CN102861105A - 使用脂肪组织来源的细胞治疗心血管病症的方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及使用脂肪组织来源的细胞治疗心血管病症的方法。本申请提供了包含脂肪来源的干细胞的浓缩细胞群体在制备用于心肌梗死后的恢复灌注和减少心肌疤痕形成的药物中的应用。脂肪来源的再生细胞被用于治疗患者，包括患有心血管病症、疾病或紊乱的患者。治疗患者的方法包括处理脂肪组织以为患者提供来自脂肪组织的浓缩量的再生细胞例如干细胞和祖细胞。该方法可以在封闭系统中实施，这样在被给药给患者之前，干细胞不会被暴露到外部环境中。因此，在优选的实施方式中，脂肪来源的再生细胞与对于促进、产生或支持治疗性心血管益处必要的添加剂一起被直接置入受体内。

Description

使用脂肪组织来源的细胞治疗心血管病症的方法

本申请是申请日为2005年5月25日，申请号为200580050265.1，发明名称为“使用脂肪组织来源的细胞治疗心血管病症的方法”的中国专利申请的分案申请。

相关申请

本申请是2004年2月20日提交发明名称为《使用脂肪组织来源的细胞治疗心血管病症的方法》的美国申请No.10/783,957（其要求2003年2月20日提交发明名称为《使用脂肪组织来源的细胞治疗心血管病症的方法》的美国临时申请No.60/449,279和2003年4月15日提交发明名称为《使用脂肪组织来源的细胞治疗心血管病症的方法》的美国临时申请No.60/462,911的优先权）的部分继续申请，以及2004年6月25日提交发明名称为《从组织分离和浓缩再生细胞的系统和方法》的美国申请No.10/877,822（其要求2003年8月20日提交发明名称为《从组织分离再生细胞的系统和方法》的美国临时申请No.60/496,467和2003年提交发明名称为《从组织分离再生细胞的系统和方法》的美国临时申请No.60/482,820的优先权）的部分继续申请，其中美国申请No.10/783,957和美国申请No.10/877,822都是2002年12月9日提交发明名称为《使用处理过的脂肪抽出物（lipoaspirate）细胞治疗患者的系统和方法》的美国申请No.10/316,127（其要求2001年12月7日提交的美国临时申请No.60/338,856的权利）的部分继续申请。这里明确地引入所有前述申请的内容作为参考。

发明背景

1.发明领域

本发明整体上涉及来源于脂肪组织的再生细胞，更具体地，涉及脂肪（adipose）来源的再生细胞（例如脂肪来源的干细胞和祖细胞），脂肪来源的再生细胞的使用方法，含有脂肪来源的再生细胞的组合物，以及制备和使用脂肪来源的再生细胞的系统，所述脂肪来源的再生细胞被用于治疗心血管疾病和紊乱。

2.相关技术的描述

心血管疾病和紊乱是所有的工业化国家中死亡和丧失劳动能力的首要原因。仅在美国，心血管疾病占死亡率的大约40%，并侵袭5800万美国人（美国心脏协会，2002）。造成心血管疾病尤其具有破坏性的主要因素之一是心脏在受损之后不能够自身修复。因为心肌细胞不能够分裂并重新占据受损区域，由于损伤或者疾病导致的心脏细胞损失很大程度上是不可逆转的（Abbate等人，2002；Remme，2000）。

在可以利用的治疗形式中，人与人之间的心脏移植已经成为治疗严重心血管疾病和紊乱中最有效的。事实上，目前普通心脏移植受体的一年和五年生存率超过了70%。然而，不幸的是，由于许多原因，移植是非常受限的治疗形式，所述原因即缺乏适宜的供体、该方法的费用以及很可能产生移植物排斥和相关问题如感染、肾功能异常以及免疫抑制剂相关癌症（美国心脏协会，2002）。

移植治疗的备选方案是使用再生药物修复和再生受损的心肌细胞。再生药物以临床靶向的方式控制干细胞的能力（即身体未特化的主细胞（mastercell））以自身无限地地更新并发育成成熟的特化细胞。在发育早期的胚胎、胎儿组织以及某些成年器官和组织中发现干细胞（Pera等人，2000）。已知胚胎干细胞（下文中称作“ESC”）会变成身体的所有细胞和组织类型。ESC不仅含有个体的全部遗传信息，还含有变成身体200+细胞和组织中任何一种的新生能力。因此，这些细胞具有作为再生药物的巨大潜力。例如ESC能够发育成特定组织如心、肺或肾，然后它们能够被用于修复受损和患病的器官（Assady等人，2001；Jacobson等人，2001；Odorico等人，2001）。然而，ESC来源的组织具有临床局限性。因为，ESC必须来自另一个个体，即胚胎，所以存在受体的免疫系统排斥新的生物材料的风险。尽管可以利用防止这些排斥的免疫抑制药物，但已知这些药物也会阻断期望的免疫应答，如针对细菌感染和病毒的免疫应答。此外，对于ESC的来源（即胚胎）的伦理上的辩论是由来已久的，可能是可预见的将来不可克服的障碍。

成年干细胞（下面可互换地被称作“ASC”）代表使用ESC的备选方案。ASC静止地存在于许多非胚胎组织中，可能等待对外伤或其他破坏性疾病进程作出应答，从而它们能够治疗受伤的组织（Arvidsson等人，2002；Bonner-Weir和Sharma，2002；Clarke和Frisen，2001；Crosby和Strain，2001；Jiang等人，2002a）。值得注意的是，不断出现的科学证据显示每个个体都携带ASC库，其与ESC都具有变成许多（如果不是全部）细胞和组织类型的能力（Young等人，2001；Jiang等人，2002a；Jiang等人，2002b；Schwartz等人，2002）。因此，ASC像ESC一样具有再生药物的临床应用的巨大潜力。

已经表明ASC群体存在于骨髓、皮肤、肌肉、肝和脑的一种或多种中（Jiang等人，2002b；Alison，1998；Crosby和Strain，2001）。然而，这些组织中ASC的出现率很低。例如，估计骨髓中间充质干细胞的出现率为100,000个有核细胞中有1个至1,000,000个有核细胞中1个之间（D’Ippolito等人，1999；Banfi等人，2001；Falla等人，1993）。类似地，从皮肤提取ASC包括数周内的一系列复杂的细胞培养步骤（Toma等人，2001）并且骨骼肌来源的ASC的临床应用需要两到三周的培养期（Hagege等人，2003）。从而，来自这些组织的ASC的所有的设计的临床应用需要通过细胞纯化和细胞培养方法增加细胞数、纯度和成熟度。

尽管细胞培养步骤可以提供增加的细胞数、纯度和成熟度，但是需要付出代价。该代价可以包括下面的技术困难中的一个或多个：由于细胞老化丧失细胞功能、可能有用的非干细胞群体的损失、细胞可能应用于患者的延迟、金钱花费增加，以及培养期间细胞受到环境微生物污染的危险增加。最近检查骨髓来源的ASC的治疗效果的研究使用基本上完整的骨髓以克服与细胞培养有关的问题（Horwitz等人，2001；Orlic等人，2001；Stamm等人，2003；Strauer等人，2002）。然而，临床益处是次最佳的，并且结果几乎无疑与有限的ASC剂量和骨髓中内在可利用的纯度有关。

最近，已经证明脂肪组织是ASC的来源之一（Zuk等人，2001；Zuk等人，2002）。与骨髓、皮肤、肌肉、肝和脑不同，脂肪组织相当容易以相对大的量收获（Commons等人，2001；Katz等人，2001b）。此外，已经表明脂肪来源的ASC具有在体外产生多种组织，包括骨髓、脂肪、软骨和肌肉的能力（Asbjian等人，2003；Mizuno等人，2002；Zuk等人，2001；Zuk等人，2002）。从而，脂肪组织提供了用于再生药物中ASC的最佳来源。然而，本领域中缺少收获脂肪来源的ASC的适宜方法。现有方法具有许多缺点。例如，现有方法不能最佳地容纳用于除去脂肪组织的吸出装置。现有方法还缺少从脂肪组织收获期到组织加工期的部分或完全自动化（Katz等人，2001a）。现有方法还缺少大于100ml脂肪组织的体积容量。现有方法还缺少从脂肪组织收获期到组织加工期的部分或全部密闭系统。最后，现有方法缺少组分处理能力以减小一个样品与另一个样品的物质的交叉污染的伴随危险。总之，用于从脂肪组织收获ASC的现有技术方法没有克服与从上述皮肤、肌肉、肝脏和脑收获ASC相关的技术困难。

因此，考虑到ASC的巨大的治疗潜力，本领域中迫切需要从产生ASC群体的脂肪组织以高产率、一致性和/或纯度收获ASC并且快速而可靠地收获并且减小或者不存在（nonexistent）对提取后操作的需要的装置、细胞或者方法。理想地，这种装置、系统或者方法将以适于直接置于受体的方式产生ASC。这种装置、系统或方法的获得以及使用脂肪来源的ASC治疗心血管疾病和紊乱的方法和组合物将对这些紊乱的治疗产生根本变化。考虑到心血管疾病的普遍和当前治疗选择的不足，迫切需要这种治疗。

发明内容

本发明涉及可以用于治疗心血管病症、疾病和紊乱的再生细胞例如成年干细胞和祖细胞。本发明还涉及用于从如脂肪组织的组织分离和浓缩再生细胞的系统和方法。本发明还涉及用于心血管相关治疗应用的再生细胞组合物。因此，在常规的实施方式中，本发明针对使用来源于组织的再生细胞的组合物、方法和系统，所述细胞与促进、产生或者支持治疗心血管相关益处所需的添加剂一起直接置于受体中。

在具体的实施方式中，本发明的再生细胞可以被用于治疗心血管病症、疾病和紊乱，其基于例如再生细胞的合成和分泌刺激新血管形成的生长因子的能力，再生细胞的合成和分泌刺激细胞存活、增殖和/或改变其他细胞损伤应答的生长因子的能力，再生细胞的增殖和/或分化成直接参与新血管形成的细胞的能力，再生细胞的移入到受损心肌层并改变疤痕形成（胶原蛋白的沉积、胶原蛋白的分解和交联）的能力，再生细胞的增殖并分化成能够有助于心肌收缩的心肌细胞（cardiomyocyte）或心肌细胞样肌细胞（cardiomyocyte-like musclecell）的能力，再生细胞的增殖并分化成心肌细胞（myocardial cell）的能力，再生细胞改善灌注并再生受损心肌（myocardium）的能力，再生细胞防止心肌梗死之后肥大（重建）进展的能力。

对心脏病患者给药的再生细胞可以包括例如干细胞、祖细胞及其组合。在某些实施方式中，可以需要给药多剂量和/或多类型的再生细胞以产生治疗益处。另外，可以与再生细胞同时给药例如一种或者多种生长因子的添加剂。在优选的实施方式中，再生细胞被与血管生成生长因子、动脉生成生长因子和/或心脏特异性生长因子单独或与其他添加剂的组合进行给药。所述再生细胞也可以与一种或者多种免疫抑制药物进行给药。

再生细胞的给药途径是本领域已知的，并且包括直接将细胞给药到期望有利的位置。这可以通过下列达到：经心脏的外表面（心外膜）直接注射到心肌，经过插入适当的插管通过内表面（心内膜）直接注射入心肌，通过动脉或静脉输注（包括逆行流动机制），或者通过这里所公开或本领域中已知的其他方式例如心包注射。本领域中技术人员已知的给药途径包括但不限于静脉内、冠状动脉内、心内膜心肌、心肌外膜、心室内、逆行冠状窦或静脉内给药。

在为患者给药前，再生细胞可以在细胞培养中进行生长以例如促进其朝着心脏表型分化。在为患者给药前，可以通过基因转移对细胞进行修饰，这样改变了在被修饰的再生细胞中一种或者多种基因例如心脏基因的表达。

本发明还涉及高度通用的系统和方法，其能够从给定的组织分离和浓缩适合再被输注到受试者的再生细胞，例如干细胞和祖细胞。在优选的实施方式中，该系统是自动化的。通常本发明的系统包括一个或者多个采集腔室（chamber）、处理腔室、废物腔室、输出腔室和样品腔室。不同的腔室通过一个或者多个导管连接到一起，使得包含生物材料的流体可以在闭合的、无菌的流体/组织通道内从一个腔室通到另一个腔室。在某些实施方式中，废物腔室、输出腔室和样本腔室是可选的。在一个实施方式中，从组织提取经过处理和将设备置入受体内的全部程序，会都在相同的装置中进行，事实上，即使在患者的同一房间内也可以进行该程序。

因此，在一个实施方式中，治疗患者中心血管相关紊乱的方法包括下列步骤：a）提供组织移除系统；b）使用组织移除系统从患者移出脂肪组织，脂肪组织具有一定浓度的再生细胞；c）处理至少一部分脂肪组织以获得一定浓度的再生细胞，该浓度与处理前的脂肪组织中再生细胞的浓度不同；以及d）将再生细胞给药给患者，不需要在对病人进行给药前从组织移除系统移除再生细胞。

这里所描述的任何特征或者特征的组合都包括在本发明的范围内，只要在任何这样的组合中包括的特征没有与通过上下文，本说明书和本领域技术人员的知识显而易见的特征互相不符合。本发明的附加优点和方面在接下来的详细描述中变得明显。

附图说明

图1示出了用于从组织分离并且浓缩再生细胞的系统，该系统包括一个过滤器组件；

图2示出了与图1相似的系统，该系统具有多个串联构造的过滤器组件；

图3示出了与图1相似的系统，该系统具有多个并联构造的过滤器组件；

图4示出了用于从组织分离并且浓缩再生细胞的系统，该系统包括离心分离腔室；

图5为包括用于从组织分离并且浓缩再生细胞的系统中使用的前置过滤器的采集腔室的截面图；

图6为使用渗滤过滤系统、从组织分离并且浓缩再生细胞的系统的处理腔室的截面图；

图7为用于分离和浓缩再生细胞的系统的处理腔室的截面图，其利用离心分离设备来浓缩再生细胞；

图8为图7的处理腔室的另一张截面图；

图9.1、图9.2和图9.3示出了与本发明的系统一起使用的淘析部件；

图10示出了用于从组织分离并且浓缩再生细胞的系统，其利用真空压力来使流体运动通过系统。通过将真空泵或真空源施加到系统的出口，控制在预先确定的速率来拉动组织和流体通过，使用旋阀、排出口和夹具的系统来控制流动的方向和定时来构造真空系统；

图11示出了用于从组织分离并且浓缩再生细胞的系统，其利用正压力来使流体运动通过系统。正压力系统使用诸如蠕动泵的机械装置来推动或推进流体和组织以预先确定的速率通过系统，使用阀（valve）、旋阀（stopcock）、排出口和夹具来控制流动的方向和定时；

图12A示出了过滤过程，其中流入的流体流与过滤器的孔成切向流动；图12B示出了过滤过程，其中流体的流入流垂直于过滤器的孔流动；

图13示出了用于本发明的系统的示例性的一次性的用具；

图14示出了用于本发明的系统的示例性的可重复使用的部件；

图15A示出了使用图13的一次性用具和图14的可重复使用的部件装配的本发明的示例性设备；

图15B为示出了示例性的预编程步骤的流程图，其通过软件程序执行，该软件程序控制本发明的系统的自动化实施例。示出了两组可替换的处理参数，以表示该系统的通用性；

图16A和图16B描绘了培养的脂肪来源的干细胞的VEGF（5A）和PIGF（5B）蛋白质的表达；

图17描绘了脂肪来源的干细胞群内内皮祖细胞的检测；

图18A和图18B描绘了正常（7A）和链唑霉素处理的（7B）小鼠脉管结构的体外发育；

图19描绘了与阴性对照比较，脂肪来源的干细胞处理的后肢局部缺血小鼠中血流的平均恢复的增加；

图20A和图20B表明增加脂肪来源的干细胞剂量提高移植存活和血管生成（20A）并描绘了组织样品中脂肪组织构造的保持（20B）；

图21描绘了梗死的心肌区域中来自供体的脂肪来源的干细胞移植的组织学时间线（timeline）；

图22描绘了β-半乳糖苷酶和肌球蛋白重链的双阳性染色。高亮细胞都显示出蓝色的半乳糖苷酶染色，表明它们来源于供体脂肪组织细胞，褐色染色表明心肌蛋白肌球蛋白重链的表达。显示出褐色和蓝色染色的细胞（如通过箭头指出）是呈现出心肌细胞表型的脂肪组织来源的细胞；

图23描绘了大鼠中阻塞/再灌注损伤后梗死的心肌区域中来自供体的脂肪来源的干细胞群；

图24描绘基于回声和收缩性分析，与盐水相比，接受脂肪来源的再生细胞治疗的大鼠在心肌梗死后12周显著改善的喷血分数；

图25描绘基于回声和收缩性分析，与盐水相比，接受脂肪来源的再生细胞治疗的大鼠在心肌梗死后12周显著改善的基线收缩；

图26描绘基于回声和收缩性分析，与盐水相比，接受脂肪来源的再生细胞治疗的大鼠在心肌梗死后12周显著改善的基线舒张；

图27描绘与盐水相比，接受脂肪来源的再生细胞治疗的大鼠在心肌梗死后12周重建参数方面的改变，即降低的心室隔膜（septal）厚度；

图28描绘与盐水相比，在接受ADC治疗的大鼠心肌梗死后12周，以降低心室隔膜厚度（心脏收缩）作为证据的防止心室扩张进程；

图29和图30表示与盐水相比，在接受脂肪来源的再生细胞治疗的大鼠心肌梗死后12周，以在心脏舒张（图29）和心脏收缩（图30）中都降低后壁（posterior wall）厚度为证据的防止心室扩张进程；

图31描绘在细胞灌注组猪与对照组猪相比，左心室射血分数的显著提高：细胞灌注组（3.0%±6.0%，平均值±SD）对比对照组（-9.0%±5.0%，p=0.01）。通过血管显像术的LVEF（n=12）表示相似的趋势，其值为分别3.7%±5.0%对-2.0%±7.5%（p=0.16）。

发明的详细描述

本发明提供了使用脂肪来源的再生细胞例如干细胞和祖细胞治疗心血管病症、疾病和紊乱的系统和方法。具体地，本发明阐明本发明的脂肪来源的再生细胞（1）表达血管生成和动脉生成生长因子，包括PIGF、VEGF、bFGF、IGF-II、嗜酸性粒细胞趋化因子（Eotaxin）、G-CSF、GM-CSF、IL-12p40/p70、IL-12p70、IL-13、IL-6、IL-9、瘦素（Leptin）、MCP-1、M-CSF、MIG、PF-4、TIMP-1、TIMP-2、TNF-α和血小板生成素（Thrombopoetin），（2）含有在血管形成中具有明确功能的内皮祖细胞（EPC），（3）在体外发育成血管，以及（4）支持体内局部缺血组织生存，（5）诱导后肢的阻塞/再灌注损伤后的恢复灌注（restore perfusion），（6）当心脏损伤后注射到动物时归巢到心脏，（7）当心脏损伤后注射到动物时分化成细胞，所述细胞表达与它们分化成心肌细胞或心肌细胞样细胞相一致的标记，（8）改善小鼠后肢局部缺血外科模型中心肌梗死后的灌注，（9）防止重建的进展以及（10）改善心肌梗死的小动物和大动物模型中的功能。因此，本公开阐明本发明脂肪来源的再生细胞可用于治疗心血管疾病和紊乱。

为了更易理解本发明，首先定义某些术语。其他定义在详细描述中给出。

在这里使用的，“再生细胞”指的是使用本发明的系统和方法获得的任何异源的或同源的细胞，其导致或帮助完全或部分再生、恢复或代替器官、组织或生理单元或系统的结构或功能，以由此提供治疗、结构或美容的益处。再生细胞的例子包括：成人干细胞（ASC）、内皮细胞、内皮前体细胞、内皮祖细胞、巨噬细胞、纤维原细胞、周皮细胞、平滑肌细胞、前脂肪细胞（preadipocyte）、分化或去分化的脂肪细胞、角化细胞、单能的和多能的祖细胞和前体细胞（和其后代）以及淋巴细胞、中性粒细胞、组织细胞（histiocyte）（组织巨噬细胞）、淋巴系统相关细胞、神经元、神经元前体细胞和施旺细胞（Schwann cell）。

再生细胞可以提供治疗、结构或美容的益处的一种机制是通过将它们自身或它们的后代掺入新生成的、现有的或修补的组织或组织成分。例如ASC和/或它们的后代可以掺入新生成的骨、肌肉、或其它结构或功能组织并且由此导致或有助于治疗、结构或美容的改善。相似地，内皮细胞或内皮前体或祖细胞和它们的后代可以掺入现有的、新生成的、修补的或扩张的血管以由此导致或有助于治疗、结构或美容的益处。

再生细胞通可以提供治疗、结构或美容的益处的另一种机制是通过表达和/或分泌分子例如生长因子，其促进给定组织或组织成分的结构或功能的形成、保持、恢复和/或再生。例如再生细胞可以表达和/或分泌分子，其导致增强的组织或细胞生长，其随后直接或间接地参与改善的结构或功能。再生细胞可以表达和/或分泌生长因子，包括例如血管内皮生长因子（VEGF）、胎盘生长因子（PlGF）、bFGF、IGF-II、嗜酸性粒细胞趋化蛋白（Eotaxin）、G-CSF、GM-CSF、IL-12p40/p70、IL-12p70、IL-13、IL-6、IL-9、瘦素（Leptin）、MCP-1、M-CSF、MIG、PF-4、TIMP-l、TIMP-2、TNF-α、血栓形成素（Thrombopoetin）和它们的同等型，其可以执行一种或多种下面的功能：剌激新血管发育，即促进血管生成；通过扩张先存的小血管（旁系血管）的血液运载容量来改善它们的供氧；诱导再生细胞从远离损伤位点的地点迁移，以由此增强将这样的细胞归巢并且迁移到损伤地点；剌激生长和/或促进细胞在损伤位点内的生存，由此促进功能或结构的保持；输送具有抗凋亡性质的分子，由此降低细胞死亡和功能永久丧失的比率或可能性；以及与内源的再生细胞和/或其它生理机制互相作用。

再生细胞可以以它们的“天然”形式使用，如存在于组织中或使用本发明的系统和方法从组织分离并且浓缩，或者如在这里进一步描述的，可以通过用生长因子或其它生物应答调节剂来刺激或启动，通过基因转移（瞬时的或稳定转移），通过对所得到的群体的亚分级分离基于物理性质（例如尺寸或密度）、对固相材料不同的吸附力、细胞表面或细胞内分子的表达、细胞培养或其它体外或体内操纵、修饰或分级分离，对再生细胞进行修饰。再生细胞也可以与其它细胞或设备结合使用，诸如合成的或生物的骨架、材料或设备，其输送修饰或增强细胞的有关的特性的因子、药物、化学物质或其它制剂如这里进一步描述的。

在这里使用的，“再生细胞组合物”指的是组织，例如脂肪组织被清洗并且至少部分分解以后通常存在于一定体积的液体内的细胞组合物。例如，本发明的再生细胞组合物包括多种不同类型的再生细胞包括ASC、内皮细胞、内皮前体细胞、内皮祖细胞、巨噬细胞、纤维原细胞、周皮细胞、平滑肌细胞、前脂肪细胞、分化或去分化的脂肪细胞、角化细胞、单能的和多能的祖细胞和前体细胞（和其后代）和淋巴细胞。再生细胞组合物还可以包含一种或多种污染物，诸如可以存在于组织片段中的胶原蛋白，或在这里描述的组织分解过程中所采用或者从该过程中所产生的残余胶原酶或其它酶或制剂。

在这里所使用的“再生药物”是指来自直接或者间接将再生细胞置入受试者内所得到的治疗、结构或者美容的益处。在这里所使用的短语“心血管病症、疾病和紊乱”为了包括特征为不足、不希望或者异常的心脏功能的所有紊乱，例如局部缺血性心脏病、高血压心脏病和肺部高血压心脏病、瓣膜疾病、先天性心脏病、中毒性或传染性心肌症和导致受试者尤其人类受试者中例如充血性心力衰竭的心力衰竭。不足或异常的心脏功能可以由疾病、损伤和/或老化导致。作为背景，对心肌损伤的应答按照确定的途径，其中一些细胞死亡而其他细胞进入休眠状态（hibernation），它们还没有死亡但是功能异常。接着，炎症细胞的渗入、胶原作为疤痕部分沉积，所有这些都与新血管内不生长和一定程度的持续细胞死亡平行发生。这里所用的术语“局部缺血”指由于血流减少和/或氧和/或其他营养物供应的减少，而引起的任何局部组织缺血（例如局部组织缺血或者全面组织缺血例如休克时）。术语“心肌局部缺血”指冠状动脉粥样硬化和/或心肌的供血、氧和/或营养物不足导致的循环紊乱。术语“心肌梗死”是指由于缺少血液流动而导致的心肌组织的缺血损伤。特别地，这种损伤来自于冠状循环中的阻塞（例如，血栓形成或栓塞）事件并产生这样的环境，心肌代谢需要量超过对心肌组织的供氧和/或营养物的供给。

这里所用的术语“血管生成”指从现有的脉管系统和组织产生新血管的过程（Folkman，1995）。术语“修复”指被损伤脉管系统的再形成（reformation）。组织局部缺血的减轻大大依赖于血管生成。新血管的自发生长提供了局部缺血区域内和周围的侧枝循环，提高了血流，并减轻了局部缺血导致的症状。这里所用的术语“血管生成因子”或者“血管生成蛋白质”指能够从现有脉管系统生长新血管（“血管生成”）的任何已知的蛋白质、肽或者其他试剂。用于本发明适宜的血管生成因子包括但不限于胎盘生长因子（Luttun等人，2002）、巨噬细胞集落刺激因子（Aharinejad等人，1995）、粒细胞巨噬细胞集落剌激因子（Buschmann等人，2003）、血管内皮生长因子（VEGF）-A，VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E（Mints等人，2002）、神经纤毛蛋白（neuropilin）（Wang等人，2003）、成纤维细胞生长因子（FGF）-1、FGF-2（bFGF）、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6（Botta等人，2000）、血管生成素（angiopoietin）1、血管生成素2（Sundberg等人，2002）、红细胞生成素（Ribatti等人，2003）、BMP-2，BMP-4、BMP-7（Carano和Filvaroff，2003）、TGF-β（Xiong等人，2002）、IGF-l（Shigematsu等人，1999）、骨桥蛋白（Asou等人，2001）、多效营养因子（Beecken等人，2000）、活化素（Lamouille等人，2002）、内皮素-1（Bagnato和Spinella，2003）和它们的组合。血管生成因子可以独立地或者相互组合地作用。当组合时，血管生成因子可以协同起作用，从而因子的组合效果大于单独采取各自因子效果的总和。术语“血管生成因子”或者“血管生成蛋白”还包括这些因子的功能类似物。功能类似物包括例如，因子的功能部分。功能类似物还包括抗独特型抗体，其结合所述因子的受体，从而模拟所述因子的活性以促进血管生成和/或组织修复。产生这些抗独特型抗体的方法是本领域中熟知的并且在例如WO97/23510中被描述，这里将WO97/23510的内容完整并入本文作为参考。

用于本发明的血管生成因子可以从任何适宜的来源生产或者得到。例如，所述因子可以从它们的天然来源纯化、或者合成产生或者重组表达产生。所述因子可以作为蛋白质组合物为患者进行给药。备选地，所述因子可以以编码该因子的表达质粒的形式给药。适宜的表达质粒的构建是本领域中熟知的。用于构建表达质粒的适宜的载体包括例如，腺病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体、RNA载体、脂质体、阳离子脂质体、慢病毒载体和转位子。

这里所用的术语“动脉生成”指增强侧枝动脉和/或来自现有小动脉连接的其他动脉的生长的过程（Carmeliet，2000；Scholz等人，2001；Scholz等人，2002）。更具体地，动脉生成是通过来自现有小动脉连接的内皮和平滑肌细胞的增殖原位募集和扩增动脉，从而为局部缺血组织、肿瘤或者炎症部位提供血液。这些血管大部分生长在受影响的组织外部并且对于将营养物向局部缺血区域、肿瘤或者炎症部位的传输是重要的。动脉生成是对心肌局部缺血的正常应答的一部分（Mills等人，2000；Monteiro等人，2003）。此外，冠状动脉旁路移植（CABG）的常规手术技术实际上不过是产生动脉侧枝血管（Sergeant等人，1997）。从而，梗死后增强血管生成的方法是提高到达局部缺血组织的血流，导致细胞死亡减少和梗死尺寸减小。这些提高将导致改善的心脏功能和治疗益处。

在这里使用的，“干细胞”指的是多能的再生细胞，其能够分化为多种其它细胞类型，其执行一个或多个特定的功能并且具有自我更新的能力。在这里公开的干细胞的一些可以为多能的。

在这里使用的，“祖细胞”指的是多能的再生细胞，其能够分化为多种细胞类型并且具有限制的或不具有自我更新的能力。在这里使用的，“祖细胞”还指的是能够分化为仅单一的细胞类型的单能细胞，其执行一个或多个特定的功能并且具有限制的或不具有自我更新的能力。特别地，在这里使用的，“内皮祖细胞”指的是能够分化为脉管内皮细胞的多能或单能的细胞。

在这里使用的，“前体细胞”指的是能够分化为一种细胞类型的单能再生细胞。前体细胞和它们的后代可以保持大量增殖的能力，例如，淋巴细胞和内皮细胞，其能够在适合的条件下增殖。

在这里使用的，“干细胞数量”或“干细胞出现率”指的是在克隆源性检定中观察到的集群的数量，在克隆源性检定中，脂肪来源的细胞（ADC）以低细胞密度（<10000细胞/孔）平铺并且在支持MSC生长的生长培养基（例如，补充有10%的胎牛血清、5%的马血清和抗细菌/抗真菌剂的DMEM/F12培养基）内生长。细胞生长两个星期，随后培养物通过苏木精着色，并且多于50个细胞的集群计算为CFU-F，干细胞出现率计算为每100个平铺的有核细胞观察到的CFU-F的数量（例如在初始具有1000个有核再生细胞的盘中计数到15个集群给出的干细胞出现率为1.5%）。干细胞的数量计算为干细胞出现率乘以获得的有核ADC细胞的总数量。从再生细胞生长的高百分比（～100%）的CFU-F表达细胞表面分子CD105，其还通过源自骨髓的干细胞表达（Barry等人，1999）。CD105也通过脂肪来源组织的干细胞表达（Zuk等人，2002）。

在这里使用的，术语“脂肪组织”指的是脂肪，包括存储脂肪的结缔组织。脂肪组织包含多种再生细胞类型，包括ASC和内皮祖细胞和前体细胞。

在这里使用的，术语“脂肪组织单元”指的是分离的或可测量的脂肪组织的量。可以通过确定单元的重量和/或体积来测量脂肪组织单元。基于上面确定的数据，当从患者体内移除时，处理过的脂肪抽出物单元具有细胞成分，其中至少0.1%的细胞成分为干细胞；即，如上所述确定的其干细胞出现率为至少0.1%。参考这里所公开的，脂肪组织单元可以指的是从患者移除的全部的量的脂肪组织，或者小于从患者移除的全部的量的脂肪组织。从而，脂肪组织单元可以与另一个脂肪组织单元，结合以形成重量或体积为单独的单元的和的脂肪组织单元。

在这里使用的，术语“部分”指的是小于全部的材料的量。较小的部分指的是小于50%的量，并且较大的部分指的是大于50%的量。从而，小于从患者移除的脂肪组织的全部量的脂肪组织单元为移除的脂肪组织的一部分。

在这里使用的，术语“处理过的脂肪抽出物”指的是已经被处理以从成熟的脂肪细胞和结缔组织分离活性的细胞成分（例如，包含再生的成分）的脂肪组织。此部分在这里指的是“脂肪来源的细胞”或“ADC”。通常，ADC指的是通过清洗并且从脂肪组织分离并且浓缩细胞获得的再生细胞小团。该小团通常通过离心分离细胞的悬浮液，使得细胞聚集在离心分离腔室或细胞浓缩器的底部来获得。

在这里使用的，术语“给药”、“递送”、“输送”、“放置”和“移植”在这里可互换地使用并且指的是通过导致再生细胞至少部分定位在希望的地点的方法或路线，将本发明的再生细胞放置到受试者体内。再生细胞可以通过任何适合的路线给药，其导致输送到受试者体内希望的位置，在该处细胞或细胞成分的至少一部分保持能够生存。在给药到受试者以后细胞能生存的时期可能短到数个小时如24小时，到数天，到长达数年。

在这里使用的，术语“治疗”包括减小或减轻疾病或病症的至少一种有害影响或症状。

在这里使用的，“治疗有效剂量的再生细胞”指的是一定量的再生细胞，其足够引起有益的或希望的临床效果。所述剂量可以是单次或多次给药。然而，精确地确定被认为是有效的剂量的量可以基于每个患者的独特因素，包括但不限于患者的年龄、尺寸（size）、疾病类型或程度、疾病的阶段、再生细胞的给药途径、所使用补充治疗的类型或程度、正在进行的疾病过程和希望的治疗类型（例如，主动的或者常规的治疗）。

在这里使用的，术语“受试者”包括温血动物，优选为哺乳动物，包括人类，在优选的实施方式中，受试者为灵长类动物。在更优选的实施方式中，受试者为人类。

如之前在这里阐明的，再生细胞例如干细胞和祖细胞，可以从多种组织获取。本发明的系统可以用于全部这样的组织。然而，脂肪组织是特别充足的再生细胞来源。因此，在这里示出的本发明的系统使用脂肪组织作为再生细胞源，这仅是作为示例而不是限制性的。

可以通过任何本领域中的普通技术人员已知的方法获得脂肪组织。例如，可以通过吸脂（注射器或动力辅助的）或通过脂肪切除术，例如抽吸辅助的脂肪成形术、超声辅助的脂肪成形术和切除的脂肪切除术或它们的组合，来从患者移除脂肪组织。移除脂肪组织并采集，并且可以根据在这里描述的本发明的系统的任何实施方式进行处理。采集的组织的量取决于许多因素，包括指供体的身体质量指数和年龄，可用于采集的时间，可到达的脂肪组织获取地点的可用性，伴随的和预先存在的药物和状态（诸如抗凝血疗法），以及采集组织的临床目的。例如，从瘦的个体取出的100毫升脂肪组织的再生细胞百分率大于从肥胖的指献者取出的100毫升脂肪组织的再生细胞百分率（表1）。这可能反映肥胖的个体中，增加的脂肪含量的稀释效率。因此，根据本发明的一个方面，与瘦的患者比较，希望从超重的供体获得更大量的组织。此观察结果还指示本发明的使用不限于具有大量脂肪组织的个体。

表1：身体质量指数对组织和细胞产量的影响

身体质量指数状态	所获得组织的量（克）	总的再生细胞产量（x107）
			正常	641±142	2.1±0.4
肥胖	1,225士173	2.4±0.5
			p值	0.03	0.6

在脂肪组织被处理以后，所得到的再生细胞基本上没有成熟的脂肪细胞和结缔组织。例如，所得到的再生细胞可以基本上没有胶原和细胞外基质组合物，但可以含有出现在结缔组织的成纤维细胞。因此，本发明的系统产生多种异源的脂肪来源的再生细胞，其可以用于研究和/或治疗目的。在优选的实施方式中，细胞适合用于放置或重新注入受体的身体内，在其它实施方式中，这些细胞可以用于研究，例如，这些细胞可以用于建立干细胞或祖细胞系，其可以长时期生存并且用于进一步的研究。

现在将详细地参考本发明的当前优选的实施方式，其实施例在附图中示出。可能的话，在附图和描述中使用的相同或相似的参考数字指的是相同或相似的部分。需要注意，附图为简化的形式而不是比例精确的。参考这里所公开的，仅为了方便和清晰，相对于附图使用诸如顶部、底部、左、右、上、下、上面、之上、下面、之下、后、前、远端和近端的方向术语。这样的方向术语不应该解释为以任何方式限制本发明的范围。

虽然这里的所公开的指的是某些说明的实施方式，应该理解这些实施方式是通过实施例提出并且不是限制性的。虽然讨论的是示例性的实施方式，下面详细描述的目的应该解释为覆盖属于通过后附权利要求书所限定的本发明的精神和范围内的实施方式的所有修饰、替代物和等价物。本发明可以与本领域中通常使用的各种医疗过程结合使用。

现在参考附图，本发明的系统10通常包括一个或多个组织采集腔室20、处理腔室30、废物腔室40、输出腔室50和样品腔室60。不同的腔室通过一个或多个导管12连接到一起，使得包含生物材料的流体可以从一个腔室通到另一个腔室，同时保持闭合无菌的流体/组织通道。导管可以包括刚性或柔性的主体，在这里可互换地分别指管腔和管道。在某些实施方式中，导管的形式为柔性的管道，诸如临床设施中通常使用的聚乙烯管道、硅树脂管道或本领域中已知的任何其它材料。导管12的尺寸可以根据需要流体通道还是组织通道而变化。导管12的尺寸还可以根据循环通过系统的组织或流体的量而变化。例如，对于流体通道，导管的直径在大约0.060英寸~大约0.075英寸的范围内，而对于组织通道，导管的直径在0.312英寸~0.750英寸的范围内。通常，选择导管的尺寸以平衡导管能够容纳的体积和传送组织或流体通过所述导管所需要的时间。在系统的自动化实施方式中，前述参数，即体积和传送时间，必须被识别，以使得适合的信号可以传输到系统的处理设备。这使得设备将准确体积的液体和组织从一个腔室运动到另一个腔室。所使用柔性的管道应该能够承受负压以减小塌陷的可能。所使用柔性的管道还应该能够承受通过例如可以用于系统中的正排量泵产生的正压。

系统的全部腔室可以包括一个或多个口，例如，出口22或入口21，其接受标准IV、注射器和抽吸管道连接器。这些口可以为密封的口，诸如用橡胶隔片关闭的注射器针进入口51。入口可以通过导管连接到一个或多个插管（cannulas）（未示出）。例如，组织入口21可以连接到整体单一使用的吸脂插管，并且导管可以为柔性管道。导管通常定位为提供从系统一个腔室到另一个腔室的流体通道。为此，导管和口可以连接到例如可以手动或自动操作的抽吸设备（未示出）。该抽吸设备可以为例如，注射器或电泵。抽吸设备应该能够提供足够的负压以从患者抽出组织。通常，可以使用本领域中的普通技术人员，例如外科医生已知的任何适合的抽吸设备。

导管12还可以包括一个或多个夹具（未示出）以控制材料在系统的不同部件之间流动。通过有效地密封系统的不同区域，夹具可以用于保持系统无菌。替代地，导管12可以包括控制材料流动通过系统的一个或多个阀14。在图中，阀14标识为空心圆（open circle）。在优选的实施方式中，阀可以为机电夹紧式胶管阀。在另一个实施方式中，阀可以为气动阀。在另一个实施方式中，阀可以为液压阀或机械阀。这样的阀优选为通过可以连接到杠杆的控制系统触发。可以手动操纵杠杆使其被触发。在自动化的实施方式中，控制系统可以连接到杠杆以及连接到处理设备，其可以在预先确定的触发条件触发阀。在某些自动化的实施方式中，阀的触发可以是部分自动并且部分根据使用者的偏好，使得过程可以被优化。在其它的实施方式中，某些阀可以手动触发，同时另一些阀通过处理设备自动地触发。阀14还可以与一个或多个泵，例如蠕动泵34或正排量泵（未示出）结合使用。导管12和/或阀14还可以包括传感器29，例如，光学传感器、超声传感器、压力传感器或本领域已知能够分辨流过系统的不同流体成分和流体水平的其它形式的监控器。在优选的实施方式中，传感器29可以为光学传感器。

系统还可以包括多个过滤器36。在某些实施方式中，过滤器可以在系统的腔室28内。系统内的不同腔室可以包括不同的过滤器，过滤器有效地从不期望的细胞和可以根据本系统使用的分解剂中分离再生细胞例如干细胞和/或祖细胞。在一个实施方式中，过滤器组件36包括空心纤维过滤设备。在另一个实施方式中，过滤器组件36包括渗滤（percolative）过滤设备，其可以与或可以不与沉淀过程一起使用。在另一个实施方式中，过滤器组件36包括离心设备，其可以与或可以不与淘析设备和过程一起使用。在另外一个实施方式中，该系统包括这些过滤设备的结合。本发明的过滤功能可以为双重的，一些过滤器从诸如胶原蛋白、游离的脂质、游离的脂肪细胞和残余的胶原酶的最终浓缩物移除物质，其它过滤器用于浓缩最终产品。该系统的过滤器可以包括多个孔，孔的直径和/或长度从20微米~800微米。在优选的实施方式中，采集腔室20具有前置过滤器28，前置过滤器28具有多个80微米~400微米的孔。在另一个优选的实施方式中，采集腔室20具有前置过滤器28，前置过滤器28具有多个265微米的孔。在其它实施方式中，过滤器可以为可拆的和/或一次性的。

系统还可以包括一个或多个温度控制设备（未示出），其定位为调节包含在系统的一个或多个腔室内材料的温度。温度控制设备可以为加热器、冷却器或二者都有，即可以能够在加热器和冷却器之间转换。温度设备可以调节通过系统的任何材料的温度，包括组织、分解剂、重悬浮剂、漂洗剂、清洗剂或添加剂。例如，加热脂肪组织促进分解，而冷却再生细胞输出对保持生存能力是需要的。而且，如果需要预热的试剂以优化组织处理，则温度设备的任务为保持预先确定的温度而不是增加或降低该温度。

为了保持闭合无菌的流体/组织通道，全部口和阀可以包括保持系统的密封构造的封闭装置。封闭装置可以为不能渗透流体、空气和其它污染物的膜，或者其可以为本领域中已知的任何其它适合的封闭装置。此外，系统的全部口可以设计为使得它们可以容纳注射器、针或其它用于在不会危害系统的无菌性的情况下抽出腔室内的材料的设备。

如在这里阐明的，可以通过任何本领域中公认的方法从患者取出组织。抽吸的组织可以在放置在系统内用于处理之前取出。抽吸的组织通常经由密封的入口，诸如用橡胶隔片关闭的注射器针入口（未在采集腔室上示出），通过导管12传输到采集腔室20。替代地，组织取出步骤可以为系统的一部分。例如，采集腔室20可以包括真空管线11，其促进使用插入患者的标准插管来移除组织。从而，在此实施例中，整个系统接附到患者。可以经由为闭合的无菌通道的一部分的诸如12a的导管，通过入口21将组织引入采集腔室20。采集腔室20可以包括多个柔性的或刚性的罐或圆筒或它们的组合。例如，采集腔室20可以包括一个或多个不同尺寸的刚性罐。采集腔室20还可以包括一个或多个柔性的袋。在这样的系统中，袋优选为提供有支撑件，诸如内部或外部的框，其帮助减小袋在抽吸作用下塌陷的可能。采集腔室20的尺寸为保持需要量的盐水，以在处理腔室30内执行过程的清洗和浓缩阶段之前，适当地清洗和分解组织。优选地，可以容易地用肉眼确定存在于采集腔室20内的组织或流体的体积。例如，为了从脂肪组织获得再生细胞，适合的采集腔室具有保持800毫升脂肪抽出物和1200毫升盐水的容量。因此，在一个实施方式中，采集腔室20具有至少2升的容量。在另一个实施方式中，为了从血液分离并且浓缩红细胞，采集腔室20具有至少1.5升的容量。通常，采集腔室20的尺寸将根据从患者采集的组织的类型和量变化。采集腔室20的尺寸为保持最小大约5毫升到大约2升组织。对于较小的组织体积，例如，5毫升到100毫升，在传输到采集腔室20之前可以将组织收集在注射器内。

采集腔室20可以使用任何能够被杀菌的生物相容的适合的材料制造。在优选的实施方式中，采集腔室20用一次性材料制造，该材料符合在IS010993标准中描述的用于血管内接触的生物相容性要求。例如，可以使用聚碳酸酯丙烯酸树脂或ABS。采集腔室20的流体通道优选为无热原的，即，适用于血液用途，没有传输疾病的危险。在一个实施方式中，采集腔室20由允许使用者用视觉确定存在于腔室内的组织的大致体积的材料制造。在其它实施方式中，采集腔室20内的组织和/或流体的体积通过自动传感器29确定。采集腔室20优选地设计为使得在自动化的实施方式中，系统能够以合理的精确度确定腔室内的组织和/或流体的体积。在优选的实施方式中，系统以正负百分之十五的精确度感测采集腔室内的体积。

在仅作为示例提供的特定实施方式中，采集腔室20为刚性腔室的形式，例如，由医用聚碳酸酯制造的腔室，包含由网格尺寸为265微米（参看图5）的医用聚酯制造的大致为圆锥形的前置过滤器28。刚性的组织采集容器的尺寸可以为大约8英寸高并且直径大约为5英寸；壁厚可以为大约0.125英寸。圆筒的内部可以通过以下口进入：例如，一个或多个用于抽吸管道的口，一个或多个具有用于通过无菌对接技术连接的管道的口，和/或一个或多个用于针通过橡胶隔片刺穿进入的口。采集腔室20内部的前置过滤器28优选构造为例如在从患者移除组织时，保留脂肪组织并且让非脂肪组织通过。更特定地，在开始获取脂肪组织期间或者在另一个实施方式中在开始获取脂肪组织以后，过滤器28可以允许游离的脂质、血液和盐水通过，而保留脂肪组织的片段。因此，过滤器28包括多个相同或不同尺寸的孔，孔的尺寸在20微米~5毫米的范围内。在优选的实施方式中，过滤器28包括多个400微米的孔。在优选的实施方式中，过滤器28为厚度大约200微米、孔尺寸为大约265微米并且开孔面积为大约47%的医用聚酯网。此材料在漂洗过程中保留组织但是随着组织分解允许细胞通过该网。从而，当组织从患者体内抽出时，可以从脂肪组织分离非脂肪组织。可以用不同的材料、网格尺寸和孔的数量和类型实现相同的功能。例如，小于100微米或数千微米大的网格孔尺寸可以实现相同的目的，即在保留脂肪聚集体和片段的同时允许盐水和血细胞通过。相似地，可以使用替代的刚性塑料材料，或者通过本领域中的普通技术人员所知道的许多其它修饰实现相同的目的。

系统10也可以包括一个或多个溶液源22。溶液源可以包括清洗溶液源23，以及组织分解剂源24，诸如胶原酶。采集腔室20包括允许以无菌的方式将清洗和分解溶液或制剂添加到组织的闭合的流体通道。

用于清洗溶液23和分解剂24的容器可以为任何适合的容器，其能够以无茵的方式保持它们的内容物，例如，可折叠收缩的袋，诸如用于临床设施中的IV袋。这些容器可以具有导管12，诸如导管12e，其连接到采集腔室20，使得清洗溶液和分解剂能够输送到采集腔室20内部。清洗溶液和分解剂可以通过任何本领域认可的方式输送到采集腔室20内部，包括施加到用于盐水23和/或分解剂24的容器外部的简单的重力压力，或者通过在例如图4所示导管12d的导管上放置正排量泵。在自动化的实施方式中，系统的处理设备基于使用者初始输入的信息（例如，处理的组织的体积）来计算不同的参数，例如，盐水的体积和清洗需妥的时间或循环的数量，以及分解剂的浓度或量和分解需要的时间。替代地，量、时间等参数可以由使用者手动操纵。

采集腔室内的组织和/或流体应该保持在30℃到40℃的温度范围内。在优选的实施方式中，采集腔室内的悬浮液的温度保持在37℃。在某些实施方式中，如果外科手术过程或治疗应用需要延迟，可以将选择的组织存储在采集腔室内稍后使用。组织可以存储在室温或大约室温或者存储在大约4℃达到96小时。

清洗溶液可以为本领域中的普通技术人员已知的任何溶液，包括盐水或任何其它含缓冲剂或不含缓冲剂的电解质溶液。处理的组织类型将指示使用的清洗溶液的类型或组合。通常，清洗溶液，诸如盐水，在已经从患者移除脂肪组织并且将脂肪组织放置到采集腔室内以后进入采集腔室20。然而，清洗溶液可以在取出脂肪组织以前输送到采集容器20，或者可以与脂肪组织同时输送到采集腔室20。在采集腔室20中，清洗溶液和取出的脂肪组织可以通过包括下述方法的任何方法混合。

例如，该组织可以通过搅动清洗（其最大化细胞生存能力并且最小化输送的游离的脂质的量）。在一个实施方式中，经由通过不同度的弧（例如，通过大约45度到大约90度的孤）以不同的速度，例如大约每分钟30转，旋转整个采集腔室20来搅动组织。在其它实施方式中，经由通过不同度的孤（例如，通过大约45度到大约90度的弧）以不同的速度，例如大约每分钟30转，旋转整个采集腔室20来搅动组织，其中采集腔室20包括一个或多个刚性接附到采集腔室内表面的桨或突出物。上述采集腔室20的旋转可以通过接附到或接近采集腔室20的驱动机构实现。驱动机构可以为简单的传动带或齿轮或本领域已知的其它驱动机构。旋转的速度可以为例如每分钟30转。通常，发现较高速度产生较大量游离的脂质，因此不是最佳的。

在其它实施方式中，通过将可旋转的轴25放置在采集腔室20内部来搅动组织，其中，可旋转的轴包括一个或多个刚性接附到可旋转的轴25的桨25a或突出物，在旋转轴时，桨25a或突出物通过混合物。在某些实施方式中，具有刚性接附的桨25a的可旋转的轴25可以靠在采集腔室20的底部上。这可以，例如，通过将桨状设备放置到旋转磁场内实现（例如，磁力搅拌器）。替代地，可以使用本领域中已知的简单的搅拌器，即，执行上下摇动而不旋转的设备来实现。也可以使用本领域认可的任何其它方法来清洗组织，包括摇摆、摇动、倒转等等。

在需要的数量的清洗循环以后，可以将组织分解剂输送到采集腔室20，以从剩下的脂肪组织成分分离再生细胞。分解剂可以为本领域中的普通技术人员已知的任何分解剂。可以使用的分解剂包括中性蛋白酶、胶原酶、胰蛋白酶、脂肪酶、透明质酸酶、脱氧核糖核酸酶、Blendzyme酶混合物族成员，例如LiberaseH1、胃蛋白酶、超声或其它物理能量、激光、微波、其它机械设备和/或它们的组合。本发明优选的分解剂为胶原酶。分解剂可以与其它溶液一起添加。例如，盐水，诸如从上述盐水源23输送的盐水，可以与胶原酶同时添加或者紧接着之后添加到脂肪组织。在一个实施方式中，清洗的脂肪组织在37℃或在37℃左右与包含胶原酶的酶溶液混合大约20~60分钟。在其它实施方式中，可以添加更高浓度的胶原酶或相似制剂以减小消化时间。清洗的脂肪组织和组织分解剂可以随后以与上述搅动方法相似的方式搅动，直到清洗的脂肪组织分解。例如，可以经由通过大约90度的弧旋转整个采集腔室，通过具有包含一个或多个桨的轴，该桨在轴旋转时通过溶液和/或通过旋转整个采集腔室，在该采集腔室的内表面上包含桨或突出物，来搅动清洗的脂肪组织和组织分解剂。

根据脂肪来源的细胞的使用目的，脂肪组织可以部分分解或完全分解。例如，在脂肪来源的细胞要与脂肪组织单元结合的实施方式中，需要部分分解获取的脂肪组织，移除部分分解的脂肪组织的一部分，并且随后继续分解剩余在采集腔室中的脂肪组织的剩余部分。替代地，在任何消化以前，可以移除一部分清洗的脂肪组织并且将其搁置在样品容器内。在另一个实施方式中，获取的脂肪组织被部分地分解以在被重新引入回到患者体内以前浓缩细胞。在一个实施方式中，脂肪组织与组织分解剂混合通常小于大约20分钟的一段时间。随后从采集腔室移除部分地分解的组织的一部分，并且可以通过将脂肪组织与组织分解剂再混合40分钟来进一步分解剩余的部分地分解的组织。当脂肪来源的细胞要用作基本上纯的再生细胞群体时，脂肪组织可以被完全分解。

消化以后，允许组织和分解剂溶液沉淀一段足够的时间，以允许溶液能漂浮的部分和不能漂浮的部分在采集腔室内区分。通常，时间在大约15秒到数分钟的范围内，但是在修饰的实施例中，也可以使用其它时间。能漂浮的层包括需要进一步清洗和浓缩的再生细胞。不能漂浮的层包括血液、胶原蛋白、脂质和组织的其它非再生细胞成分。不能漂浮的层必须被移除到废物腔室。

因此，采集腔室20优选为包括在腔室的最下面的位置的出口22，使得血液和组织的其它不能漂浮的部分可以通过一个或多个导管12排出到一个或多个废物容器400采集腔室20通常处于（或者可以放置在）直立的位置，使得出口22定位在采集腔室的底部。排出可以为被动的或主动的。例如，上述不能漂浮的成分可以使用重力、通过施加正或负压力、通过使用泵34或通过使用排出口32排出。在自动化的实施方式中，处理设备可以发信号通知某些阀和/或泵以从采集腔室20排出不能漂浮的层。自动化的实施方式也可以包括传感器29，其能够探测能飘浮的和不能漂浮的液体之间何时达到分界面。自动化的实施方式也可以包括传感器29，例如，光学传感器，其可以能够探测直通采集腔室的导管内流动的流出物的光折射的变化，光折射的适当变化可以标志输出导管内存在能漂浮的层，其指示不能漂浮的层已经被排出。传感器29能够随后发信号通知处理设备继续下一个步骤。

然而，在某些实施方式中，组织可以被处理以取回组织的非再生细胞成分。例如，在某些治疗的或研究的应用中，可能需要胶原质、蛋白质、基质或基质的成分、脂质、脂肪细胞或组织的其它成分。在这样的实施方式中，包括再生细胞的能漂浮的层必须如上述般被移除到废物腔室。不能漂浮的层随后保留在系统中以根据需要用于进一步处理。

一旦移除不能漂浮的层，包括再生细胞的能漂浮的层可以被清洗一次或多次以移除残余的污染物。因此，采集腔室20通常包括用于允许清洗溶液被输送到腔室内部的一个或多个口（port）21，以及用于允许废物和其它材料被引导出采集腔室20的一个或多个口22。例如，采集腔室可以包括一个或多个如在这里描述的密封的进入口。采集腔室20还可以包括一个或多个帽（未示出），诸如顶部帽和底部帽，以进一步确保在清洗溶液被输送到采集腔室内和/或废物被传送出采集腔室的同时系统保持无菌。口21可以提供在采集腔室的帽上或者在采集腔室的侧壁上。

可以重复使用新的清洗溶液的清洗过程，直到溶液内的不能漂的污染物的残余量达到预先确定的水平。换句话说，采集腔室20内剩余的材料，其包括上述混合物的能漂浮的材料，包括脂肪组织片段，可以被额外清洗一次或多次，直到不需要的材料的量减小到需要的预先确定的水平。一种确定清洗的终点的方法为测量组织溶液内红细胞的量。这能够通过测量在540纳米波长吸收光来实现。在优选的实施方式中，认为大约0.546~大约0.842之间的范围是可以接受的。

在清洗和/或分解期间，一种或多种添加剂可以根据需要添加到不同的容器以增强结果。一些添加剂的例子包括优化清洗和分解的制剂、增强处理期间活性的细胞群体的生存能力的添加剂、抗微生物剂（例如抗生素）、溶解脂肪细胞和/或红细胞的添加剂、或富集所期望细胞群体的添加剂（通过有差别地粘附到回相部分或另外促进细胞群体的相当大的减少或者富集）。其它可能的添加剂包括那些促进再生细胞恢复和生存能力的添加剂（例如，半脱氨酸蛋白酶抑制剂）或那些减小注入或安置中的有害反应的可能性的添加剂（例如，细胞或结缔组织再次分解的抑制剂）。

在足够的沉淀时间以后，所得到的清洗的脂肪组织片段和脂肪分解剂的混合物的不能漂浮的部份将包含再生细胞，例如，干细胞和其它脂肪来源的祖细胞。如在这里讨论的，包含再生细胞的不能漂浮的部份将被传输到处理腔室30，其中，所关心的再生细胞，诸如脂肪来源的干细胞，将从存在于混合物的不能漂浮的部份中的其它细胞和材料分离。在这里，不能漂浮的部份指的是再生细胞组合物并且包括多种不同类型的细胞，包括干细胞、祖细胞、内皮前体细胞、脂肪细胞和其它在这里描述的再生细胞。再生细胞组合物还可以包含一种或多种污染物，诸如存在于脂肪组织片段中的胶原蛋白和其它结缔组织蛋白质和其片段，或来自组织分解过程的残余的胶原酶。

本发明的处理腔室30优选地定位在系统内部，使得再生细胞组合物通过管道12、阀14和泵34以无菌的方式从采集腔室20运动到处理腔室30。处理腔室的尺寸为容纳10毫升~1.2升范围内的组织/流体混合物。在优选的实施方式中，处理腔室的尺寸为容纳800毫升。在某些实施方式中，来自采集腔室20的全部再生细胞组合物被引导到处理腔室30。然而，在其它实施方式中，再生细胞组合物的一部分被引导到处理腔室30，并且另一部分被引导到系统的不同的区域，例如，样品腔室60，以稍后与处理腔室30内处理的细胞重新结合。

处理腔室30可以使用任何能够与被杀菌的生物相容的适合材料制造。在优选的实施方式中，采集腔室30用一次性材料制造，该材料符合在IS010993标准中描述的用于血管内接触的生物相容性要求，例如，可以使用聚碳酸酯、丙烯酸树脂、ABS、乙烯-醋酸乙烯共聚物或苯乙烯丁二烯共聚物（SBC）。在另一个实施方式中，一次性的处理腔室的流体通道为无热原的，处理腔室可以采取塑料袋的形式，诸如那些通常用于在血库中处理血液的塑料袋；或者在其它实施方式中，其可以为刚性结构（图6）。在一个实施方式中，处理腔室30可以与共同拥有的2001年12月7日提出的美国专利申请No.10/316,127和2002年12月20日提出的美国专利申请No.10/325，728中公开的处理腔室相似，这里将这两篇专利申请的内容全文通过参考进行引入。

处理腔室30可以以任何适合于分离和浓缩细胞的方式构造，包括过滤和离心分离和/或它们的组合。在某些实施方式中，来自采集腔室20的再生细胞组合物被引入处理腔室30，此处能够过滤该组合物以分离和/或浓缩特定的再生细胞群体。细胞过滤为将特定的成分和细胞从其它不同的成分或不同类型的细胞分离的方法。例如，本发明的再生细胞组合物包括多种不同类型的细胞，包括干细胞、祖细胞和脂肪细胞以及一种或多种污染物，诸如胶原蛋白，其存在于脂肪组织片段中或来自组织分解过程的残余的胶原酶。存在于处理腔室30中的过滤器36可以允许分离和浓缩再生细胞的特定的亚群体，例如，干细胞或内皮祖细胞等等。

一些与从液体过滤细胞相关的变量包括但不限于，过滤器介质的孔尺寸、孔的几何形状（形状）、过滤器的表面积、过滤的溶液的流动方向、贯穿膜的压力、特定的细胞群体的稀释度、微粒的大小和形状以及细胞大小和细胞生存能力。根据这里的公开物，需要分离或过滤的特定细胞通常为脂肪来源的干细胞。然而，在某些实施方式中，特定的细胞可以包括脂肪来源的祖细胞，诸如单独的内皮前体细胞或内皮前体细胞与干细胞组合。

再生细胞组合物可以被引导通过过滤器组件，诸如过滤器组件36。在某些实施方式中，过滤器组件36包括构造为执行不同的功能并且将再生细胞组合物分离为不同的部分或成分的多个过滤器。例如，过滤器之一可以构造为从再生细胞组合物分离胶原蛋白，过滤器之一可以构造为从再生细胞组合物分离脂肪细胞和/或脂质成分，以及过滤器之一可以构造为从再生细胞组合物分离残余的酶，诸如组织分解剂。在某些实施方式中，过滤器之一能够执行两个功能，诸如从组合物分离胶原蛋白和组织分解剂。多个过滤器通常串联地布置，然而，过滤器的至少一部分也可以并联地布置。图2中示出了过滤器组件36的过滤器的串联布置。图3中示出了过滤器组件36的过滤器的并联布置。

在一个实施方式中，过滤器组件36包括第一过滤器、第二过滤器和第三过滤器。第一过滤器构造为移除存在于再生细胞组合物中的胶原质颗粒。这些胶原蛋白颗粒通常直径大约为0.1微米并且长度能够达到20微米。根据消化能力，胶原蛋白颗粒可以为不同的尺寸。它们也可以是原纤维，意味着它们具有扭曲和旋转。这里描述的任何过滤器可以由聚醚砜、聚醋、聚四氟乙烯、聚丙烯、聚偏氟乙稀、或可能由纤维素构造。过滤胶原蛋白存在两种可能性。一种为试图首先移除较大的颗粒，让细胞通过，这需要例如大约在10微米范围的过滤器。第二种方法为使用较小尺寸的过滤器，诸如4.5微米，目的为很好地消化胶原蛋白，以便捕获细胞，并且让胶原蛋白通过。这需要让细胞从过滤器漂浮退出的装置。还可能实现吸引并且保持胶原蛋白纤维的过滤器。

第二过滤器构造为移除在再生细胞组合物中不能漂浮的游离不成熟脂肪细胞。在一个实施方式中，第二过滤器可以由聚酯构造并且孔尺寸在大约30和大约50微米之间，优选的孔尺寸为大约40微米。虽然称作第二过滤器，这样的设备可以放置在第一而不是第二位置，以促进初始移除较大的细胞和颗粒。第三过滤器构造为移除存在于组合物中的未用过的或残余的胶原酶或其它组织分解剂。在优选的实施方式中，胶原酶可以随着时间的过去而退化。在一个实施方式中，第三过滤器包括多个直径或长度小于1微米的孔。在某些实施方式中，孔的直径可以小于1微米。在其它实施方式中，孔的直径在10千道尔顿和5微米之间。在某些实施方式中，第二过滤器可以构造为将再生细胞群体浓缩到小体积的盐水或其它清洗溶液中，如在这里描述的。当前优选地，仅最终过滤器为空心纤维单元。没有必要任何过滤器必须是空心纤维类型的。在优选的实施方式中，空心纤维单元用于最终过滤器，因为其对在对再生细胞的有害影响最小的情况下移除胶原酶是最有效的。在设备采用现成的物品的实施例中，三个过滤器在分开的壳体中。如果空心纤维单元用于第二过滤器，将第一和第二过滤器结合到一个壳体内是合理的。如采最终过滤器不是空心纤维配置，那么全部三个过滤器能够包在一个壳体内。

过滤器组件36的过滤器可以定位在处理腔室30内或可以提供为从处理腔室30分离的部件。另外，过滤器组件36的过滤器可以提供在多个处理腔室内或者以在管线内的方式提供。在某些实施方式中，导管或管道可以作为一个或多个处理腔室。处理腔室的尺寸可以减小，使得其变成连接过滤器的导管的内部体积。如果组织溶液的体积大小适合，此类型系统将正确地起作用。从而，通过在具有细胞的流体穿过过滤器时容纳该流体，导管可以作为处理腔室。应该注意使得导管的体积最小，使得在起动和运行系统的过程中不会不必要地损失细胞/组织。

参考上述实施方式，包含清洗的细胞和残余的胶原蛋白、脂肪细胞和/或未消化的组织分解剂的再生细胞组合物可以被引导通过第一过滤器，以从该组合物移除胶原颗粒的至少一部分并且优选地移除基本上全部，使得较少优选没有胶原蛋白颗粒存在于过滤的溶液内。包含脂肪细胞和/或未消化的组织分解剂的过滤的再生细胞组合物，可以随后被引导通过第二过滤器，以从过滤的再生细胞组合物移除游离的脂肪细胞的至少一部分并且优选移除基本上全部。随后，包含未消化的组织分解剂的两次过滤的再生细胞组合物，可以被引导通过第二过滤器，诸如如在这里所讨论的空心纤维过滤设备，以从再生细胞组合物移除或减少未消化的组织分解剂。

三次过滤的再生细胞组合物（即在通过第一、第二和第二过滤器后剩余的组合物）可以随后被引导到多个出口，其可以包括包含多个出口的处理腔室30的一部分。这些出口可以用来维持必要的压力，以及通过导管提供到其它容器的连接，其它容器可以包括采集腔室20、输出腔室50和/或废物容器40。

在一个实施方式中，过滤器组件36的过滤器包括空心纤维过滤构件。或者换句话说，过滤器包括用过滤器介质形成的空心管的聚集。可以与公开的系统10一起使用的过滤器介质的示例包括聚砜、聚醚砜或混合的酯材料和类似物。这些过滤器介质的空心纤维或空心管可以包含在过滤器组件36的圆柱形滤筒内。过滤器介质的单独的管或纤维的内直径通常在大约0.1毫米到大约1毫米的范围内，优选的值为大约0.5毫米。适合的圆柱形滤筒的直径和长度将确定可以放置在滤筒内的过滤器介质的单独的管的数量。一个适合的空心纤维过滤器滤筒的示例为切向流过滤器，目录#M-C-050-K（MinntechMinneapolis，Minnesota）。过滤器介质的孔尺寸能够在大约10K道尔顿和大约5微米之间的范围内，优选的孔尺寸为大约0.5微米。

在空心纤维过滤器中，每个空心管的主体具有第一端、第二端和定位在主体内并且在第一端和第二端之间延伸的内腔。每个空心管的主体包括多个孔。孔通常在主体内定向为使得通过使再生细胞组合物流动通过主体的内腔来过滤再生细胞组合物，并且要被过滤的产品切向地通过孔，如图12A所示。换句话说，液体中的较小颗粒相对于通过主体的内腔的流体流动切向地通过孔。当过滤组合物时，具有再生细胞的组合物通过每个空心管的内腔。优选地，组合物的流动与每个空心管的主体的孔成切向。

通过使用切向地流动的流体，与其它过滤技术相比，可以增强干细胞的过滤效率。例如，根据一些过滤技术，过滤器介质的孔以这样的方式布置，使得过滤器定向为垂直于流体的流动，使得过滤器介质阻塞被过滤的流体的通道，如在图12B中所示。在此类型的过滤中，被从例如干细胞的再生细胞组合物中滤出的颗粒倾向于在过滤器的一侧积累并且阻塞流体通过孔的流动。此阻塞可以减小过滤器的效率。另外，细胞被流体流的压力以及积累在过滤器的上游侧的细胞的重量不断地压缩。这能够导致增加干细胞溶解。从而，在这样的流体的流动与过滤器内的孔的方位平行的过滤技术中，在流体通过孔时，大细胞和小颗粒都可能被不合需要地引导靠着过滤器介质。从而，诸如细胞的液体内的较大的产品可能阻塞孔，从而降低过滤效果并且增加细胞破裂或伤害的发生。

相反，在当前系统10的空心纤维构造中，被过滤的流体在空心管的内腔内流动。能够通过过滤器的主体的孔的流体的部分借助于在主体的内侧上的流体的正压力以及施加在主体的外侧上的负压力通过过滤器的主体的孔。在此实施例中，细胞通常不遭受流体流的压力或其它细胞的重量，并且因此，减小了在干细胞上的剪切力。从而，能够通过减小阻塞率和减小再生细胞溶解增强过滤的效率和效果。由于盐水和不需要的蛋白质分子的尺寸，在过滤期间，这些分子和其它小成分通过空心管的主体的孔到达空心管外部，并且被引导到废物容器40。在一个实施方式中，通过在空心管过滤器介质的外侧产生真空来自增强过滤。由于再生细胞例如干细胞或祖细胞的尺寸，这些细胞通常不能通过主体的孔，并且因此保留在空心管过滤器的内侧上（例如，在管的内腔内），并且通过在过滤器和处理腔室之间的导管被引导回到处理腔室30，或者到输出腔室50。

在一个特定的实施方式中，空心纤维过滤器的孔尺寸为大约0.05微米，并且包含大约550平方厘米的过滤器介质表面积。单独的介质管的直径通常为大约0.5毫米。在处理130毫升再生细胞组合物中，大约120毫升附加的盐水可以添加到组合物。处理或过滤器时间可以为大约8分钟。空心纤维管的主体任一侧上的压力差异（例如，主体内腔内的压力和主体外部）认为是贯穿膜的压力。贯穿膜的压力可以在大约1毫米汞柱到大约500毫米汞柱的范围内，优选为大约200毫米汞柱。使用空心纤维过滤的平均有核细胞恢复和生存能力可以为大约生存的细胞的80%。

在这样的系统中通常被移除的胶原酶的量等于减少了1000倍。例如，如果从采集腔室传输到处理腔室的再生细胞组合物中的胶原酶的初始浓度为0.078U/ml，最终的再生细胞组合物中的胶原酶浓度将为0.00078U/ml。胶原酶在空心纤维过滤器中被移除，并且空心纤维过滤器对应上述第二过滤器。

说明了一种或多种上述细胞过滤方法的处理腔室在图中示出，特别是图1~3。参考图1~3，在处理腔室30和过滤器组件36的过滤腔室之间，可以提供泵，诸如泵34。另外，排出口和压力传感器，诸如排出口32和压力传感器39，可以和处理腔室30和过滤器组件36共管线提供。也可以提供用于输出腔室50的配件。这些可选的部件（例如，泵34、排出口32、压力传感器39，以及用于输出腔室50的配件）可以提供在处理腔室30和过滤器组件36之间，使得容纳在处理腔室30内的液体可以在流动通过过滤器组件36以前流到这些可选的部件中的一个或多个。例如，液体可以在通到过滤器组件36以前流动通过泵34。或者，液体可以在通过过滤器组件以前通过压力传感器39，以在系统内获得过滤器前的液体压力。在某些情况中，一种或多种这样的部件也可以提供为处理腔室30的元件，诸如图6中所示的排出口32。在示出的实施方式中，压力传感器39在管线内，以在再生细胞组合物进入过滤器组件36的过滤腔室时确定由泵34产生的再生细胞组合物的压力。此构造能够促进监测穿过过滤器膜的贯穿膜的压力。附加的盐水或其它缓冲和清洗溶液可以添加到再生细胞组合物，以当该组合物通过过滤器组件36被过滤时，帮助移除不需要的蛋白质。此重复的清洗能够被执行多次以增强再生细胞的纯度。在某些实施例中，盐水能够在任何认为有必要的步骤添加，以增强过滤。

在一个作为示例提供并且不是限制性的特定的实施方式中，以接下来的方式移除不需要的蛋白质和盐水或其它清洗溶液。具有再生细胞，以及胶原蛋白和结缔组织颗粒或片段、脂肪细胞和胶原酶的组合物，被循环通过一系列过滤器，直到达到最小的体积。该最小的体积为系统的总滞留体积和一些预先确定的常数的函数。滞留体积为如果全部处理腔室是空的，包含在管道和导管中的液体的体积。在一个实施例中，最小的体积为15毫升。当达到最小的体积时，将预先确定量的清洗溶液引入系统以与再生细胞组合物混合。此清洗溶液和再生细胞组合物的混合物随后被循环通过过滤器，直到再次达到最小体积。此循环可以重复多次以提高再生细胞的纯度，或者换句话说，增加组合物中的再生细胞对组合物中的其它材料的比率。参看图10和图11。

在已经确定已经从再生细胞组合物清除了不需要的蛋白质并且充分地浓缩（在示例性的实施方式中，可以使用的最小浓度在大约1x10⁵到大约1x10⁷细胞/毫升的范围内并且，在优选的实施方式中最小浓度可以为大约1x10⁷细胞/毫升）以后，输出腔室50，诸如输出袋，可以根据特定的实施方式连接到处理腔室30和/或过滤器组件36的出口。诸如排出口32的排出口可以随后打开以促进浓缩的再生细胞输出。在一个实施方式中，在已经运行实验以后，根据经验确定何时到达最小浓度，并且编程序到设备的电子控制器内。该确定可以为需要出产什么，即需要多少干/祖细胞，或者细胞浓度的范围的过程的输入。基于科学的数据，预定量的脂肪组织需要被获得并且放置到系统内以获得需要的输出。通过排出口32打开，诸如泵34的泵可以工作以将浓缩的再生细胞传输到输出袋内。在一个实施方式中，输出袋50与具有在一端具有配件的管的空的血袋相似。输出袋上的配件可以以无菌的方式接附到出口，并且浓缩的再生细胞可以被传输到输出袋。

如图1到图3所示，可以在系统10中提供真空泵26以改变系统内的压力和其它参数。例如，真空泵26可以通过诸如导管12b的导管连接到采集腔室20，以导致采集腔室20内的压力降低。真空泵26也可以通过诸如导管12g的导管连接到处理腔室30。考虑到真空泵26连同泵34的操作，可以实施两个分开的真空泵或源，或者，通过使用将真空拉力引导到在过程的特定点需要真空拉力的不同的导管的阀，可以实施单独的真空泵或源。另外，真空泵26可以通过诸如导管12f的导管连接到废物容器40。

参考图10和图11，通过真空泵26产生的压力可以用于引导包括再生细胞的流体流动通过导管12。此压力可以以多个方向施加，例如，通过自动地或手动地控制系统10中的一个或多个阀14的位置。可以通过使用正压力或负压力或它们的组合来使得系统10正确地发挥作用。例如，再生细胞可以被拉动通过上述第一和第二过滤器进入连接到第三过滤器的软侧的容器。软侧容器可以连接在第三过滤器前面的管线内（串联）。最终输出腔室可以为软侧的容器，其在第三过滤器的另一侧（例如，下游侧）。在此实施方式中，使用压力将再生细胞从一个软侧容器通过过滤器运动到第二软侧容器。

在系统10的另一个实施方式中，可以使用渗滤过滤和沉淀结合来实现对干细胞和/或源自脂肪的祖细胞的过滤，例如，这样的系统使用盐水，将该盐水通过组织再生细胞组合物（例如，包含干细胞和/或源自脂肪的祖细胞的组合物）并且随后通过过滤器。与从再生细胞组合物渗滤过滤细胞有关的变量的一些包括但不限于，过滤器介质的孔尺寸、孔几何形状或形状、过滤器的表面积、被过滤的再生细胞组合物的流动方向、注入的盐水的流速、贯穿膜的压力、细胞群体的稀释度、细胞尺寸和生存能力。

在系统10的一个实施方式中，处理腔室30使用过滤器组件36，其执行渗滤过滤和沉淀以分离和浓缩再生细胞。示例性的而不是限制性的，处理腔室30限定为如图6所示的大致上圆筒形的主体，具有侧壁30a、顶部表面30b和底部表面30C。在顶部表面30b内提供了无菌的排出口32。

在图6所示的实施方式中，处理腔室30示出为包括过滤器组件36，过滤器组件36包括两个过滤器，诸如大孔过滤器36a和小孔过滤器36b。过滤器36a和36b的孔尺寸通常在大约0.05微米和大约10微米的范围内。大孔过滤器36a可以包括直径为大约5微米的孔，并且小孔过滤器36b可以包括直径为大约1到3微米的孔。在一个实施方式中，过滤器的表面积为大约785平方毫米。过滤器36a和36b划分处理腔室30的内部以包括第一腔室37a、第二腔室37b和第三腔室37c。如图6所示，第一腔室37a定位在第二腔室37b和第二腔室37c之间。另外，第一腔室37a示出为具有入口31a和出口31b的处理腔室30的区域。示出的处理腔室30包括多个提供从处理腔室30的外部到处理腔室30的内部的连通通道的口，诸如口31a、31b和31c。口31a、31b和31c示出为设置在处理腔室30的主体的侧壁30a内。然而，口31a、31b和31c也可以定位在其它区域内。口31a示出为样品入口，其构造为连接到导管，使得包含再生细胞的组合物可以进入处理腔室30内部。口31b示出为出口，其构造为连接到导管，使得分离并且浓缩的细胞可以从处理腔室30的内部移除。口31c示出为入口，其构造为连接到导管，用于将诸如盐水的新的清洗溶液输送到处理腔室30的内部。

使用中，再生细胞可以通过入口31a引入中央的腔室37a。盐水或其它缓冲剂通过入口31c引入底部腔室37b。可以以大约10毫升/分钟的速率引导盐水通过腔室37a中的再生细胞组合物。盐水的流速为使得其抵消重力。盐水的流动使得腔室内的细胞能够基于细胞的密度分离。通常，当迫使盐水上升通过组合物时，组合物中的较大的细胞将沉淀到中央腔室37a的底部，而较小的细胞和蛋白质将被运走通过第二过滤器36b进入顶部腔室37c。通过调节盐水的流边，使得较大的细胞在允许使较小的颗粒脱离并且用盐水带走的位置滚动，该过滤可以实现。在腔室30中包括无菌的排出口32以确保在处理单元内部的三个腔室内维持正确的压力梯度。上腔室37c可以包括吸收剂介质33。吸收剂介质的目的为捕获溶液中的不合需要的蛋白质，以确保如果例如盐水的流速降低，溶液中的不合需要的蛋白质不会穿过过滤器介质回到处理溶液内。吸收剂介质可以为某种类型的过滤器材料，其为吸收剂、或吸引要被滤出的材料或成分。可以在顶部过滤器上方添加流出口以帮助排出废物。排出废物的另一个实施方式可以为从顶部施加轻度的真空以帮助排出废物。如在示出的实施例中，吸收剂介质可以在流速相对较小时实施。多余的盐水和蛋白质随后被运走到废物容器。

当已经充分地从较小的细胞和蛋白质分离较大的细胞（例如，源自脂肪的干细胞和/或祖细胞）后，如在这里讨论的，可以浓缩包含分离的细胞的组合物。在已经通过出口31b从腔室37a移除组合物以后，或当其在腔室37a中时，该组合物可以被进一步浓缩。在一个实施例中，以接下来的方式增加组合物中的细胞浓度。在细胞已经被充分地分离以后，诸如过滤器36a和36b的过滤器可以朝向彼此运动。此运动的效果为减小两个过滤器之间的体积（例如，腔室37a的体积）。也可以提供与处理腔室30相结合的振动构件，以促进组合物中的细胞浓缩。在一个实施方式中，振动构件可以连接到过滤器36b（例如，小孔过滤器）。振动可以减小细胞被捕获在过滤器内的发生率。组合物体积的减小允许移除多余的盐水作为废物和细胞浓缩为较小的体积。

在另一个实施方式中，以接下来的方式实现对再生细胞的浓缩。在细胞已经被充分地分离以后，可以将再生细胞组合物传输到另一个腔室（未示出），该腔室使用重力来滤出多余的盐水。在优选的实施例中，沉淀可以在渗滤的同时发生。可以通过将组合物引入到孔尺寸从大约10千道尔顿到大约2微米的范围内的过滤器的顶部来实现沉淀。在一个实施方式中，适合的过滤器的孔尺寸为大约1微米。重力将在防止组合物中的细胞流动通过过滤器的同时允许盐水和较小的颗粒通过过滤器。在已经获得对细胞的需要的浓缩以后，并且在已经从过滤器下方移除过滤的较小的颗粒以后，可以搅动再生细胞组合物以从过滤器移除细胞，并且随后将浓缩的再生细胞传输到输出袋。较小的颗粒可以作为废物通过出口排出。

在特定的实施例中，来自采集腔室20的再生细胞组合物被传送到处理腔室30，其中可以离心分离组合物以分离和浓缩再生细胞。离心分离原理在本技术领域中众所周知，因此为了简短，将不在这里重复叙述。这里使用标准的、领域内认可的离心分离设备、部件和参数。用作离心分离设备的一部分的示例性的处理腔室在图7和图8中示出。通常，离心分离设备导致离心分离腔室（诸如图7中所示的离心分离腔室）围绕轴线旋转，以由此增加作用在溶液中的细胞上的力以使得该力大于重力。溶液中密度较大或较重的材料通常沉淀到离心分离腔室，即图7所示的输出腔室50的一端，以形成再生细胞小团。该小团可以随后重新悬浮以获得具有需要的细胞浓度和/或需要的细胞和介质量的溶液。图7所示的处理腔室构造为使用离心力和重力分离和浓缩细胞。特定地，在离心分离期间，离心力引导再生细胞组合物的密度较大的成分，例如再生细胞，朝向离心分离腔室的最远端。在离心分离腔室慢下来并且最终停止时，重力帮助再生细胞保持在离心分离腔室的最远端并且形成细胞小团。因此，再生细胞组合物的不需要的成分，即废物，可以在不防碍细胞小团的情况下被移除。

在本发明的再一个实施方式中，处理腔室可以包括旋转膜过滤器形式的细胞浓缩器。在离心分离过程的再一个实施方式中，也可以应用离心淘析法。在此实施例中，可以基于个体细胞的沉淀速率分离细胞，使得通过离心分离施加的定向的（例如，向外的）力导致细胞和溶液以不同的速率沉淀。在淘析中，目标细胞群体的沉淀速率与通过在与离心力相反的方向泵送溶液施加的相反的（例如，向内的）流速对抗。调节该逆流使得溶液内的细胞和颗粒分离。淘析已经被应用于许多细胞分离的例子中（Inoue，Carsten等人，1981；Hayner，Braun等人，1984；Noga1999），并且用于优化流动和离心参数的原理和实践可以由本领域中的普通技术人员根据本公开物在这里实施。

图9示出了与根据本发明的淘析实现有关的原理。在使用旋转转子将力施加到溶液的方面，该淘析实施例与离心分离实现相似。与目前具体化的淘析分离有关的一些变量包括但不限于，旋转腔室的尺寸和形状、转子的直径、转子的速度、逆流管道的直径、逆流的流速、以及要从溶液移除的颗粒和细胞的尺寸和密度。如在离心分离中一样，再生细胞可以基于个体细胞密度分离。

在一个实施方式中，再生细胞组合物，例如，包含再生细胞和胶原酶的溶液，被引入如图9.1所示的旋转转子的腔室。在溶液已经添加到腔室以后，以预先确定的流速将附加的盐水添加到腔室。盐水的流速可以作为转子速度、细胞直径和根据经验所设的腔室常数的函数确定。例如使用与IV泵相似的设备来控制流速。附加的盐水的目的为在转子腔室内提供某种状态，在该状态下，较大的颗粒将运动到腔室的一侧并且较小的颗粒将运动到另一侧，如图9.2中所示。调节该流动使得，在此应用中，较小的颗粒将退出腔室并且运动到废物容器，如图9.3中所示。此运动导致转子腔室内的溶液具有基本上均匀的细胞群体，诸如干细胞。在已经确定干细胞已经被从溶液中剩下的物品分离以后（不需要的蛋白质和游离的脂质已经从腔室移除），停止逆流。腔室内的细胞将随后在腔室的外壁上形成浓缩的小团。逆流反转并且细胞小团被传输到输出袋。

如之前在这里阐明的，处理腔室30或输出腔室50可以包括一个或多个口，例如口51或52。一个或多个这些口可以设计为将使用任何上述方法的组合获得的再生细胞或其一部分通过导管传送到其它外科手术设备、细胞培养设备、细胞腌泡设备、基因治疗设备或纯化设备。这些口也可以设计为将再生细胞通过导管传送到系统内另外的腔室或容器或作为用于与上述相同的目的的另一个系统的一部分的腔室或容器。口和导管也可以用于添加一种或多种添加剂，例如，生长因子、重新悬浮流体、细胞培养试剂、细胞扩张试剂、细胞保存试剂或包括将基因传输到细胞的制剂的细胞修改试剂。口和导管也可以用于将再生细胞传送到诸如植入材料（例如，架子或骨片段）以及其它外科手术植入物和设备的其它目标。

还可以通过重构现有系统的一次性用具的相互连接、为现有系统的处理设备重新编程序、通过为现有系统提供不同的或附加的容器和/或腔室、通过将细胞传送到一个或多个附加的系统或设备和/或它们的任何组合，来开始对细胞的进一步处理。例如，系统可以通过任何上述方法重构，使得使用该系统获得的再生细胞可以经历接下来的一种或多种处理：细胞扩张（针对一种或多种再生细胞）和细胞维护（包括细胞片漂洗和介质变化）；次培养；细胞播种；瞬时转染（包括从大量供给播种转染的细胞）；获取（包括酶促、非酶促的获取和通过机械刮削获取）；测量细胞生存能力；细胞平铺（例如，在微量滴定板上，包括从单独的井拾取用于扩张的细胞，将细胞扩张到新的井内）；高吞吐量筛选；细胞治疗应用；基因治疗应用；组织工程应用；治疗的蛋白质应用；病毒疫苗应用；获取再生细胞或上清液用于库存或筛选，测量细胞生长、溶解、培植、感染或引入；产生细胞系（包括杂交瘤细胞）；培养细胞用于渗透性研究；用于RNAi和抗病毒研究的细胞；用于破坏和转基因动物研究的细胞；亲和力纯化作用研究；结构生物学应用；检定开发和蛋白质工程应用。

例如，如果对于特定的应用需要扩张再生细胞群体，可能使用这样的方法，其使用培养条件来优选地扩张该群体，而其它群体由于需要的生长条件缺乏而维持（并且因此通过被生长的选择的细胞稀释而减小）或损失。Sekiya等人已经描述了可以在这点上用于源自骨髓的干细胞的条件（Sekiya等人，2002）。可以将此方法（到组织培养塑料的附着力有差异或没有差异）应用到本发明的再一个实施方式。在此实施方式中，从输出腔室移除最终的再生细胞小团并且将其放置到提供细胞培养部件的第二系统内。这可以采取传统的实验室组织培养培育器或生物反应器类型的设备的形式，诸如Tsao等人在美国专利No.6，001，642中所描述的，或Armstrong等人在美国专利No.6，238，908中所描述的。在替代的实施例中，细胞扩张或细胞培养部件可以添加到现有系统中，例如，添加到输出腔室内，允许脂肪来源的细胞群体短期粘附和/或细胞培养。此替代的实施方式允许将细胞培养和/或细胞扩张部件整合到系统并且不再需要从此系统移除细胞并且将其放置到另一个系统内。

在处理期间，根据需要，可以将一种或多种添加剂添加到不同的腔室或容器或与其一起提供，以增强结果。这些添加剂也可以提供为与现有系统相关或分开的另一个系统的一部分。例如，在某些实施方式中，添加剂在不需要从系统移除再生细胞的情况下添加或提供。在其它实施例中，通过以无菌的方式将包括该添加剂的新的容器或腔室连接到系统的未使用的口内来添加或提供添加剂。在再一个实施方式中，通过未连接到本发明的系统的第二系统或设备添加或提供添加剂。一些添加剂的示例包括如这里所描述的优化清洗和分解的制剂、增强在处理期间活性的细胞群体的生存能力的添加剂、抗微生物剂（例如，抗生素）、溶解脂肪细胞和/或红细胞的添加剂、或富集所关心的细胞群体的添加剂（通过有差别地粘附到固相部分或另外促进细胞群体的相当大的减少或者富集）。

例如，为了获得同源的再生细胞群体，可以使用任何适合的方法来分离并且浓缩特定的再生细胞类型，诸如使用细胞特定的抗体，其识别并且结合存在于例如，干细胞或祖细胞，例如，内皮前体细胞上的抗原。这些包括正向选择（选择目标细胞）、负向选择（选择性地移除不需要的细胞）、或它们的结合。诸如酶的细胞内的标记也可以用于使用当与特定的酶起作用时发荧光的分子的选择。另外，可以将具有选择为允许区别地附着和/或洗脱在最终的细胞小团内的特定的再生细胞群体的附着特性的固相材料插入系统的输出腔室。

此区别附着方法的替代的实施例可以包括使用识别目标的再生细胞和不需要的细胞上区别地表达的表面分子的抗体和/或抗体的组合。基于特定细胞表面标记（或它们的组合）的表达的选择是另一种通常应用的技术，其中抗体被接附（直接地或间接地）到固相支撑结构上（Geiselhart等人，1996；Formanek等人，1998；Graepler等人，1998；Kobari等人，2001；Mohr等人，2001）。

在另一个实施方式中，细胞小团可以被重新悬浮在流体材料上（或下）分层，该流体材料形成为连续的或不连续的密度梯度并且被放置在离心机内以基于细胞密度分离细胞群体。在相似的实施例中，也可以使用连续流动方法，诸如脱落（Smith1997），和淘析（有或没有逆流）（Lasch等人，2000）（Ito和Shinomiya，2001）。

如在这里讨论的，添加剂的其它示例可以包括附加的生物学的或结构的成分，诸如细胞分化因子、生长促进剂、免疫抑制剂、医疗设备、或它们的任何组合。例如，可以添加其它细胞（例如，心球样细胞（cardiosphere））、组织（例如，心脏组织）、组织片段、诸如VEGF的生长因子和其它已知的血管生成的或动脉生成的生长因子、生物活性或惰性化合物（如cardiogenol C）、可再吸收的支架、或其它倾向于增强再生细胞群体的输送、功效、可容许性、或功能的添加剂。

再生细胞群体也可以通过插入DNA（例如编码Id蛋白质、WNT家族蛋白、如RXR家族蛋白和gp130的信号蛋白和/或如IGF-1的生长因子，）或通过以改变、增强、或补充再生细胞的功能以实现结构的或治疗的目的的方式放置到细胞培养系统（如在这里所述或本领域内已知的）内来修饰。例如，基因工程可以用于定制再生细胞的基本速率（pacing rate），其再输注到患者内之前分化成心肌细胞或心肌细胞样细胞以确保最佳心跳速率（beating rate）。

本领域中的普通技术人员已知用于干细胞的基因转移技术，如在（Morizono等人，2003；Mosca等人，2000）中公开的，并且可以包括病毒转染技术，并且更特定地，腺相关的病毒基因转移技术，如在（Walther和Stein，2000）和（Athanasopoulos等人，1998）中公开的。也可以执行非基于病毒的技术，如在（Muramatsu等人，1998）中公开的。可以添加编码一个或多个细胞分化因子，例如，生长因子或细胞活素，的基因。不同的细胞分化剂的示例在（Gimble等人，1995；Lennon等人，1995；Majumdar等人，1998；Caplan和Goldberg，1999；Ohgushi和Caplan，1999；Pittenger等人，1999；Caplan和Bruder，2001；Fukuda，2001；Worster等人，2001；Zuk等人，2001）中公开。也可以添加编码抗凋亡因子或制剂的基因。基因（或基因的组合）的添加可以通过本领域中已知的任何技术，包括但不限于腺病毒转导、”基因枪”、脂质体介导的转导和逆转录病毒或慢病毒介导的转导、质粒、腺相关的病毒。这些再生细胞可以随后与载有能够随着时间的过去，将基因释放和/或提供给细胞的基因输送媒介物的载体材料一起植入，使得转导可以继续或在原位开始。

当包含细胞和/或包含细胞的组织所给药的患者不是获得该细胞和/或组织的患者时，可以给予接受该细胞和/或组织的患者一种或多种免疫抑制剂，以减小并且优选地防止移植的排斥反应。如在这里使用的，术语“免疫抑制药品或制剂”倾向于包括抑制或防碍正常的免疫功能的药剂。这里公开的方法适合的免疫抑制剂的示例包括抑制T细胞/B细胞协同剌激通道的制剂，诸如防碍T细胞和B细胞通过CTLA4和B7通道连结的制剂，如在美国专利No.20020182211中所公开的。优选的免疫抑制剂为环抱霉素A。其它示例包括myophenylatemofetil、雷伯霉素和抗胸腺细胞球蛋白。在一个实施方式中，免疫抑制药品与至少一种其它治疗试剂一起给药，免疫抑制药品以与给药的路线相容的自己方给药，并且给药受试者足够的剂量以得到理想的治疗效果。在另一个实施方式中，免疫抑制药品瞬时地给药足够的时间以导致对本发明的再生细胞的耐受性。

在这些实施方式中，再生细胞可以通过本领域中认可的任何方式接触、结合、混合或添加到添加剂，包括诸如搅动设备的设备和在这里描述的相关方法。例如，可以使用摇动、倒转、压缩脉冲或运动的转子。

在另一个方面，细胞群体可以被放置在受体内并且被可重新吸收的塑料护套或其它材料和诸如那些由MacroPoreBiosurgery公司制造的相关联的部件（参看例如，美国专利No.6,269,716；5,919,234；6,673,362；6,635,064；6,653,146；6,391,059；6,343,531；6,280,473）围绕。

在所有前述实施方式中，分离并且浓缩的再生细胞的至少一部分可以被低温贮藏，如在2002年9月12日提出的题目为“PRESERVATION OF NONEMBRYONIC CELLS FROM NON HEMATOPOIETIC TISSUES”的美国专利申请No.10/242，094中所描述的，其要求2001年9月14日提出的美国临时专利申请60/322，070的优先权，其已经共同转让，并且其内容在这里通过参考全文清楚地加入。

在处理的结尾，可以手动地从输出腔室取回再生细胞。该细胞可以被装载到诸如注射器的输送设备中，用于通过皮下的、肌肉内的或其它允许将细胞输送到患者体内的目标位置的技术将该细胞放置到受体内。换句话说，可以通过本领域中的普通技术人员已知的任何方式将细胞放置到患者体内。优选的实施方式包括通过针或导液管放置，或者通过直接外科手术植入。在其它实施方式中，细胞可以自动地传送到输出腔室，其形式可以为容器、注射器或导液管等等，其可以用于将细胞放置在患者体内。该容器也可以用于存储细胞，用于稍后使用或用于低温贮藏。所有取回方法以无菌的方式执行。在外科手术植入的实施方式中，细胞可以与诸如在这里描述的预形成的基质或架子的添加剂联合施加。

在本发明的优选的实施方式中（例如，图4中所示的实施例），系统是自动的。在另一个实施方式中，系统具有自动部件，和手动部件。系统可以包括一个或多个连接到或安装在可重复使用的硬件部件或模块上的一次性部件。本发明的自动的系统提供屏幕显示（参看图16），其促使正确地操作该系统。自动的系统也可以提供屏幕，其提供过程的状态和/或逐步的说明，以正确地设置系统的一次性部件。屏幕也可以指示系统内发生的问题或故障，如果它们发生的话，并且如果适当的话提供”排除故障”指导。在一个实施方式中，屏幕为使用者接口屏幕，其允许使用者通过例如触摸屏将参数输入系统。

部分和完全自动的系统可以包括处理设备（例如，微处理器或个人计算机）和提供用于系统基于使用者输入操作和自动化过程的一个或多个步骤的控制逻辑的相关的软件程序。在某些实施方式中，系统的一种或多种情况可以为使用者能够通过驻留在处理设备中的软件编程序的。处理设备可以具有一个或多个在只读存储器（ROM）中的预编程序的软件程序。例如，处理设备可以具有定制为用于处理血液的预编程序的软件，用于处理脂肪组织以获得小体积的再生细胞的另一个程序，并且用于处理脂肪组织以获得较大体积的再生细胞的另一个程序。处理设备也可以具有预编程序的软件，其向使用者提供适当的参数以基于使用者输入的有关信息优化过程，使用者输入的有关信息诸如，需要的再生细胞的量，处理的组织类型，需要的处理后操纵的类型，治疗应用的类型等等。

软件还可以允许步骤自动化，诸如通过控制系统的泵和阀，控制流体和组织沿特定的管道通道进入和外出；控制触发的适当的顺序和/或方向；用压力传感器探测阻塞；混合机构，使用测量体积的机构测量要沿特定的通道运动的组织和/或流体的量；使用加热控制设备维持不同部件的温度；并且整合分离和浓缩过程与定时和软件机构。处理设备也可以基于处理的组织类型和/或获取的细胞群体或子群体，和要执行的过程的类型（例如，使用再生细胞增加的脂肪组织的组织增强，或用于使用再生细胞涂覆的骨移植物来修复骨的应用的细胞的处理），来控制离心机速度。处理设备还可以包括标准并行或串行口或其它用于与其它计算机或网络通信的装置。因此，处理设备可以为独立单元或者联合用于在这里描述的其它处理方法的一种或多种附加的设备。

软件可以允许自动采集”运行数据”，包括例如，一次性的部件的批号、温度和体积测量结果、组织体积和细胞数量参数、施加的酶的剂量、培育时间、操作者身份、数据和时间、患者身份等等。在设备的优选的实施方式中，可以整合诸如条形码读取系统的字符识别系统，以允许这些变量（例如一次性的用具批号和有效期，胶原酶的批号和有效期，患者/样品标识符等等）数据输入处理设备作为处理文件的一部分。这将减小数据输入错误的可能性。可以使用USB或本领域中已知的其它接口端口和系统容易地将这样的条形码读取系统加入处理设备。这样，设备可以提供整合控制过程的数据输入和文件。这些参数的打印出的报告将作为该系统的编程序的操作的使用者定义的参数的一部分。自然，这需要整合打印机部件（硬件和驱动程序），或软件中的打印机驱动程序加上在设备的硬件中用于打印机的接口输出连接器（例如，USB口）。

在某些实施方式中，系统为完全自动的系统。例如，使用者可以初始地选择要处理的组织的量，将系统接附到患者并且系统可以自动地抽吸需要的组织并且在不需要使用者进一步输入的情况下以连续的顺序分离并且浓缩再生细胞。使用者也可以输入需要的再生细胞的量并且允许系统抽吸需要的量的组织并且处理该组织。完全自动的系统还包括能够基于数个（例如，两个或更多）使用者的输入参数，例如，清洗循环的数量，离心分离速度等等重新配置的系统。系统也可以以半自动方式运行，期间系统在不需要使用者干涉的情况下经过某些步骤，但是在某些过程能够发生以前需要使用者干涉。在其它实施方式中，系统为单一的整合的系统，其显示说明以引导使用者在预先确定的时间执行预先确定的操作。例如，处理设备可以提示使用者适当地插入管道、腔室和系统的其它部件所必需的步骤。因此，使用者能够确保执行操作的顺序正确。这样的系统可能附加地需要使用者确认每个操作步骤以防止在过程中无意地触发或中止步骤。在再一个实施方式中，系统可以开始自动地测试以确保正确地插入管道、腔室、没有阻塞等等。在再一个实施方式中，本发明的系统能够编程序以通过自动控制组织流动通过系统，执行多个分离和浓缩过程。此特征可以是重要的，例如，在对患者的外科手术期间，其中否则可能损失的组织被采集到系统内，并且来自组织的再生细胞分离并且浓缩并且将其返回患者体内。

如上所述，系统的部件可以是一次性的（在这里称作“一次性用具”），使得系统的部分可以在单次使用后除掉。此实现可以帮助确保与患者的组织接触的任何表面将在使用后适当地除掉。图13示出了示例性的一次性用具。在优选的实施方式中，系统的一次性部件被预先杀菌并且封装，以便能够“现贷供应”地使用，其容易使用并且容易装载并且其消除了对许多管道连接和复杂的管道连接路线的需要。这样的一次性部件的制造相对便宜，并且因此，不由于它们的废弃导致较大的费用。在一个实施方式中，一次性的系统（在这里可交换地称作“一次性用具”）包括，基本上包含，或者包含，采集腔室20、处理腔室30、废物腔室40、输出腔室50、过滤器组件36、样品袋60和相关的导管12或管道。在系统的一次性用具的优选的实施方式中，采集腔室20和处理腔室30通过容纳在刚性框内的导管12连接。处理腔室30的旋转密封网络（图7和8）也可以容纳在同一个刚性框内。在另一个优选的实施方式中，一次性用具的不同腔室和容器包括必要的接口，该接口能够与系统的处理设备连通，使得自动化系统的泵、阀、传感器和其它设备在没有使用者干涉的情况下根据需要被适当地触发或停用。该接口还减小了需要设置系统的时间和所需要的专业技术，并且还通过指示如何正确地设置系统并且在设置错误时警告使用者减小了错误。

本发明的大多数一次性用具可以具有许多通用的元件。然而，本领域中的普通技术人员可以理解，系统的不同应用可能需要附加的部件，其可以为一次性用具的一部分。因此，一次性用具还可以包括适合于从患者获得脂肪或其它组织并且将再生细胞返回患者体内的一种或多种针或注射器。包括的针和注射器的类型数和种类将取决于被处理的组织的类型和量。一次性用具还可以包括保持系统中使用的清洗流体和其它处理试剂的一个或多个刚性或柔性的容器。例如，一次性用具可以包括用于保持盐水、酶和过程需要的任何其它处理或置换流体的容器。另外，适合的清洗溶液、重新悬浮流体、添加剂、制剂或移植材料可以与一次性用具一起提供，以与本发明的系统和方法一起使用。

在这里描述的或另外需要用于实施本发明的系统部件、装备或供给源的任何组合可以以成套器具的形式提供。例如，本发明的成套器具可以包括，例如，用于基于注射器的吸脂的最佳长度和规格的针和包含允许处理小体积的组织的优选的过滤器介质的无菌的注射器。在表II和III中列出了可以与本发明一起使用并且可以与本发明的成套器具包括在一起的其它示例性的装备和供给源。

下面的表II列出了能够用于根据本发明的系统和方法获得脂肪来源的再生细胞的供给源的示例：

表II

下面的表III列出了可以与在这里公开的系统和方法一起使用的装备。

表III

系统的可重复使用的部件包括，基本上包含，或者包含用于采集腔室的搅动机构、泵和触发阀和泵控制器的各种各样的传感器、离心机马达、离心机马达的旋转框、使用者接口屏幕和USB口、互锁或对接设备或连接一次性用具使得该一次性用具牢固地接附到并且与可重复使用的硬件部件和其它相关设备接口的构造。图14中示出了示例性的可重复使用的部件。在优选的实施方式中，可重复使用的部件包括用于从再生细胞组合物分离并且浓缩再生细胞的装置，例如旋转离心机。在此实施，例中，可重复使用的部件设计为连接到并且与一次性的用具的处理腔室（包括离心分离腔室）的一部分接口，如图15A所示。可以理解，在可重复使用的部件中的用于分离和浓缩再生细胞的装置不限于旋转离心机，而是还可以包括在这里描述的任何其它构造，包括旋转膜过滤器。可重复使用的部件还可以容纳在这里描述的处理设备，该处理设备包含用于执行数个不同的组织处理过程并且从而选择地触发系统的不同的泵和阀的预编程序的软件。该处理器还可以包括数据存储能力，用于存储捐献人/患者信息、处理或采集信息和其它用于稍后下载或编辑的数据。可重复使用的部件也可以与多种一次性用具一起使用。一次性用具通过例如互锁设备或构造连接到可重复使用的部件，以连接一次性用具使得一次性用具以以下方式牢固地接附到并且与可重复使用的硬件部件接口，即存在于可重复使用的部件上的处理设备能够控制一次性用具的不同部件以及可重复使用的部件的不同部件和其它相关的设备和系统，即向它们发送信息并且接受来自它们的信息。

在一个实施方式中，用于系统中的一次性用具包括采集腔室20，其能够容纳大约800毫升组织；处理腔室30，其能够处理通过采集腔室20内的清洗的并且消化的大约800毫升组织产生的再生细胞组合物；输出腔室50，其能够容纳至少0.5毫升再生细胞；和废物容器40，其能够容纳大约10升废物。在此实施例中，硬件设备不大于24”长×18”宽×36”高。一次性用具以及硬件设备的不同部件的可选择的尺寸可以根据需要构造并且企图非限制性地被本发明包含。

系统的一次性部件容易放置在设备上。图15A中示出了与对应的可重复使用的部件装配在一起使用的一次性用具。系统优选地设计为使得其能够探测不正确地装载的一次性部件。例如，每个一次性用具的部件可以具有颜色引导的标记以正确地对准并且插入管道、腔室等等，进入系统内适当的位置。在另外的实施方式中，在这里公开的系统为便携式单元。例如，该便携式的单元能够从一个执行脂肪组织获取的位置运动到另一个用于脂肪组织获取的位置。在某些实施方式中，该便携式的单元适合于通过患者的床侧获取和处理脂肪组织。从而，便携式的单元可以为能够从一个患者运动到另一个患者的系统的一部分。因此，该便携式单元可以在锁定在某个位置中的轮子上，并且因此能够在整个过程中容易地在方便的地点放置在稳定并且牢固的位置中并且在该位置中使用。在其它实施方式中，便携式单元设计为在诸如桌面的平坦表面上设置和操作。该便携式单元也可以封闭在壳体单元中。该便携式的单元还可以包括吊架、吊钩、标志、标度尺和其它在过程中起辅助作用的设备。全部在这里描述的系统的可重复使用的部件，诸如离心机、处理设备、显示屏幕，可以安装在系统的便携式单元上。

用于获得再生细胞的替代的手动实施例也在本发明的范围内。例如，在一个实施方式中，可以使用在这里描述的系统的部件、装备和/或供给源的任何组合来处理脂肪组织。

本发明的系统的手动实施例可以根据接下来的步骤和信息实施，其提供为示例性的而不是限制性的。第一，从患者采集脂肪组织。组织取回管线或采样位置连接器打开，并且尖头插入600毫升血袋的侧口。大约10毫升脂肪组织通过钝插管采集在10毫升注射器内。用相对锋利的针（14G）替换钝插管。采样位置用碘擦拭用具擦拭，脂肪组织通过采样位置注入600毫升袋。注射器和针随后丢弃在锋利物腔室内。重复这些步骤以将足够的组织放置到袋内。基于患者和应用的临床特性确定不同情况基础的足够的组织。

第二，清洗抽吸的脂肪组织。预加温（37℃）的盐水袋悬挂在工作表面上方。蓝色的止血钳夹子放置在600毫升袋和尖头之间的管道上。夹子闭合以密封该管道。在600毫升袋上的尖头用于进入盐水袋（在此设置中使用600毫升袋上的针来通过橡胶隔片进入盐水袋，在插入针之前用碘擦拭该隔片）。释放蓝色夹子并且允许大约150毫升盐水进入600毫升袋。当需要的量的盐水已经进入600毫升袋以后关闭蓝色夹子。该600毫升袋在大约15秒期间颠倒大约10到15次。第二蓝色夹子施加在从3L废物袋通向尖头的管道。在3升袋上的尖头用于进入600毫升袋。600毫升袋颠倒悬挂在工作表面上方，并且被允许放置大约1分钟。释放通向3升袋的蓝色夹子。允许废物流体流入3升袋。施加蓝色的夹子以在组织进入管道之前停止流动。600毫升袋降低到工作表面。这些步骤再重复两次。如果盐水废物仍然呈现显著的红色，需要第三附加的循环。使用热封机来密封3升废物袋和600毫升袋之间的管道。在管道的大约一半的位置上进行密封。移除并且丢弃3升废物袋。600毫升袋返回工作表面。

第三，消化清洗的脂肪组织。释放在盐水和600毫升袋之间的管道上的蓝色夹子，以允许大约150毫升盐水进入600毫升袋。用碘擦拭用具擦拭600毫升袋上的采样位置。通过采样位置将胶原酶注入600毫升袋。通过在37℃水浴或除了微波的等价物中解冻一个胶原酶小瓶来准备胶原酶。将具有22G针的1毫升注射器插入小瓶，胶原酶被抽入针内。针被移除并且替换为0.2微米过滤器和第二22G针。随后通过0.2微米过滤器和针从注射器排出胶原酶。在0.1到0.2Wunsch单位/毫升的最终胶原酶浓度下执行脂肪组织消化。加热垫放置在振荡器上。在此时间期间，盐水袋在仍然接附的同时被设置到振荡器侧。注意确保通向盐水袋的管道定位为使得当运动时该管道不会被捕获在振荡器上。加热垫控制器设置为37℃。600毫升袋放置在振荡器上。振荡器设直到最大限度。观察袋以确保其稳定，并且允许摇摆大约1小时（55±10分钟）。

第四，取回再生细胞组合物。从振荡器移除袋。将蓝色夹子施加到闭合的原来通向废物袋的管道。使用无菌的连接设备将四边形袋用具（根据接下来的说明预先准备）接附到原来接附到废物袋的管道。四边形包可以看作两个连接的四边形包。确定将其分为两个包的管道，将管道向后折叠到其自身上，并且在折叠的管道上（在两段管道上）滑动金属环。向下滑动环大约0.5英寸，形成在弯曲处的折边作用为密封管道。使用止血钳子来部分地折边环闭合。环没有过紧折边，因为环需要在处理期间移除。600毫升袋颠倒地悬挂在工作表面上方，并且被允许放置大约3分钟。释放在通向四边形用具的管道上的蓝色夹子，以将细胞部分（黄/橙脂肪层下面的层）排出到四边形用具内。注意防止脂肪层进入管道。在此过程期间，可以手动折边管道以在脂肪层靠近管道时减缓流动。随后用蓝色夹子关闭通向四边形袋用具的管道，将600毫升袋返回工作表面，并且悬挂盐水袋。释放盐水和600毫升袋之间管道上的蓝色夹子以允许大约150毫升盐水进入600毫升袋。该600毫升袋在大约15秒期间颠倒大约10到15次。随后将600毫升袋颠倒地悬挂在工作表面上方并且允许其放置大约3到5分钟。释放通向四边形用具的管道上的蓝色夹子，并且细胞部分（黄/橙脂肪层下面的层）排出到四边形用具内。注意防止脂肪层进入管道。例如，在脂肪层靠近管道时，可以通过手动折边管道以减缓流动，用蓝色夹子关闭通向四边形袋用具的管道。随后加热密封从四边形用具通向600毫升袋的管道。随后移除并且丢弃600毫升袋。

第五，清洗再生细胞组合物。将金属夹放置在两个满的袋中间的管道上以密封该管道。将四边形用具放置在夭平上。将水添加到第二“虚”四边形用其以平衡四边形用具。四边形用具和平衡用具放置在离心机的相对叶片上。对于空心的过滤器，细胞被清洗并且放置在袋内，并且管道在袋和上述空心纤维过滤器组件之间密封。使用蠕动泵，流体运行通过过滤器组件，并且在下游端的袋中采集细胞浓缩物。注意确保四边形用具袋没有被压缩并且直立。离心机在400xg运行10分钟。从离心机移除四边形用具并且将其放置在等离子表现物内。注意以这样的方式将袋放置在表现物内，使得袋的顶部的硬管道正好在后板的顶部。如果袋过高，将保留过多盐水，如果袋过低，管道将防碍前板关闭并且再次保留过多盐水。将蓝色夹子施加到从满的四边形用具通向空的四边形用具的每条管线上。移除金属环和蓝色夹子以允许上清液流入空的四边形用具。榨出尽可能多的盐水，但是注意不要移去细胞小团。加热密封进入每个包含上清液的袋内的管道。移除包含上清液的废物袋。将蓝色夹子施加到通向每个包含细胞的四边形用具袋的管道。将袋从等离子体表现物中取出。使用无菌的连接设备将通向四边形包的管道连接到盐水袋。移除通向四边形用具袋之一的蓝色夹子，以允许大约150毫升盐水流入袋，并且随后再次施加夹子以停止盐水流动。随后满的四边形用具袋在大约15秒期间颠倒大约10到15次。随后移除通向空的四边形用具袋的蓝色夹子，并且满袋的全部内容物排入空的袋中。再次施加金属环夹子以密封在两个四边形用具袋之间的管道。随后加热密封管道并且移除盐水袋。随后满的四边形用具袋在大约15秒期间颠倒大约10到15次，将另一个虚四边形用具放置在天平上并且再次与细胞四边形用具平衡。四边形用具袋（一个满，一个空）随后放置到离心机内，使得四边形用具袋没有压缩并且直立。

离心机在大约400xg运行10分钟。随后从离心机移除四边形用具并且将其小心放置在等离子体表现物内，使得袋顶部的硬管道正好在后板的顶部。如果袋过高，将保留过多盐水，如果袋过低，管道将干涉前板关闭并且再次保留过多盐水。移除金属环以将全部上清液从满的袋榨出到空的袋中，注意不要移去再生细胞小团。密封在袋之间的管道，并且移除并且丢弃满的（废物）袋。随后将新的采样位置连接器插入剩余的袋。随后在残余的盐水（如果存在）中重新悬浮细胞小团的细胞，以获得一定浓度的再生细胞。可以通过轻柔操纵袋来执行重新悬浮（例如，挤压和摩擦）。

在图4中示出了体现本发明的系统的特别的示例。图4示出了用于从组织，例如脂肪组织，分离并且浓缩适合于重新注入患者体内的再生细胞的自动化系统和方法。在图4所示的系统的某些实施方式中，系统还包括用于从患者抽吸给定量的组织的自动步骤。图4所示系统包括连接到图14所示系统的可重复使用的部件的图13所示的一次性用具，以获得如图15A所示系统的自动化的实施方式。一次性用具通过例如将一次性用具连接到可重复使用的部件的互锁或对接设备或构造连接到可重复使用的部件，使得一次性用具以以下方式牢固地接附到并且与可重复使用的硬件部件联合，即存在于可重复使用的部件上的处理设备能够控制一次性用具的不同部件以及可重复使用的部件的不同部件和其它相关的设备和系统，并且与它们接口，即向它们发送信息并且接收来自它们的信息。

使用者可以将一次性用具连接到可重复使用的部件，使用使用者接口输入某些参数，例如，采集的组织的体积，将系统接附到患者，并且系统使用预编程序的和/或使用者输入的参数以连续的顺序自动地执行图4中所示的全部步骤。图15B中示出了一个这样的顺序。替代地，使用者可以手动从患者抽吸组织并且将其传送到用于处理，即，分离和浓缩再生细胞的系统。

特定地，如图4所示，可以使用导管12从患者抽出例如脂肪组织并且将脂肪组织引入采集腔室20。图5详细示出了图4中的采集腔室。如图5所示，采集腔室20可以包括使用标准插管促进组织移除的真空管线11。在这点上，使用者可以输入预计引入采集腔室20的组织的体积。组织通过入口21引入采集腔室20，入口21为允许组织、盐水和其它制剂以无菌的方式添加到组织的闭合流体通道的一部分。系统的光学传感器，例如传感器29，可以探测何时使用者输入的体积的组织存在于采集腔室20内。在某些实施方式中，如果存在于采集腔室中的组织少于使用者输入，使用者可以选择开始处理存在于采集腔室20内的体积的组织。在某些实施方式中，一部分从患者移除的组织可以通过使用经由使用使用者接口的使用者输入来触发的泵，例如蠕动泵，通过导管引导到样品腔室60。

传感器29可以发信号通知存在于可重复使用的部件中的处理设备，以触发需要清洗和分解组织的步骤。例如，处理设备可以使用自动阀和泵基于采集的组织的体积引入预先设定的体积的清洗剂。此循环可以在采集腔室内重复，直到光学传感器确定流出的液体足够清澈并且没有不需要的物质。例如，沿从采集腔室出来的导管12b或12d的光学传感器29能够探测到不需要的物质已经被移除，并且能够发信号通知处理设备关闭需要的阀并且初始下一个步骤。

接下来，处理设备可以基于采集的组织的量引入预编程序的量的分解剂。处理设备还可以基于采集的组织的初始体和、或基于使用者输入触发搅动采集腔室内组织预置的一段时间。在图4所示实施方式中，一旦分解剂，例如胶原酶，通过胶原酶源24被添加到采集腔室20，通过处理设备触发采集腔室20中的马达。马达触发可旋转的轴25，其包括磁性搅拌器和桨状设备，其中一个或多个桨25a刚性地接附到放置在采集腔室28前面的过滤器的过滤器笼27。在存在分解剂的情况下，桨搅拌使得再生细胞从组织分离。

允许采集腔室20内的溶液沉淀预置的一段时间。允许溶液的能漂浮的部分升起到溶液的顶部。一旦预置的一段时间过去，通过处理设备触发必要的阀和泵以将不能漂浮的部分移除到废物腔室40。继续传输到废物腔室40内，直到沿从采集腔室出来的导管12b或12d的传感器29能够探测到溶液的能漂浮的部分即将传输到废物腔室30。例如，沿从采集腔室出来的导管12b或12d的传感器29能够探测到不需要的材料已经被移除并且能够发信号通知处理设备关闭需要阀。

此时，溶液的不能漂浮的部分，即再生细胞组合物，被运动到处理腔室30。这通过使用必要的阀和蠕动泵实现。在某些实施方式中，在将再生细胞组合物传输到处理腔室30以前，附加的体积的盐水可以被添加到保留在采集腔室20内的溶液的能漂浮的部分。可以重复另一个清洗循环。在此循环以后，允许溶液沉淀，并且将不能漂浮的部分（其包含再生细胞）传送到处理腔室30，并且能漂浮的部分排出到废物腔室40。使用附加的清洗循环来优化将全部分离的再生细胞传输到处理腔室30。

一旦再生细胞组合物通过导管12被传送到处理腔室30，在浓缩阶段开始以前，组合物可以经受一个或多个附加的清洗步骤。这确保从采集腔室20移除废物和残余的污染物。相似地，在浓缩步骤以后，再生细胞组合物可以经受一个或多个附加的清洗步骤，以移除残余的污染物。不需要的材料可以以相同的方式从处理腔室30移除到废物腔室40，即，通过来自处理设备的信号控制阀和泵，如上所述。

接下来详细描述图4所示的处理腔室30的不同实施方式。图4所示处理腔室30的形式为离心分离腔室。图7和图8中详细示出了图4所示处理腔室。这样的处理腔室30通常包括旋转密封网络30.1，包括外部壳体30.2，一个或多个密封件30.3，一个或多个轴承30.4和用于将处理腔室连接到存在于系统的可重复使用的部件中的离心分离设备的接附位置30.6；一个或多个流体通道30.5，其形式为从旋转密封件延伸出来并且在每端以离心分离腔室为端部的导管，离心分离腔室形式为容纳在框53内的输出腔室50，其中框包括一个或多个口52和一个或多个用于手动重新定位输出腔室50的手柄。

包括旋转密封网络30.1以确保处理腔室的流体通道能够维持在无菌状态。另外，在任何时候可以以无菌的方式进入处理腔室的流体通道（例如，添加制剂或清洗溶液），即使在处理腔室的离心分离腔室旋转时。

图7和图8所示的旋转密封网络30.1包括旋转轴，该旋转轴包括两个或多个轴承30.4、三个或多个唇形密封件30.3和外部壳体30.2。在此实施例中，轴承30.4还包括在这里称作座圈的外部和内部轴（未示出）。这些座圈可以通过精密研磨的球分开。包括轴承的座圈和球优选地用适合于与体液接触的材料制造，或者涂覆有适合于与体液接触的材料。在优选的实施方式中，座圈和球使用例如硅树脂氮化物或氧化锆制造。此外，在此实施例中，三个唇形密封件包括圆形的“U”形通路（未示出）以及圆形弹簧（未示出）。圆形”U”形通路优选地使用柔性材料制造，使得形成与旋转密封网络30.1的旋转轴的防漏连接。另外，唇形密封件优选地以这样的方式定向，使得来自流动通过处理腔室的再生细胞组合物的压力通过增加张力导致密封组件与旋转轴的连接变紧。可以通过一个或多个能够根据需要扩张和/或收缩以便接合旋转密封网络30.1的外部壳体30.2内的凹槽的圆形夹（未示出）将密封件固定在适当的位置。通过或靠近旋转密封网络30.1产生的热量必须被控制以防止通过通道运动的溶液内的细胞溶解。这可以通过，例如，选择硬的材料来构造旋转轴，抛光旋转轴与密封件接触的区域，并且使得旋转轴和密封件之间的接触最小化来实现。

在另一个实施方式中，旋转密封网络30.1包括单一的橡胶密封件30.3和空气垫片（未示出）。此密封件和垫片提供了用于可以破坏系统的无菌性的任何生物物体的曲折的通道。在另一个实施方式中，旋转密封网络30.1包括多个弹簧加载的密封件30.3，其隔离单独的流体通道。密封件30.3由能够被杀菌以及在没有润滑剂的情况下密封旋转轴的材料制造。在另一个实施方式中，旋转密封网络30.1包括一对陶瓷盘（未示出），其形成不同的流体通道并且能够承受系统旋转并且不导致细胞溶解。在另一个实施方式中，流体通道是柔性的并且允许相对于处理腔室缠绕和松开。这通过处理腔室30每旋转两圈让柔性的流体通道旋转一圈实现。这完全消除了旋转密封件的需要。

再生细胞组合物沿流体通道从采集腔室20中泵出，该流体通道通过旋转密封网络30.1的旋转轴线并且随后分成最少两个流体通道30.5，其中每个从处理腔室30的中心轴线向外辐射并且终止于处理腔室30的外部端附近，即，在容纳输出腔室50（图7和图8）的离心分离腔室内。因此，在优选的实施方式中，处理腔室30包括两个或更多如图7和图8所示的输出腔室50。这些输出腔室50定位为使得在处理期间，它们在一个方位30.7，而在取回浓缩的再生细胞期间，它们在另一个方位30.8。例如，在处理期间，输出改变以一个角度倾斜，而在细胞取回期间以另一个角度倾斜。细胞取回角度比处理角度更加垂直。可以通过突出处理腔室30的手柄53手动操纵输出腔室50的两个位置。当输出腔室50在取回方位30.8时，可以使用注射器手动地从输出腔室50取回再生细胞。在另一个实施方式中，流体通道30.5构造为使得其在处理腔室外部分开并且随后连接到处理腔室30的外部端，即，在容纳输出腔室50（未示出）的离心分离腔室内。在此实施例中，可以将大体积的再生细胞组合物和/或添加剂、溶液等等直接传送到离心分离腔室和/或输出腔室。

参考图4以及图7至图9，在采集腔室20和处理腔室30之间，可以提供泵34和一个或多个阀14。在优选的实施方式中，阀14为机电阀。另外，诸如压力传感器29的传感器可以与处理腔室30和采集腔室20关管线提供。阀、泵和传感器与存在于可重复使用的部件（图14）上的处理设备合作使用以自动进行系统的浓缩步骤。

传感器探测离心分离腔室内再生细胞组合物的存在并且通过与系统的处理设备通信来触发离心分离设备。再生细胞组合物随后基于原始采集的组织的量和/或使用者输入遭受预编程序的负载持续预编程序的时间。在某些实施方式中，此步骤可以自动地或通过使用者输入重复。例如，组合物遭受大约重力的400倍的负载持续大约5分钟。输出腔室50构造为使得腔室的外部末端形成用于密集的颗粒和细胞的小贮备处。输出腔室50保持密集的颗粒，其用术语称作“细胞小团”，同时允许通过流体通道，例如，沿旋转密封网络30.1的旋转轴线且从处理腔室30的中心的下部位置行进通过旋转密封网络30.1到达废物容器40的流体通道，移除较轻的上清液。阀14和泵34发信号通知处理设备触发步骤以在不干扰存在于输出腔室50内的细胞小团的情况下，将上清液移除到废物容器40。

使用图4所示系统获得的细胞小团包括本发明的浓缩的再生细胞。在一些实施方式中，在上清液已经被移除并且引导到废物腔室40以后，可以使用流体通道30.5来重新悬浮与附加的溶液和/或其它添加剂离心分离以后形成的细胞小团，以此方式重新悬浮细胞小团允许进一步清洗再生细胞以移除不需要的蛋白质和化合物，以及增加流动到细胞的氧气。所得到的悬浮液可以遭受另一个大约重力的400倍的负载持续另一个大约5分钟。在形成第二细胞小团并且所得到的上清液被移除到废物腔室40以后，可以用盐水或一些其它适合的缓冲溶液以上述方式执行最终清洗。此重复清洗可以执行多次以提高再生细胞溶液的纯度。在某些实施方式中，可以在认为必要的任何步骤添加盐水以增强处理。使用图4所示系统获得的再生细胞的浓度可以根据采集的组织的量、患者年龄、患者体形等因素变化。示例性的产量在表1中提供。

在输出腔室50已经定位在适合于细胞移除的方位以后，随后可以使用适当的注射器以无菌的方式取回存在于输出腔室50内的最终小团。在其它实施，例中，最终小团可以自动移动到输出腔室50内的容器，其可以根据需要被移除和存储或使用。此容器可以为任何适合的形式或尺寸。例如，该容器可以为注射器。在某些实施方式中，输出容器50自身可以被加热密封（自动地或手动地）并且与处理腔室的其它部件隔离，用于随后取回并且在如在这里描述的治疗应用中使用再生细胞，包括重新注入患者体内。在从输出腔室取回以前或在传输到第二系统或设备以后，细胞也可以遭受如这里描述的进一步处理。图14所示的可重复使用的部件构造为使得其能够根据需要被连接到用于进一步处理的一个或多个附加的系统或设备。

正如这里所描述的，基于在实施例中所描述的特性，使用本发明的系统和方法所获的的脂肪来源再生细胞可以用于治疗心血管疾病和紊乱。因此，在本发明的一方面，从供体的脂肪组织提取脂肪组织来源的细胞并将其用于通过文中阐明的一种或多种机制引起对损害或者再生的心肌或者其他心肌组织的治疗益处。在优选实施方式中，从人的脂肪组织提取细胞并将该细胞植入所述人中，从而减小与针对移植物的抗原和/或免疫原应答有关的潜在并发症。通常评价患者以评估心肌损伤或者疾病，这可以通过医生或者其他临床供应者实施一个或多个下面的步骤未完成：患者的健康史、体检、以及客观数据，包括但不限于EKG、血清心脏酶图谱，以及超声波心动描记法。

在一个实施方式中，在患者接受经设计用以减少血液凝固和治疗心肌梗死的任意产品之前进行收获步骤。然而，在某些实施方式中，可以在收获步骤之前让患者接受阿司匹林。此外，一种优选的方法包括在任何试图的血管再形成步骤之前收集脂肪组织。然而，如本领域中技术人员理解的，将预期收集的时间选择不同并且取决于多种因素，包括患者稳定性、患者凝固图谱、供给者的可用性，和质量照顾标准。最后，收集的时间选择将由负责对受侵袭的患者进行护理的开业医生决定。

从患者收集的脂肪组织的体积可以为约0cc到约2000cc在一些实施方式中，高达约3000cc。所除去的脂肪的体积将在患者之间不同并且将取决于许多因素，包括但不限于：年龄、体质、凝血图、血液动力学稳定性、梗死的严重性、共-发病，以及医生的偏好。

细胞可以给药于其中心肌功能受损的任何背景下的患者。这些背景的实方式包括，但不限于，急性心肌梗死（心脏病发作）、充血性心力衰竭（作为治疗或者作为移植的桥接），和冠状动脉旁路移植术手术的补充，等等。可以预先提取细胞并将其以冷冻保存的方式保存或者可以在明确需要时或者接近该时间时提取细胞。如文中讨论的，可以将细胞给药于患者，或者直接应用于受损的组织，或者受损组织附近，而不进一步处理或者按照其他的方法进一步纯化、修饰、剌激或者改变细胞。例如，从患者所得细胞可以给药于需要该细胞的患者而不在将它们给药于该患者前培养所述细胞。在一个实施方式中，将在患者的床边实施脂肪组织的收集。可以用血液动力学监视患者的临床状态。

根据文中公开的本发明，可以在从患者收获脂肪组织后不久将脂肪来源的细胞递送给该患者。例如，可以在处理脂肪组织后将细胞立即给药以得到脂肪来源的干细胞的组合物。在一个实施方式中，递送的优选计时应该在梗死后数小时到数天后发生以利用心脏损伤后存在的神经激素环境。最后，递送的计时将取决于患者可用性和处理脂肪组织所需的处理时间。在另一实施方式中，如果将再次输注于患者的细胞受到如文中讨论的额外的修饰、纯化、刺激或者其他操作，那么递送计时将相对更长。此外，梗死后可以多次给药脂肪来源的细胞。例如，细胞可以在更长的时间内（例如数小时）连续给药，或者可以在更长的时间内多次大剂量注射给药。在某些实施方式中，细胞的最初给药将在梗死后约12小时内给药，如在6小时，或者一次和多次细胞剂量将以12小时间隔给药。

给药于患者的细胞数可以例如与脂肪组织处理后的细胞产率有关。细胞总数的一部分可以保留用于以后使用或者冷藏。此外，所递送的剂量将取决于细胞向患者的递送途径。当使用心外和心内递送系统时，需要较少的细胞，因为这些系统和方法可以提供治疗心血管疾病的最直接的途径。在本发明的一个实施方式中，将要递送到患者的细胞，例如，未纯化的细胞数预计为约5.5X10⁴个细胞。然而，可以以数量级调节该数目以实现所希望的疗效。

细胞可以与添加剂一起应用以增强、控制或者指导预定的疗效。例如，在一个实施方式中，如文中描绘，可以通过抗体介导的阳性和/或阴性细胞选择进一步纯化细胞以富集细胞群体以增加功效、减少发病率，或者促进所述方法的容易性。类似地，细胞可以与生物相容的基质一起应用，所述基质通过支持和/或指导植入细胞的命运而促进体内组织工程化。同样地，可以将细胞基因操作后给药从而它们表达基因产物，认为或预定所述基因产物促进所述细胞提供的治疗应答。操作的实例包括控制（增加或减少）促进血管生成或者脉管发生的因子（例如VEGF）的表达、促进分化成特定细胞谱系的发育基因（例如，MyoD）或者剌激细胞生长和分化的发育基因（例如，bFGF-l）的表达的操作。

还可以将细胞在支架材料上进行细胞培养后植入。从而，使用ADC可以在天然或者合成的基质或支架上合成组织工程化瓣膜、心室补片、心包膜、血管，和其他结构后插入或者植入接受者（Eschenhagen等人，2002；Zimmermann等人，2004；Zimmermann等人，2002；Nerem和Ensley，2004）。实际上，已经阐明了脂肪组织来源的干细胞和祖细胞体外分化成心肌细胞的细胞表达标记（Gaustad等人，2004；Rangappa等人，2003）。

在一个实施方式中，优选将细胞直接给药于目的计划益处的部位。这可以通过直接注射到心脏的外部表面（心外膜）、通过插入适宜的插管通过内表面（心内的）直接注射到心肌、通过动脉或者静脉注射（包括逆行流动机制）或者通本文中公开的或者本领域中公知的其他方法实现。本领域中普通技术人员公知的给药途径包括但不限于，静脉内、冠状动脉内、心内膜心肌、心肌外膜、心室内、后窦或者静脉内。

如上文提到的，通过一些途径可以给药细胞，这些途径包括通过静脉或者动脉注射（包括逆行流动注射）全身性给药或者直接注射到心肌或心室。全身性给药，尤其通过外围静脉通路全身性给药依赖于心脏的天然灌注从而具有最小侵入性和脂肪组织来源的细胞能够靶定损伤部位的优点。细胞可以以单次大剂量进行注射，这可通过缓慢注射或者通过相隔数小时的交错系列应用或者如果细胞经适宜保存，可以相隔数天或者数周交错系列应用。可以通过导管插入术应用细胞以增强细胞通过心脏的首次穿过，该应用还可以通过使用气囊控制心肌血流得到进一步改善。关于外周静脉通路，可以通过导管以单次大剂量或者以多次较小的等分注射细胞。还可以通过心外膜注射将细胞直接应用于心肌。这可以在打开心脏方法（如冠状动脉旁路移植手术）或者放置心室辅助装置的情况下，在直接观察下应用。装备针头的导管可以用于将细胞以心内方式直接递送到心肌，这可以允许直接应用的较小的侵入性方法。

在一个实施方式中，递送途径包括通过标准外周静脉导管、中央静脉导管或者肺动脉导管的静脉内递送。在其他实施方式中，可以通过当前可接受的方法得到的冠状动脉内途径递送细胞。通过位于患者脉管系统内远端和近端气囊的连续充气/放气可以控制细胞的流动，从而产生暂时的无流动区，其促进细胞植入或者细胞治疗作用。在另一实施方式中，可以通过心内（心室的内表面）方法递送细胞，该方法需要使用相容的导管以及能够成像或者检测所计划的靶组织。备选地，可以通过心外膜（心脏的外表面）方法递送细胞。该递送可以通过打开心脏方法时直接观察或者通过需要专门的细胞递送仪器的胸腔镜方法实现。此外，应该按照单独或者与上面鉴别的一种或多种方法联合的下述途径递送细胞：皮下、肌内、舌下、逆行冠状注射、冠状旁路机制、离体膜充氧（ECMO）设备和通过心包窗。

在一个实施方式中，将细胞作为血管内大剂量或者定时注射给药于患者。在另一实施方式中，可以将细胞重悬于人工或者天然培养基或者组织支架中后给药于患者。

给药于患者的细胞剂量将取决于收获的脂肪组织量和供体的身体质量指数（作为可利用的脂肪组织的量度）。也可通过心肌损伤或者退化程度确定所获得组织的量。本发明的范围包括使用多次组织收获的多次治疗或者利用应用间细胞的适宜保存的单次收获的多次治疗。

部分处理的脂肪抽出物在给药于患者前可以保存起来。对于短期保存（少于6小时），可以将细胞在室温或者室温下保存在密闭容器中，容器中补加或者不补加营养溶液。中期保存（小于48小时）优选在2~8℃下的等渗缓冲液（例如，

）容器中进行，所述容器含有防止细胞贴壁的材料或者由防止细胞贴壁的材料组成。长期保存优选通过适宜的冷藏进行并且将细胞保存在促进细胞功能保持的条件下，如2002年9月13日申请的共同拥有和转让的PCT申请号PCTIUS02/29207和2001年9月14日申请的美国临时申请号60/322,070中公开的条件，这里引入所述专利申请的内容作为参考。

按照本发明的一个方面，给药于患者的脂肪组织来源的细胞可以作为生长因子递送载体。例如，通过对细胞进行改造以表达适于减轻与心血管病症或疾病有关的症状的一种或多种生长因子，可以将细胞给药于患者，并且改造以释放一种或多种生长因子。所述释放可以以受控的方式长期释放。因为可以控制释放，所以生长因子以脉冲的或者定期方式释放从而在组织的损伤区域附近生长因子局部升高和/或生长因子的量局部下降。

给药于患者的细胞不仅帮助恢复受损或者不健康组织的功能，而且促进受损组织的修复。

可以在下列场所进行细胞递送但是不限于下列场所：诊所、门诊部、急诊室、医院病房、重病监护室、手术室、导管插入室和放射室。

在一个实施方式中，将通过但不限于下面的临床检测之一证明细胞递送疗法的效果：心脏射血分数增加、心力衰竭率降低、梗死尺寸减小、收缩性的降低（dP/dT）、心室僵硬度的降低（-dP/dT的提高）、相关患病率（肺水肿、肾衰竭、心率不齐和目标血管的血管再生）的降低、运动耐受性的改善或者其他生命质量量度以及死亡率的降低。在该方法后数天到数周时间里，细胞疗法的效果将变得明显。然而，有益效果可以在早至该方法后数小时观察到，并且可以持续数年。

通常在细胞递送之前和期间监视患者。监视方法包括，但不限于：凝血研究、氧饱和、血流动力学监视和心律监视。细胞递送后，患者需要约24小时对副反应进行监视。用于评估所述方法的功能改善的跟踪研究可以包括但不限于：患者功能性能力（例如，用力时呼吸困难、突发性夜间呼吸困难、咽痛）、超声波心动描记法、核灌注研究、磁共振成像、正电子成像术和冠状血管造影术。

如前面提出的，在优选实施方式中，将ADC，即活性脂肪来源的干细胞群体直接给药于患者。换句话说，将活性细胞群体（即干细胞和/或内皮前体细胞）给药于患者而不从系统除去或者在给药于患者前暴露于系统的外部环境。提供密闭的系统减小了给药于患者的材料污染的可能性。从而，在密闭系统中处理脂肪组织提供了相对于现有方法的益处，因为活性细胞群体更可能是无菌的。在这种实施方式中，干细胞和/或内皮前体细胞暴露于外部环境或者从系统除去的唯一时间是细胞被吸入应用装置或者给药于患者时。在一个实施方式中，应用装置可以是密闭系统的部分。从而，用于这些实施方式中的细胞不经处理以用于培养或者冷藏并且可以不经处理而给药于患者，或者可以与其他组织或者细胞混合后给药于患者。

在其他实施方式中，保存至少一部分活性细胞群体以用于以后的植入/灌注。可以将该群体分成一份以上的等分试样或者单位从而干细胞或者内皮前体细胞群体的部分保留用于以后应用而部分立即应用于患者。细胞库中所有或部分细胞中到长期保存也在本发明的范围内，如2002年9月12日申请的发明名称为“保存来自非造血组织的非胚胎细胞”的美国专利申请号10/242，094中公开的，该申请要求普通转让的2001年9月14日申请的美国临时专利申请60/322，070的权利，将这些文献特别并入本文作为参考。处理结束时，可以将浓缩的细胞装入递送装置，如注射器，以通过本领域中普通技术人员已知的任意方法置于接受者中。

活性细胞群体可以单独应用或者与其他细胞、组织、组织碎片、生长因子如VEGF和其他已知的血管生成和动脉生成性生长因子、生物活性或惰性化合物、可以再吸收的塑料支架或者旨在增强群体的递送、功效、耐受性或者功能的其他添加剂联合应用。通过插入DNA或者通过将DNA以这样的方式置于细胞培养物中使得改变、增强或者补充细胞的功能以达到结构或者治疗目的来修饰细胞群体。例如，干细胞的基因转移技术是本领域中技术人员已知的，如（Morizono等人，2003；Mosca等人，2000）中公开的，并可以包括病毒转染技术，更具体地如（Walther和Stein，2000）和（Athanasopoulos等人，2000）中公开的腺相关病毒基因转移技术。还可以如（Muramatsu等人，1998）中公开的实施基于非病毒的技术。

另一方面，细胞可以与编码促进血管生成和/或心肌生成的生长因子的基因结合，所述基因允许细胞在心脏修复或再生期间能够作为它们生长因子的自身来源。还可以应用编码抗凋亡因子的基因或者药物。

在本发明的某些实施方式中，细胞被与一种或者多种细胞分化药物例如细胞因子和生长因子给药给患者。多种细胞分化药物的例子被公开在（Gimble等人，1995；Lennon等人，1995；Majumdar等人，1998；Caplan和Goldberg，1999；Ohgushi和Caplan，1999；Pittenger等人，1999；Caplan和Bruder，2001；Fukuda，2001；Worster等人，200l；Zuk等人，2001）。

通过下面的实施例对本发明进行进一步说明，其不能认为是进一步地限制。所有引用的参考包括本申请中所引用的参考文献，公告的专利，公开的专利和审查中的专利申请都被全部引入作为参考。

实施例

在下面的实施例中所使用的脂肪来源的再生细胞是通过在这里所公开的和/或作为参考在这里所引入的方法获得的。

实施例1：通过ADC表达血管生成生长因子，VEGF

血管内皮生长因子（VEGF）是血管生成的关键调节剂之一（Nagy等人，2003；Folkman，1995）。胎盘生长因子是VEGF家族的另一成员，其在血管生成以及动脉生成侧枝血管应答增加的灌注和剪切力募集和扩增的过程中发挥了相似的作用（Nagy等人，2003；Pipp等人，2003；Scholz，1995）。特别地，将野生型（PlGF+/+）移植到敲除PlGF的小鼠，恢复了从后肢局部缺血快速恢复的能力（Scholz等人，2003）。

考虑到血管生成和动脉生成对血管再形成过程的重要性，使用来自3名供体的细胞用ELISA测定法（R&DSystems，Minneapolis，MN）检查通过脂肪组织来源的再生细胞的PlGF和VEGF的表达。一名供体具有高血糖和II型糖尿病（与微血管和微血管疾病高度相关的疾病，包括冠状动脉病的患者）病史。将来自每个供体的ADC细胞以1,000个细胞/cm²铺于补加10%FCS和5%HS的DMEM/F-12培养基中，并培养到连生（confluent）。取上清样品并分析PlGF和VEGF蛋白质的表达。如图16A和图16B所示，其结果表示本发明的脂肪来源的再生细胞高水平表达VEGF（图16A）和PlGF（图16A）。

在单独的研究中，检测了由来自正常成年小鼠的培养再生细胞所分泌的血管生成相关细胞因子的相对量。将再生细胞培养在含有10%FBS的α-MEM中连生后5天，此时收集细胞培养基，并通过抗体阵列分析进行评估（Mouse Cytokine Antibody Array II（RayBiotech，Inc.））检测到了下列血管生成相关血管内皮生长因子（VEGF）、bFGF、IGF-II、嗜酸性粒细胞趋化因子（Eotaxin）、G-CSF、GM-CSF、IL-12p40/p70、IL-12p70、IL-13、IL-6、IL-9、瘦素（Leptin）、MCP-1、M-CSF、MIG、PF-4、TIMP-1、TIMP-2、TNF-α和血小板生成素（Thrombopoetin）。在至少两只小鼠上对下列血管生成相关生长因子或细胞因子与含有10%FBS的空白对照培养基进行比较评估：血管内皮生长因子（VEGF）、嗜酸性粒细胞趋化因子（Eotaxin）、G-CSF、IL-6、MCP-I和PF-4。

这些数据表明本发明的再生细胞表达宽阵列的血管生成和动脉生成生长因子。这些数据还表明来自正常和糖尿病患者的脂肪组织来源的干细胞和祖细胞都表达血管生成和动脉生成生长因子。这是重要的，因为患有糖尿病的患者具有提高的心血管疾病的风险，并这些数据表明ADC细胞在糖尿病背景中保持它们的血管生成能力。对于糖尿病患者表达于普通患者相同水平的VEGF和PlGF的发现暗示，糖尿病患者可以是通过自身脂肪来源的再生细胞进行血管生成治疗的候选。

实施例2：ADC含有参与血管生成的细胞群体

已知内皮细胞及其前体细胞，内皮祖细胞（EPC）参与血管生成。为了测定是否EPC存在于脂肪来源的再生细胞中，对人脂肪来源的再生细胞检测了EPC细胞表面标记物，例如CD-34。

通过对人皮下脂肪组织进行酶消化分离ADC。将ADC（l00μl）在含有0.2%胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS）中，并与荧光标记的在多能细胞上选择性表达的针对人内皮标记物CD-31（分化的内皮细胞标记物）和CD-34（EPC标记物）以及人ABCG2（ATP结合框转运子）的抗体在4℃下孵育20~30分钟。在清洗之后，在FACSAria Sorter（BecktonDickenson-Immunocytometry）上对细胞进行分析。接着通过FACSDiva软件（BD-Immunocytometry，CA）进行数据获取和分析。结果（未显示）表示来自健康成年人的脂肪来源的再生细胞表达EPC标记物CD-34和ABCG2，但不表达内皮细胞标记物CD-31。在来自具有糖尿病病史的供体的再生细胞中，以相同的出现率检测到了EPC标记物CD-34和ABCG2。

为了确定脂肪来源的干细胞中EPC的出现率，在将再生细胞培养在内皮细胞分化培养基上之后，将再生细胞铺在包被纤连蛋白的平板上并在内皮细胞培养基中培养3天以除去成熟的内皮细胞。除去未贴壁的细胞并再次铺板。14天后，通过用偶联FITC的荆豆（Ulexeuropaeus）凝集素-I（VectorLabs，Burlingame，CA）和Dil-标记的乙酰化LDL（MolecularProbes，Eugene，OR）进行染色鉴定菌落。如图17所示，结果表明EPC出现率为约500EPC/l06ADC细胞。

脂肪组织来源的干细胞和祖细胞群体内EPC的存在表明该群体可以直接参与新血管的发育和增强血管生成和恢复灌注。

实施例3：ADC中血管结构的体外发育

本领域公知的血管生成测定法是这样的一种测定法：其中成纤维细胞的滋养层上生长的内皮细胞发育成CD31-阳性管的复杂网络，这让人想起初生毛细血管网（Donovan等人，2001）。因为脂肪来源的再生细胞含有内皮细胞、EPC和其他间质前体细胞，因此我们检测了在缺少滋养层时，这些再生细胞形成毛细血管样的网络的能力（图18A）。值得注意地，从患有利用给药链脲霉素（STZ）8周而STZ诱导的I型糖尿病的高血糖小鼠得到的再生细胞与正常小鼠形成相似的结构（图18B）。

在后续的研究中，将脂肪来源的再生细胞培养在全培养基中（补充10%FCS的α-MEM）并且没有额外的生长因子。这些再生细胞也形成了毛细血管网。而且，所形成的血管结构被染色成对内皮细胞标记物CD31、CD34、VE-钙调蛋白和血管性血友病因子（von Willebrand factor）/因子VIII呈阳性，而不是全淋巴细胞（pan-lymphocyte）标记物CD45。

为了比较来自年轻小鼠与年龄大的小鼠形成毛细管网络的能力，将来自正常年轻小鼠和年龄大的小鼠（1、12或18个月大）的再生细胞在没有额外生长因子的全培养基（补充10%FCS的α-MEM）中培养2周。在来自所有供体的再生细胞的培养中观察到了同样的毛细血管样网络（未显示）。

前面的数据表明来自正常和糖尿病以及年轻和年长的患者的脂肪来源再生细胞都能够形成与初生毛细血管网形成一致的血管结构。因此，本发明的再生细胞能够被用于治疗血管生成不足。

实施例4：ADC中血管结构的体内发育

如果细胞不发挥体内血管活性，那么体外血管生成潜力尽管有希望，但是仍几乎没有价值。嗤齿动物中关键肢局部缺血的手术诱导，是可以观察到动脉生成（主要应答增加的剪切力的侧枝血管的募集和扩大）和血管生成（应答局部缺血的新血管生成）同时发生过程的公认模型（Schatteman，2000；Scholz，2002；Takahashi，1999）。该模型在免疫缺陷（NOD-SCID）小鼠中开发，所述小鼠中可以观察到人细胞驱动再灌注。具体地，将动物用氯胺酮（ketamine）和甲苯噻嗪（80mg/kg；7.5mg/kg）麻醉并以仰卧位置姿势置于手术台面上。根据下面的描述，为两个后肢测定手术前血流值。将动物用聚烯吡酮磺（betadine）预处理，以常规消毒方式覆盖（drape）并置于循环水浴上。切开单侧1.5cm切口，该切口从后肢的起端到接近膝盖以暴露髂骨动脉，接近其分叉点到深层和表面股动脉。用3-0丝结扎线对脉管系统在下面的部位打结：1）髂骨动脉接近其分叉点，2）深层股动脉起始的远侧，3）接近表面股动脉的分枝处。结扎后，一起除去脉管系统。然后鉴定任何明显侧枝，将其结扎并随后除去。伤口和肌肉层用4-0vicryl线封闭并用5-0vicryl线封闭皮肤。动物手术后用丁丙诺啡（5.0mg/kg）处理并在循环水浴上恢复直到自发斜卧。手术后24小时，将动物通过尾部静脉注射5X10⁶个ADC细胞。NOD-SCID小鼠用人供体细胞注射，包括在一个研究中，用来自糖尿病患者的细胞注射。处理后14天对流动成像。

在这些研究中，ADC治疗的动物表现出肢结构保持的改善（肢挽救；与0/5ADC治疗的动物相比2/3未治疗的小鼠丧失所有较低的后肢结构）和流动恢复的改善（图19）。最显著地，在接受来自糖尿病人供体细胞的NOD-SCID小鼠中，与未治疗动物中10±10%相比，经治疗的动物中第14天流动恢复到50±11%（p<0.05）。到第19天已经发生反弹从而实验肢中灌注大于对照中的灌注（136±37%）。该反应在用从两名正常（非糖尿病）供体得到的细胞观察的范围内（50~90%）。

在类似实验中，在其中可以确定自体细胞转移的效果的免疫活性小鼠（129S小鼠）中，ADC细胞治疗的小鼠在第14天表现出80±12%的流动恢复，相比未治疗的小鼠中为56±4%。

在该模型中，血流的恢复来自侧枝血管的募集和扩大和下肢中的血管生成。这些过程是梗死后心脏中血流恢复的关键。从而，ADC体内刺激这些过程的能力强烈支持ADC细胞应用于心肌梗死的背景中。同样重要的是注意到从糖尿病供体（处于心血管疾病的较高危险下的患者群体的成员）所得的ADC细胞也表现出该活性。

实施例5：增加ADC剂量与提高的移植存活和血管生成有关

自体脂肪组织的移植是整形和重构手术中相对常见的方法{Fulton，1998；Shiffman，200l}。然而，该方法受到如下事实的限制：即转移的脂肪组织碎片没有血管供应，结果，移植物存活取决于新血管形成（Coleman，1995；Eppley等人，1990）。从而，移植的组织以受限的方式代表局部缺血组织。

在Fisher大鼠中进行了研究，其中将脂肪组织碎片移植到外部大腿肌肉上的皮下空间中。将右腿仅用0.2g脂肪组织碎片移植，左腿用0.2g脂肪组织碎片移植，补加三种不同剂量（1.7X10⁵~1.3X10⁶个细胞/移植物；每种剂量三只动物）的脂肪来源的干细胞；这样，对侧腿作为对照。将动物保持1个月，之后对动物实施安乐死并回收移植物，将其称重，福尔马林固定并包埋在石蜡中进行组织学分析。

如图20A中所示，结果表明对照腿中移植组织的最小保持，和经处理腿中移植物重量保持的依赖剂量的增加。此外，移植物的免疫组织化学分析表明脂肪来源的干细胞处理的移植物中大量新血管生成和灌注（图20B，箭头）。这也与脂肪组织形态的保持相关（图20B）。

如上文，ADC细胞促进灌注不足的缺血组织的存活的证明是心血管疾病中临床潜力的重要标志。

实施例6通过ADC的心肌植入

心肌的冷损伤是研究细胞治疗在心肌再生中的作用成熟的手术模型（Marchlinski等人，1987）。为了阐明ADC细胞能够植入受损的心肌并从而移植疤痕形成（胶原沉积和交联），进行B6129SF1/J小鼠中心肌冷损伤。损伤后即刻，通过心室内途径注射从lacZ基因为ROSA26转基因小鼠中收获的一百万（1.0X10⁶）个ADC细胞。用β-半乳糖苷酶染色的受体心脏组织将通过染成蓝色检测供体脂肪来源的再生细胞的存在。在注射后5个时间点处理并收获小鼠心脏：第1天、第7天、第14天、第28天、第84天。如图10中所示，结果证明上面参考的所有时间点梗死的心肌区域中来自供体的脂肪来源的再生细胞的植入。图21表示植入的组织学时间线。

重要的是，在第14天的供体来源的（β-半乳糖苷酶阳性）细胞的免疫组织化学分析表明许多供体来源的细胞表达心肌细胞标记肌球蛋白重链（图22）肌钙蛋白I和nkx2.5。这表明ADC细胞能够归巢到受损心脏的损伤部位并且能够分化成心肌细胞或心肌细胞样细胞。从而，ADC细胞能够补充心脏病发作（心肌梗死）后损失的心肌细胞或心肌细胞样细胞。

为了在物种间扩展这些发现，研究了大鼠阻塞/再灌注心脏模型中供体来源的经处理的脂肪抽出物的植入。在该实验设置中，用7-0聚丙烯纺织纤维（prolene suture）暂时阻塞免疫活性Wistar大鼠的主要冠状动脉（左前降支）并且用小部分硅胶管（silastic tubing）作为动脉上的圈套器（snare）。1小时后，释放阻塞并允许血液再灌注局部缺血的心肌。该模型更接近代表人临床范例中的损伤和修复机理。再灌注后，立即通过心室内途径注射从Rosa26小鼠得到的一百万（1X10⁶）个ADC细胞。注射后1周收获心脏。如图23中所示，结果阐明了供体来源的ADC细胞的植入。

因此，本发明的再生细胞是临床上相关的，并且具有提高灌注和在再生受损心肌的能力。

实施例7：ADC提高大鼠心肌梗死后心脏的功能

急性心肌梗死（AMI）导致缺血心肌，这表示最终导致充血心脏衰竭的事件的负面环境（negative milieu）。使用ADC的细胞心肌成形术具有通过提供再生细胞以替换/修复被缺血损伤的宿主细胞（host cell）而改变这种进程的能力。该实施例描述心肌梗死的小动物模型，并证明在这些动物中通过接受大剂量ADC（a bolus ofADC）而导致的功能改善。

通过将雌性Lewis大鼠（250~300克）中扎住冠状动脉左前降支60分钟诱导心肌梗死。将18只大鼠随机分成两组：（1）ADC处理的（n=10）或者（2）盐水处理的（n=8）。对于ADC处理的动物，在再灌注后15分钟将五百万个ADC引入到左心室腔，接近冠状动脉内导入。在梗死之前以及AMI之后第4周、第8周、第12周进行心回波描记术。完成该研究之后，进行入侵式收缩性检测分析左心室的收缩/舒张。接着在舒张期捕获心脏，并准备进行组织学分析。

在MI后第12周的回声和收缩性分析显示与用盐水处理的大鼠与用ADC处理的大鼠下功能比具有显著提高的喷血分数（Ejection Fraction）（76.0±0.9%比68.3±1.9%，p<0.01，图24）；基线收缩（+dP/dT：5494.46±550.76mmHg比2837.61±301.19mmHg，p<0.05，图25）；基线舒张（-dP/dT：-6326.28±544.61比-2716.49±331.83mmHg，p<0.05，图26）以及重建参数，包括心室隔膜厚度（心脏舒张：1.23±0.03mm比1.50±0.11mm，p<0.05，图27）。ADC处理还防止心室膨胀的进展（心脏收缩，图28）以及后壁厚度（在心脏舒张（图29）和收缩（图30）中）。

实施例8：ADC改善AMI猪模型的功能

正如上面所证明的，ADC能够改善小动物中AMI之后的心脏功能。本研究证明这些功能益处中的一些也在大型动物中被观察到。本研究还证明将ADC血管内输入到冠状动脉左前降支（“LAD”）是安全和可行的。

通过气体封闭中部LAD，在13头幼年猪中诱导了前-尖位心肌梗死。在梗死后48小时，通过右股沟脂肪切除术收集脂肪组织，分离自体同源ADC，将猪随机分成冠脉内灌注盐水（对照）或者远侧灌注到LAD的封闭位置四千万~一亿四千万（平均52x10⁶）个ADC。在梗死前，梗死之后立刻以及梗死后6个月，进行冠状血管造影术、左心室（LV）血管显像术，以及2D心回波描记术。

在之后6个月，所有13头猪（7头接受ADC治疗，6头对照）都存活了，其中在LAD中有TIMI-3冠脉血流量，而没有显著的负面心脏事件。如图31所证明的，在10头猪中通过心回波描记术得到的左心室射血分数（“LVEF”）显著地在细胞灌注组中提高（3.0%±6.0%，平均值±SD），而在对照组中为（-9.0%±5.0％，p=0.01）。通过血管显像术的LVEF（n=12）表示相似的趋势，其值为分别3.7%±5.0%对-2.0%±7.5%（p=0.16）。下面的表IV总结了这些结果。总之，这些数据显示ADC在大型动物中引起心脏功能的显著改善，并且引入ADC是安全的，并有效保持心室收缩功能。

表IV

实施例9：急性心脏损伤的治疗

急性心肌梗死（心脏病发作）导致心肌的局部缺血损伤。通过损伤组织的再灌注和心肌组织的再生可以使组织损伤最小化。（Murry等人，1996；Orlie等人，2001；Orlie等人，2003；Rajnoeh等人，2001；Strauer等人，2002；Assmus等人，2002）。由于例如非脂肪来源疗法，如骨髓收获使用更多数目的非培养的细胞和更纯的细胞至少一种，如本文中公开的，脂肪来源的细胞疗法设法提供相对于非脂肪来源的细胞疗法的再生细胞的更好来源。

一名患者被怀疑患心肌梗死。该患者经历1小时的梗死后被接收。为患者开具脂肪来源的细胞疗法的处方。查看患者的体型寻找适于进行脂肪组织采集的部位。通过下面的至少一种表征收获部位：受到正常解剖结构限制的潜在空间、没有处于损害危险的主要血管或者内脏结构，以及接近的容易性。优选原始收获部位，但是以前的收获部位不妨碍额外的脂肪组织收获。潜在的收获部位包括，但不限于下列：双侧下肢的侧面和中间大腿区、前腹壁血管翳和双侧肋腹区。

患者接受肿胀流体溶液的皮下注射，该溶液含有例如不同标准给药方案中的利多卡因、盐水和肾上腺素的联合。使用解剖刀（例如，11-刀片解剖刀），在患者的右和/或左腿的股内前廉区中产生小穿刺伤口以便横切真皮。将刀片转360度以完成伤口。将钝头插管（例如，14-号插管）插入切口下的皮下脂肪组织平面。该插管连接动力辅助的抽吸装置。通过脂肪组织平面移动插管以破坏结缔组织结构。得到约500cc抽出物。除去脂肪组织后，用标准手术技术实现止血并将伤口缝合。

根据上文中公开的方法处理脂肪抽出物以得到一单位浓缩的脂肪来源的干细胞。备选地，梗死约6小时后，对患者施给药干细胞。基于脂肪抽出物的处理，估计患者接受的最初干细胞剂量为约5.5X10⁴个干细胞~约5.5X10⁵个干细胞。最初给药后患者以12小时间隔接受两次补充剂量。将干细胞通过中央静脉导管给药于患者。为了促进靶区域中的细胞植入，通过位于靶标部位下游的气囊和靶标部位上游的气囊控制干细胞流动以产生低血流或最小血流区。

细胞给药程序后约6小时注意到患者的改善。细胞给药程序后数天观察到患者的进一步改善，这可通过增加的血液体积射血分数、心力衰竭的速度下降、梗死大小的减小、改善的锻炼耐受性和其他生命质量量度来证明。

文中描述的任何特征或者特征的组合都包括在本发明的范围内，条件是任这类组合中包括的特征不相互矛盾，这将从本说明书的上下文，以及本领域中普通技术人员的知识是显而易见的。为了概述本发明，在文中描述本发明的某些方面、优点和新的特征。当然，将理解不必所有这些方面、优点或者特征都在本发明的任意具体实施方式中体现。在下面的详细描述和说明书中本发明的其他优点和方面是显而易见的。

通过实施例提供了上述实施方式，并且本发明不局限于这些实施例。本领域技术人员考虑前面的描述后可以对所公开的实施方式作出多种改变和修改。此外，本领域技术人员考虑、文中的公开将发现其他组合、省略、替换和修饰将是显而易见的。因此，本发明不会受到所公开的实施方式的限制，而是受到所附权利要求书的限定。

上文中已经引用了许多出版物和专利，将每个所引用的出版物和专利完整并入本文作为参考。

等价物

本领域中的普通技术人员可以理解，或能够只是通过例行实验发现在这里描述的本发明的特定实施例的许多等价物。这样的等价物企图被接下来的权利要求书包括。

Claims (13)

1.包含脂肪来源的干细胞的浓缩细胞群体在制备用于心肌梗死后的恢复灌注和减少心肌疤痕形成的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述包含脂肪来源的干细胞的浓缩细胞群体还包含脂肪来源的祖细胞。

3.根据权利要求1所述的应用，其中，制成所述药物用于大剂量给药。

4.根据权利要求1所述的应用，其中，制成所述药物用于多剂量给药。

5.根据权利要求1-4中的任意一项所述的应用，其中，所述药物还包含至少一种血管生成因子。

6.根据权利要求1-5中的任意一项所述的应用，其中，所述药物还包含至少一种动脉生成因子。

7.根据权利要求1-6中的任意一项所述的应用，其中，所述药物还包含一种或者多种免疫抑制药物。

8.根据权利要求1-7中的任意一项所述的应用，其中，制成所述药物用于通过心内膜心肌、心肌外膜、心室内、冠状动脉内、逆行冠状窦、动脉内、心包内或者静脉内给药途径给药。

9.根据权利要求1-8中的任意一项所述的应用，其中，包含脂肪来源的干细胞的浓缩细胞群体被基因转移所修饰。

10.根据权利要求1所述的应用，其中，所述包含脂肪来源的干细胞的浓缩细胞群体还包含添加剂。

11.根据权利要求10所述的应用，其中，所述添加剂选自由生长因子、免疫抑制剂、细胞再分解抑制剂组成的组。

12.根据权利要求1所述的应用，其中，所述包含脂肪来源的干细胞的浓缩细胞群体没有被培养。

13.根据权利要求1所述的应用，其中，所述包含脂肪来源的干细胞的浓缩细胞群体被隔离在设置成维持闭合的无菌的流体/组织通道的系统中。

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