrer geringen Toxizitat vielseitig verwendbar sind, wurden sie in den letzten Jahren zunehmend als Trager verschiedenster therapeutischer Wirkstoffe, u.a. für Tumortherapeutika, verwendet.

Liposomen werden in zwei Hauptkategorien eingeteilt. Zur ersten Kategorie zahlen die uni- oder multilamellaren "konventionellen" Liposomen. Diese Liposomen haben aufgrund ihrer raschen Aufnahme durch das retikuloendotheliale System eine relativ kurze Halbwertszeit . Um bei der Anwendung der Liposomen m vivo unspezifische Interaktionen mit Zellen des retikuloendothelialen Systems zu verringern und einen unerwünscht raschen Abbau zu verhindern, sind die Liposomen in einer Ausfuhrungsform der Erfindung modifiziert. Bevorzugt sind die Liposomen mit kovalent gekoppeltem Polyethylenglykol (PEG) modifiziert ( "PEGyliert" ; Moπ et al., 1991; Chonn et al., 1992; Woodle et al . , 1994). Die Menge des eingesetzten PEG betragt zwischen 2 und 10 % PEG-gekoppeltem Lipid im Liposom (m/m) , das

Molekulargewicht von PEG bevorzugt zwischen 750 und 5000 D (Klibanov et al., 1990.; Blume et al., 1990; Mayhew et al., 1992; Papahadjopoulos et al., 1991; Senior et al . , 1991; Moπ et al., 1991; Yoshioka, 1991). Die Liposomen können auch mit anderen Gruppierungen, wie amphiphilen Vmylpolymeren, modifiziert sein, um deren Halbwertszeit m vivo zu verlangern.

Der Stand der Technik stellt eine große Vielfalt von Liposomen und Herstellungsmethoden dafür zur Verfugung, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, stellvertretend sei verwiesen auf die US Patente 4,485,045 und 4,544,545; Epstein et al., 1985; Hwang et al., 1980; EP 0 036 676; EP 0 052 322; EP 0 088 046; EP 0 102 324; EP 0 142 641; EP 0 143 949; DE 3,218,121; Eppste , 1982; Bergers et al . , 1993; Kedar et al.,

1994; Herrmann und Stricker, 1995; Koppenhagen, 1997. Die Auswirkung der Inkorpierung von IFN-γ in Liposomen auf dessen biologische Wirkung wurde u.a. von Mellors et al., 1989, und Saravolac et al., 1996, beschrieben.

Als Alternative für Liposomen als Slow Release System kommen für den Einbau von IFN-γ biologisch abbaubare polymere Materialien in Form von Mikrospharen (Maulding, 1987; Golumbek et al., 1993; Johnson et al . , 1996; Lee et al., 1997; Cleland, 1997; Cleland und Jones, 1996) oder Minipellets (Fu iwara et al . , 1990; Marumo et al., 1997) m Betracht; diese können ebenfalls, zwecks Verlängerung der Halbwertszeit, modifiziert sein.

Als Tumorantigenquelle der erfmdungsgemaßen Vakzine können sämtliche Tumorantigene enthaltenden Zusammensetzungen dienen, die geeignet sind, im behandelten Individuum eine spezifische Immunantwort auszulosen.

In einer Ausfuhrungsform der Erfindung liegen die Tumorantigene m Form von Tumorzellen vor.

Bei den Tumorzellen der Vakzine kann es sich um autologe oder allogene Tumorzellen handeln.

In einer Ausfuhrungsform der Erfindung sind die Tumorzellen der Vakzine autolog. Dabei handelt es sich um Zellen, die dem zu behandelnden Patienten entnommen werden, ex vivo gegebenenfalls inaktiviert, mit dem IFN-γ freisetzenden Slow-Release-System vermischt und danach dem Patienten wieder verabreicht werden (Methoden zur Herstellung von autologen Tumorvakzmen sind dem Fachmann bekannt und u.a. in der WO 94/21808, auf deren Offenbarung Bezug genommen wird, beschrieben.)

In einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung sind die Tumorzellen allogen, d.h. sie stammen nicht von dem zu behandelnden Patienten (Barth et al . , 1994; Morton et al., 1992) . Der Verwendung von allogenen Zellen, die im allgemeinen Form von etablierten Tumorzellinien zur Verfügung stehen, wird vor allem dann der Vorzug gegeben, wenn arbeitsökonomische Überlegungen eine Rolle spielen; die Herstellung von individuellen Vakzinen für jeden einzelnen Patienten ist arbeits- und kostenaufwendig, außerdem treten bei einzelnen Patienten Schwierigkeiten bei der ex vivo Kultivierung der Tumorzellen auf, so daß Tumorzellen nicht in ausreichend großer Zahl erhalten werden, um eine Vakzine herstellen zu können. Bevorzugt wird als Tumorantigenquelle eine Mischung von Zellen aus mehreren allogenen

Tumorzellinien verwendet. Tumorvakzine aus allogenen Tumorzellen sind Stand der Technik, derartige Vakzinen wurden u.a. von Adler et al., 1995 und Hayashi et al., 1993; Oratz et al., 1989; Morton et al . , 1989; Bystryn et al., 1986, beschrieben.

Als Antigenquelle können auch Lysate von Tumorzellen, wie z.B. von Mitchell, et al., 1993, beschrieben, verwendet werden.

In einer Ausführungsform der Erfindung besteht die Tumorantigenquelle aus Tumorzellen, insbesondere allogenen Tumorzellen, die mit Peptiden beladen sind, die von Tumorantigenen abgeleitet sind. Eine Tumorvakzine, die erfindungsgemäß als Antigenquelle in Verbindung mit der IFN-γ-Slow Release-Formulierung verwendet werden kann, wurde von Buschle et al., 1997, beschrieben; als Alternative zu Tumorzellen können auch Antigen-präsentierende Zellen verwendet werden, z.B. dendritische Zellen, die mit den Tumorantigenpeptiden beladen sind, wie in der DE-Al 196 07 044 oder von Buschle et al., 1997, beschrieben. Die Identifizierung und Isolierung von Tumorantigenen und Tumor-assoznerten Antigenen (TAs) bzw. davon abgeleiteter Peptide (z.B. beschrieben von Wolfel et al., 1994 a) und 1994 b) ; Carrel et al., 1993; Lehmann et al., 1989; Tibbets et al., 1993; oder den veröffentlichten internationalen Anmeldungen WO 92/20356, WO 94/05304, WO 94/23031, WO 95/00159 beschrieben) , war die Voraussetzung dafür, Tumorantigene als solche als Immunogene zu verwenden, wie z.B. von Anchim et al., 1996, beschrieben.

In einer Ausfuhrungsform der Erfindung liegen die Tumorantigene in Form von Tumorantigenen als solchen vor, um eine zellulare Immunantwort auszulosen, wie sie zur Elimmierung von Tumorantigen tragenden Tumorzellen erforderlich ist (Bakker et al . , 1994; Cox et al.,

1994) . Die Tumorantigene können in Form von Proteinen oder in Form von Tu orantigen-abgeleiteten Peptiden vorliegen .

Ein Beispiel für eine zeilfreie Tumorvakzine auf der Grundlage von Tumorantigenen oder davon abgeleiteten Peptiden, die als Antigenquelle im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet ist, wurde von Schmidt et al., 1996, sowie in der WO 97/30721 beschrieben, auf diese Offenbarungen wird hiermit Bezug genommen. Eine Übersicht über Krebsvakzine auf der Grundlage von

Peptiden, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Antigenquelle geeignet sind, wird von Melief et al., 1996, gegeben.

Die Antigenquelle kann gegebenenfalls ebenfalls in Form einer Slow-Release-Formulierung vorliegen. Eine Tumorvakzine auf der Grundlage von Tumorantigenen, z.B. in Form von Tumorzellen, in Kombination mit einem "slow release" System, m das IFN-γ eingebaut ist, hat gegenüber Tumorvakzinen aus gen-modifizierten Tumorzellen, die IFN-γ exprimieren, den Vorteil einer exakten Steuerung der Zytokinfreisetzung am Vakzinierungsort und damit einer reproduzierbaren und genauen Dosierung des Zytokins. Ferner ist der Arbeitsund somit Kostenaufwand für die Herstellung wesentlich geringer.

Die Ergebnisse der im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Versuche zeigen, daß die Immunisierung von Mausen mit Vakzinen, bestehend aus bestrahlten Tumorzellen und muIFN-γ-Liposomen eine systemische Immunantwort induzieren kann, die die Tiere vor einer

Tumorentwicklung schützt. Dieser Schutzeffekt zeigt eine klare Abhängigkeit von der IFN-γ Dosis. Der für eine Immunisierung wirkungsvollste Dosisbereich wurde im Bereich von 100 ng bis 1 μg muIFN-γ gefunden.

Es konnte gezeigt werden, daß der Schutzeffekt außer von der IFN-γ-Dosis auch von der verzögerten Freisetzung des Zytokins abhangig ist.

Dabei war die verzögerte Freisetzung von Liposomen- verkapseltem muIFN-γ hinsichtlich der Anti- Tumorschutzwirkung ebenso effizient wie muIFN-γ, das von genmodifizierten Zellen exprimiert wurde. Freies muIFN-γ, zugemischt zu den bestrahlten Zellen, bewirkte einen weitaus geringeren bzw. überhaupt keinen Schutz. Sowohl Menge an eingebautem IFN-γ als auch dessen Freisetzung am Wirkungsort sind von Große, Form, Struktur und chemischer Zusammensetzung des jeweils gewählten Slow-release Systems abhangig.

Gegebenenfalls kann die erfmdungsgemaße Vakzine neben IFN-γ ein oder mehrere weitere Zytokine enthalten, z.B. Interleukm-2 (IL-2), IL-4, IL-12, IFN-α IFN-ß, IFN-ω

TNF-α. Das gegebenenfalls zusätzlich m der Vakzine enthaltene Zytokm kann in demselben oder in einem verschiedenen Slow-Release System vorliegen wie IFN-γ. Das Zytokm kann auch dadurch am Applikationsort verfugbar gemacht werden, daß als Tumorantigenquelle Tumorzellen (vorzugsweise allogene) verwendet werden, die mit dem entspechenden Zytokm-Gen transfiziert sind.

Derartige modifizierte Tumorzellen sowie Verfahren zu ihrer Herstellung wurden u.a. in der WO 95/09655, WO 95/31107, WO 93/10219, WO 93/07906 und WO 94/21808 sowie von Belli et al . , 1997 beschrieben.

Gegebenenfalls enthalt die Vakzine zusätzlich unspezifische immunstimulierende Adjuvantien, wie LPS

(L popolysaccharid) oder BCG (Bacillus Calmette Guerin) .

Die Formulierung der Vakzine kann zweckmäßig wie folgt vorgenommen werden:

Im allgemeinen wird zunächst das für eine effiziente Antitumorwirkung geeignete Verhältnis von Antigen: IFN-γ- Dosis ermittelt. Eine dazu geeignete Vorgehensweise besteht darin, daß ausgehend von einer im Hinblick auf die Ausbildung einer Antitumor-Antwort suboptimalen Menge an Antigen (im Falle einer optimalen Antigendosis von ca. 10^ Tumorzellen z.B. ca. 10^ Zellen) durch Titration diejenige Menge an IFN-γ ermittelt wird, bei der der Antitumoreffekt eine Steigerung erfahrt.

Danach wird die definitive Menge an Antigen optimiert.

Um eine wirksame Antigendosis zur Verfugung zu stellen, enthalt die Formulierung im Falle der Verwendung von Tumorzellen als Antigenquelle im allgemeinen ca. 10^ bis lO^, vorzugsweise 10^ bis 10^ Zellen; im Falle der Verwendung einer zeilfreien Antigenquelle wird die Menge an Tumorantigenen bzw. davon abgeleiteten Peptiden so bemessen, daß eine Immunantwort ausgelost wird, die der durch die oben genannte Tumorzellzahl ausgelosten Immunantwort etwa äquivalent ist.

Gegebenenfalls kann m einem weiteren Schritt überprüft werden, ob die Beifügung eines weiteren Zytokms oder eines weiteren unspezifischen Adjuvans eine Steigerung der Antitumorwirkung heroeifuhrt.

Um ein hinsichtlich der IFN-γ-Dosis und Freisetzungskinetik den Anforderungen entsprechendes Slow Release System auszuwählen, wird zweckmäßig wie folgt vorgegangen (im folgenden wird der Begriff "Liposomen" stellvertretend für alle Praparationen verwendet, die eine verzögerte Abgabe von Proteinen erlauben, z.B. Mikrospharen oder Minipellets):

Um die Beladungseffizienz der Liposomen mit IFN-γ zu testen, wird IFN-γ m verschiedene Liposomenpraparationen mkorpiert, freies IFN-γ abgetrennt und der IFN-γ-Gehalt der Liposomen bestimmt, z.B. mittels ELISA, HPLC oder mittels der Proteinbestimmungsmethode nach Lowry (Lowry et al., 1951) . Für die biologische Wirksamkeit der erfmdungsgemaßen Vakzine ist der absolute Beladungsgrad der Liposomen mit IFN-γ nicht kritisch, wesentlich ist die in einem bestimmten Zeitraum verfugbare Dosis. Es hat sich jedoch als vorteilhaft erwiesen, wenn die IFN-γ -Konzentration m der Liposomenpraparation mindestens etwa 10 μg/ml, vorzugsweise mehr als 20 μg/ml betragt. (Bei geringem absolutem Beladungsgrad der Liposomen kann die gewünschte immunmodulatorische Wirkung von IFN-γ in der Vakzine erzielt werden, indem der Anteil der Liposomenpraparation in der Vakzine erhöht wird) .

In einer bevorzugten Ausfuhrungsform befinden sich mindestens 90% des IFN-γ m den Liposomen eingeschlossen, d.h. daß höchstens 10% des Proteins an der Außenseite der Liposomen adsorbiert sind. Eine vorteilhafte Herstellungsmethode für derartige „alternative" Liposomen besteht darin, die unspezifische elektrostatische Wechselwirkung, die zur Adsorption von IFN-γ fuhrt, zu verringern bzw. zu verhindern, indem man einen Waschschritt mit einer salzhaltigen Losung (z.B. NaCl) vorsieht. Die Konzentration der Ionen muß ausreichend sein, um mit dem Protein um die Bindung an die Liposomen zu konkurrieren.

In einem nächsten Schritt wird die Freisetzungskinetik der Liposomen bestimmt.

Im Falle von Liposomen ist der Einbau bzw. die Freisetzungskinetik der Zytokine von der Ladung, dem hydrophilen/hydrophoben Charakter des Zytokins einerseits, und von den chemischen und physiko- chemischen Charakteristika der Liposomen andererseits abhangig. Wichtigste Charakteristika der Liposomen, die die Freisetzungskinetik bestimmen, sind deren Große, Anzahl der Lipidschichten (unι-/multιlamellar) , Ladung und Fluiditat der Lipidschichten. Diese wiederum werden bestimmt durch die chemische Zusammensetzung der Lipidschichten (Eppste , 1982; Koppenhagen, 1997).

Das Prinzip geeigneter Tests für die Bestimmung der Freisetzungskinetik beruht darauf, die IFN-γ-beladenen Liposomen m einem physiologischen Puffersystem, welches zwecks Simulation von in vivo Bedingungen Serum enthalt, zu mkubieren und in bestimmten Zeitabstanden im Überstand die IFN-γ-Konzentration zu bestimmen, z.B. mittels ELISA. In der Fachliteratur für die jeweiligen Slow Release Systeme sind jeweils spezifische Tests beschrieben, mit denen die Freisetzungskinetik des Therapeutikums bestimmt werden kann.

Vorzugsweise wird zusatzlich zu den in vi tro Tests die Freisetzungskinetik in vivo bestimmt. Analog zur letztlich für die therapeutische Anwendung vorgesehenen Applikationsform (Vakzinierungsort, Applikationsroute) wird Versuchstieren das entsprechende Injektionsvolumen, das aus Gründen der Nachweisbarkeit zweckmäßig einen höheren IFN-γ-Gehalt aufweist als die vorgesehene wirksame Dosis der Vakzine, verabreicht. Dann wird den Versuchstieren m definierten Zeitabstanden Blut abgenommen und der IFN-γ-Gehalt bestimmt, z.B. mit ELISA.

Alternativ kann die m m vivo Freisetzungskinetik bestimmt werden, indem eine Liposomenpraparation appliziert wird, in der die Liposomen und das darin enthaltene IFN-γ eine unterschiedliche radioaktive Markierung aufweisen. Nach der Injektion werden in definierten Zeitabstanden Proben aus der Vakzinierungsstelle entnommen und die

Restradioaktivitaten bestimmt. Die absoluten Werte geben Aufschluß über noch an der Impfstelle vorhandene Liposomen/IFN-γ; eine proportionale Abnahme der beiden Werte laßt darauf schließen, daß das IFN-γ noch in den Liposomen verkapselt ist.

Die in der erfindungsgemaßen Tumorvakzine enthaltene wirksame Kombination Tumorantigene/IFN-γ liegt derart vor, daß eine zytotoxische T-Zell-Anwort und/oder eine humorale Immunantwort ausgelost wird, die die Tumorzellen eliminiert bzw. im Fall der prophylaktischen Anwendung einen Schutz vor Tumorbildung gewahrleistet.

Dem Fachmann stehen geeignete Tests zur Verfugung, um das Ausmaß der Immunantwort festzustellen und auf Grundlage der Testergebnisse eine optimale Dosierung an Tumorantigen/IFN-γ zu ermitteln.

Die Auslosung einer zellularen Immunantwort kann durch den Nachweis antigenspezifischer CTLs bestätigt werden (Coligan et al., 1991) . Ein weiterer Nachweis für das Vorliegen einer zellularen Immunantwort ist dann gegeben, wenn m Abwesenheit von T-Zellen in einem

Versuchstier (welche dadurch erzielt wird, daß man das Tier mit Antikörpern benandelt, die CD4- oder CD8-Zellen depletieren) keine Immunantwort auftritt (Coligan et al., 1991) . Eine zellulare Immunantwort kann auch durch den Nachweis einer "delayed-type hypersensitivity" (DTH) -Reaktion in immunisierten Tieren gezeigt werden. Hierzu werden Peptide m die Fußsohle von Mausen injiziert und die Anschwellung der injizierten Stelle gemessen (Grohman et al., 1995; Puccetti et al., 1994). Zur Messung der DTH-Reaktion im Patienten werden diesem Antigene intradermal injiziert und die Rötung bzw. die Anschwellung der injizierten Stelle gemessen.

Die Induktion einer humoralen Immunantwort durch Antigene bzw. davon abgeleitete Peptide, die Fremdantigene für den Organismus sind bzw. Antigene, die vom zu behandelnden Organismus m geringer Konzentration exprimiert werden, kann durch Nachweis von spezifischen Antikörpern im Serum bestimmt werden. Eine geeignete

Methode zur Antikorpertiterbestimmung im Serum ist der Enzyme Lmked Immunoassay (ELISA) . Dabei werden die spezifischen Antikörper nach Bindung an das zur Immunisierung verwendeten Peptids mit einer Farbreaktion nachgewiesen. E ne alternative Methode ist der Western Blot . Hierbei binden spezifische Serumantikorper an das auf einer Membran immobilisierte Peptid. Gebundene Antikörper werden schließlich wiederum mit einer Farbreaktion nachgewiesen (Coligan et al., 1991).

Im nächsten Schritt wird die immunmodulatorische Wirkung der Vakzine im Tierversuch gemessen. Hierzu können u.a. etablierte Tumormodelle, bei denen bestrahlte Tumorzellen zumindest eine geringe Immunantwort induzieren, oder Tumormodelle, bei denen von Immunzellen erkannte Tumorantigen-Peptidsequenzen bekannt sind, eingesetzt werden. Die Vakzine wird in variierenden Verhaltnissen Tumorantigenquelle/IFN-γ-Slow Release System appliziert. Der Schutz vor Tumorwachstum ist ein Maß für die Wirksamkeit der Tumorvakzine.

Das Injektionsvolumen betragt im allgemeinen 50 μl bis 2 ml.

Die erfmdungsgemaße Vakzine liegt im allgemeinen als Suspension in einem pharmazeutisch annehmbaren Trager vor, vorzugsweise einem wasserigen Trager. Als wasserige Trager können z.B. Wasser, gepuffertes Wasser, Salzlosung (0.4 %) Glycinlosung (0.3 %), Hyaluronsaure und ähnliche bekannte Trager verwendet werden. Die Zusammensetzung kann außerdem pharmazeutisch annehmbare Hilfsstoffe enthalten, wie Puffersubstanzen sowie anorganische Salze, um einen normalen osmotischen Druck und/oder eine wirksame Lyophilisierung zu erreichen. Beispiele für derartige Zusätze sind Natrium- und Kaliumsalze, z.B. Chloride und Phosphate, Saccharose, Glukose, Protemhydrolisate, Dextran, Polyv ylpyrrolidon oder Polyethylenglycol . Die Zusammensetzungen können mittels herkömmlicher Techniken sterilisiert werden, z.B. mittels Steπlfiltration. Die Zusammensetzung kann in dieser Form unmittelbar abgefüllt oder auch lyophilisiert und vor dem Gebrauch mit einer sterilen Losung gemischt werden.

Gegebenenfalls liegt liegt die erfmdungsgemaße

Tumorvakzine in Form zweier getrennter Formulierungen vor (Tumorantigenquelle und IFN-γ-Slow-Release- Formulierung) , die vor αer Verabreichung vereinigt werden. Die erfindungsgemäße Tumorvakzine kann prophylaktisch oder therapeutisch verabreicht werden. Die Applikationsroute ist bevorzugt intradermal, subkutan oder intramuskulär.

Figurenübersicht

Fig. 1: Bestimmung der Freisetzungskinetik von muIFN-γ aus Liposomen in vi tro

Fig. 2: Immunisierung von Mäusen mit einer Vakzine aus Tumorzellen und muIFN-γ (1. Experiment)

Fig. 3: Immunisierung von Mäusen mit einer Vakzine aus Tumorzellen und muIFN-γ (2. Experiment)

Fig. 4: Bestimmung der zytotoxischen Aktivität von T-Lymphozyten nach Immunisierung mit einer

Vakzine aus Tumorzellen und muIFN-γ

Beispiel 1

Einbau von humanem IFN-γ in Liposomen

Optimierung der chemischen Zusammensetzung und Herstellungsmethode der Liposomen

Da die Assoziation von IFN-γ und Liposomen in erster Linie ladungsabhängig ist, wurden Vorversuche mit humanem IFN-γ durchgeführt, in denen die Ladung der Liposomen variiert wurde. Es wurde festgestellt, daß mit steigender negativer Ladung der Liposomen die Effizienz der Inkapsulierung bzw. Assoziation von IFN-γ zunimmt.

Für diese Versuche wurde das molare Verhältnis der negativen und neutralen Phospholipide (Ei- Phosphatidylcholin (PC) und Ei-Phosphatidylglycerin (PG) ) verändert .

Es wurde festgestellt, daß die Assoziationseffizienz bei einem molaren Verhältnis von 1:0 lediglich 20 % betrug, wahrend sie bei einem molaren Verhältnis von 1:4, 4:1 oder 9:1 auf mehr als 95 % anstieg.

Weiterhin wurde festgestellt, daß die Gegenwart von Salz im Hydratationsmedium wahrend der Inkapsulierung die Effizienz des Einbaus von IFN-γ in Liposomen verringert; z.B. verringerte sich bei einem Verhältnis von PC:PG=9:1 nach Zugabe von 0.9 % NaCl die Einbaurate von 90 % auf 35 %) . Deshalb wurde anstelle der physiologischen Kochsalzlosung eine 5 % Glukoselosung zugesetzt, um eine isotonische Losung (Isotonie ist für die Applikation notwendig) zu erhalten.

Für die subkutane (s.c.) Verabreichung werden große, nicht großendefinierte ("unsized") Liposomen (multilamellare Vesikel) verwendet, weil für eine optimale immunstimulierende Wirkung bei der prophylaktischen oder therapeutischen Anwendung der Impfung die Bildung eines s.c. Depots erforderlich ist und nur große Liposomen wahrend längerer Zeit an der Injektionsstelle bleiben. Ein zusätzlicher Einbau von Cholesterin

(PC: PG:Cholesterin=5 : 1 : 4) in den Lipid-Bilayers, der die Liposomen steifer macht, beeinflußte weder Einbaurate noch Freisetzungskinetik von IFN-γ.

Stabilitätsuntersuchungen von Liposomen

(PC: PG:Cholesterin=5: 1: ) bei 4°C zeigten keine veränderte Stabilität.

Die IFN-γ enthaltenden Liposomen zeigten sich bei 4°C mindestens einen Monat lang stabil. Nach 30 Tagen wurde eine IFN-γ-Aktivität von mehr als >80 %, bestimmt mittels HPLC, nachgewiesen. Die 20 % Abnahme der Aktivität ist offensichtlich auf einen Abbau von IFN-γ zurückzuführen; die Proteinbestimmung nach Lowry et al., 1951, ergab, daß keine nennenswerten Mengen an Protein aus den Liposomen freigesetzt wurden (die Lagerung von freiem IFN-γ bei 4°C zeigt ebenfalls einen Verlust der Aktivität von 20 %) .

Beispiel 2

Induktion einer systemischen Immunantwort gegen Melanomzellen durch Immunisierung mit Vakzinen, bestehend aus einer Mischung aus bestrahlten Tumorzellen und muIFN-γ-Liposomen

a) Herstellung von muIFN-γ-Liposomen:

Rekombinantes murines IFN-γ wurde in 10 mM

Succinatpuffer (10 mM Natriumsuccinat , pH=5, 5% Glukose) auf eine Konzentration von 100 μg/ml verdünnt. Die Liposomen wurden durch Hydrierung eines Lipidfilmes wie folgt hergestellt: Es wurden Ei-Phosphatidylchol (EPC, Lipoid GmbH, Ludwigshafen) und Ei- Phosphatidylglyzerm (EPG, Lipoid GmbH, Ludwigshafen) (m einem molaren Verhältnis von 9:1) m

5 Volumenanteilen Äthanol/Methanol (=Losungsmιttel) gelost. (100 μmol Lipid entspricht 75 mg, entsprechend wurden 0.9 x 40 x 0.75 mg/ml EPC und 0.1 x 40 x 0.75 mg/ml EPG verwendet.) Das organische Losungsmittel wurde unter Vakuum in einem Drehkolben evaporiert. Der somit erhaltene dünne Lipidfilm wurde mit der IFN-γ-Losung durch Schwenken des Kolbens mit Glasperlen abgelost. Bei dieser Methode bilden sich größtenteils multilamellare Liposomen (MVL) , in die das IFN-γ eingeschlossen ist bzw. an denen em Teil des

IFN-γ gegebenenfalls adsorbiert ist. Nicht-emgebautes bzw. nicht-adsorbiertes IFN-γ wurde durch Ultrazentrifugation bei 250 000 x g wahrend 60 mm in 10 mM Succmatpuffer, pH=5, 10% Saccharose abgetrennt. Die Liposomen enthielten ca. 86 μg IFN-γ/ml und

36 μmol/ml Phospholipide . Sie wurden bei 4°C gelagert.

b) Bestimmung der Freisetzungskinetik des muIFN-γ aus den Liposomen m vitro

Zur Bestimmung der Freisetzungskinetik von IFN-γ aus den Liposomen wurden IFN-γ-enthaltende Liposomen in PBS/10%FCS-Puffer (ca. 0.5 - 1 ml Liposomen pro ml Puffer) bei 37 °C, was eine m vivo Umgebung simuliert, über die m Fig.l angegeben Zeitspannen mkubiert. Nach Inkubation wurden die Proben mit Saccharoselosung versetzt und zentrifugiert , um die Liposomen und das freigesetzte Protein zu trennen. Die untere Phase wurde von den Liposomen getrennt und bis zur Bestimmung des IFN-γ Gehaltes bei -20°C eingefroren. Der Gehalt an IFN-γ wurde mit Hilfe eines ELISA (BIO Source) bestimmt.

Es wurde eine verzögerte Freisetzung des Zytokins aus den Liposomen gefunden. Ein Großteil des Zytokins wird innerhalb des 1. Tages freigesetzt. Die Freisetzung setzt sich jedoch über mehrere Tage fort und ist noch nach 8 Tagen detektierbar (Fig.l).

c) Maus-Melanomzellen

Die Maus-Melanomzellinie B16F10 (Fidler et al . , 1975) stammt vom NIH DCTDC Tumor Repository. Die Zellen wurden in T175 Kulturflaschen in DMEM, 10% FCS, 2 mM Glutamin gezüchtet .

d) Vorbereitung der Vakzinen

B16F10 Melanomzellen (1-2 x 10⁷ Zellen pro T175 Kulturflasche) wurden mit γ-Strahlen einer Dosis von

50 Gy bestrahlt, um eine weitere Vermehrung der Zellen zu unterbinden. 2-6 h nach Bestrahlung wurden die Zellen mit einer Trypsin/EDTA-Losung trypsiniert, in 3 Waschschritten mit Kulturmedium, PBS und Ringer 's Losung gewaschen und auf eine Konzentration von 4 x 10^ Zellen pro ml (m Ringer' s Losung) eingestellt. Die Zellsuspension wurde zu gleichen Volumenteilen mit Liposomensuspensionen, enthaltend muIFN-γ in verschiedenen Konzentrationen (100 μg/ml, 20 μg/ml, 4 μg/ml, 0.8 μg/ml und 0 μg/ml) gemischt. Die fertigen Vakzinen enthielten somit eine Tumorzellkonzentration von 2 x 10" Zellen pro ml und Konzentrationen von liposomal verkapselten muIFN-γ von entsprechend: 50 μg/ml, 10 μg/ml, 2 μg/ml, 0.4 μg/ml und 0 μg/ml.

e) Immunisierung der Mäuse

1. Experiment:

Syngene C57B1/6 Mäuse (weiblich, Alter: 8 Wochen) wurden durch subkutane Injektion der Vakzinen in die rechte hintere Flanke immunisiert. Das Fell war dazu an beiden hinteren Flanken abrasiert worden. Das Injektionsvolumen war 100 μl pro Maus. Somit wurden pro Maus 2 x 10^ B16-Zellen und entsprechend 5 μg, 1 μg, 200 ng oder 40 ng liposomal verkapseltes muIFN-γ pro Immunisierung appliziert. Pro Dosisgruppe wurden 8 Mäuse immunisiert.

Parallel dazu wurden Gruppen von jeweils 8 Mäusen mit folgenden Kontrollvakzinen immunisiert :

- bestrahlte B16-Zellen

- bestrahlte B16-Zellen + Leer (=placebo) liposomen

- bestrahlte B16-Zellen + freies u IFN-γ 5μg/ml - mu IFN-γ-genmodifizierte, bestrahlte B16-Zellen (die Transfektion wurde mit dem Adenovirus-unterstützten Gentransfersystem auf Grundlage der rezeptorvermittelten Endozytose, wie in der WO 94/21808 und von Zatloukal et al., 1995, beschrieben, durchgeführt; die mu IFN-γ Freisetzung betrug 120 ng pro 24 h) .

Eine Woche nach der ersten Immunisierung erhielten die Mause eine Boosterimmunisierung mit denselben Vakzinen, wie sie für die erste Immunisierung verwendet worden war.

Nach einer weiteren Woche wurden die Tiere der hochtumorigenen Dosis von 1 x 10^ B16-Zellen ausgesetzt, die an einer Stelle appliziert wurde, die entfernt (contralateral) von der Immunisierungsstelle lag. Zusatzlich wurde eine Gruppe (8 Tiere) von nicht- lmmunisierten Mausen auf gleiche Weise den tumoπgenen Zellen ausgesetzt.

Acht Wochen nach der Tumorzellimplantation hatten alle (8/8) der nicht immunisierten Mause Tumore entwickelt. Demgegenüber waren 4 von 8 bzw. 3 von 8 Tieren der Gruppen, die mit bestrahlten Zellen und mu IFN-γ- Liposomen, enthaltend 200 ng bzw. 1 μg mu IFN-γ, immunisiert worden waren, geschützt. Em ähnlicher Schutzeffekt (3/8 tumorfreie Tiere) wurde für Tiere gefunden, die m t mu IFN-γ-genmodiflzierten Zellen immunisiert worden waren.

Em lediglich margmaler (nicht signifikanter) Effekt (1 von 8 geschützten Tieren) wurde für bestrahlte Zellen + Liposomen, enthaltend 40 ng mu IFN-γ-, bestrahlte Zellen + freies mu IFN-γ (5 μg) sowie für bestrahlte Zellen + Leerliposomen gefunden. Bestrahlte Zellen allem oder bestrahlte Zellen + Liposomen, enthaltend 5 μg mu IFN-γ, hatten keinen Schutzeffekt. Die Entwicklung der Tumore in den Tieren ist in Tabelle I. und Fig.2 zusammengefaßt.

2. Experiment:

Syngene C57B1/6 Mäuse (weiblich, Alter: 9 Wochen) wurden durch subkutane Injektion der Vakzinen in die rechte hintere Flanke immunisiert. Das Fell war dazu an beiden hinteren Flanken abrasiert worden. Das Injektionsvolumen war 100 μl pro Maus. Es wurden pro Maus 2 x 10^ B16-Zellen sowie liposomal verkapseltes mu IFN-γ in Dosen von 4 μg, 1 μg, 200 ng oder 40 ng pro Immunisierung appliziert. Pro Dosisgruppe wurden 8 Mäuse immunisiert .

- bestrahlte B16-Zellen

- bestrahlte B16-Zellen + Leer (=placebo) liposomen

- bestrahlte B16-Zellen + freies muIFN-γ 4 μg/ml - bestrahlte B16-Zellen + freies muIFN-γ 1 μg/ml

- bestrahlte B16-Zellen + freies muIFN-γ 200 ng/ml

- muIFN-g-genmodifizierte, bestrahlte B16-Zellen (die muIFN-γ Freisetzung betrug 200 ng pro 24 h) .

Eine Woche nach der ersten Immunisierung erhielten die Mäuse eine Boosterimmunisierung mit denselben Vakzinen, wie sie für die erste Immunisierung verwendet worden war.

Nach einer weiteren Woche wurden die Tiere der hochtumorigenen Dosis von 1 x 10^ B16-Zellen ausgesetzt, die an einer Stelle appliziert wurde, die entfernt (contralateral) von der Immunisierungsstelle lag. Zusatzlich wurde eine Gruppe (8 Tiere) von nicht- immunisierten Mausen auf gleiche Weise den tumorigenen Zellen ausgesetzt.

Acht Wochen nach der Tumorzellimplantation hatten alle (8/8) der nicht immunisierten Mause Tumore entwickelt. Demgegenüber waren 4 von 8 bzw. 3 von 8 Tieren der Gruppen, die mit bestrahlten Zellen und muIFN-γ- Liposomen, enthaltend 1 μg bzw. 200 ng muIFN-γ, immunisiert worden waren, geschützt. Ein ahnlicher Schutzeffekt (4/8 tumorfreie Tiere) wurde für Tiere gefunden, die mit muIFN-γ-genmodifizierten Zellen immunisiert worden waren.

Ein geringer Schutzeffekt (1 von 8 Tieren geschützt) wurde für bestrahlte Zellen + Liposomen, enthaltend 40 ng muIFN-γ und für bestrahlte Zellen + freies muIFN-γ (1 μg) gefunden. Bestrahlte Zellen oder bestrahlte Zellen + muIFN-γ-Liposomen, enthaltend 4 μg muIFN-γ sowie Vakzine, bestehend aus bestrahlten Zellen + freies muIFN-γ (4 μg oder 200 ng) hatten keinen Schutzeffekt. Die Entwicklung der Tumore in den Tieren ist in Tabelle II. und Fig.3 zusammengefaßt.

Beispiel 3

Bestimmung der zytotoxischen Aktivität von T-Lymphozyten vakzinierter Tiere Syngene C57B1/6 Mause (weiblich, Alter: 9 Wochen) wurden durch subkutane Injektion der Vakzinen in die rechte hintere Flanke immunisiert. Das Fell war dazu an beiden hinteren Flanken abrasiert worden. Das Injektionsvolumen war 100 μl pro Maus. Es wurden pro Maus 2 x 10^

B16-Zellen sowie liposomal verkapseltes muIFN-γ in Dosen von 3.8 μg (=hohe Dosis) und 300 ng (optimale Dosis) pro Immunisierung appliziert. Parallel dazu wurde eine Gruppe nur mit bestrahlten B16-Zellen immunisiert und eine weitere Gruppe wurde nur mit Puffer injiziert

(Kontrollgruppe). Pro Gruppe wurden 4 Mause immunisiert.

Nach 13 Tagen wurden die Tiere getötet und die Milzen entnommen. Die Splenozyten wurden isoliert, innerhalb einer jeden Gruppe gepoolt und 5 Tage in vi tro mit bestrahlten B16-Zellen restimuliert. Am 6. Tag wurde die zytotoxische Aktivität (CTL Aktivität) der Splenozyten (Effektorzellen) gegen B16-Zellen (Targetzellen) mit Hilfe eines Europium-Freisetzungs-Assays (Blomberg et al., 1993) gemessen. Die CTL-Aktivitat (ausgedruckt als % spezifische Lyse (Zatloukal et al., 1993)) wurde für verschiedene Effektor : Target-Verhaltnisse (100:1, 50:1, 25:1) bestimmt und ist in Fig.4 gezeigt. Splenozyten von Mausen, die mit bestrahlten B16-Zellen und muIFN-γ- Liposomen im optimalen Dosisbereich (300 ng muIFN-γ) immunisiert worden waren, zeigten eine deutliche zytotoxische Aktivität gegenüber B16-Zellen

(10 % spezifische Lyse) gegenüber einer ganz geringen background-Aktivitat bei Kontrolltieren bzw. Tieren, die nur mit bestrahlten B16-Zellen immunisiert worden waren. Die Erhöhung der muIFN-γ Dosis auf 3.8 μg (bereits hohe Dosis) führte zu einer Verringerung der CTL-Aktivitat im Vergleich zur optimalen Dosis.

Beispiel 4

Bestimmung der Freisetzungskinetik von muIFN-γ am Vakzinierungsort

Nachdem sich gezeigt hatte, daß muIFN-γ-Liposomen em effizientes Adjuvans m einer zellularen Tumorvakzine sind und freies muIFN-γ keinen Schutz gegen eine letale Tumorchallenge induzierte, wurde angenommen, daß die Emkapselung m Liposomen in einer verlängerten Anwesenheit des Zytokmes an der Wirkungsstelle resultiert. Es wurde daher die Freisetzung von muIFN-γ- Liposomen untersucht um zu zeigen, daß die Liposomen an der Injektionsstelle, der Stelle der Antigenprasentation, verbleiben. Es wurden muIFN-γ- Liposomen hergestellt, wie in Beispiel 2a beschrieben, mit dem Unterschied, daß die Endkonzentration von muIFN-γ 5 μg/ml betrug.

Um den Verbleib von muIFN-γ an der Injektionsstelle verfolgen zu können, wurde ¹²⁵I-markιertes muIFN-γ verwendet (die spezifische Aktivität entsprach der des im folgenden Beispiel beschriebenen ¹²⁵I-markιerten huIFN-γ, ebenso das Mischungsverhältnis zu nicht- markiertem muIFN-γ) . Um den Verbleib der Liposomen an der Injektionsstelle verfolgen zu können, wurde in einem alternativen Ansatz bei der Zubereitung des Lipidfilms zusatzlich zu PC und PG lα,2α (n)-[³H]- cholesterylether, spezifische Aktivität: 46 mCI (1.71 Tbq) /iτiMol (Amersham) verwendet (10 μl).

Analog wie im Beispiel 2e beschrieben, wurde den Mausen subkutan in die rechte hintere Flanke eine Einzeldosis von 100 μl Liposomen ( [¹²⁵I] -muIFN-γLiposomen oder [³H] -Liposomen) oder freiem [¹²⁵I] -muIFN-γ (5 μg/ml) injiziert. Im Unterschied zu Beispiel 2e wurden keine Zellen zugemischt. Nach verschiedenen Zeitpunkten (s. Fig. 5) wurden die Mause getötet. Die Injektionsstelle wurde in drei Teile geteilt. Jedes Stuck wurde in ein Glasscintillationsrohrchen gegeben und 3 ml Soluene-350 (Packard) zugefugt, um die Proben wahrend drei Tagen bei 40°C aufzulösen. 500 μl der gelosten Probe wurden in ein sauberes Glasrohrchen pipettiert und 250 μl H₂0₂ zugegeben, wobei die Rohrchen nach Aufhören des Schäumens geschlossen wurden. Die Proben wurden 24 h gebleicht, dann wurde die Zugabe von 250 μl H₂0₂ zweimal wiederholt, bis die Proben farblos waren. Schließlich wurde Hionic-Fluor (Packard) als Scintillationsflussigkeit beigegeben und die Proben wurden in einem Vortex gemischt. Die [¹²⁵I]- Radioaktivität wurde nach 24 h in einem Packard multi- prias-2γ-Counter, die [³H] -Radioaktivität wurde in einem Philips PW 4700 Liquid Scmtillation Counter gemessen. Fig. 5 zeigt den Prozentsatz der an der Injektionsstelle verbleibenden Dosis (ID) , bezogen auf die insgesamt injizierte Dosis. Es zeigte sich, daß das liposomal verkapselte muIFN-γ länger am Injektionsort verbleibt als das freie.

Beispiel 5

Bestimmung der Freisetzungskinetik von huIFN-γ am Vakzinierungsort

a ) Herstellung " konventioneller" huIFN-γ-Liposomen

Die Liposomen (40 μMol/ml) wurden hergestellt nach der Filmmethode, im wesentlichen wie in Beispiel 1 bzw. Beispiel 2 beschrieben, wobei PC und PG in einem molaren Verhältnis von 9:1 gemischt wurden. Für die Herstellung von [¹²⁵I] -huIFN-γ-Liposomen wurden 3.5 ml (50 μg/ml) huIFN-γ in 5 % Glukose (10 mM Na-Succinat- Puffer, pH 5.0) plus 79 μl [¹²⁵I] -huIFN-γ (spezifische Aktivität: 13.8 μCi/ml; 10 kBq/Maus) zugegeben. Die Filme wurden durch handisches Schuttein der Kolben hydriert .

b ) Herstellung "alternativer" huIFN-γ-Liposomen

Da die "konventionelle" Liposomenformulierung in Vorversuchen die Freisetzung eines hohen Anteils von

[¹²⁵I] -huIFN-γ wahrend der ersten Stunden gezeigt hatte, was vermutlich darauf zurück zu führen ist, daß dieser Anteil sich sofort von den Liposomen ablost und von der Impfstelle verschwindet, wurden "alternative" Liposomen hergestellt, die weniger Protein (< 10 %) an der äußeren Membran adsorbiert enthalten. Dazu wurden Lipidfilme, bestehend aus PC und PG in einem molaren Verhältnis von 9:1, mit einem sehr kleinen Volumen von huIFN-γ in 10 % Saccharose (10 mM Na-Succinat-Puffer, pH 5.0), z.B. 0.5 μl; 500 μg/ml, hydriert. Dabei entstand eine sehr viskose, gelartige Masse aus hochkonzentrierten Liposomen. Nach 30 min wurden diese auf die übliche injizierbare Konzentration verdünnt (40 mM Gesamtlipid; 5 μg/ml huIFN-γ) und in 0.9 % NaCl in 10 mM Na-Succinat pH 5, gewaschen. Indem das Salz die negativen Ladungen der Lipidmembran abschirmt, vermeidet oder verhindert es die elektrostatische Wechselwirkung mit dem positiv geladenen huIFN-γ. Das nicht-eingekapselte huIFN-γ wurde durch Ultrazentrifugation entfernt. Nach zwei Waschvorgängen wurden die Liposomen in 10 % Saccharosepuffer aufgenommen. Der Einbau von [¹²⁵I] -huIFN-γ wurde vorgenommen, wie in a) beschrieben.

Um den Anteil von Liposom-gebundenem Protein zu bestimmen, der an der Außenseite der Liposomen adsorbiert ist, wurden die Liposomen in einer

Trypsinlösung inkubiert: zu 100 ml (100 mg/ml) der liposomalen Dispersion wurden 20 ml (1 mg/ml) Trypsin in phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7.4, gegeben (100 mg/ml Trypsin war ausreichend, um 250 mg/ml Protein abzubauen). Nach einer 1 h Inkubation bei 37 °C wurde die enzymatische Reaktion während der Extraktion der Proben abgebrochen; die Menge an verkapseltem huIFN-γ wurde mittels HPLC bestimmt; sie betrug >90 %. c) Herstellung von freies huIFN-γ enthaltender Lösung

Die "freie" [¹²⁵I ] -huIFN-γ-Losung (10 kBq/Maus) wurde durch Hinzufugen von 52 μl [¹²⁵I] -huIFN-γ-Stammlosung (120μ Ci/ml) zu 2.3 ml (50 μg/ml) huIFN-γ in 5 % Glukose (10 mM Na-Succinat-Puffer, pH 5.0) hergestellt.

d) in vivo Versuch

Den Mausen wurden, wie in den vorigen Beispielen beschrieben, die beiden Liposomenpraparationen bzw. die freies huIFN-γ enthaltende Losung injiziert und die verbleibende Injektionsdosis gemessen, wie in Beispiel 4 beschrieben. Das Ergebnis der Messungen ist in Fig. 6 dargestellt, wobei der Prozentsatz der an der Injektionsstelle verbleibenden Dosis (ID), bezogen auf die insgesamt injizierte Dosis, angegeben ist. Es zeigte sich, daß das liposomal verkapselte huIFN-γ langer am Injektionsort verbleibt als das freie, wobei die „alternativen" Liposomen noch gunstigere Eigenschaften hinsichtlich der verzögerten Freisetzung zeigten.

Tabelle I

B16 = mit einer Dosis von 50 Gy bestrahlte B16F10 Melanomzellen IFN/B16 = mit dem Gen für IFN-gamma transfizierte, mit 50 Gy bestrahlte B16F10 Melanomzellen Tabelle II

B16 = mit einer Dosis von 50 Gy bestrahlte B16F10 Melanomzellen

IFN/B16 = mit dem Gen für IFN-gamma transfizierte, mit 50 Gy bestrahlte B16F10

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Claims

Patentansprüche

1. Tumorvakzine auf der Grundlage von Tumorantigenen, dadurch gekennzeichnet, daß sie als wirksamen Bestandteil neben einer Tumorantigenquelle ein Abgabesystem mit verzögerter Wirkstoff-Freisetzung für IFN-γ enthalt, wobei die wirksame IFN-γ-Dosis 50 ng bis 5 μg und der Freisetzungszeitraum eine halbe Stunde bis 8 Tage betragt.

2. Tumorvakzine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die wirksame IFN-γ-Dosis 100 ng bis 2 μg betragt.

3. Tumorvakzine nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die wirksame IFN-γ-Dosis 100 ng bis 1 μg betragt.

4. Tumorvakzine nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Freisetzungszeitraum eme halbe Stunde bis 2 bis 3 Tage betragt.

5. Tumorvakzine nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß ca. 75% der IFN-γ-Dosis binnen eines Zeitraums zwischen einer Stunde und 3 Tagen freigesetzt werden.

6. Tumorvakzine nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Abgabesystem mit verzögerter Wirkstoff-Freisetzung aus Liposomen besteht .

7. Tumorvakzine nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Liposomen >90 % des IFN-γ eingeschlossen und <10 % außen adsorbiert enthalten.

8. Tumorvakzine nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Abgabesystem mit verzögerter Wirkstoff-Freisetzung aus Mikrospharen besteht .

9. Tumorvakzine nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Abgabesystem mit verzögerter Wirkstoff-Freisetzung aus Minipellets besteht .

10. Tumorvakzine nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Tumorantigenquelle aus Tumorzellen besteht.

11. Tumorvakzine nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Tumorzellen allogene Tumorzellen sind.

12. Tumorvakzine nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Tumorzellen mit von

Tumorantigenen abgeleiteten Peptiden beladen sind.

13. Tumorvakzine nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Tumorantigenquelle aus Antigen-prasentierenden Zellen besteht, die mit Tumorantigenpeptiden beladen sind.

14. Tumorvakzine nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Tumorantigenquelle aus Tumorantigenen als solchen oder davon abgeleiteten Peptide besteht.