DE4411425A1 - Verfahren zur Herstellung einer Tumorvakzine für die Aktive Spezifische Immuntherapie (ASI) - Google Patents
Verfahren zur Herstellung einer Tumorvakzine für die Aktive Spezifische Immuntherapie (ASI)Info
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Description
Die Behandlung von Tumorerkrankungen durch Vakzinierung von Patienten
mit ihren eigenen inaktivierten Tumorzellen ist in den letzten Jahrzehnten in
einer Reihe von Veröffentlichungen beschrieben und in vielen Studien erprobt
worden (1). Es hat sich dabei gezeigt, daß die Beimischung eines Adjuvants
notwendig ist, um das Immunsystem des Patienten gegen die autologen
Tumorzellen stimulieren zu können. In den ersten Versuchen dieser Art wurde
BCG (Bacille Calmette Guerin) verwendet (2). Später wurden den Patienten
Tumorzellen, vermischt mit inaktivierten BCG appliziert. Peters et al. (3)
konnten im Tierversuch belegen, daß diese Methode tatsächlich zur Induktion
einer Tumor-spezifischen Immunantwort führt.
Verschiedene Gruppen führten weltweit ähnliche Versuche bei anderen
Tumoren durch. In diesem Zusammenhang seien die Arbeiten von Tallberg et
al. (4) erwähnt. In diesen Arbeiten konnte gezeigt werden, daß die Applikation
von inaktivierten Tumorzellen zusammen mit einem bakteriellen Adjuvants
zur signifikanten Verbesserung der Überlebensrate von Patienten mit
metastasiertem Nierenzellkarzinom führte.
Cassel et al. (5) verwendeten für solche Behandlungsversuche von Patienten mit
malignen Melanomen Newcastle Disease Virus (NDV) als Adjuvants und
erreichten damit ebenfalls Verbesserungen der statistischen Überlebensrate der
Patienten. Schirrmacher et al. (6) griffen diesen Ansatz auf und zeigten im
Tierversuch, daß die Applikation von Tumorzellen, die mit dem human
apathogenen NDV infiziert worden und anschließen mit 200 Gy bestrahlt
worden waren, in den Tieren eine bleibende T-Zell-Immunität gegen Antigene
der Zellen des verwendeten Tumors (Esb) induzierten (7). Sie konnten ferner
zeigen, daß diese Immunität gegen den Tumor zellgebunden war und durch
Zellen adoptiv auf andere Tiere übertragen werden konnte (8). Dieser Ansatz ist
inzwischen von verschiedenen Gruppen in Deutschland übernommen worden,
und zur Zeit (1993/94) wird eine Reihe von Studien nach diesem Schema
durchgeführt.
In einer zunächst davon unabhängigen Entwicklung hat sich gezeigt, daß
Zytokine ebenfalls eine Wirkung auf das Tumorwachstum haben können. Hier
wurde vor allem das Interleukin-2 (IL-2) eingesetzt, da es gelang, dieses Zytokin
schon zu einem sehr frühen Zeitpunkt der Entwicklung gentechnisch zu
produzieren und der klinisch-wissenschaftlichen Forschung in therapeutisch
sinnvollen Mengen zur Verfügung zu stellen. Mit systemisch appliziertem rIL-2
sind dabei Effekte erreicht worden (9, 10), jedoch führt die systemische
Applikation von IL-2 auch zu schweren Nebenwirkungen, selbst zu
therapiebedingten Todesfällen. Außerdem ist dieses Verfahren mit
beträchtlichen Kosten verbunden, die leicht die Größenordnung von 30 000 bis
50 000 DM bei einem Patienten erreichen können.
Die schweren Nebenwirkungen sind verständlich, betrachtet man die hohen
Dosen, die bei dieser Applikationsform dem Patienten zugeführt werden
müssen, um überhaupt einen Effekt zu erreichen. Zytokine sind eigentlich
"short-range substances", die der Kommunikation zwischen nahe beieinander
liegenden Zellen dienen. Werden solche Substanzen systemisch angewendet,
dann kann die "Überschwemmung" des Organismus mit diesen normalerweise
nur lokal in geringsten Dosen freigesetzten Substanzen durchaus zu einer
gegenteiligen Reaktion, zu einer Blockierung des Immunsystems führen. Daher
ist die systemische Anwendung von Zytokinen, obwohl sie sich in vielen Fällen
als hilfreich erwiesen hat, grundsätzlich falsch und nicht physiologisch.
Die lokale Anwendung von Zytokinen ist ebenfalls problematisch, da die
Zytokinmoleküle wegen ihrer geringen Größe sehr schnell vom Ort der
Applikation weg ins Gewebe hineindiffundieren und sich diffus im Gewebe
verteilen. Wegen ihrer geringen Halbswertszeit im Serum sind sie auch nur sehr
kurze Zeit wirksam. Eigentlich gibt es nur eine einzige Form der Applikation, die
man mit Einschränkungen "lokal" nennen könnte, das ist die Applikation in
Form eines Sprays zur Therapie von Lungenmetastasen von
Nierenzellkarzinomen (11). Bei dieser Applikationsform geht man davon aus,
daß die Tumorläsionen vom Zytokin in relativ hoher Konzentration direkt
erreicht werden können.
Nachdem Zytokine, vor allem das IL-2, in gentechnisch produzierter Form in
größeren Mengen zur Verfügung standen, hat man sie auch, zusätzlich zu der
oben beschrieben aus inaktivierten Tumorzellen und einem Adjuvants
bestehenden Tumorvakzine, in der ASI eingesetzt. Dabei wurde rIL-2 sowohl
systemisch, zur Unterstützung des Immunsystems bei der ASI, als auch lokal,
zusammen mit der Tumorvakzine, verabreicht (12). Es muß allerdings davon
ausgegangen werden, daß beide Formen der Zytokinapplikation kaum
zufriedenstellende Ergebnisse liefern werden. Bei der systemischen Applikation
verteilt sich das Interleukin im ganzen Organismus und wird daher seinen
eigentlichen Wirkort, d. h. die Stelle, an der die Tumorvakzine appliziert worden
ist, nur in geringsten Konzentrationen erreichen, im übrigen aber das ganze
Immunsystem infolge der Überschwemmung mit diesem Zytokin lahmlegen.
Bei der lokalen Applikation muß davon ausgegangen werden, daß das
zusammen mit der Tumorzellen applizierte Zytokin sich innerhalb kürzester
Zeit so stark verdünnt, daß es kaum zur Wirkung am gewünschten Wirkort
kommt.
In den letzten Jahren haben mehrere auf diesem Sektor arbeitende Gruppen
versucht, die Wirkung der Zytokine auf die Induktion einer Immunität gegen
Antigene von Tumorzellen am Ort der Applikation dadurch zu erreichen, daß
sie die Tumorzellen selbst mit dem das Zytokin kodierenden Gen transfiziert
und so zu Zytokin-Produzenten gemacht haben (13). Diese Zytokingen-
transfizierten Zellen wurden bisher nur in Tierversuchen angewendet. Dabei
werden die Zellen in ihrer vitalen Form appliziert, da vitale Zellen notwendig
sind, um die den Zellen transfizierten Gene auch zur Expression bringen zu
können. Nach diesem Prinzip wurden inzwischen Tumorzellen der
verschiedensten Art mit den verschiedensten Zytokingenen transfiziert und
Versuchstieren, vor allem Mäusen, appliziert. Bei diesen Versuchen wurde -
erwartungsgemäß - beobachtet, daß die Tumorzellen zunächst angingen, d. h. sich
teilten und einen Tumor bildeten. Nach einigen Tagen nahm die Tumormasse
jedoch wieder ab, und schließlich verschwand der Tumor wieder vollständig.
Während dieser Zeit war in den so behandelten Tieren systemisch keine erhöhte
Zytokinaktivität nachweisbar. Danach waren die Tiere immun gegen eine
"Infektion" mit vitalen Tumorzellen desselben Genotyps, jedoch nicht
gegenüber anderen Tumoren.
In weiteren Versuchen zeigte es sich, daß auch gegen andere, nicht Zytokingen-
transfizierte, Tumorzellen Immunität induziert werden konnte, wenn diese
Tumorzellen gemischt mit den Zytokingen-transfizierten Tumorzellen
appliziert wurden (14). Offensichtlich kommt es darauf an, daß beide Reize, der
von den Tumorzellen ausgehende Antigenreiz und der von den Zytokinen
ausgehende und auf die Zellen des Immunsystems wirkende Stimulationsreiz,
von derselben Lokalisation innerhalb des Organismus kommt. Daher wurden
auch Versuche unternommen, eine Stimulation gegen Tumorzellen zu
erreichen, indem man den Tumorzellen, gegen die Immunität erzeugt werden
sollte, nicht Zytokingen-transfizierte Tumorzellen einer anderen Tumorart,
sondern Zellen einer Linie nicht transformierter somatischer Zellen, beimischte,
die mit einem Zytokingen transfiziert worden waren. Hierzu wurden vor allem
Fibroblasten verwendet, da sie sich leicht isolieren lassen und im Organismus
eine sehr kurze Halbwertszeit (einige Wochen) besitzen (15).
Die Übertragung eines dieser Therapieansätze mit transfizierten Tumorzellen
oder mit transfizierten somatischen Zellen auf den Menschen dürfte kaum zu
realisieren sein. Zum einen ist die Übertragung lebender Tumorzellen auf einen
Patienten mit unabschätzbar großen ethischen Risiken verbunden. In
Tierversuchen konnte inzwischen nachgewiesen werden, daß durchaus nicht
alle Tiere diese Manipulation überleben (16). Durch Verlust des übertragenen
Gens, wie er bei solchen Manipulationen immer auftreten kann, kann es zum
Wachstum der transplantierten Tumorzellen und zur Entstehung eines Tumors
kommen. Ein solches Risiko kann beim Menschen auf keinen Fall in Kauf
genommen werden. Man hat daher versucht, dieses Risiko dadurch zu
verringern, daß man die Tumorzellen letal bestrahlt und sich damit zufrieden
gibt, daß die in den so bestrahlten Zellen enthaltenen Zytokingene eben nur
einige wenige Tage lang zur Expression kommen und die Zellen daher nur
geringe Mengen des Zytokins während einer nur sehr kurzen Zeitspanne
sezernieren. Damit wird natürlich die Wirksamkeit der Methode stark
eingeschränkt.
Auch die Anwendung von Zytokingen-transfizierten somatischen Zellen, wie
z. B. autologen Fibroblasten, ist mit großen Risiken verbunden. So konnte im
Tierversuch gezeigt werden, das solche Zytokingen-transfizierten Fibroblasten
durchaus auch das Wachstum von Tumoren fördern können. Fibroblasten sind
nämlich an der Ausbildung der bindegewebigen Matrix des Tumors beteiligt, und
Zytokine spielen beim Aufbau dieser Matrix ebenfalls eine Rolle. Es konnte auch
gezeigt werden, daß die Zellen mancher Tumorarten Rezeptoren für Zytokine
tragen und folglich durch Zytokine zum Wachstum angeregt werden können.
Dies ist für Zellen der lymphoiden Linie schon lange bekannt; es konnte kürzlich
jedoch auch für Zellen von menschlichen Nierenzellkarzinomen (17) gezeigt
werden.
Zu all dem kommt die Problematik der Kultivierung und Transfektion der zu
verwendenden Tumorzellen. Die zu transfizierenden autologen Tumorzellen
bzw. die autologen Fibroblasten müssen ja vor Beginn der Therapie nicht nur
gewonnenen, sondern auch an in vitro-Kulturbedingungen adaptiert werden,
bevor sie transfiziert werden können. Nach der Transfektion müssen unter den
vielen erhaltenen Transfektanten die am besten geeigneten ausgewählt werden.
Alle diese Manipulationen sind mit einem beträchtlichen personellen und
Kosten-Aufwand verbunden und stehen der routinemäßigen Anwendung eines
solchen Tumortherapiekonzepts im Wege, insbesondere wenn man bedenkt, daß
es sich bei dieser Therapieform um die Therapie von Individuen mit einer für
jedes Individuum individuell herzustellenden Vakzine handelt.
Aus all diesen Gründen wird ein Therapiekonzept, das auf der Applikation von
Zytokingen-transfizierten lebenden autologen Tumorzellen oder Fibroblasten an
Patienten basiert, kaum oder nur unter größten Schwierigkeiten und Risiken zu
realisieren sein. Es ist daher notwendig, nach einem alternativen Konzept zu
suchen, bei dem dasselbe Ziel auf anderen weniger aufwendigen und für den
Patienten mit geringeren Risiken belasteten Wegen erreicht werden kann.
In den Originalarbeiten, in denen über die Ergebnisse der tierexperimentellen
Untersuchungen mit Zytokingen-transfizierten Tumorzellen berichtet wird (18)
sowie auch in den Übersichtsarbeiten, die sich kritisch mit den bei diesen
Versuchen erhaltenen Ergebnisse auseinandersetzen, wird immer wieder
hervorgehoben, daß das entscheidende Ergebnis dieser Versuche die Feststellung
ist, daß der Antigenreiz und der Zytokinreiz von exakt derselben Lokalisation,
nämlich der Tumorzelle oder von einer direkt der Tumorzelle benachbarten
Zelle kommen muß, um eine Immunität gegen Antigene des Tumors zu
erzeugen. Es muß also nach einem anderen Weg gesucht werden, um diese
beiden Reize in oder an der Tumorzelle selbst oder in ihrer unmittelbaren Nähe
zur Wirkung zu bringen.
Es ist die Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, das es
ermöglicht, die beiden Reize, den Antigenreiz und den Zytokinreiz, von sehr
nahe beieinander liegenden Lokalisationen ausgehen zu lassen. Zur Lösung
dieser Aufgabe wird vorgeschlagen, daß die Zytokine der Tumorvakzine in Form
eines Depots zugeführt werden, aus dem sie über einen längeren Zeitraum
freigesetzt werden.
Die Vorteile eines solchen Verfahrens sind vielfältig:
- - die Zytokine werden nicht nur einmal, sondern über einen langen Zeitraum freigesetzt und können dadurch über einen langen Zeitraum immunstimulierend wirken.
- - Bei Zytokingen-transfizierten Zellen ist die zelluläre Zytokin-Produktionsrate nur sehr gering (unter 1,0 ng/10⁶ Zellen). Daher kommt es erst dann zu einer signifikanten Zytokinproduktion, wenn bereits eine beträchtliche Tumormasse entstanden ist. Im Gegensatz dazu ist bei der Applikation einer Tumorvakzine, die das Zytokin in Depotform enthält, von ersten Moment der Applikation eine relativ höhere Zytogendosis vorhanden.
- - Im Vergleich zu der systemischen Applikation von Zytokinen hat die vorgeschlagene lokale Applikation in Depotform den Vorteil, daß keine Nebenwirkungen zu erwarten sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann beispielsweise folgendermaßen
ausgeführt werden:
Die Herstellung von Zytokin-haltigen Liposomen ist in der Literatur (19, 20)
sowie auch in Patenten ausführlich beschrieben. Bei den diesem Patentantrag
zugrundeliegenden Versuchen wurde rIL-2 nach diesen Verfahren encapsuliert.
Für die Herstellung der Liposomen wurde ein Verhältnis von PC : Cholesterol :
PE von 28 : 42 : 1 angewendet. Dabei wurden Liposomen erhalten, die
typischerweise 12 µg rIL-2/ml enthielten. Es ist jedoch auch möglich, andere
Phospholipid- Zusammensetzungen für die Herstellung der Zytokin-
enthaltenden Liposomen verwendet.
Bei der Anwendung wurden den Versuchstieren (Mäusen das Stammes
C57BL/6) 10⁵ bestrahle (200 Gy) Tumorzellen zusammen mit 3 µg rIL-2 in
Liposomen-eingeschlossener Form appliziert. Mit der so hergestellten Vakzine
wurde eine wesentliche Verbesserung der Überlebensraten der behandelten
Mäuse nach Challenge mit vitalen Tumorzellen erreicht.
Hierzu wurden die rIL-2-haltigen Liposomen auf dieselbe Weise wie unter Beispiel 1
hergestellt. Anschließend wurden sie nach der Methode von Partis (21) mit MHS
(Maleimido-Hexanoyl-N-Hydroxy-Succinimid) behandelt. Es wurde ein 5-fach
molarer Überschuß von MHS bezogen auf das liposomale PE eingesetzt.
Parallel dazu wurden die Tumorzellen zur Einführung von SH-Gruppen nach
der Methode von Ishikawa (22) mit SAMB (S-Acethyl-Mercapto-
Bernsteinsäreanhydrid) behandelt. Die Zellen waren nach der Behandlung noch
vital und konnten erneut in vitro kultiviert werden.
Die Bindung der Liposomen an die aktivierten Tumorzellen erfolgte durch
Zusammenmischen der MHS-aktivierten rIL-2-Liposomen-Suspension mit der
SAMB-aktivierten Tumorzellsuspension. Die Bindung erfolgt durch Ausbildung
von Thioätherbrücken zwischen den Liposomen und den Tumorzellen. Die
Bindung der Liposomen an die Tumorzellen konnte fluoreszenzmikroskopisch
mit Hilfe von Liposomen nachgewiesen werden, die FITC-markiertes rIL-2
enthielten. Auch in der rasterelektronenmikroskopischen Untersuchung ließen
sich Tumorzell-gebundene Liposomen nachweisen.
Zur Bestimmung des IL-2-Gehalts der Liposomen-Tumorzell-Konjugate wurden
sie in Triton-X100 lysiert und der IL-2-Gehalt anschließend in einem ELISA
bestimmt. Es wurden Werte von 30 µg rIL-2 pro 10⁶ Zellen nachgewiesen.
Bei der Anwendung wurden den Versuchstieren (Mäusen das Stammes
C57BL/6) 10⁵ bestrahle (200 Gy) Tumorzellen in Form von rIL-2-Liposomen-
Tumorzell-Konjugaten mit 3 µg rIL-2 in liposomen-eingeschlossener Form
appliziert. Mit der so hergestellten Vakzine wurde eine wesentliche
Verbesserung der Überlebensraten der behandelten Mäuse nach Challenge mit
vitalen Tumorzellen erreicht.
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Claims (23)
1. Verfahren zur Herstellung einer Tumorvakzine für die Aktive Spezifische
Immuntherapie (ASI), bestehend aus intakten inaktivierten Tumorzellen und
Zytokinen,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Zytokine der Tumorvakzine in Depotform beigegeben werden.
2. Verfahren nach 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Zytokine kovalent an die Tumorzellen gebunden werden.
3. Verfahren nach 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Zytokine kovalent an ein Protein mit Affinität für Strukturen der
Tumorzellen gebunden werden.
4. Verfahren nach 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Zytokine in Form von Fusionsproteinen, bestehend aus einem Zytokin
und einem Protein mit Affinität für Strukturen der Tumorzellen, an die
Tumorzellen gebunden werden.
5. Verfahren nach 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Zytokine in Liposomen eingeschlossen werden.
6. Verfahren nach 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Zytokine polymerisiert werden.
7. Verfahren nach 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Zytokine an biologisch abbaubare (biodegradable) Polymere gebunden
werden.
8. Verfahren nach 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Zytokine adsorptiv an anorganische Partikel gebunden werden.
9. Verfahren nach 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Zytokine an Viruspartikel gebunden werden.
10. Verfahren nach 5, dadurch gekennzeichnet,
daß die Liposomen den Tumorzellen beigemischt werden.
11. Verfahren nach 5, dadurch gekennzeichnet,
daß die Liposomen kovalent an die Tumorzellen gebunden werden.
12. Verfahren nach 6, dadurch gekennzeichnet,
daß die polymerisierten Zytokine den Tumorzellen beigemischt werden.
13. Verfahren nach 6, dadurch gekennzeichnet,
daß die polymerisierten Zytokine kovalent an die Tumorzellen gebunden
werden.
14. Verfahren nach 7, dadurch gekennzeichnet,
daß die Zytokin-enthaltenden biologisch abbaubare Polymeren den Tumorzellen
beigemischt werden.
15. Verfahren nach 7, dadurch gekennzeichnet,
daß die Zytokin-enthaltenden biologisch abbaubare Polymeren kovalent an die
Tumorzellen gebunden werden.
16. Verfahren nach 8, dadurch gekennzeichnet,
daß die an anorganische Partikel adsorbierten Zytokine den Tumorzellen
beigemischt werden.
17. Verfahren nach 9, dadurch gekennzeichnet,
daß die Zytokin-enthaltenden Viruspartikel den Tumorzellen beigemischt
werden.
18. Verfahren nach 9, dadurch gekennzeichnet,
daß die Zytokin-enthaltenden Viruspartikel kovalent an die Tumorzellen
gebunden werden.
19. Verfahren nach 1, dadurch gekennzeichnet, daß IL-2 als Zytokin Verwendung
findet.
20. Verfahren nach 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet,
daß Antikörper als Proteine mit Affinität zu Tumorzellen verwendet werden.
21. Verfahren nach 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet,
daß Lektine als Proteine mit Affinität zu Tumorzellen verwendet werden.
22. Verfahren nach 7, dadurch gekennzeichnet,
daß Polymere aus Milchsäure (Poly-Lacide) verwendet werden.
23. Verfahren nach 8, dadurch gekennzeichnet,
daß Aluminiumhydroxyd oder Calciumphosphat als adsorbierende Partikel
verwendet werden.
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