CN114222563A - 可植入胶囊 - Google Patents

Abstract

可植入胶囊，其包括细胞接收部分(2)，该细胞接收部分包括围绕用于接收分泌治疗剂的处于液体介质中的永生化细胞的细胞接收室(13)的多孔膜(5)。该胶囊还包括插入细胞接收室(13)内的细胞支持基质(7)，该细胞支持基质被配置为用于在细胞接收室内排列永生化细胞。

Description

可植入胶囊

发明领域

本发明涉及一种可植入胶囊，其用于封装细胞以释放治疗用蛋白或佐剂。本发明尤其可用于封装永生化细胞系以释放治疗用蛋白或佐剂的领域。

发明背景

细胞封装技术能够在多个域中长期和/或局部施用大分子。该技术基于将一个或几个含有基因修饰细胞的生物相容性胶囊植入受试者体内，以产生目标治疗蛋白。这种类型的胶囊通常由半透膜组成，其提供了对修饰细胞的机械保护，从而避免所述细胞与宿主免疫细胞之间发生接触，并使得被封装细胞的生存期延长。另外，该半透膜允许养分和氧气流入移植细胞中，并使目标蛋白流出到宿主，从而能够持续进行生产。

使用可回收的封装细胞植入物的离体基因疗法已被开发，作为用于局部和/或长期递送治疗用蛋白的有效策略。特别地，调节患者免疫系统的活性已被认为是用于治疗各种疾病的创新方法，并且特别地，已经开发出使用基因工程封装细胞的治疗方案，例如长期施用单克隆抗体用于抗神经退行性疾病的被动免疫，和局部递送细胞因子作为抗癌疫苗的佐剂(Lathuilière等人.,2015,Int.J.Mol.Sci.,16,10578-10600和Schwenter等人,2011,《癌症基因治疗》(Cancer Gene Therapy.),18,553-562)。

最近已开发了一种使用分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的封装细胞进行抗癌主动免疫的技术，其能够使基因修饰的异源细胞(MVX-1细胞)标准化释放具有免疫保护和增强活性，可用于肿瘤消退的GM-CSF。患者免疫接种在远离肿瘤沉积的健康皮肤中进行，通过将辐照的自体肿瘤细胞和2粒含有MVX-1细胞的胶囊结合，产生＞20ng/24h的huGM-CSF。这使得GM-CSF产生，并使得免疫系统暴露于注射部位自体肿瘤细胞表达的肿瘤相关抗原(TAA)。GM-CSF的局部表达招募并激活抗原呈递细胞(APC)，其诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和注射部位的细胞毒性T淋巴细胞反应(WO 2017/064571)。使用这些胶囊的临床试验结果发表在《肿瘤学年鉴》(Annals of Oncology),2015,26(增刊第8期):1-4.10.1093/Annonc/mdv513。

为了优化封装技术的人体应用，关键点是生成可植入的、安全且有效的人类细胞系作为体内分泌目的重组蛋白的平台。因此，需要开发在安全性和持久效果方面特别适合封装技术的高效细胞系。此外，对于某些应用，需要将细胞冷冻以进行保存和运输，并且，开发能确保细胞在储存和运输过程中(尤其是在冷冻细胞解冻后)高水平存活的胶囊，对促进使用封装细胞的治疗策略具有很大意义。

根据应用和治疗方案，植入的胶囊可能会在患者体内停留很长时间，从几天到几个月不等。为了患者的舒适感，特别是为了便于将植入和移除胶囊的不适感最小化，希望能够有特别紧密和小直径的植入物。但是，胶囊的内部体积和与周围组织接触的膜的表面积会影响细胞存活，从而影响从胶囊中释放的治疗用蛋白或佐剂的量。

因此，为了获得特别紧密的可植入胶囊，需要有一个能够有效封装细胞，并对所需治疗剂具有高产量和释放率的系统。

发明内容

鉴于前述情况，本发明的一个目的是提供一种用于封装细胞以释放治疗剂的可植入胶囊，其结构紧密，易于植入和移除，且能够保证目的治疗剂的高产量和释放率。

提供适合封装贴壁及非贴壁细胞的可植入胶囊是有利的。

提供用于封装细胞、可在较长的一段时间内保持细胞的活性的可植入胶囊是有利的。

提供用于封装细胞的可植入胶囊是有利的，不同类型的细胞可用于不同治疗。

提供易于插入和取出、对患者的不适感最小的可植入胶囊是有利的。

提供能够冷冻和解冻，同时使封装的细胞维持在良好的存活状态，使得它们在解冻后能够保持分泌高水平的目的蛋白的能力的可植入胶囊是有用的。

本发明的目的是通过提供权利要求1所述的系统来实现的。

本文公开了一种可植入胶囊，其包括细胞接收部分，其包括围绕用于接收分泌治疗剂的处于液体介质中的永生化细胞的细胞接收室的多孔膜，其特征在于，所述胶囊进一步包含插入细胞接收室内的细胞支撑基质，其被配置为用于在细胞接收室内排列永生化细胞。所述细胞支撑基质包含至少一根纱线(yarn)。

“纱线(yarn)”是指，就其本身通常的理解，编织或纺织在一起形成一根绳子的多股纤维。

在一个有利的实施方式中，所述的至少一种纱线由聚酯材料组成，或包括聚酯材料。

在一个有利的实施方式中，所述细胞支撑基质包括多根所述的纱线。

在一个有利的实施方式中，所述多根纱线在5-20根纱线范围内，优选地在5-15根纱线范围内，例如约10根纱线。

在一个有利的实施方式中，所述纱线在细胞接收室内延伸至基本为所述接收室的全长或所述细胞接收室长度的至少80％。

在一个有利的实施方式中，所述细胞接收室包含聚酯纱线。

在一个有利的实施方式中，所述细胞接收部分进一步包括安装在细胞接收室中的膜支架，其被配置为用于向多孔膜提供结构支撑，所述膜支架由生物相容性材料制成的线圈组成，或包括生物相容性材料制成的线圈，例如不锈钢线圈。

在一个有利的实施方式中，所述胶囊进一步包括联接到所述细胞接收部分取出器端的取出器部分，其被配置为能够使用手术工具将所述可植入胶囊从植入部位拉出，所述取出器部分包括取回线。

在一个有利的实施方式中，所述取回线由聚丙烯线制成。

在一个有利的实施方式中，所述取出器部分包括锚管(8)，所述锚管中具有腔，取回线(9)的锚定部分(15)插入并结合在该腔中。

在一个有利的实施方式中，所述的锚管由聚氨酯材料组成或包含聚氨酯材料。

在一个有利的实施方式中，所述取出器部分经由包含连接器的连接部连接到所述细胞接收部分，连接器包括插入到所述多孔膜的取出器末端中的部分和插入到所述锚管的连接端中的第二部分。

在一个有利的实施方式中，所述连接器通过粘合剂结合到锚管和细胞接收部分，特别地为光固化粘合剂，例如光固化氨基甲酸酯甲基丙烯酸酯型。

在一个有利的实施方式中，所述胶囊的外径在0.5-3毫米范围内，优选地在0.8-1.5毫米范围内，其长度在5-25毫米范围内，优选地在8-20毫米范围内。

在一个有利的实施方式中，所述胶囊的长度直径比在5-20范围内。

从权利要求和以下详细描述和附图中能够明显得见本发明的进一步目的和有利的方面。

附图简述

现在将参考附图描述本发明，这些附图通过示例说明了本发明的实施方式，并且其中：

图1是根据本发明的实施方式的可植入胶囊的示意图；

图2是图1沿II-II线的剖视图；

图3是类似于图2的剖视图，去除了胶囊的内部基质；

图4是图3中圈IV的详细视图；

图5是图2中圈V的详细视图；

图6示出了常规胶囊和根据本发明实施方式的胶囊的测试结果。

本发明实施方式详述

参见附图，根据本发明实施方式的可植入胶囊1包括通过连接器4连接在一起的细胞接收部分2和取出器部分3。所述细胞接收部分2包括基本为圆柱形的外形，其直径通常可以在0.5-3毫米范围内，长度通常可以在5-20毫米范围内，例如在10毫米左右。所述长度L与所述直径D之比L/D优选地在5-20范围内，优选地在5-15范围内。所述胶囊可以通过植入装置植入患者组织，该装置本身在植入物领域是公知的，无需在此进一步描述。

所述细胞接收部分2包括多孔膜5，其被配置为能够使由胶囊中所含的细胞24产生的治疗剂通过该膜到达周围组织，并能够使供给细胞24的液体和电解质以及营养物质通过该膜从周围组织进入胶囊。因此，所述膜的孔隙度和类型可取决于特定的用途和胶囊内含有的细胞类型。例如，所述膜为聚醚-砜(PES)膜的形式，其孔隙度约为0.65μm，被配置为以允许目标分子通过该膜。下面将详细介绍本发明中可使用的膜的一个示例：

膜的示例性实施方式包括聚醚砜，这是基于其生物相容性的化学组分、结构性质以及固有的膜性能，例如优秀的流速、下游清洁度和低蛋白结合亲和力。它可以以不同形状且在小直径的管道中挤出。

细胞接收部分2可以具有扁平片的形式，如Lathuillère等人,2014,《生物材料学》(Biomaterials)35 780-790或WO 2014/173441中所描述，或具有中空纤维形式，如上述Lathuillère等人，2015中所描述，这取决于分泌的蛋白和装置的植入部位。

取决于用途和所分泌的蛋白，细胞接收部分2可包含有效量的细胞，例如，根据目的在例如1.0×10⁴个细胞至8×l0⁵个细胞间(例如，1.0×10⁴、5.0×10⁴、1.0×10⁵、3.0×10⁵、5.0×10⁵或8×10⁵或10⁶个细胞)。本领域技术人员能够认识到，细胞接收部分中的确切细胞数同时取决于封装的细胞/细胞系的生长速率和/或细胞接收部分的体积。

多孔膜5包围细胞接收室13和细胞接收室13内的膜支架6。膜支架用于机械支撑多孔膜以维持细胞接收室13中体积的稳定并防止膜破裂。在示出的实施方式中，膜支架是线圈的形式，特别是不锈钢线圈，其本身是已知的，例如如WO 2017/0645701中描述。膜支架6还用于通过连接部4锚定取出器部分3。

在示出的实施方式中，连接部4包括连接器10，其具有插入膜支架6的部分10a，特别是在本实施例中插入到被不锈钢线圈包围的圆柱内。连接器插入部分10a的直径可被配置为在线圈的取出器端紧密贴合，以保持其间的稳定连接。连接部4还包括接入到取出器部分3的锚8的固定部分10b，在目前展示的实施方式中，锚8以管的形式存在，优选为安装在连接器10的第二末端10b上的聚氨酯(PU)管。在插入细胞接收部分的取出器末端12b，分别将锚的末端8a连接到连接器10的8上之前，可以将粘合剂18a附着在连接器上。该粘合剂可以有利的为光固化粘合剂的形式，例如可光固化的氨基甲酸酯甲基丙烯酸酯(例如戴马斯(dymax)1187M Sv)的形式。

取出器部分3用于提供在使用结束时从患者组织中拔出植入物的方法。在示出的实施方式中，取出器部分还包括取回线9，其包括固定在锚管8上的锚定部分15和延伸到锚管之外的线部分16，其被配置为能够使用手术装置抓住该线以拉出可植入胶囊。在示出的实施方式中，取回线9由生物相容性纱线或线制成，例如聚丙烯型(例如丙烯^TM缝合线)。

在一个实施方式中，所述线的长度延伸到空心锚管8内并包括线结15a，锚定部分15通过粘合剂(例如如上所述的光固化粘合剂)固定在管内，所述线结增加了取回线与锚管的连接强度。因此，取回线柔软且非常细，以减少患者的不适，并能够轻松移除植入物。

可注意到，取出器部分3可以具有不同的形状和配置，其目的是允许手术装置夹持到植入物上并将其从患者组织中拉出。

在一种变体中，取回线可以直接固定在连接器10上，或者在不存在锚管的情况下与连接器10整体成型。在这样的变体中，连接器可以例如包括一个孔口，该孔口允许一根线穿过孔口并能够将植入的胶囊从患者组织中拉出。聚氨酯管，或任何其他具有足够机械和生物性能的材料，有利地提供支撑取回线连接部的结构。它也可以在操作过程中(无论是在组装过程中还是在植入过程中)，用作镊子的支撑。

细胞接收部分2进一步包括插入细胞接收室内的细胞支撑基质7。在一个优选的实施方式中，细胞支撑基质7包括一根或更多生物相容性材料的纱线14，优选为在细胞接收室13内纵向延伸的多根纱线。在优选的实施方式中，所述纱线从取出器末端12b处或附近的位置延伸到膜5的细胞装载端12a处或其附近的位置。所述纱线优选地延伸到细胞接收室13的整个长度或其长度的很大一部分。在一个优选的实施方式中，纱线可以有利地由临床级的聚酯(PE)制成，其本身是众所周知的并且已经批准用于外科植入用途。这种聚酯纱线通常用于患者体内组织的缝合。可用于本发明有利实施方式的聚酯纱线的一个例子是例如44/27-PET-5540-FTT-SS(纺织品开发协会公司(Textile Development Associates)，Inc)。该材料是由变形聚酯制成的40旦27长丝纱线。

已经发现，细胞支撑基质7显著改善了细胞接收室中所含的永生化细胞的性能，增加了释放治疗剂的活性和随时间推移的耐久性，特别是对于贴壁细胞而言。例如，这种贴壁细胞是可用于细胞治疗的基因工程细胞，例如基因工程永生化的人成肌细胞，小鼠成肌细胞，人视网膜色素上皮细胞，干细胞，干细胞衍生细胞系。由此发现了这些细胞24倾向于与纱线14的纤维排成行，从而改进了为释放治疗剂和摄入营养物而优化的细胞的密度和间距。纱线还有利地为细胞的贴壁提供了较大的总表面积。

在一个示例性实施方式中，分泌GM-CSF的永生化人成肌细胞被装载到本发明胶囊的细胞接收部分2中。这些胶囊能够用于个性化的抗肿瘤细胞免疫疗法。

将在适于细胞类型的补充有生长因子或胎牛血清的细胞生长培养基(例如Ham'sF12或DMEM)中的细胞装载到细胞接收部分中。此外，对于将要冷冻的细胞，细胞生长培养基中还添加有冷冻培养基/冷冻保存剂，例如甘油。

在一个示例性实施方式中，细胞接收腔13可以接收在腔室内部平行排列的例如5至20根纱线14，其基本上延伸至腔室的整个长度。一旦膜支架6和细胞支撑基质14已安装在多孔膜5中，所述纱线就可以通过拉动其一端穿过细胞接收腔13而插入腔内，并将连接部4安装在细胞接收部分2的取出器端12b上。

可以注意到，细胞支撑基质7可以预先组装到膜支架6上，例如通过在将预组装的线圈和细胞支撑基质插入管状多孔膜5之前通过线圈内部插入它们。

因此，细胞支持基质7(特别是以纱线14的形式)具有非常有益的效果，能够在细胞接收室内以有序的方式优化细胞的排布，提高给定体积下的分泌产量和速率。此外，这种配置允许通过简单地将纱线的切割长度更改为多孔膜管和膜支架6的线圈的相应长度来容易地调整细胞接收部分的长度。此外，使用具有良好特性的生物相容性植入式聚酯不会对设备的安全性产生不利影响。

还观察到细胞支撑基质7的存在能够使所包含的细胞冷冻和解冻但不影响细胞的活力。基质7的存在改善了胶囊的冷冻和解冻性能，这是特别有利的，因为它能够使胶囊在冷冻状态下长时间储存，准备在需要时用于治疗患者。特别是，细胞(特别是贴壁细胞)沿着纱线的分布的改善似乎有助于在冷冻和解冻过程中保持高存活率。

液体介质中的细胞可以通过细胞装载装置20(仅部分地和示意性地表示在图中)插入到细胞接收室13中，该装置包括插入到多孔膜5的细胞装载端12a中的出口喷嘴22。

可植入胶囊1可以与细胞装载装置一起以预组装的方式提供。在该实施方式中，细胞装载装置的喷嘴22可以(例如通过粘合剂18c，例如上述的光固化粘合剂)连接在细胞装载端12a的膜上。细胞装载装置可以包括导管，以使得液体介质中的细胞通过导管注入胶囊的细胞接收室，细胞接收胶囊内所含的空气通过多孔膜5被推出。

然而如上所述，胶囊中可以填充永生化细胞和处于即用状态的培养基，细胞接收端12被塞子(未示出)密封，随后冷冻直至需要用于治疗患者。

根据一个特定方面，与本发明相关的合适的永生化人成肌细胞可以衍生自原代人成肌细胞，其中所述细胞表达CDK4和hTERT并保留成肌细胞特征，并进一步经过基因工程改造以分泌目的蛋白如人、人源化或嵌合单克隆抗体(或重组蛋白(例如小鼠或人))等。

根据一个进一步的特定方面，与本发明相关的合适的永生化人成肌细胞系可以是以CCOS登录号1902保藏的人类成肌细胞系或其组合物或其子代，其可以进一步进行基因工程改造以分泌蛋白。例如，这些细胞可以由启动子控制，在有目的的控制下有利地进行转导以表达目标蛋白，该启动子在缺氧条件下过度活化，例如PGK(磷酸甘油酯激酶)启动子，特别是人磷酸甘油酯激酶(hPGK)启动子，如Salmon,2013,《分子生物方法》(Methods MolBiol.),；945:417-48中所述。

根据一个进一步的特定方面，与本发明相关的合适的永生化人成肌细胞可以衍生自原代人成肌细胞，其中所述细胞表达CDK4和hTERT并保留成肌细胞特征，并进一步经过基因工程改造以分泌GM-CSF。例如，与本发明相关的合适的永生化人成肌细胞系可以是经基因工程改造用于GM-CSF分泌的永生化成肌母细胞，以编号CCOS 1901保藏(衍生细胞系以编号CCOS 1902保藏)。

实施例1：本发明的胶囊用于在体外和体内递送人GM-CSF的测试

在以下实验中，比较了两种类型的可植入胶囊：图1中描述的胶囊用于A组和B组，而WO 2017/064571中描述的胶囊(常规胶囊)用于对比组C组。

A组：胶囊中装载有本发明细胞(表达人GM-CSF的永生化人成肌细胞系(以编号CCOS1901保藏的细胞系)

B组：胶囊中装载有对照细胞系：表达人类GM-CSF的K562人红白血病细胞

C组：胶囊中装载有相同的对照细胞系：表达人类GM-CSF的K562人红白血病细胞。常规胶囊不包含任何支持基质，因此不适合装载贴壁细胞，如人成肌细胞。为了比较两种不同胶囊随时间推移产生huGM-CSF的功效，我们使用了表达人GM-CSF的K562人红白血病细胞系。

B组和C组的数据提供了本发明胶囊性能的直接比较，因为它是含有表达相同目的治疗蛋白的相同基因工程化细胞系的2种不同胶囊的正面比较。A组提供的数据支持了本发明胶囊与贴壁细胞(例如永生化的人成肌细胞)结合的特殊优势：K562人红白血病细胞是表达目的蛋白如GM-CSF的标准胶囊(C组)。

在无菌培养条件下，将约800000个细胞装载到胶囊中。将胶囊保存在培养基中，37℃和5％CO2条件下。使用ELISA(试剂盒#KHC2011，赛默飞世尔(Thermo Fischer))在培养基中定量检测人GM-CSF递送量，并以ng/24小时形式报告(图6A)。将胶囊植入小鼠皮下组织1周。处死后，从动物身上取出胶囊并置于培养基中，用于定量检测人GM-CSF递送量(图6B)。此外，在小鼠血清(图6C)以及胶囊周围的皮下组织(图6D)中定量检测GM-CSF。

这些数据支持本发明的胶囊对于贴壁细胞的培养特别有用，例如永生化的人成肌细胞，因为其能够通过封装细胞在体外和体内获得持续、稳定的GM-CSF和最有效的生产。

附图涉及内容列表：

胶囊 1

细胞接收部分 2

细胞装载端 12a

取出器末端 12b

多孔膜 5

PES 膜

细胞接收室 13

膜支架 6

线圈

不锈钢线圈

细胞支撑基质 7

纱线 14

聚酯纱线

取出器部分 3

锚 8

管

连接部端 8a

取回线 9

锚定部分 15

锚线结 15a

线部分 16

粘合剂 18a

连接部 4

连接器 10

粘合剂 18b

(光)固化粘合剂

细胞装载装置 20

出口喷嘴 22

结合部(细胞装载装置与胶囊)

粘合剂 18c

细胞 24

膜直径 D(外部)

膜长度 L

长度/直径比 L/D

Claims (15)

1.一种可植入胶囊，其包括细胞接收部分(2)，其包括围绕用于接收分泌治疗剂的处于液体介质中的永生化细胞的细胞接收室(13)的多孔膜(5)，其特征在于，所述胶囊进一步包含插入细胞接收室(13)内的包括至少一根纱线(14)的细胞支撑基质(7)，其被配置为用于在细胞接收室内排列永生化细胞。

2.根据前述权利要求所述的可植入胶囊，其中所述的至少一根纱线由聚酯材料组成或包括聚酯材料。

3.根据前述任一权利要求所述的可植入胶囊，其中所述细胞支撑基质(7)包括多根所述纱线。

4.根据前述权利要求所述的可植入胶囊，其中所述多根纱线在5-20根纱线范围内，优选地在5-15根纱线范围内，例如约10根纱线。

5.根据前述任一权利要求所述的可植入胶囊，其中所述纱线在细胞接收室内延伸至基本为所述接收室的全长或所述细胞接收室长度的至少80％。

6.根据前述任一权利要求所述的可植入胶囊，其中所述细胞接收室(13)包括聚酯纱线。

7.根据前述任一权利要求所述的可植入胶囊，其中所述细胞接收部分还包括安装在细胞接收室(13)中的膜支架(6)，其被配置为用于向多孔膜(9)提供结构支撑，所述膜支架由生物相容性材料制成的线圈组成，或包括生物相容性材料制成的线圈，例如不锈钢线圈。

8.根据前述任一权利要求所述的可植入胶囊，其进一步包括联接到所述细胞接收部分的取出器端(12a)的取出器部分(3)，其被配置为能够使用手术工具将所述可植入胶囊从植入部位拉出，所述取出器部分包括取回线(9)。

9.根据前述权利要求所述的可植入胶囊，其中所述取回线(9)由聚丙烯线制成。

10.根据前两项直接权利要求中任一项所述的可植入胶囊，其中所述取出器部分包括锚管(8)，所述锚管中具有腔，取回线(9)的锚定部分(15)插入并结合在该腔中。

11.根据前述权利要求所述的可植入胶囊，其中所述锚管(8)由聚氨酯材料组成或包含聚氨酯材料。

12.根据前述三项权利要求中任一项所述的可植入胶囊，其中所述取出器部分(3)经由包含连接器(10)的连接部(14)连接到所述细胞接收部分(2)，连接器(10)包括插入到所述多孔膜(5)的取出器末端(12b)中的部分(10a)和插入到所述锚管(8)的连接端(8a)中的第二部分(10b)。

13.根据前述权利要求所述的可植入胶囊，其中所述连接器(10)通过粘合剂(18b)结合到锚管(8)和细胞接收部分(2)，所述粘合剂特别地为光固化粘合剂，例如光固化氨基甲酸酯甲基丙烯酸酯型。

14.根据前述权利要求中任一项所述的可植入胶囊，其中所述胶囊的外径在0.5-3毫米范围内，优选地在0.8-1.5毫米范围内，并且其长度在5-25毫米范围内，优选地在8-20毫米范围内。

15.根据前述权利要求中任一项所述的可植入胶囊，其中所述胶囊的长度直径比在5-20范围内。

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