KR101197909B1 - 상처 치유를 촉진하기 위해 재생 세포를 사용하는 방법 - Google Patents

상처 치유를 촉진하기 위해 재생 세포를 사용하는 방법 Download PDF

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Abstract

환자의 상처 치유를 촉진하기 위해 지방 조직에 존재하는 세포가 사용된다. 환자의 처치 방법은 지방 조직을 프로세싱하여 지방 조직으로부터 수득된 농축된 양의 재생 세포를 환자에게 전달하는 것을 포함한다. 환자에게 투여되기 전에 재생 세포가 외부 환경에 노출되지 않도록 밀폐 시스템에서 방법을 실행할 수 있다. 따라서, 바람직한 방법에서, 지방 조직 내에 존재하는 세포가 치료적 이점을 촉진, 야기 또는 지지하는 첨가제와 함께 직접적으로 수용자 내에 배치된다.
Figure R1020077002519
상처 치유, 지방 조직, 재생 세포, 줄기 세포, 밀폐 시스템

Description

상처 치유를 촉진하기 위해 재생 세포를 사용하는 방법{METHODS OF USING REGENERATIVE CELLS TO PROMOTE WOUND HEALING}
관련 출원
본 출원은 미국 가출원 번호 제60/338,856호 (2001년 12월 7일 출원)를 우선권으로 청구한 발명의 영문 명칭이 "SYSTEMS AND METHODS FOR TREATING PATIENTS WITH PROCESSED LIPOASPIRATE CELLS"인 미국 특허 출원 제10/316,127호 (2002년 12월 9일 출원)의 일부 계속 출원이다. 상기 언급된 출원들의 내용은 이러한 거명에 의해 본원에 명백하게 포함된다.
본 발명은 일반적으로 광범위한 조직으로부터 유래된 재생 세포에 관한 것이고, 더욱 특히, 당뇨병, 만성 말초 혈관 질환 및 비만으로부터 생성된 상처 치유를 촉진하는데 사용되는, 지방-유래 재생 세포 (예를 들어, 줄기 및/또는 선조 세포(progenitor cells)), 지방-유래 재생 세포의 사용 방법, 지방-유래 재생 세포를 함유하는 조성물, 및 지방-유래 재생 세포의 제조 및 사용을 위한 시스템에 관한 것이다.
약 5백만명의 미국인이 종종 제한된 혈류로 인한 만성 개방형 궤양을 앓고 있고, 상기의 제한된 혈류는 신체의 자체 치유 프로세스를 느리게 할 수 있다. 정상적으로, 피부에 대한 손상은 궁극적으로는 상처 치유, 즉, 즉 신생진피(neodermis)의 형성 및 재-상피화를 초래하는 복합적인 현상들의 케스케이드가 작동되도록 한다. 이러한 복합적인 현상들의 경로에는 국소적, 영역적 및 전신성 성장 인자, 사이토카인, 뿐만 아니라 중간엽 줄기 세포가 포함되는 세포성 참여인자들 간의 조화로운 상호작용이 포함된다. 그러나, 부적절하고/하거나 불완전한 상처 치유는 삶의 질의 현저한 저하를 비롯한 상당한 개인 질병률을 야기할 수 있다. 궤양은 심각하게 감염되어 괴저성이 될 수 있고, 일부 경우에는 절단을 필요로 한다. 예를 들어, 부적절한 상처 치유로 인한 비외상성 절단의 주요 원인은 당뇨병이다. 미국에는 거의 1600만명의 당뇨병 환자가 있다. 매해 67,000명을 초과하는 당뇨병 환자가 수술적 절단을 받을 필요가 있어서, 장기간의 값비싼 재활을 필요로 한다. 대다수에게, 운동성 및 독립성이 심하게 영향을 받아 삶의 질을 영구적으로 변형시킨다. 극단적으로는, 불량한 상처 치유는 사망의 근본적인 원인으로 작용할 수 있다.
치유하기 어려운 만성 상처가 있는 환자에게는 기본적인 의학적 및 수술적 케어(care)가 필수적이지만, 항상 충분하지는 않다. 상처 치유를 위한 현재의 치료법에는 건강하지 않은 조직의 제거, 성장 인자의 사용, (고압) 산소 처치, 진보된 상처 드레싱(dressing), 항생제 요법, 통성적인 상처 드레싱, 영양 상담, 교육/예방, 수술, 및 물리치료가 포함된다. 예를 들어, PDGF-BB 및 bFGF가 포함되지만 이에 한정되지 않는 단일한 또는 조합된 참여 분자의 조작을 천연적인 상처 치유를 증대시키는데 사용할 수 있다. 또한, 더욱 생리학적인 패턴의 성장 인자 발현을 야기하는 방식으로서의 "조작된(engineered)" 세포 생성물 (Apligraf® 및 Dermagraft®)도 적용할 수 있다. 치유를 자극하는 혈소판-유래 성장 인자인 Regranex와 같은 요법의 실행도 적당한 환자들에서 상처 케어에 이로운 것으로 입증되었다.
재생 세포성 접근법 또한, 상기 기술된 단일 또는 조합 분자 요법과 비교하여 비교적 성공적이었다. 재생 의학은 임상적으로 표적화된 방식으로, 스스로를 무한적으로 재생성시키고 성숙한 분화 세포로 발달되는 줄기 세포 (즉, 신체의 미특화 마스터 세포)의 능력을 이용한다. 그러나, 재생 세포 요법의 광범위한 적용에는 세포 보존 및 과도한 신체외 조작과 관련된 높은 비용 문제가 장애가 되고 있다. 그러나, 줄기 세포 집단은 골수, 피부, 근육, 간 및 뇌 중 1가지 이상에 존재하는 것으로 나타났지만 ([Jiang et al., 2002b]; [Alison, 1998]; [Crosby and Strain, 2001]), 이러한 조직에서의 출현 빈도는 낮다. 예를 들어, 골수 내의 중간엽 줄기 세포의 빈도는 유핵 세포 중에서 1/100,000 내지 1/1,000,000 사이인 것으로 추정된다 ([D'Ippolito et al., 1999]; [Banfi et al., 2001]; [Falla et al., 1993]). 유사하게, 피부로부터의 ASC 추출에는 수 주에 걸친 복잡한 일련의 세포 배양 단계가 수반되고 ([Toma et al., 2001]), 골격 근육-유래 줄기 세포의 임상 적용은 2 내지 3 주의 배양 단계를 필요로 한다 ([Hagege et al., 2003]). 따라서, 이같은 조직들로부터의 줄기 세포를 임의의 제안된 용도에 사용하려면 세포 정제 및 세포 배양의 과정에 의해 세포 갯수, 순도 및 성숙도를 증가시킬 필요 가 있다.
세포 배양 단계가 세포 수, 순도 및 성숙도의 증가를 제공할 수 있지만, 여기에는 비용이 든다. 이러한 비용은 하기 기술적 난점들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 세포 노화로 인한 세포 기능의 상실, 잠재적으로 유용한 비-줄기 세포 집단의 손실, 환자에게의 세포의 잠재적 적용의 지연, 재정 비용의 증가, 및 배양 도중 주위환경 미생물에 의한 세포 오염 위험의 증가. 세포 배양과 관련된 문제들을 피하기 위해, 골수 유래 ASC의 치료적 효과를 시험하는 최근의 연구들은 본질적으로 전체 골수를 사용하였다 ([Horwitz et al., 2001]; [Orlic et al., 2001]; [Stamm et al., 2003]; [Strauer et al., 2002]). 그러나, 임상적 이점은 차선적이었고, 결과는 골수에서 본질적으로 이용가능한 제한된 ASC 용량 및 순도와 거의 확실히 관련되었다.
최근, 지방 조직이 줄기 세포의 공급원인 것으로 나타났다 ([Zuk et al., 2001]; [Zuk et al., 2002]). 지방 조직은 (골수, 피부, 근육, 간 및 뇌와 달리) 낮은 이환율로 비교적 많은 양으로 수확하기가 비교적 용이하다 ([Commons et al., 2001]; [Katz et al., 2001b]). 그러나, 지방 유래 줄기 세포를 수확하기 위한 적절한 방법은 당업계에 없다. 기존의 방법에는 다수의 단점이 있다. 예를 들어, 기존의 방법에는 부분적 또는 완전한 자동화, 부분적 또는 완전하게 밀폐된 시스템, 성분의 1회용성 등이 없다.
상처 치유에 대한 지방 유래 줄기 세포의 주어진 치료적 잠재력 하에, 증가된 수율, 일관성 및/또는 순도로 성체 줄기 세포 집단을 생산하고, 추출후 조작의 필요성이 감소했거나 전혀 없으면서 신속하고 신뢰성 있게 이를 수행하는, 지방 조직으로부터의 세포의 수확 방법이 당업계에서 요구된다.
발명의 개요
본 발명은 상처 치유를 촉진하는데 사용될 수 있는 재생 세포, 예를 들어, 성체 줄기 및 선조 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 재생 세포를 조직, 예를 들어, 지방 조직으로부터 분리하고 농축시키기 위한 시스템 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 상처 치유 용도를 위한 재생 세포의 조성물에 관한 것이다. 따라서, 일반적인 실시양태에서, 본 발명은 치료적 상처 치유 이점을 촉진, 야기 또는 지지하는데 필요한 첨가제와 함께, 수용자 내에 직접적으로 배치된 조직으로부터 유래된 재생 세포를 사용하기 위한 조성물, 방법 및 시스템에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 일정 농도의 재생 세포를 투여함으로써 상처 치유를 촉진하는 방법에 관한 것이다. 재생 세포는, 예를 들어, 줄기 세포, 선조 세포 또는 이의 배합물을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 다중 용량의 재생 세포를 투여하는 것이 치료적 이점을 유도하는데 필요할 수 있다. 또한, 1가지 이상의 성장 인자와 같은 첨가제가 재생 세포와 함께 투여될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 재생 세포는 혈관신생 성장 인자 (단독 또는 다른 첨가제와 배합됨)와 함께 투여된다. 또한, 재생 세포는 1가지 이상의 면역억제 약물과 함께 투여될 수 있다.
재생 세포에 대한 투여 경로는 당업계에 공지되어 있고, 손상부로부터 먼 부위에서의 피하, 피부 또는 근육내 주사, 또는 카테터(catheter)를 기초로 하는 메 커니즘을 사용하는 국소화된 도관 전달을 포함한다. 세포는 예를 들어, 환자의 혈관계에 투여할 수 있다. 또한, 세포를 스캐폴드(scaffold), 예를 들어, 재흡수성 스캐폴드, 또는 당업계에 공지된 붕대를 통해 투여할 수 있다.
환자에게의 투여 전에, 재생 세포를 세포 배양에서 성장시켜, 예를 들어, 상피 및/또는 내피 표현형으로의 분화를 촉진할 수 있다. 환자 상에 또는 환자 내로 배치될 수 있는 2차원 또는 3차원 구축물이 생성되도록 세포 배양을 스캐폴드 물질, 예를 들어, 재흡수성 스캐폴드에서 수행할 수 있다. 변형된 재생 세포에서의 하나 이상의 유전자, 예를 들어 혈관신생 유전자의 발현이 변경되도록 환자에게의 투여 전에, 유전자 전달로 세포를 변형시킬 수도 있다.
또한, 본 발명은 대상 내로의 재-주입에 적절한 재생 세포, 예를 들어, 줄기 및 선조 세포를 소정의 조직으로부터 분리하고 농축시킬 수 있는 고도로 다용도성인 시스템 및 방법에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 시스템은 자동화된다. 본 발명의 시스템은 일반적으로 1개 이상의 수집 챔버, 프로세싱(processing) 챔버, 폐기물 챔버, 산출 챔버 및 샘플 챔버를 포함한다. 생물학적 물질을 함유하는 유체들이 밀폐된 무균 유체/조직 경로도 한 챔버에서 또다른 챔버로 통과할 수 있도록, 여러 챔버들은 1개 이상의 도관을 통해 서로 커플링된다. 특정 실시양태에서, 폐기물 챔버, 산출 챔버 및 샘플 챔버는 선택적이다. 한 실시양태에서, 조직 추출에서부터 프로세싱, 및 수용자 내로의 장치 배치에 이르기까지의 전체적인 절차 모두가 동일한 설비에서, 실제로는, 심지어 처치를 받고 있는 환자의 동일한 공간에서 수행될 것이다.
따라서, 한 실시양태에서, 환자의 상처 치유를 촉진하는 방법은 a) 조직 제거 시스템을 제공하는 단계; b) 조직 제거 시스템을 사용하여 일정 농도의 줄기 세포를 갖는 지방 조직을 환자로부터 제거하는 단계; c) 지방 조직의 적어도 일부를 프로세싱하여, 프로세싱 전의 지방 조직의 재생 세포 농도 이외의 농도의 재생 세포를 수득하는 단계; 및 d) 환자에게 투여되기 전에 조직 제거 시스템으로부터 재생 세포를 제거하지 않으면서 환자에게 재생 세포를 투여하는 단계를 포함한다.
본원에 기술된 임의의 양상 또는 양상들의 조합은, 임의의 이같은 조합 내에 포함된 양상들이 문맥, 본 명세서 및 당업자의 지식으로부터 명백할 바와 같이 서로 모순되지 않는 한, 본 발명의 범주 내에 포함된다. 본 발명의 추가적인 장점 및 양상들은 하기의 상세한 설명으로부터 명백하다.
도 1은 1개의 필터 조립체를 포함하는, 조직으로부터 재생 세포를 분리하는 시스템을 예시한다.
도 2는 직렬 구조의 복수의 필터 조립체를 포함하는, 도 1과 유사한 시스템을 예시한다.
도 3은 병렬 구조의 복수의 필터 조립체를 포함하는, 도 1과 유사한 시스템을 예시한다.
도 4는 원심분리 챔버를 포함하는, 조직으로부터 재생 세포를 분리하는 시스템을 예시한다.
도 5는 조직으로부터 재생 세포를 분리하는 시스템에 사용된 예비고정된 필 터를 포함하는 수집 챔버의 단면도이다.
도 6은 침출식(percolative) 여과 시스템을 이용하는, 조직으로부터 재생 세포를 분리하는 시스템의 프로세싱 챔버의 단면도이다.
도 7은 재생 세포를 농축시키기 위해 원심분리 장치를 이용하는, 재생 세포를 분리하는 시스템의 프로세싱 챔버의 단면도이다.
도 8은 도 7의 프로세싱 챔버의 또다른 단면도이다.
도 9.1, 9.2 및 9.3은 본 발명의 시스템에 이용되는 수력분급(elutriation) 성분을 예시한다.
도 10은 진공 압력을 이용하여 시스템에서 유체를 이동시키는, 조직으로부터 재생 세포를 분리하는 시스템을 예시한다. 진공 시스템은 미리 정해진 속도로 제어되어 조직 및 액체를 끌어내는 진공 펌프 또는 진공 공급원을 시스템의 출구에 적용함으로써 구축될 수 있고, 잠금꼭지, 통풍구 및 클램프의 시스템을 이용하여 유동 방향 및 시기를 제어한다.
도 11은 가압을 이용하여 시스템에서 유체를 이동시키는, 조직으로부터 재생 세포를 분리하는 시스템을 예시한다. 가압 시스템은 연동식 펌프와 같은 기계적 수단을 이용하여, 정해진 속도로 시스템에서 액체 및 조직을 밀어내거나 추진시킬 수 있으며, 밸브, 잠금꼭지, 통풍구 및 클램프를 이용하여 유동 방향 및 시기를 제어한다.
도 12A는 유체의 공급물 스트림이 필터의 공극에 대해 접선방향으로 유동하는 여과 공정을 예시한다. 도 12B는 액체의 공급물 스트림이 필터의 공극에 대해 수직방향으로 유동하는 여과 공정을 예시한다.
도 13은 본 발명의 시스템을 위한 예시적인 일회용 세트를 예시한다.
도 14는 본 발명의 시스템을 위한 예시적인 재사용가능한 성분을 예시한다.
도 15A는 도 13의 일회용 세트 및 도 14의 재사용가능한 성분을 사용하여 조립된 본 발명의 예시적인 장치를 예시한다.
도 15B는 본 발명의 시스템의 자동화된 실시양태를 제어하는, 예시적인 예비-프로그래밍된 단계들을 도시(圖示)하는 순서도이다 (소프트웨어 프로그램을 통해 구현됨). 2개의 별법적 프로세싱 파라메터가 제시되어, 시스템의 다목적성을 가리킨다.
도 16A 및 16B는 배양된 지방 유래 줄기 세포에 의한 VEGF 단백질 (5A) 및 PIGF 단백질 (5B)의 발현을 도시한다.
도 17은 지방 유래 줄기 세포 집단 내의 내피 선조 세포의 검출을 도시한다.
도 18A 및 18B는 정상 마우스 (7A) 및 스트렙토조토신-처치 마우스 (7B)의 혈관 구조물의 시험관내 발달을 도시한다.
도 19는 음성 대조군에 비해 지방 유래 줄기 세포로 처치된 뒷다리 허혈 마우스에서의 평균 혈류 복원 증가를 도시한다.
도 20A 및 20B는 지방 유래 줄기 세포 용량을 증가시키는 것이 이식 생존율 및 혈관신생을 개선시킨다는 것을 나타내고 (20A), 조직학적 표본에서 지방 조직 구조의 유지를 도시한다 (20B).
도 21은 마우스 섬유아세포 및 지방 유래 세포(ADC)의 공동배양으로부터의 콜라겐 분비량을 나타내는 그래프이다.
도 22는 상처 부위에 지방 유래 세포(ADC)를 투여한 후, 마우스에서의 상처 치유 백분율을 나타내는 그래프이다.
본 발명은 지방 유래 재생 세포 ("ADC")를 사용하여 상처 치유를 촉진하는 방법을 제공한다. 본 발명은 부분적으로는, 본 발명의 재생 세포가 (1) PIGF, VEGF, bFGF, IGF-II, 에오탁신(Eotaxin), G-CSF, GM-CSF, IL-12 p40/p70, IL-12 p70, IL-13, IL-6, IL-9, 렙틴(Leptin), MCP-1, M-CSF, MIG, PF-4, TIMP-1, TIMP-2, TNF-α 및 트롬보포에틴(Thrombopoetin)이 포함되는 혈관신생 성장 인자 및 사이토카인을 발현하고, (2) MIP-1알파, RANTES, MCP-1, MIG, TARC, MIP-1, KC 및 TIMP가 포함되는 상처 치유 관련 사이토카인을 분비하고, (3) 시험관내에서 콜라겐을 분비하고, (4) 생체내 상처 치유를 촉진한다는 발견을 기초로 한다. 따라서, 지방 조직에서 유래된 재생 세포, 예를 들어, 중간엽 줄기 세포의 특징인 것으로 일반적으로 간주되는 세포 표면 분자를 발현하는 줄기 세포는, 신규 혈관 형성 및 상처 치유를 촉진하는 능력을 갖는다.
또한, 본 발명은 지방, 골수, 혈액, 피부, 근육, 간, 결합 조직, 근막, 뇌 및 기타 신경계 조직, 혈관 및 기타 연조직 또는 액상 조직 성분 또는 조직 혼합물 (예를 들어 피부, 혈관, 지방 및 결합 조직의 혼합물)이 포함되지만, 이에 한정되지 않는 다양한 조직들로부터 재생 세포, 예를 들어 줄기 세포 및/또는 선조 세포를 분리하고 농축시키기 위한 신속하고 신뢰성 있는 시스템 및 방법에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 시스템은 지방 조직으로부터 재생 세포를 분리하고 농축시킨다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 시스템은 전체 방법이 최소한의 사용자 개입 또는 전문적 지식으로 수행될 수 있도록 자동화된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 시스템 및 방법을 사용하여 수득된 재생 세포는 병든 수용자 내로 직접 배치하기에 적절하다.
바람직하게는, 조직 추출에서부터 재생 세포의 분리, 농축 및 수용자 내로의 배치까지의 전체적인 절차 모두가 동일한 설비에서, 실제로는, 심지어 처치를 받고 있는 환자의 동일한 공간에서 수행될 것이다. 재생 세포는 추출 및 농축 후에 비교적 짧은 시간 기간 동안 사용될 수 있다. 예를 들어, 재생 세포는 환자로부터의 조직 수확 이후 약 한 시간 내에 사용가능할 수 있고, 특정 상황에서는 조직 수확 후 약 10 내지 40분 내에 사용가능할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 재생 세포는 조직 수확 후 약 20분 내에 사용할 수 있다. 추출에서부터 분리 및 농축까지의 절차의 전체적인 길이는 환자의 프로필, 수확될 조직의 유형 및 소정의 치료 용도에 요구되는 재생 조직의 양을 비롯한 다수의 인자에 따라 변할 수 있다. 또한, 세포는 수용자에게 치료적, 구조적 또는 미용적 이익을 유도하기 위한 단일 수술 절차의와 관련하여, 다른 세포, 조직, 조직 단편, 스캐폴드 또는 기타 세포 성장 및/또는 분화 자극제와 함께 수용자 내로 배치될 수 있다. 시스템의 분리 및 농축 단계 이상의 재생 세포에 대한 임의의 추가적인 조작은, 이같은 조작 방식에 맞는 추가의 시간을 필요로 할 것으로 이해된다.
본 발명을 보다 용이하게 이해할 수 있도록 하기 위해, 먼저 특정 용어들을 정의한다. 추가적인 정의는 상세한 설명 전반에 걸쳐 기재된다.
본원에서 사용된 "재생 세포"는 기관, 조직, 또는 생리학적 단위 또는 시스템의 구조 또는 기능의 완전한 또는 부분적인 재생, 복원 또는 치환을 야기하거나 이에 기여함으로써 치료적, 구조적 또는 미용적 이점을 제공하는, 본 발명의 시스템 및 방법을 사용하여 수득된 임의의 이종 또는 동종 세포를 지칭한다. 재생 세포의 예로는 ASC, 내피 세포, 내피 전구 세포, 내피 선조 세포, 대식세포, 섬유아세포, 혈관주위세포, 평활근 세포, 지방전구세포, 분화 또는 탈분화(de-differentiated) 지방세포, 각질세포, 단일분화성(unipotent) 및 다분화성(multipotent) 선조 및 전구 세포 (및 이들의 자손) 및 림프구가 포함된다.
재생 세포가 치료적, 구조적 또는 미용적 이점을 제공할 수 있는 한 메커니즘은, 이들 또는 이들의 자손을 새롭게 생성된, 기존의, 또는 복구된 조직 또는 조직 성분 내로 혼입시키는 것에 의한 것이다. 예를 들어, ASC 및/또는 이의 자손은 새롭게 생성된 뼈, 근육 또는 기타 구조적 또는 기능적 조직 내로 혼입되어 치료적, 구조적 또는 미용적 개선을 야기하거나 이에 기여할 수 있다. 유사하게, 내피 세포 또는 내피 전구 세포 또는 선조 세포 및 이들의 자손은 기존의, 새롭게 생성된, 복구된, 또는 확장된 혈관 내로 혼입되어 치료적, 구조적 또는 미용적 이점을 야기하거나 이에 기여할 수 있다.
재생 세포가 치료적, 구조적 또는 미용적 이점을 제공할 수 있는 또다른 메커니즘은, 소정의 조직 또는 조직 성분의 구조 또는 기능의 생성, 유지, 복원 및/또는 재생을 촉진하는 분자, 예를 들어 성장 인자를 발현시키고/시키거나 분비시키는 것에 의한 것이다. 예를 들어, 재생 세포는 조직 또는 세포의 성장을 증강시키는 분자를 발현하고/하거나 분비할 수 있고, 이후 구조 또는 기능의 개선에 직접적 또는 간접적으로 참여할 수 있다. 재생 세포는 예컨대, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 태반 성장 인자 (PIGF), bFGF, IGF-II, 에오탁신, G-CSF, GM-CSF, IL-12 p40/p70, IL-12 p70, IL-13, IL-6, IL-9, 렙틴, MCP-1, M-CSF, MIG, PF-4, TIMP-1, TIMP-2, TNF-α, 트롬보포에틴 및 이들의 이소형(isoform)을 비롯한 성장 인자를 발현 및/또는 분비할 수 있고, 이들은 하기의 기능들 중 하나 이상의 기능을 수행할 수 있다: 새로운 혈관의 발달을 자극함, 즉 혈관신생을 촉진함; 혈액 운반 용량을 확대시킴으로써 기존의 소혈관 (측부혈관)의 산소 공급을 개선시킴; 손상 부위로부터 먼 부위로부터의 재생 세포의 이동을 유도함으로써 이같은 세포의 손상 부위로의 귀환 및 이동을 증강시킴; 손상 부위에서의 세포성장을 자극하고/하거나 세포 생존을 촉진함으로써 기능 또는 구조의 유지를 촉진함; 항-아폽토시스 (anti-apoptotic) 성질을 갖는 분자를 전달함으로써 세포 사멸의 속도 또는 가능성, 및 기능의 영구적인 손실을 감소시킴; 및 내인성 재생 세포 및/또는 기타 생리학적 메커니즘과 상호작용함.
재생 세포는 조직 내에 존재하는 바대로, 또는 본 발명의 시스템 및 방법을 사용하여 조직으로부터 분리 및 농축된 '천연' 형태로 사용될 수 있거나, 또는 이들은 성장 인자 또는 다른 생물학적 반응 변형제에 의한 자극 또는 프라이밍(priming)에 의해, 유전자 전달 (일시적 또는 안정적인 전달)에 의해, 생성된 집단의 물성 (예를 들어 크기 또는 밀도), 고체상 물질에의 차등 부착, 세포 표면 또는 세포내 분자의 발현, 세포 배양 또는 기타 생체외 또는 생체내 조작, 변형, 또는 본원에 추가로 기술된 바와 같은 분획화를 기초로 하는 추가적인 하위-분획화(sub-fractionation)에 의해 변형될 수 있다. 또한, 재생 세포는 추가로 본원에 기술되는 바와 같이, 세포의 관련 특징을 변형 또는 증강시키는 인자, 약물, 화학물질 또는 기타 작용제를 전달하는 다른 세포 또는 합성 또는 생물학적 스캐폴드, 물질 또는 장치와 조합되어 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 "재생 세포 조성물"은 조직, 예를 들어, 지방 조직을 세정하고 적어도 부분적으로 해리(disaggregation)시킨 후에, 일정 부피의 액체에 전형적으로 존재하는 세포의 조성물을 지칭한다. 예를 들어, 본 발명의 재생 세포 조성물은 ASC, 내피 세포, 내피 전구 세포, 내피 선조 세포, 대식세포, 섬유아세포, 혈관주위세포, 평활근 세포, 지방전구세포, 분화 또는 탈분화 지방세포, 각질세포, 단일분화성 및 다분화성 선조 및 전구 세포 (및 이들의 자손) 및 림프구를 포함하여, 다양한 여러 유형의 재생 세포를 포함한다. 재생 세포 조성물은 1가지 이상의 오염물, 예컨대 조직 단편에 존재할 수 있는 콜라겐, 또는 본원에 기술된 조직 해리 공정에 사용되거나 이로부터 생성된 잔류 콜라게나제, 또는 기타 효소 또는 작용제도 함유할 수 있다.
본원에서 사용된 "상처 치유"는 피부 및/또는 기저부의 결합 조직의 임의의 질환, 장애, 증후군, 기형, 병리학, 또는 비정상적인 상태를 특징으로 하는 모든 장애, 예를 들어, 수술 후의 피부 상처, 기계적 외상, 부식제 또는 화상으로 인한 피부 마모, 백내장 수술 또는 각막 이식 후의 각막, 감염 또는 약물 요법 후의 점막 상피 상처 (예를 들어, 호흡, 위장관, 비뇨생식, 유방, 구강, 안구 조직, 간 및 신장), 당뇨병성 상처, 이식 후의 피부 상처, 및 혈관성형술 후의 혈관 재성장을 포함하도록 의도된다. 상처, 질환 또는 장애의 치료는 재생 의학의 첫 전략 내에 속한다.
본원에서 사용된 용어 "허혈"은 혈액 유입 또는 유출의 감소로 인한 임의의 국소화된 조직 허혈을 지칭한다. 용어 "허혈성 상처"는 부적절한 산소로 인한 상처 수축 및 재-상피화 불능을 지칭한다. 상처 치유는 비치유성(non-healing) 상처도 포함한다. 특정한 의학적 및 수술 상황은 비치유성 상처, 예를 들어, 당뇨병 (제I형 및 제II형), 만성 말초 혈관 질환, 류마티스 관절염, 울혈성 심부전, 동맥 또는 정맥 궤양, 림프부종, 비만, 외인성 스테로이드 투여, 혈관 질환 상처, 수술 상처 붕괴, 화학적 상처, 및 화학요법제 또는 기타 면역억제제 요법으로 인한 상처가 발달되는 것에 대한 고도의 위험과 관련된다.
본원에서 사용된 용어 "혈관신생"은 기존의 혈관구조 및 조직으로부터 새로운 혈관이 생성되는 프로세스를 지칭한다 ([Folkman, 1995]). 어구 "복구 또는 리모델링"은 기존의 혈관구조의 재형성을 지칭한다. 조직 허혈의 완화는 혈관신생에 결정적으로 의존한다. 새로운 혈관의 자발적 성장은 허혈 영역 내에서 및 그 주위에서의 측순환을 제공하고, 혈류를 개선시키고, 허혈로 인한 증상을 완화시킨다. 혈관신생에 의해 매개되는 질환 및 장애에는 급성 심근 경색증, 허혈성 심근병증, 말초 혈관 질환, 허혈성 뇌졸중, 급성 세뇨관 괴사, 허혈성 상처-포함 AFT, 패혈증, 허혈성 장 질환, 당뇨병성 망막증, 신경병증 및 신병증, 혈관염, 허혈성 뇌병증, 생리적 발기기능장애, 허혈성 또는 외상성 척수 손상, 다발성 기관계 부전, 허혈성 잇몸 질환, 및 이식-관련 허혈이 포함된다.
본원에서 사용된 "줄기 세포"는 다양한 다른 세포 유형으로 분화되는 잠재력이 있는 다분화성 재생 세포를 지칭하며, 이는 하나 이상의 특정 기능을 수행하고 자가-재생 능력을 갖는다. 본원에 개시된 줄기 세포의 일부는 다분화성일 수 있다.
본원에서 사용된 "선조 세포 (progenitor cell)"는 1가지를 초과하는 세포 유형으로 분화되는 잠재력이 있는 다분화성 재생 세포를 지칭하며, 자가-재생 능력은 제한적이거나 없다. 본원에서 사용된 "선조 세포"는 또한, 단일 세포 유형으로만 분화되는 잠재력이 있는 단일분화성 세포를 지칭하며, 이는 하나 이상의 특정 기능을 수행하고 자가-재생 능력이 없거나 제한되어 있다. 특히, 본원에서 사용된 "내피 선조 세포"는 혈관 내피 세포로 분화되는 잠재력이 있는 다분화성 또는 단일분화성 세포를 지칭한다.
본원에서 사용된 "전구 세포"는 1가지 세포 유형으로 분화되는 잠재력이 있는 단일분화성 재생 세포를 지칭한다. 전구 세포 및 이의 자손은 광범위한 증식능을 유지할 수 있고, 예를 들어 적절한 조건 하에 증식할 수 있는 림프구 및 내피 세포이다.
본원에서 사용된 용어 "혈관신생 인자" 또는 "혈관신생 단백질"은 기존의 혈관구조로부터의 새로운 혈관의 성장 ("혈관신생")을 촉진할 수 있는 임의의 공지된 단백질, 펩티드 또는 기타 작용제를 지칭한다. 본 발명에서 사용하기에 적절한 혈관신생 인자로는, 태반 성장 인자 ([Luttun et al., 2002]), 대식세포 콜로니 자극 인자 ([Aharinejad et al., 1995]), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 ([Buschmann et al., 2003]), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)-A, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E ([Mints et al., 2002]), 뉴로필린 ([Wang et al., 2003]), 섬유아세포 성장 인자 (FGF)-1, FGF-2 (bFGF), FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6 ([Botta et al., 2000]), 안지오포이에틴(Angiopoietin) 1, 안지오포이에틴 2 ([Sundberg et al., 2002]), 에리트로포이에틴 ([Ribatti et al., 2003]), BMP-2, BMP-4, BMP-7 ([Carano and Filvaroff, 2003]), TGF-베타 ([Xiong et al., 2002]), IGF-1 ([Shigematsu et al., 1999]), 오스테오폰틴(Osteopontin) ([Asou et al., 2001]), 플레이오트로핀(Pleiotropin) ([Beecken et al., 2000]), 액티빈(Activin) ([Lamouille et al., 2002]), 엔도텔린(Endothelin)-1 ([Bagnato and Spinella, 2003]) 및 이들의 배합물이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 혈관신생 인자는 독립적으로, 또는 서로 조합되어 작용할 수 있다. 조합되는 경우, 혈관신생 인자도 상승적으로 작용할 수 있고, 따라서 인자들의 조합된 효과는 각각의 인자들의 개별적인 효과의 합보다 크다. 용어 "혈관신생 인자" 또는 "혈관신생 단백질"에는 이같은 인자들의 기능적 유사체도 포함한다. 기능적 유사체는, 예를 들어 인자의 기능적 부분을 포함한다. 기능적 유사체는 인자의 수용체에 결합하여 혈관신생 및/또는 조직 리모델링을 촉진하는데 있어서 인자의 활성을 모방하는, 항-이디오타입 항체도 포함한다. 이같은 항-이디오타입 항체의 생성 방법은 당업계에 주지되어 있고, 예를 들어 WO 97/23510 (거명에 의해 본원에 그 내용이 포함됨)에 기재되어 있다.
본 발명에 사용된 혈관신생 인자는 임의의 적절한 공급원으로부터 생산 또는 수득될 수 있다. 예를 들어, 인자를 천연 공급원으로부터 정제하거나, 합성에 의해 또는 재조합 발현에 의해 생산할 수 있다. 인자는 단백질 조성물로서 환자에게 투여할 수 있다. 별법으로, 인자는 이를 코딩하는 발현 플라스미드 형태로 투여될 수 있다. 적합한 발현 플라스미드의 구축은 당업계에 주지되어 있다. 발현 플라스미드를 구축하는데 적절한 벡터로는, 예를 들어 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡트, 아데노-관련 바이러스 벡터, RNA 벡터, 리포솜, 양이온성 지질, 렌티바이러스 벡터 및 트랜스포손이 포함된다.
본원에서 사용된 "줄기 세포 수" 또는 "줄기 세포 빈도"는, 지방 유래 세포 (ADC)를 낮은 세포 밀도 (10,000개 미만의 세포/웰)로 플레이팅하고 MSC 성장을 지지하는 성장 배지 (예를 들어, 10％ 소태아 혈청, 5％ 말 혈청 및 항생제/항진균제가 보충된 DMEM/F12 배지)에서 성장시키는 클론원성 분석에서 관찰된 콜로니의 수를 지칭한다. 세포를 2주 동안 성장시킨 후, 배양물을 헤마톡실린으로 염색하고 50개 초과의 세포의 콜로니를 CFU-F로서 계수한다. 줄기 세포 빈도는 플레이팅된 유핵 세포 100개 당 관찰된 CFU-F의 수로서 계산된다 (예를 들어, 1,000개의 유핵 재생 세포로 시작된 플레이트에서 계수된 15개의 콜로니는 1.5％의 줄기 세포 빈도를 제공한다). 줄기 세포 수는 줄기 세포 빈도 곱하기 수득된 유핵 ADC 세포의 총 수로 계산된다. 재생 세포로부터 성장된 CFU-F는 높은 백분율 (~100％)로 세포 표면 분자인 CD105를 발현하며, CD105는 골수-유래 줄기 세포에 의해서도 발현된다 ([Barry et al., 1999]). CD105는 지방 조직-유래 줄기 세포에 의해서도 발현된다 ([Zuk et al., 2002]).
본원에서 사용된 용어 "지방 조직"은 지방질을 저장하는 결합 조직을 포함하여 지방질을 지칭한다. 지방 조직은 ASC 및 내피 선조 세포 및 전구 세포를 포함하여, 다수의 재생 세포 유형을 함유한다.
본원에서 사용된 용어 "지방 조직의 단위"는 구별된 또는 측정가능한 양의 지방 조직을 지칭한다. 지방 조직의 단위는 단위의 중량 및/또는 부피를 결정함으로써 측정할 수 있다. 상기에서 확인된 데이타를 기초로, 환자로부터 제거된 프로세싱된 지방흡인물(lipoaspirate)의 단위는 세포 성분의 0.1％ 이상이 줄기 세포인 세포 성분을 갖는다; 즉, 상기 기술된 바와 같이 결정된 이의 줄기 세포 빈도가 0.1％ 이상이다. 본원의 개시내용과 관련하여, 지방 조직의 단위는 환자로부터 제거한 지방 조직의 전체 양, 또는 환자로부터 제거한 지방 조직의 전체 양보다 작은 양을 지칭할 수 있다. 따라서, 지방 조직의 단위를 지방 조직의 또다른 단위와 조합하여, 중량 또는 부피가 개별적인 단위들의 중량 또는 부피의 합이 되는 지방 조직의 단위를 형성시킬 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "부분"은 전체보다 적은 물질의 양을 지칭한다. 미량 부분은 50％ 미만의 양을, 다량 부분은 50％ 초과의 양을 지칭한다. 따라서, 환자로부터 제거된 지방 조직의 전체 양보다 적은 지방 조직의 단위는 제거된 지방 조직의 부분이 된다.
본원에서 사용된 용어 "프로세싱된 지방흡인물"은 성숙 지방세포 및 결합 조직으로부터 활성 세포 성분 (예를 들어, 재생 성분을 함유하는 성분)을 분리하도록 프로세싱된 지방 조직을 지칭한다. 이러한 분획은 본원에서 "지방-유래 세포" 또는 "ADC"로서 지칭된다. 전형적으로, ADC는 지방 조직으로부터 세포를 세정 및 분리 및 농축시킴으로써 수득된 재생 세포의 펠렛을 지칭한다. 펠렛은 세포가 원심분리 챔버 또는 세포 농축기의 하부에서 응집되도록 세포의 현탁액을 원심분리함으로써 전형적으로 수득된다.
본원에서 사용된 용어 "투여", "도입", "전달", "배치" 및 "이식"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 원하는 부위에서 재생 세포의 적어도 부분적인 국소화를 유발하는 방법 또는 경로에 의해 본 발명의 재생 세포를 대상에 배치시키는 것을 지칭한다. 재생 세포는 세포 또는 세포의 성분의 적어도 일부분이 여전히 생존가능한 대상의 원하는 위치로 전달되게 하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 대상으로의 투여 후 세포의 생존가능 기간은 수시간, 예를 들어, 24시간 내지 수일 정도로 짧거나, 수년 정도로 길 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "처치"는 질병 또는 장애의 적어도 하나 이상의 부작용 또는 증상을 감소 또는 완화시키는 것을 포함한다.
본원에서 사용된 "재생 세포의 치료적 유효 용량"은 이로운 또는 원하는 임상 효과를 일으키기기에 충분한 재생 세포의 양을 지칭한다. 상기 용량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 그러나, 얼마가 유효 용량으로 고려되는지의 정확한 결정은 환자의 연령, 사이즈, 질환의 유형 또는 정도, 질환의 단계, 재생 세포의 투여 경로, 사용된 보충 요법의 유형 및 정도, 진행중인 질환 프로세스 및 원하는 처치 유형 (예를 들어, 공격적 처치 대 통상적 처치)이 포함되지만 이에 한정되지 않는, 각 환자에게 독특한 인자에 기초할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "대상"은 온혈 동물, 바람직하게는 인간을 포함한 포유류를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 대상은 영장류이다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 대상은 인간이다.
본원에서 앞서 기재된 바와 같이, 재생 세포, 예를 들어 줄기 및 선조 세포는 광범위한 조직으로부터 수확될 수 있다. 본 발명의 시스템은 이같은 모든 조직에 사용될 수 있다. 그러나, 지방 조직이 재생 세포의 특히 풍부한 공급원이다. 따라서, 본원에서는, 예시적으로 및 비제한적으로, 재생 세포의 공급원으로서 지방 조직을 사용하여 본 발명의 시스템을 설명한다.
지방 조직은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 수득할 수 있다. 예를 들어, 지방 조직은 지방흡입술 (주사기 또는 동력-어시스트(assisted) 지방흡인술)에 의해, 또는 지방절제술, 예를 들어 흡입-어시스트 지방성형술(suction-assisted lipoplasty), 초음파-어시스트 지방성형술 및 적출 지방절제술(excisional lipectomy) 또는 이들의 조합에 의해 환자로부터 제거될 수 있다. 지방 조직을 제거 및 수집하여, 본원에 기술된 발명의 시스템의 임의의 실시양태에 따라 프로세싱할 수 있다. 수집된 조직의 양은 공여자의 체질량지수 및 연령, 수집에 이용가능한 시간, 접근가능한 지방 조직 수확 부위의 이용가능성, 동시성 및 선재성 약물처치 및 조건 (예컨대 항응고 요법), 및 조직을 수집하는 임상적 목적이 포함되는 수많은 인자에 좌우된다. 예를 들어, 마른 개인으로부터 추출된 지방 조직 100 ㎖의 재생 세포 백분율은 비만인 공여자로부터 추출된 것보다 높다 (표 1). 이는 아마도 비만인 개인에서의 증가된 지방질 함량의 희석 효과를 반영할 것이다. 따라서, 본 발명의 한 양상에 따르면, 보다 마른 환자로부터 회수될 양과 비교하여 과체중 공여자로부터 더욱 많은 양의 조직을 수득하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 이러한 관찰은 본 발명의 유용성이 다량의 지방 조직을 갖는 개인에게 제한되지 않는다는 것을 가리킨다.
조직 및 세포 수율에 대한 체질량지수의 효과
체질량지수 상태 수득된 조직의 양 (g) 전체 재생 세포 수율 (×107)
보통 641±142 2.1±0.4
비만 1,225±173 2.4±0.5
p값 0.03 0.6
지방 조직이 프로세싱된 후, 생성된 재생 세포에는 성숙 지방세포 및 결합 조직이 실질적으로 없다. 따라서, 본 발명의 시스템으로 복수 개의 이종성 지방 유래 재생 세포가 생성되고, 이는 연구 및/또는 치료 목적용으로 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 세포는 수용자의 신체 내에서의 배치 또는 재주입에 적절하다. 또다른 실시양태에서, 세포는 연구용으로 사용될 수 있고, 예를 들어, 세포를 사용하여, 장기간 동안 생존할 수 있어 추가 연구용으로 사용될 수 있는 줄기 또는 선조 세포주를 확립할 수 있다.
이제, 본 발명의 바람직한 실시양태가 자세히 설명될 것이며, 이의 예는 첨부된 도면에 예시된다. 가능한 곳이라면, 동일하거나 유사한 참조 번호가 도면 및 명세서에 사용되어 동일하거나 같은 부분을 지칭한다. 도면은 단순화된 형태이며 정확한 비율이 아님을 주지하여야 한다. 본원의 개시내용과 관련하여, 단지 편리함과 명확함을 위해, 상부, 하부, 좌, 우, 위, 아래, 너머, 위쪽, 아래쪽, 밑, 뒤, 앞, 먼 및 인접한과 같은 방향 관련 용어가 첨부된 도면에 대해서 사용된다. 이같은 방향 용어는 어떠한 방식으로도 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
본원의 개시내용에서 특정한 예시된 실시양태들이 지칭되지만, 이러한 실시양태들은 예로서 제시되며, 제한을 위하여 제시되지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 예시적인 실시양태들을 논의하고 있지만, 하기 상세한 설명의 목적은 첨부된 특허청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 취지 및 범주 내에 속할 수 있는 실시양태의 모든 변형, 대안 및 균등물을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본 발명은 당업계에서 통상적으로 사용되는 다양한 의학 절차와 함께 이용될 수 있다.
이제 도면을 참조하면, 본 발명의 시스템 (10)은 일반적으로 1개 이상의 조직 수집 챔버 (20), 프로세싱 챔버 (30), 폐기물 챔버 (40), 산출 챔버 (50) 및 샘플 챔버 (60)으로 구성된다. 밀폐된 무균 유체/조직 경로를 유지하면서 생물학적 물질을 함유하는 유체가 한 챔버에서 또다른 챔버로 통과할 수 있도록, 여러 챔버들은 1개 이상의 도관 (12)를 통해 서로 커플링된다. 도관은 본원에서 각각 루멘(lumen) 및 튜브로 상호교환가능하게 언급되는 강성 또는 가요성 동체(胴體)를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 도관은 임상적 상황(clinical setting)에서 통상적으로 사용되는 폴리에틸렌 튜브, 실리콘 또는 당업계에 공지된 임의의 기타 물질과 같은 가요성 튜브의 형태이다. 도관 (12)는 유체 또는 조직의 통과를 원하는지 여부에 따라 크기가 다양할 수 있다. 도관 (12)는 또한, 시스템에 순환되는 조직 또는 액체의 양에 따라 크기가 다양할 수 있다. 예를 들어, 유체 통과를 위해서는 도관의 직경이 약 0.060 내지 약 0.750 인치 범위일 수 있고, 조직 통과를 위해서는 도관의 직경이 0.312 내지 0.750 인치 범위일 수 있다. 일반적으로, 도관의 크기는 도관이 수용할 수 있는 양과 상기 도관을 통해 조직 또는 액체를 이동시키는데 필요한 시간이 균형을 이루도록 선택된다. 시스템의 자동화된 실시양태에서, 적합한 신호를 시스템의 프로세싱 장치에 보낼 수 있도록 상기 파라미터, 즉, 이동량 및 시간이 확인되어야 한다. 이는 상기 장치가 한 챔버에서 또다른 챔버로 정확한 부피의 액체 및 조직을 이동시키도록 한다. 사용된 가요성 튜브는 붕괴 가능성을 감소시키기 위해 음압을 견딜 수 있어야 한다. 사용된 가요성 튜브는 시스템에서 사용될 수 있는, 포지티브 변위 펌프에 의해 예를 들어 생성되는 양압도 견딜 수 있어야 한다.
시스템의 모든 챔버는 1개 이상의 포트, 예를 들어 출구 (22) 또는 입구 (21) 포트로 구성될 수 있고, 이는 표준물 IV, 주사기 및 흡입 튜브 연결부를 받아들인다. 포트는 밀봉된 포트, 예컨대 고무 격막으로 밀폐된 주사기 바늘 진입 포트 (51)일 수 있다. 입구는 도관에 의해 1개 이상의 캐뉼라 (도시되지 않음)에 커플링될 수 있다. 예를 들어, 조직 입구 포트 (21)이 통합형 단독 사용 지방흡입 캐뉼라에 연결될 수 있고, 도관은 가요성 튜브일 수 있다. 도관은 일반적으로 시스템의 한 챔버에서 또다른 챔버로의 유체 통로를 제공하도록 위치한다. 이 때문에, 도관 및 포트는 예를 들어, 수동 또는 자동으로 작동될 수 있는 흡입 장치 (도시되지 않음)에 커플링될 수 있다. 흡입 장치는 예를 들어, 주사기 또는 전기 펌프일 수 있다. 흡입 장치는 환자로부터 조직을 흡인하기에 충분한 음압을 제공할 수 있어야 한다. 일반적으로 당업자, 예를 들어 외과의사에게 공지된 임의의 적절한 흡입 장치를 사용할 수 있다.
도관 (12)는 시스템의 다양한 성분들 중에서 물질의 유동을 제어하는 1개 이상의 클램프 (도시되지 않음)를 추가로 포함할 수 있다. 클램프는 시스템의 상이한 영역들을 효과적으로 밀봉함으로써 시스템의 무균성을 유지하는데 유용하다. 별법으로, 도관 (12)는 시스템을 통해 물질의 유동을 제어하는 1개 이상의 밸브 (14)를 포함할 수 있다. 밸브 (14)는 도면에서 백색 원으로 확인된다. 바람직한 실시양태에서, 밸브는 전기기계식 핀치 밸브일 수 있다. 또다른 실시양태에서, 밸브는 공압식 밸브일 수 있다. 또다른 실시양태에서, 밸브는 수압식 밸브 또는 기계식 밸브일 수 있다. 바람직하게는, 이같은 밸브들은 레버에 커플링될 수 있는 제어 시스템에 의해 활성화된다. 레버를 수동으로 조작하여 레버가 활성화되도록 할 수 있다. 자동화된 실시양태에서, 제어 시스템은 레버뿐만 아니라, 미리 정해진 활성화 조건에서 밸브를 활성화시킬 수 있는 프로세싱 장치에 커플링될 수 있다. 특정한 자동화된 실시양태에서, 밸브의 활성화는 프로세스가 최적화될 수 있도록 부분적으로는 자동화되고 부분적으로는 사용자의 선호도에 맞춰질 수 있다. 또다른 실시양태에서, 특정 밸브는 수동으로 작동되고 다른 밸브들은 프로세싱 장치를 통해 자동으로 작동될 수 있다. 밸브 (14)는 또한, 1개 이상의 펌프, 예를 들어 연동 펌프 (34) 또는 용적형 펌프(positive displacement pump) (도시되지 않음)와 함께 사용될 수도 있다. 도관 (12) 및/또는 밸브 (14)는 시스템을 통해 흐르는 다양한 유체 성분 및 액체 수준을 구별할 수 있는 센서 (29), 예를 들어 광학 센서, 초음파 센서, 압력 센서 또는 당업계에 공지된 기타 형태의 모니터로 구성될 수도 있다. 바람직한 실시양태에서, 센서 (29)는 광학 센서일 수 있다.
시스템은 또한, 복수 개의 필터 (36)을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 필터는 시스템의 챔버 (28) 내에 있을 수 있다. 시스템 내의 상이한 챔버는 상이한 필터로 구성될 수 있다. 필터는 바람직하지 않은 세포 및 시스템에 따라 사용될 수 있는 해리제로부터 재생 세포, 예를 들어 줄기 세포 및/또는 선조 세포를 분리하는데 효과적이다. 한 실시양태에서, 필터 조립체 (36)은 중공사 여과 장치를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 필터 조립체 (36)은 침출식 여과 장치를 포함하고, 이는 침강 프로세스와 함께 사용될 수 있거나 사용되지 않을 수 있다. 추가의 실시양태에서, 필터 조립체 (36)은 원심분리 장치를 포함하고, 이는 수력분급 장치 및 프로세스와 함께 사용될 수 있거나 사용되지 않을 수 있다. 또다른 실시양태에서, 시스템은 이러한 필터 장치들의 조합을 포함한다. 본 발명의 여과 기능은 콜라겐, 유리 지질, 유리 지방세포 및 잔류 콜라게나제와 같은 것들을 최종 농축물로부터 제거하는 일부 필터 및 최종 생성물을 농축하는데 사용되는 기타 필터에 의해 2배가 될 수 있다. 시스템의 필터는 직경 및/또는 길이가 20 내지 800 ㎛ 범위인 복수 개의 공극을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 수집 챔버 (20)은 복수 개의 80 내지 400 ㎛ 범위의 공극을 갖는 예비고정된 필터 (28)을 갖는다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 수집 챔버 (20)은 복수 개의 265 ㎛ 공극을 갖는 예비고정된 필터 (28)을 갖는다. 또다른 실시양태에서, 필터는 탈착가능하고/하거나 1회용일 수 있다.
시스템은 또한, 시스템의 1개 이상의 챔버 내에 함유된 물질의 온도를 조절하도록 위치하는 1개 이상의 온도 제어 장치 (도시되지 않음)로 구성될 수도 있다. 온도 제어 장치는 가열기, 냉각기 또는 이들 둘 다일 수 있고, 즉 가열기와 냉각기 사이에서 전환될 수 있다. 온도 장치는 조직, 해리제, 재현탁제, 헹굼제, 세정제 또는 첨가제를 포함하여, 시스템을 통과하는 임의의 물질의 온도를 조정할 수 있다. 예를 들어, 지방 조직을 가열하는 것은 해리를 용이하게 하는 반면, 재생 세포 산출물을 냉각하는 것이 생존력 유지에 바람직하다. 또한, 예비-가온된 시약이 최적의 조직 프로세싱에 필요한 경우에, 온도 장치의 역할은 온도를 상승 또는 저하시키는 것보다는 미리 정해진 온도를 유지하는 것일 것이다.
밀폐된 무균 유체/조직 경로를 유지하기 위하여, 모든 포트 및 밸브는 시스템의 밀봉된 배열을 유지시키는 클로저(closure)를 포함할 수 있다. 클로저는 유체, 공기 및 기타 오염물에 불투과성인 막일 수 있거나, 또는 당업계에 공지된 임의의 기타 적절한 클로저일 수 있다. 또한, 시스템의 모든 포트는, 시스템의 무균성을 손상시키지 않으면서 챔버 내의 물질을 배출시키기 위한 주사기, 바늘 또는 기타 장치를 수용할 수 있도록 고안될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 조직은 당업계에 인식된 임의의 방법을 통해 환자로부터 추출될 수 있다. 흡인된 조직이 프로세싱을 위해 시스템에 배치되기 전에 추출될 수 있다. 흡인된 조직은 밀봉된 출입 포트, 예컨대 고무 격막으로 밀폐된 주사기 바늘 진입 포트 (수집 챔버 상에 도시되지 않음)를 통해 도관 (12)를 지나 수집 챔버 (20)으로 전형적으로 옮겨진다. 별법으로, 조직 추출 단계는 시스템의 일부일 수 있다. 예를 들어, 수집 챔버 (20)은 환자 내로 삽입된 표준 캐뉼라를 사용하여 조직 제거를 용이하게 하는 진공 라인 (11)으로 구성될 수 있다. 따라서, 이러한 실시양태에서는 전체 시스템이 환자에게 부착된다. 조직은 밀폐된 멸균 경로의 일부인 (12a)와 같은 도관을 통해 입구 포트 (21)를 지나 수집 챔버 (20) 내로 도입될 수 있다. 수집 챔버 (20)은 복수 개의 가요성 또는 강성 캐니스터(canister) 또는 실린더 또는 이들의 조합으로 구성될 수 있다. 예를 들어, 수집 챔버 (20)은 다양한 크기의 1개 이상의 강성 캐니스터로 구성될 수 있다. 또한, 수집 챔버 (20)은 1개 이상의 가요성 백(bag)으로 구성될 수도 있다. 이같은 시스템에서, 백에 흡입을 적용할 때 백이 붕괴될 가능성을 감소시키는 것을 돕는 지지체가 백에 제공되는 것이 바람직하고, 예컨대 백이 내부 또는 외부 프레임 내에 제공된다. 수집 챔버 (20)은 프로세싱 챔버 (30)에서 수행된 프로세스의 세정 및 농축 단계 전에 조직을 적합하게 세정하고 해리시키는데 필요한 양의 염수를 보유하도록 크기조절된다. 바람직하게는, 수집 챔버 (20)에 존재하는 조직 또는 유체의 부피는 육안으로 쉽게 확인가능하다. 예를 들어, 지방 조직으로부터 재생 세포를 수득하기 위해, 적절한 수집 챔버의 용량은 지방흡인물 800 ㎖ 및 염수 1200 ㎖를 보유하는 것이다. 따라서, 한 실시양태에서, 수집 챔버 (20)의 용량은 적어도 2 리터이다. 또다른 실시양태에서, 혈액으로부터의 적혈구 세포의 분리 및 농축을 위해, 수집 챔버 (20)은 용량이 적어도 1.5 리터이다. 일반적으로, 수집 챔버 (20)의 크기는 환자로부터 수집된 조직의 유형 및 양에 따라 변할 것이다. 수집 챔버 (20)은 약 5 ㎖ 내지 최대 약 2 리터까지 적은 양의 조직을 보유하도록 크기조절될 수 있다. 더 작은 조직 부피, 예를 들어 5 ㎖ 내지 100 ㎖에 대해서는, 수집 챔버 (20)으로 옮기기 전에 조직을 주사기에 취합할 수 있다.
멸균될 수 있는 임의의 적절한 생체적합성 물질을 사용하여 수집 챔버 (20)를 구축할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 수집 챔버 (20)은 ISO 10993 표준에 기술된 혈관내 접촉을 위한 생체적합성 요건을 충족시키는 일회용 물질로 구축된다. 예를 들어, 폴리카르보네이트 아크릴 또는 ABS를 사용할 수 있다. 수집 챔버 (20)의 유체 경로에는 바람직하게는 발열원이 없으며, 즉 질환 전염의 위험 없이 혈액 사용에 적합하다. 한 실시양태에서, 수집 챔버 (20)은 사용자가 챔버 내에 존재하는 조직의 대략적인 부피를 가시적으로 결정할 수 있게 하는 물질로 구축된다. 또다른 실시양태에서, 수집 챔버 (20) 내의 조직 및/또는 유체의 부피는 자동화 센서 (29)에 의해 결정된다. 자동화 시스템에서, 시스템이 합당한 정도의 정확성으로 챔버 내의 조직 및/또는 유체의 부피를 결정할 수 있도록 수집 챔버 (20)이 고안되는 것이 바람직하다. 바람직한 실시양태에서, 시스템은 ±15％의 정확성으로 수집 챔버 내의 부피를 감지한다.
예로서 제공되는 특정 실시양태에서, 수집 챔버 (20)은 경질 챔버, 예를 들어, 메쉬 크기가 265 ㎛인 의료 등급 폴리에스테르의 대략 원뿔형인 예비고정된 필터 (28)을 포함하는 의료 등급 폴리카르보네이트로 구축된 챔버의 형태이다 (도 5 참조). 경질의 조직 수집 용기는 높이 약 8 인치 및 직경 약 5 인치의 크기일 수 있고, 벽 두께는 약 0.125 인치일 수 있다. 예를 들어, 흡입 튜브용의 1개 이상의 포트, 무균 도킹(docking) 기술을 통한 연결용 튜브를 갖는 1개 이상의 포트 및/또는 고무 격막을 통한 바늘 구멍 접근용 1개 이상의 포트를 통해 실린더의 내부에 접근할 수 있다. 예를 들어, 조직이 환자로부터 제거되는 경우, 수집 챔버 (20)의 내부에 예비고정된 필터 (28)은 지방 조직은 유지시키고 비-지방 조직은 통과시키도록 구조화되는 것이 바람직하다. 더욱 구체적으로, 필터 (28)은 지방 조직을 최초로 수확하는 동안 또는 최초 수확 후의 또다른 실시양태에서 지방 조직의 단편은 유지하면서 유리 지질, 혈액 및 염수는 통과시킬 수 있다. 이와 관련하여, 필터 (28)은 동일하거나 상이한 크기이지만, 약 20 ㎛ 내지 5 ㎜ 크기 범위의 복수 개의 공극을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 필터 (28)은 복수 개의 400 ㎛ 공극을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 필터 (28)은 약 265 ㎛의 공극 크기 및 약 47％ 개방 영역을 갖는 두께 약 200 ㎛의 의료 등급 폴리에스테르 메쉬이다. 이러한 물질은 헹구는 동안 조직을 보유하지만, 조직 해리 후에는 세포가 메쉬를 통과하도록 한다. 따라서, 조직이 환자로부터 흡인되는 경우, 비-지방 조직이 지방 조직으부터 분리될 수 있다. 동일한 기능이 물질, 메쉬 크기 및 포트의 갯수 및 유형이 상이한 것으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 100 ㎛ 미만이거나 수천 마이크로미터 정도로 큰 메쉬 공극 크기로, 지방 조직 응집물 및 단편은 유지시키면서 염수 및 혈액 세포를 통과시키는 동일한 목적을 달성할 수 있다. 유사하게, 대안적인 경질 플라스틱 물질의 사용에 의해, 또는 당업자에게 공지되어 있는 다수의 기타 변형에 의해 동일한 목적을 달성할 수 있다.
또한, 시스템 (10)은 1개 이상의 용액 공급원 (22)을 포함할 수 있다. 용액 공급원은 세정 용액 공급원 (23) 및 조직 해리제 공급원 (24), 예컨대 콜라게나제를 포함할 수 있다. 수집 챔버 (20)은 세정 및 해리 용액 또는 작용제가 무균 방식으로 조직에 첨가되게 하는 밀폐된 유체 통로를 포함한다.
세정 용액 (23) 및 해리제 (24)용 용기는 무균 방식으로 내용물을 보유할 수 있는 임의의 적절한 용기, 예를 들어 접을 수 있는 백, 예컨대 임상적 상황에 사용되는 IV 백일 수 있다. 이러한 용기는 세정 용액 및 해리제가 수집 챔버 (20)의 내부에 전달될 수 있도록 수집 챔버 (20)에 커플링된 도관 (12), 예컨대 도관 (12e)를 가질 수 있다. 세정 용액 및 해리제는 염수 (23) 및/또는 해리제 (24)용 용기의 외부에 적용된 단순한 중력압을 포함하는 임의의 당업계에 공지된 방식을 통해, 또는 도관, 예를 들어 도 4에서의 도관 (12d) 상에 용적형 펌프를 배치시킴으로써 수집 챔버 (20)의 내부로 전달될 수 있다. 자동화된 실시양태에서, 시스템의 프로세싱 장치는 사용자가 초기에 입력한 정보 (예를 들어, 프로세싱될 조직의 부피)를 기초로 다양한 파라미터, 예컨대 세정에 필요한 염수의 부피 및 사이클 시간 또는 횟수, 뿐만 아니라 해리제의 농도 또는 양 및 해리에 필요한 시간을 산정한다. 별법으로, 양, 시간 등은 사용자에 의해 수동으로 조작될 수 있다.
수집 챔버 내의 조직 및/또는 유체는 30℃ 내지 40℃의 온도 범위에서 유지되어야 한다. 바람직한 실시양태에서, 수집 챔버 내의 현탁액의 온도는 37℃로 유지된다. 특정 실시양태에서, 수술 절차 또는 치료용 적용이 지연될 필요가 있는 경우, 선택된 조직을 추후 사용을 위해 수집 챔버에 저장할 수 있다. 조직은 약 실온에서 또는 약 4℃에서 96시간까지 저장될 수 있다.
세정 용액은 염수 또는 완충되거나 완충되지 않은 임의의 기타 전해질 용액을 비롯하여, 당업자에게 공지된 임의의 용액일 수 있다. 프로세싱되는 조직의 유형이 사용된 세정 용액의 유형 또는 조합을 지시할 것이다. 전형적으로, 염수와 같은 세정 용액은 지방 조직을 환자로부터 제거하여 수집 챔버 내에 배치한 후에 수집 챔버 (20)에 도입된다. 그러나, 지방 조직을 추출하기 전에 세정 용액을 수집 챔버 (20)으로 전달할 수 있거나, 또는 세정 용액을 지방 조직과 함께 수집 챔버 (20)으로 전달할 수 있다. 수집 챔버 (20)에서, 세정 용액 및 추출된 지방 조직은 하기에 기술된 방법을 포함한 임의의 수단에 의해 혼합될 수 있다.
예를 들어, 진탕에 의해 조직을 세정할 수 있다 (이는 세포 생존력을 최대화시키고, 유리 지질의 방출량을 최소화시킨다). 한 실시양태에서, 전체 수집 챔버 (20)를 다양한 속도, 예를 들어 1분당 약 30회의 회전수로 다양한 각도의 아크(arc)를 통해 (예를 들어, 약 45도 내지 약 90도의 아크를 통해) 회전시킴으로써 조직을 진탕시킨다. 또다른 실시양태에서는, 수집 챔버의 내부 표면에 단단하게 부착된 1개 이상의 패들 또는 돌출부로 구성된 전체 수집 챔버 (20)를 다양한 속도, 예를 들어 1분당 약 30회의 회전수로 다양한 각도의 아크를 통해 (예를 들어, 약 45도 내지 약 90도의 아크를 통해) 회전시킴으로써 조직을 진탕시킨다. 상기 기술된 수집 챔버 (20)의 회전은 수집 챔버 (20)에 부착된 또는 근접한 구동 메커니즘에 의해 수행될 수 있다. 구동 메커니즘은 단순 벨트 또는 기어, 또는 당업계에 공지된 기타 구동 메커니즘일 수 있다. 회전 속도는 예를 들어, 1분당 30회의 회전수일 수 있다. 일반적으로, 더 높은 속도에서 더 큰 부피의 유리 지질이 생성되는 것으로 발견되었고, 이는 최적이 아닐 수 있다.
또다른 실시양태에서, 축이 회전될 때 혼합물을 통과하는, 회전축 (25)에 단단하게 부착된 1개 이상의 패들 (25a) 또는 돌출부로 구성된 회전축 (25)를 수집 챔버 (20) 내부에 배치함으로써 조직을 진탕시킨다. 특정 실시양태에서는, 패들 (25a)이 단단하게 부착된 회전축 (25)를 수집 챔버 (20)의 바닥에 놓을 수 있다. 이는 예를 들어, 패들형 장치를 스피닝(spinning) 자기장 (예를 들어, 자기 교반기) 내에 배치함으로써 수행될 수 있다. 별법으로, 조직의 진탕은 당업계에 공지된 단순 진탕기, 즉 회전없이 위 아래로 진동시키는 장치를 사용하여 수행될 수 있다. 또한, 로킹(rocking), 교반, 반전 등이 포함되는 임의의 당업계에 공지된 수단을 사용하여 조직을 세정할 수 있다.
원하는 양의 세정 사이클 후, 재생 세포를 잔류 지방 조직 성분으로부터 분리하기 위해 조직 해리제를 수집 챔버 (20)에 전달할 수 있다. 해리제는 당업자에게 공지된 임의의 해리제일 수 있다. 사용될 수 있는 해리제로는 중성 프로테아제, 콜라게나제, 트립신, 리파제, 하이알루로니다제, 데옥시리보뉴클레아제, 블렌드자임(Blendzyme) 효소 혼합물 패밀리의 구성원, 예를 들어 리베라제(Liberase) H1, 펩신, 초음파 또는 기타 물리적 에너지, 레이저, 마이크로웨이브, 기타 기계적 장치 및/또는 이들의 조합물이 포함된다. 본 발명의 바람직한 해리제는 콜라게나제이다. 해리제는 다른 용액과 함께 첨가될 수 있다. 예를 들어 염수, 예컨대 상기 기술된 염수 공급원 (23)으로부터 유래된 염수를 콜라게나제와 함께, 또는 콜라게나제의 첨가 직후에 첨가할 수 있다. 한 실시양태에서, 세정한 지방 조직을 37℃ 또는 약 37℃에서 약 20 내지 60분 동안 콜라게나제-함유 효소 용액과 혼합한다. 또다른 실시양태에서, 더욱 높은 농도의 콜라게나제 또는 유사 작용제를 첨가하여 소화 시간을 감소시킬 수 있다. 그후, 세정된 지방 조직이 해리될 때까지 세정된 지방 조직 및 조직 해리제를 상기 기술된 진탕 방법과 유사한 방식으로 진탕시킬 수 있다. 예를 들어, 세정된 지방 조직 및 조직 해리제를 약 90 도의 아크를 통해 수집 챔버 전체를 회전시킴으로써, 축이 회전됨에 따라 용액을 통과하는 하나 이상의 패들을 함유하는 축을 가짐으로써, 및/또는 수집 챔버의 내부 표면 상에 패들 또는 돌출부를 함유하는 수집 챔버 전체를 회전시킴으로써 진탕시킬 수 있다.
지방 유래 세포가 사용될 목적에 따라서, 지방 조직을 부분적으로 해리시키거나, 또는 완전히 해리시킬 수 있다. 예를 들어, 지방 유래 세포를 지방 조직 단위와 조합시키려는 실시양태에서는, 수확된 지방 조직을 부분적으로 해리시키고, 부분적으로 해리된 지방 조직의 일부를 제거한 후, 수집 챔버 내에 남아있는 지방 조직의 나머지 부분을 계속하여 해리시키는 것이 바람직할 수 있다. 별법으로, 세정된 지방 조직의 일부를 제거하고, 임의의 소화 전에 샘플 용기 내에 둔다. 또다른 실시양태에서는, 수확된 지방 조직을 부분적으로 해리시켜 환자 내로 다시 도입하기 전에 세포를 농축시킨다. 한 실시양태에서는, 지방 조직을 일반적으로 약 20 분 미만의 시간 동안 조직 해리제와 혼합한다. 이어서 부분적으로 해리된 조직의 일부를 수집 챔버로부터 제거할 수 있으며, 또다른 40 분 동안 지방 조직을 조직 해리제와 혼합함으로써 나머지의 부분적으로 해리된 조직을 추가로 해리시킬 수 있다. 지방 유래 세포를 본질적으로 순수한 재생 세포 집단으로 사용하려는 경우에는, 지방 조직을 충분히 해리시킬 수 있다.
소화 후, 조직 및 해리제 용액을 용액의 부유성 성분과 비-부유성 성분이 수집 챔버 내에서 구별되기에 충분한 시간 동안 침강시킨다. 전형적으로, 시간은 약 15초 내지 수 분의 범위이지만, 변형된 실시양태에서 다른 시간이 실행될 수 있다. 부유층은 추가적인 세정 및 농축이 필요한 재생 세포로 구성된다. 비-부유층은 혈액, 콜라겐, 지질 및 조직의 기타 비-재생세포 성분으로 구성된다. 비-부유층은 폐기물 챔버로 제거되어야 한다.
따라서, 바람직하게는 수집 챔버 (20)은 조직의 혈액 및 다른 비-부유성 성분이 1개 이상의 도관 (12)를 통해 1개 이상의 폐기물 챔버 (40)으로 배수될 수 있도록 수집 챔버의 가장 낮은 지점의 출구 포트 (22)로 구성된다. 출구 포트 (22)가 수집 챔버의 바닥에 위치하도록 수집 챔버 (20)은 일반적으로 직립 위치로 있거나 또는 직립 위치로 배치될 수 있다. 배수는 수동적 또는 활성일 수 있다. 예를 들어, 상기 기술된 비-부유성 성분을 중력을 이용하여, 양압 또는 음압의 적용에 의해, 펌프 (34)의 사용에 의해 또는 통풍구 (32)의 사용에 의해 배수시킬 수 있다. 자동화된 실시양태에서, 프로세싱 장치는 특정 밸브 및/또는 펌프에 신호를 전달하여 비-부유층이 수집 챔버 (20)에서 배수되도록 할 수 있다. 또한, 자동화된 실시양태는 부유성 액체와 비-부유성 액체 사이의 계면에 도달했을 때를 검출할 수 있는 센서 (29)로 구성될 수 있다. 또한, 자동화된 실시양태는 수집 챔버에서 흘러나오는 도관에서 유동하는 유출물의 빛 굴절 변화를 검출할 수 있는 센서 (29), 예를 들어 광학 센서로 구성될 수 있다. 빛 굴절의 적합한 변화는 바깥으로 향하는 도관 내에 부유층이 존재한다는 것을 신호전달할 수 있고, 이는 비-부유층이 배수되고 없음을 가리킨다. 그후 센서 (29)는 다음 단계로 진행하도록 프로세싱 장치에 신호를 전달할 수 있다.
그러나, 특정 실시양태에서 조직은 조직의 비-재생세포 성분이 회수되도록 프로세싱될 수 있다. 예를 들어, 특정 치료 또는 연구 용도에서 콜라겐, 단백질, 기질 또는 간질 성분, 지질, 지방세포 또는 기타 조직 성분을 원할 수 있다. 이같은 실시양태에서는, 앞에서 기술된 바와 같이 폐기물 챔버로 제거되어야 하는 것은 재생 세포를 포함하는 부유층이다. 그러면 비-부유층이 필요하다면 추후의 프로세싱을 위해 시스템 내에 남게 된다.
일단 비-부유층이 제거되면, 재생 세포를 포함하는 부유층을 1회 이상 세정하여 잔류 오염물을 제거할 수 있다. 따라서, 전형적으로 수집 챔버 (20)은 세정 용액이 챔버 내부로 전달되도록 하기 위한 1개 이상의 포트 (21), 및 폐기물 및 기타 물질이 수집 챔버 (20)으로부터 유출되도록 하기 위한 1개 이상의 포트 (22)를 포함한다. 예를 들어, 수집 챔버는 본원에 기술된 바와 같은 1개 이상의 밀봉된 출입 포트를 포함할 수 있다. 수집 챔버 (20)은 세정 용액이 수집 챔버 내로 전달되고/되거나 폐기물이 유출되는 동안 시스템이 계속 무균 상태인 것을 확실히 하기 위해 하나 이상의 캡 (도시되지 않음), 예컨대 상부 캡 및 하부 캡도 포함할 수 있다. 포트 (21)는 수집 챔버의 캡 상에 또는 수집 챔버의 측벽 상에 제공될 수 있다.
신선한 세정 용액으로 세정하는 공정은 용액 내 비-부유성 오염물의 잔류량이 미리 정해진 수준에 도달할 때까지 반복될 수 있다. 즉, 지방 조직 단편을 포함하여 상기 기술된 혼합물의 부유성 물질을 포함하는 수집 챔버 (20) 내 잔류 물질을 원치 않는 물질의 양이 원하는 미리 정해진 수준에 도달할 때까지 1회 이상 추가로 세정할 수 있다. 세정의 종점을 결정하는 한 방법은 조직 용액 내 적혈구의 양을 측정하는 것이다. 이는 540 nm 파장에서 흡수되는 빛을 측정하여 수행할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 약 0.546 내지 약 0.842 사이의 범위가 허용되는 것으로 간주된다.
세정 및/또는 해리 동안, 하나 이상의 첨가제가 필요에 따라 다양한 용기에 첨가되어 결과를 증강시킬 수 있다. 첨가제의 일부 예로는 세정 및 해리를 최적화하는 작용제, 프로세싱 동안 활성 세포 집단의 생존력을 증강시키는 첨가제, 항균제 (예를 들어, 항생제), 지방세포 및/또는 적혈구를 용해시키는 첨가제, 또는 (고체상 모이어티에의 차등 부착에 의해, 또는 다르게는 세포 집단의 실질적인 감소 또는 강화를 촉진함으로써) 당해 세포 집단을 강화시키는 첨가제가 포함된다. 기타 가능한 첨가제로는 재생 세포의 회복 및 생존력을 촉진하는 것들 (예를 들어, 카스파제 억제제), 또는 주입 또는 설치(emplacement)에 대한 유해 반응 경향을 감소시키는 것들 (예를 들어, 세포 또는 결합 조직의 재응집 억제제)이 포함되다.
충분한 침강 시간이 경과한 후, 생성된 세정된 지방 조직 단편과 조직 해리제 혼합물의 비-부유성 분획은 재생 세포, 예를 들어 줄기 세포 및 기타 지방 유래 선조 세포를 함유할 것이다. 본원에서 논의된 바와 같이, 재생 세포를 함유하는 비-부유성 분획은 프로세싱 챔버 (30)으로 전달되고, 여기에서 당해 재생 세포, 예컨대 지방 유래 줄기 세포가 혼합물의 비-부유성 분획에 존재하는 다른 세포 및 물질들로부터 분리될 것이다. 이러한 비-부유성 분획은 본원에서 재생 세포 조성물로 지칭되고, 줄기 세포, 선조 세포, 내피 전구 세포, 지방세포 및 본원에 기술된 기타 재생 세포를 포함하여 여러 상이한 유형의 세포들을 포함한다. 재생 세포 조성물은 1종 이상의 오염물, 예컨대 지방 조직 단편 내에 존재했던 콜라겐 및 기타 결합 조직 단백질 및 그의 단편, 또는 조직 해리 공정으로부터의 잔류 콜라게나제를 함유할 수도 있다.
바람직하게는, 본 발명의 프로세싱 챔버 (30)은 재생 세포 조성물이 튜브 (12), 밸브 (14) 및 펌프 (34)에 의해 수집 챔버 (20)으로부터 프로세싱 챔버 (30)으로 무균 방식으로 이동하도록 시스템 내에 위치된다. 프로세싱 챔버는 10 ㎖ 내지 1.2 L 범위의 조직/유체 혼합물을 수용하는 크기를 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 프로세싱 챔버는 800 ㎖를 수용하는 크기를 갖는다. 특정 실시양태에서, 수집 챔버 (20)으로부터의 전체 재생 세포 조성물을 프로세싱 챔버 (30)으로 보낸다. 그러나 또다른 실시양태에서는, 재생 세포 조성물의 일부를 프로세싱 챔버 (30)으로 보내고, 또다른 부분은 시스템의 다른 영역, 예를 들어 샘플 챔버 (60)으로 보내서, 이후에 프로세싱 챔버 (30) 내에서 프로세싱된 세포들과 재혼합시킨다.
프로세싱 챔버 (30)은 멸균될 수 있는 임의의 적합한 생체적합성 물질을 사용하여 구축할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 프로세싱 챔버 (30)은 ISO 10993 표준에 기재된 바와 같은 혈관내 접촉을 위한 생체적합성 요건들을 만족시키는 1회용 물질로 구축된다. 예를 들어, 폴리카르보네이트, 아크릴, ABS, 에틸렌 비닐 아세테이트 또는 스티렌-부타디엔 공중합체 (SBC)를 사용할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 1회용 프로세싱 챔버의 유체 경로에는 발열원이 없다 (pyrogen free). 프로세싱 챔버는 플라스틱 백, 예컨대 혈액은행에서 혈액을 프로세싱하는데 통상적으로 사용되는 것들의 형태일 수 있거나, 또다른 실시양태에서는 프로세싱 챔버가 구조적으로 강성일 수 있다 (도 6). 한 실시양태에서, 프로세싱 챔버 (30)은 거명에 의해 전문이 본원에 참고로 포함된, 본원과 공동명의의 미국 출원 제10/316,127호 (2001년 12월 7일 출원) 및 미국 출원 제10/325,728호 (2002년 12월 20일 출원)에 개시된 프로세싱 챔버와 유사할 수 있다.
프로세싱 챔버 (30)은 세포의 여과 및 원심분리 및/또는 이들의 조합을 포함하여 세포의 분리 및 농축에 적절한 임의의 방식으로 구축될 수 있다. 특정 실시양태에서, 수집 챔버 (20)으로부터의 재생 세포 조성물이 프로세싱 챔버 (30)으로 도입되고, 여기에서 조성물이 여과되어 특정 재생 세포 집단이 분리 및/또는 농축될 수 있다. 세포 여과는 특정 성분 및 세포를 다른 상이한 성분 또는 세포 유형으로부터 분리하는 방법이다. 예를 들어, 본 발명의 재생 세포 조성물은 줄기 세포, 선조 세포 및 지방세포를 포함한 여러 상이한 유형의 세포, 뿐만 아니라 한가지 이상의 오염물, 예컨대 지방 조직 단편에 존재했던 콜라겐 또는 조직 해리 공정으로부터의 잔류 콜라게나제를 포함한다. 프로세싱 챔버 (30)에 존재하는 필터 (36)은 특정 하위집단의 재생 세포, 예를 들어 줄기 세포 또는 내피 선조 세포 등이 분리 및 농축되도록 할 수 있다.
액체로부터의 세포의 여과와 관련된 일부 변수들에는 필터 매체의 공극 크기, 공극의 외형 (형상), 필터의 표면적, 여과되는 용액의 유동 방향, 막횡단 압력, 특정 세포 집단의 희석, 미립자 크기 및 형상, 뿐만 아니라 세포 크기 및 세포 생존력이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. 본원의 개시 내용에 따르면, 분리 또는 여과하기를 원하는 특정 세포는 전형적으로 지방 유래 줄기 세포이다. 그러나, 특정 실시양태에서, 특정 세포에는 지방 유래 선조 세포, 예컨대 내피 전구 세포가 단독으로, 또는 줄기 세포와 함께 포함될 수 있다.
재생 세포 조성물을 필터 조립체, 예컨대 필터 조립체 (36)을 통과시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 필터 조립체 (36)은 상이한 기능을 수행하여 재생 세포 조성물을 별개의 부분 또는 성분으로 분리하도록 구조화된 복수 개의 필터를 포함한다. 예를 들어, 필터들 중 하나는 재생 세포 조성물로부터 콜라겐을 분리하도록 설정될 수 있고, 필터들 중 하나는 재생 세포 조성물로부터 지방세포 및/또는 지질 성분을 분리하도록 설정될 수 있고, 필터들 중 하나는 재생 세포 조성물로부터 잔류 효소들, 예컨대 조직 해리제를 분리하도록 설정될 수 있다. 특정 실시양태에서는, 필터들 중 하나가 조성물로부터 콜라겐 및 조직 해리제를 분리하는 것과 같은 2가지 기능을 수행할 수 있다. 복수 개의 필터들은 전형적으로 직렬 배열되나, 적어도 일부의 필터는 병렬로 배열될 수도 있다. 필터 조립체 (36)의 필터들의 직렬 배열이 도 2에 제시된다. 필터 조립체 (36)의 필터들의 병렬 배열이 도 3에 제시된다.
한 실시양태에서, 필터 조립체 (36)은 제1 필터, 제2 필터 및 제3 필터를 포함한다. 제1 필터는 재생 세포 조성물 내에 존재하는 콜라겐 입자를 제거하도록 설정된다. 이러한 콜라겐 입자는 전형적으로 직경이 약 0.1 ㎛이고 길이는 20 ㎛까지일 수 있다. 콜라겐 입자는 소화에 따라 다양한 크기일 수 있다. 이들은 또한, 원섬유(fibril)일 수 있으며, 이는 이들이 꼬임과 회전을 갖는다는 것을 의미한다. 본원에 기술된 모든 필터는 폴리에테르술폰, 폴리에스테르, PTFE, 폴리프로필렌, PVDF, 또는 가능하게는 셀룰로스로부터 제조될 수 있다. 콜라겐을 여과하기 위한 2가지 가능성이 존재한다. 한가지는 더 큰 입자를 먼저 제거하여 세포가 통과하도록 시도하는 것으로, 이는 예를 들어 아마도 10 ㎛ 범위의 필터를 필요로 할 것이다. 두번째 방법은 콜라겐이 잘 소화될 것이라는 계획 하에, 예컨대 4.5 ㎛의 작은 크기의 필터를 사용하여 세포를 포획하고, 콜라겐이 통과되도록 하게 하는 것이다. 이는 세포가 필터로부터 떨어져 부유하도록 하는 수단을 필요로 할 것이다. 또한, 콜라겐 섬유를 유인하여 보유하는 필터를 장착하는 가능성도 있을 수 있다.
제2 필터는 재생 세포 조성물 내에서 부유성이 아닌 유리 미성숙 지방세포를 제거하도록 설정된다. 한 실시양태에서, 제2 필터는 폴리에스테르로 구축될 수 있으며, 공극 크기가 약 30 내지 약 50 ㎛이고, 바람직한 공극 크기는 약 40 ㎛이다. 제2 필터로 지칭되었으나, 이같은 장치의 배치는 보다 큰 세포 및 입자의 초기 제거를 용이하게 하기 위해 두 번째가 아닌 첫 번째 위치일 수 있다. 제3 필터는 조성물 내에 존재하는 미사용 또는 잔류 콜라게나제 또는 기타 조직 해리제를 제거하도록 구성된다. 바람직한 실행에 있어서, 콜라게나제는 시간 경과에 따라 퇴화될 수 있다. 한 실시양태에서, 제3 필터는 직경 또는 길이가 1 ㎛ 미만인 복수 개의 공극을 포함한다. 특정 실시양태에서, 공극의 직경은 1 ㎛ 미만일 수 있다. 또다른 실시양태에서, 공극의 직경은 10 kD 내지 5 ㎛ 사이이다. 특정 실시양태에서, 제3 필터는 본원에 논의된 바와 같이 작은 부피의 염수 또는 다른 세정 용액 내로 재생 세포 집단을 농축시키도록 설정될 수 있다. 본 발명에서 바람직한 바와 같이, 오직 최종 필터만이 중공사 단위이다. 모든 필터가 중공사 유형일 필요는 없다. 중공사 단위는 바람직한 실행에서 최종 필터에 사용되는데, 이는 재생 세포에 최소한의 불리한 영향을 미치면서 콜라게나제를 제거하는데 가장 효율적이기 때문이다. 장치가 기성품의 수집물인 실시양태에서, 세 필터는 별개의 하우징(housing)에 존재한다. 중공사 단위가 제3 필터에 사용되는 경우, 제1 및 제2 필터를 하나의 하우징으로 조합하는 것이 가능하다. 최종 필터가 중공사 구조가 아니면, 세 필터 모두가 한 하우징 내에 존재할 수 있다.
필터 조립체 (36)의 필터는 프로세싱 챔버 (30) 내에 위치하거나, 프로세싱 챔버 (30)과 분리된 성분으로 제공될 수 있다. 또한, 필터 조립체 (36)의 필터는 다중 프로세싱 챔버에, 또는 일렬 방식으로 제공될 수 있다. 특정 실시양태에서, 도관 또는 튜브가 프로세싱 챔버 또는 챔버들로서 기능할 수 있다. 프로세싱 챔버는 필터들을 연결하는 도관의 내부 부피에 알맞도록 크기를 줄일 수 있다. 이러한 유형의 시스템은 조직 용액의 부피가 적절하게 크기 조절된다면 올바르게 기능할 것이다. 따라서, 도관은 세포를 갖는 유체가 필터를 통과하여 러닝될 때 유체를 함유함으로써 프로세싱 챔버로서 기능할 수 있다. 시스템을 프라이밍 및 운전하는 공정 중 세포/조직이 불필요하게 손실되지 않도록 도관의 부피를 최소화시키도록 주의해야 한다.
상기 기술된 실시양태를 참조하면, 세정된 세포 및 잔류 콜라겐, 지방세포 및/또는 소화되지 않은 조직 해리제를 함유하는 재생 세포 조성물을 제1 필터로 보내, 조성물로부터 적어도 일부의, 바람직하게는 실질적으로 모든 콜라겐 입자를 제거함으로써, 여과된 용액 중에 콜라겐 입자가 더 적게 존재하도록, 바람직하게는 없도록 할 수 있다. 그 후, 지방세포 및/또는 소화되지 않은 조직 해리제를 함유하는 여과된 재생 세포 조성물을 제2 필터로 보내, 여과된 재생 세포 조성물로부터 적어도 일부의, 바람직하게는 실질적으로 모든 유리 지방세포를 제거할 수 있다. 이어서, 소화되지 않은 조직 해리제를 함유하는 2회 여과된 재생 세포 조성물을 본원에 논의된 바와 같은 중공사 여과 장치와 같은 제3 필터로 보내, 재생 세포 조성물로부터 소화되지 않은 조직 해리제를 제거하거나 감소시킬 수 있다.
3회 여과된 재생 세포 조성물 (즉, 제1, 제2 및 제3 필터를 통과한 후에 남아 있는 조성물)을 이어서 다중 출구로 보낼 수 있고, 이는 다중 출구를 포함하는 프로세싱 챔버 (30)의 일부를 포함할 수 있다. 이러한 출구들은 필요한 압력을 유지시킬 뿐만 아니라, 수집 챔버 (20), 산출 챔버 (50), 및/또는 폐기물 용기 (40)를 포함할 수 있는 다른 용기로의 도관을 통한 연결부를 제공할 수 있다.
한 실시양태에서, 필터 조립체 (36)의 필터는 중공사 여과 부재를 포함한다. 또는, 즉, 필터는 필터 매체로 형성된 중공 튜브의 수집물을 포함한다. 개시된 시스템 (10)에 사용될 수 있는 필터 매체의 예로는 폴리술폰, 폴리에테르술폰 또는 혼합 에스테르 물질 등이 포함된다. 필터 매체의 이러한 중공사 또는 중공 튜브는 필터 조립체 (36)의 원통형 카트리지 내에 함유될 수 있다. 필터 매체의 개개의 튜브 또는 섬유는 전형적으로 내부 직경이 약 0.1 ㎜ 내지 약 1 ㎜이며, 바람직한 값은 약 0.5 ㎜이다. 적합한 원통형 카트리지의 직경 및 길이는 카트리지의 내부에 배치될 수 있는 필터 매체의 개개의 튜브의 수를 결정할 것이다. 적절한 중공사 필터 카트리지의 일례는 FiberFlo® 접선방향 유동 필터, 카탈로그 #M-C-050-K (Minntech, Minneapolis, Minnesota)이다. 필터 매체의 공극 크기는 약 10 kDa 내지 약 5 ㎛ 범위일 수 있으며, 바람직한 공극 크기는 약 0.5 ㎛이다.
중공사 필터에서, 각각의 중공 튜브는 제1 연부, 제2 연부, 및 동체 내에 위치하고 제1 연부와 제2 연부 사이에서 연장되는 루멘을 갖는다. 각각의 중공 튜브의 동체는 복수 개의 공극을 포함한다. 공극은 도 12A에 제시된 바와 같이, 일반적으로 재생 세포 조성물이 동체의 루멘을 통해 유동함으로써 여과되고, 여과될 생성물이 공극을 접선방향으로 통과하도록 동체 내에 배향된다. 즉, 액체 중 작은 입자는 동체의 루멘을 통해 유체의 유동에 대해 공극을 접선방향으로 통과한다. 재생 세포를 함유하는 조성물은 조성물이 여과될 때 각각의 중공 튜브의 루멘을 통과한다. 바람직하게는, 조성물의 유동은 각각의 중공 튜브의 동체의 공극에 대해 접선방향이다.
액체의 접선 방향 유동을 이용함으로써, 줄기 세포의 여과 효율이 다른 여과 기술에 비해 향상될 수 있다. 예를 들어, 일부 여과 기술에 따르면 도 12B에 예시된 바와 같이, 필터 매체의 공극은 필터가 유체의 유동에 대해 수직으로 배향되어 필터 매체가 여과될 액체의 경로를 차단하는 방식으로 배치된다. 이러한 유형의 여과에 있어서, 재생 세포 조성물로부터 여과되는 입자, 예를 들어 줄기 세포가 필터의 한쪽 면에 쌓여서 공극을 통한 유체의 유동을 차단하는 경향이 있다. 이러한 차단은 필터의 효율을 저하시킬 수 있다. 또한, 세포가 유체 유동의 압력, 뿐만 아니라 필터의 상류쪽에 축적되는 세포의 무게에 의해 지속적으로 압착된다. 이는 줄기 세포의 용해를 증가시킬 수 있다. 따라서, 유체의 유동이 필터 공극의 배향과 평행한 여과 기술에서는, 유체가 공극을 통과할 때 대형 세포 및 소형 입자 모두가 원치않게 필터 매체에 대해 이동될 수 있다. 따라서, 액체 내의 세포와 같은 더 큰 생성물이 공극을 차단하여, 여과 효과를 감소시키고 세포 파쇄 또는 손상의 발생을 증가시킬 수 있다.
이와 반대로, 본 발명의 시스템 (10)에 따른 중공사 구조에서는, 여과되는 유체가 중공 튜브의 루멘 내부에서 유동하게 된다. 필터 동체의 공극을 통과하는 능력을 갖는 유체의 부분은 동체 내부에 가해지는 유체의 양압, 뿐만 아니라 동체의 외부에서 가해지는 음압의 도움을 받아 공극을 통과한다. 이러한 실시양태에서는, 세포는 전형적으로 다른 세포 무게 또는 유체 유동의 압력을 받지 않게 되고, 이에 따라 줄기 세포에 대한 전단력이 감소된다. 따라서, 막힘(clogging) 비율의 감소 및 재생 세포의 용해 감소에 의해 여과 효율 및 효과가 증강될 수 있다. 염수 및 원치않는 단백질 분자의 크기로 인해, 이러한 분자들 및 기타 소형 성분들은 여과시에 중공 튜브 동체의 공극을 통과해서 중공 튜브 밖으로 나가 폐기물 용기 (40)으로 보내진다. 한 실시양태에서, 중공 튜브 필터 매체 외부에 진공을 생성시킴으로써 여과가 증강된다. 재생 세포, 예를 들어 줄기 세포 또는 선조 세포는 크기 때문에, 전형적으로 상기 동체의 공극을 통과할 수 없고, 따라서 중공 튜브 필터의 내부 (예를 들어, 튜브의 루멘 내)에 잔류하게 되며, 필터와 프로세싱 챔버 사이의 도관을 통해 프로세싱 챔버 (30)으로, 또는 산출 챔버 (50)으로 다시 보내진다.
한 구체적인 실시양태에서, 중공사 필터의 공극 크기는 약 0.05 ㎛이고, 약 550 ㎠ 표면적의 필터 매체를 함유한다. 각 매체 튜브의 직경은 전형적으로 약 0.5 ㎜이다. 재생 세포 조성물 130 ㎖의 프로세싱에서, 약 120 ㎖의 추가 염수가 조성물에 첨가될 수 있다. 프로세싱 또는 여과 시간은 약 8분일 수 있다. 중공사 튜브의 동체 중 어느 한쪽 면에서의 압력차 (예컨대, 동체 루멘 내부 및 동체 외부의 압력)는 막-횡단 압력으로 간주된다. 막-횡단 압력은 약 1 ㎜Hg 내지 500 ㎜Hg의 범위일 수 있으며, 바람직한 압력은 약 200 ㎜Hg이다. 중공사 여과를 이용한 평균 유핵 세포 회수율 및 생존율은 생존 세포 약 80％일 수 있다.
이같은 시스템에서 전형적으로 제거되는 콜라게나제의 양은 3의 대수 감소치와 동등하다. 예를 들어, 수집 챔버에서 프로세싱 챔버로 전달되는 재생 세포 조성물 내의 초기 콜라게나제 농도가 0.078 U/㎖인 경우, 최종 재생 세포 조성물의 콜라게나제 농도는 0.00078 U/㎖일 것이다. 콜라게나제는 중공사 필터에서 제거되고, 중공사 필터는 하기 논의되는 제3 필터에 해당한다.
상기 기술된 한가지 이상의 세포 여과 방법을 예시하는 프로세싱 챔버가 도면, 특히 도 1 내지 3에 제시된다. 도 1 내지 3을 참조하면, 프로세싱 챔버 (30)과 필터 조립체 (36)의 여과 챔버 사이에 펌프 (34)와 같은 펌프가 제공될 수 있다. 또한, 통풍구 (32) 및 압력 센서 (39)와 같은 통풍구 및 압력 센서가 프로세싱 챔버 (30) 및 필터 조립체 (36)과 일렬로 제공될 수 있다. 산출 챔버 (50)용 부속품도 제공될 수 있다. 이러한 임의 성분 (예를 들어, 펌프 (34), 통풍구 (32), 압력 센서 (39), 및 산출 챔버 (50)용 부속품)은 프로세싱 챔버 (30)에 함유된 액체가 이러한 임의 성분들을 통과하여 유동된 후에 필터 조립체 (36)로 통과될 수 있도록 프로세싱 챔버 (30)과 필터 조립체 (36) 사이에 제공될 수 있다. 예를 들어, 액체는 필터 조립체 (36)으로 통과하기 전에 펌프 (34)를 통해 유동할 수 있다. 또는, 필터 조립체를 통과하기 전에 액체가 압력 센서 (39)를 통과하여 시스템의 예비-필터 액체 압력을 수득할 수 있다. 특정 상황에서는, 1가지 이상의 이러한 성분들이 도 6에 예시된 바와 같은 통풍구 (32)와 같이 프로세싱 챔버 (30)의 요소로서 제공될 수도 있다. 예시된 실시양태에서, 압력 센서 (39)는 재생 세포 조성물이 필터 조립체 (36)의 여과 챔버로 들어갈 때 펌프 (34)에 의해 생성되는 상기 조성물의 압력을 결정하기 위해 일렬로 배열된다. 이러한 구축은 필터 막을 가로지르는 막-횡단 압력의 모니터링을 용이하게 할 수 있다. 추가적인 염수 또는 기타 완충액 및 세정 용액이 재생 세포 조성물에 첨가되어, 조성물이 필터 조립체 (36)을 통해 여과될 때 원치않는 단백질의 제거를 도울 수 있다. 이러한 반복 세정을 여러 번 수행하여 재생 세포의 순도를 증강시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 염수는 여과를 증강시키는데 필요하다고 간주되는 어떠한 단계에서도 첨가될 수 있다.
본 발명을 제한하려는 의도가 아니라 단지 예로써 제공되는 한 구체적인 실시양태에서, 원치않는 단백질 및 염수 또는 기타 세정 용액은 하기의 방식으로 제거된다. 재생 세포, 뿐만 아니라 콜라겐 및 결합 조직 입자 또는 단편, 지방세포, 및 콜라게나제를 포함하는 조성물은 최소 부피에 도달할 때까지 일련의 필터를 통해 순환된다. 최소 부피는 시스템의 총 정체(hold up) 부피 및 몇몇 예정된 상수의 함수이다. 정체 부피는 모든 프로세싱 챔버가 비어있는 경우에 튜브 및 도관에 함유되어 있는 액체의 부피이다. 한 실시양태에서, 최소 부피는 15 ㎖이다. 최소 부피에 도달했을 때, 예정된 부피의 세정 용액이 시스템으로 도입되어 재생 세포 조성물과 혼합된다. 이어서, 세정 용액과 재생 세포 조성물의 혼합물은 최소 부피에 다시 도달할 때까지 필터를 통해 순환된다. 이러한 순환을 여러 번 반복하여 재생 세포의 순도를 증강시킬 수 있고, 즉, 조성물 내의 다른 물질에 비해 조성물 내의 재생 세포 비율을 증가시킬 수 있다. 도 10 및 11 참조.
재생 세포 조성물에서 원치않는 단백질이 소거되었고 조성물이 충분히 농축된 것으로 결정된 후 (예시적 실시양태에서는 약 1×105 내지 약 1×107개 세포/㎖ 범위의 최소 농도가 이용될 수 있고, 바람직한 실시양태에서는 최소 농도가 약 1×107개 세포/㎖일 수 있음), 산출 백과 같은 산출 챔버 (50)이 특정 실시양태에 따라 프로세싱 챔버 (30) 및/또는 필터 조립체 (36)의 출구 포트에 연결될 수 있다. 이어서, 통풍구 (32)와 같은 통풍구가 개방되어 농축된 재생 세포의 배출을 용이하게 할 수 있다. 한 실시양태에서, 언제 최소 농도에 도달했는지에 대한 이러한 결정은 실험을 실시하여 전자 제어 장치에 프로그래밍한 후에 경험적으로 결정하였다. 결정은 무엇을 수득하려고 하는 것인지, 즉, 얼마나 많은 줄기/선조 세포를 원하는지, 또는 세포 농도 범위를 프로세스 내로 입력하는 것일 수 있다. 과학적 데이타에 근거하여 미리 정해진 양의 지방 조직을 수득하고 시스템에 배치시켜, 원하는 출력을 달성할 필요가 있다. 통풍구 (32)가 개방되면, 펌프 (34)와 같은 펌프는 농축된 재생 세포를 산출 백으로 전달하는 기능을 할 수 있다. 한 실시양태에서, 산출 백 (50)은 한쪽 말단에 부속품이 있는 튜브를 갖는, 비어있는 혈액 백과 유사하다. 무균 방식으로, 산출 백의 부속품은 출구 포트에 부착될 수 있고, 농축된 재생 세포는 산출 백으로 전달될 수 있다.
도 1 내지 3에 예시된 바와 같이, 진공 펌프 (26)을 시스템 (10) 내에 제공하여 특히 시스템 내의 압력을 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 진공 펌프 (26)이 도관 (12b)와 같은 도관을 통해 수집 챔버 (20)으로 커플링되어 수집 챔버 (20) 내의 압력 감소를 야기할 수 있다. 또한, 진공 펌프 (26)이 도관 (12g)와 같은 도관에 의해 프로세싱 챔버 (30)으로 커플링될 수 있다. 펌프 (34)와 연결된 진공 펌프 (26)의 작동과 관련해서, 2개의 분리된 진공 펌프 또는 공급원을 사용할 수 있거나, 공정 중의 특정 지점에서 진공 인력을 필요로 하는 여러가지 도관으로 이를 향하게 하는 밸브를 이용함으로써 단일한 진공 펌프 또는 공급원을 사용할 수 있다. 또한, 진공 펌프 (26)은 도관 (12f)와 같은 도관을 통하여 폐기물 용기 (40)에 커플링될 수 있다.
도 10 및 11을 참조로, 진공 펌프 (26)에 의해 생성된 압력을 이용하여 재생 세포를 포함하는 유체의 유동을 도관 (12)를 통하여 향하도록 할 수 있다. 이러한 압력은 예를 들어, 시스템 (10)에서의 하나 이상의 밸브 (14)의 위치를 자동으로 또는 수동으로 제어함으로써, 여러 방향에서 공급될 수 있다. 시스템 (10)은 양압 또는 음압을 사용하거나 이의 조합을 통해 적절하게 기능하도록 만들어질 수 있다. 예를 들어, 재생 세포를 상기 기술된 제1 및 제2 필터를 통해 제3 필터와 연결된 연질 측면의 용기로 끌어들일 수 있다. 연질 측면의 용기는 제3 필터의 앞에 일렬로 (직렬) 연결될 수 있다. 최종 산출 챔버는 제3 필터의 다른 쪽 (예를 들어 하류쪽)에 있는 연질 측면의 용기일 수 있다. 이러한 실시양태에서, 압력을 사용하여 재생 세포를 한 연질 측면의 용기에서 제2 연질 측면의 용기로 필터를 통해 이동시킨다.
시스템 (10)의 또다른 실시양태에서, 줄기 세포 및/또는 지방 유래 선조 세포의 여과를 침출식 여과 및 침강의 조합을 이용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 이같은 시스템은 조직 재생 세포 조성물 (예를 들어 줄기 세포 및/또는 지방 유래 선조 세포를 함유하는 조성물)을 통과한 후 필터를 통과하는 염수를 사용한다. 재생 세포 조성물로부터의 세포의 침출식 여과와 관련된 일부 변수로는 필터 매체의 공극 크기, 공극 외형 또는 형상, 필터의 표면적, 여과될 재생 세포 조성물의 유동 방향, 주입된 염수의 유속, 막-횡단 압력, 세포 집단의 희석, 세포 크기 및 생존력이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
시스템 (10)의 한 실시양태에서, 프로세싱 챔버 (30)은 재생 세포의 분리 및 농축을 위해 침출식 여과 및 침강을 이용하는 필터 조립체 (36)을 사용한다. 비제한적인 예로서, 프로세싱 챔버 (30)은 도 6에 제시된 바와 같이 측벽 (30a), 상부 표면 (30b) 및 하부 표면 (30c)를 갖는, 일반적으로 원통형인 동체로서 정의된다. 무균 통풍구 (32)는 상부 표면 (30b)에 제공된다.
도 6의 실시양태에서, 프로세싱 챔버 (30)은 대형 공극 필터 (36a) 및 소형 공극 필터 (36b)와 같은 2개의 필터를 포함하는 필터 조립체 (36)을 포함하는 것으로 예시된다. 필터 (36a) 및 (36b)의 공극 크기는 전형적으로 약 0.05 ㎛ 내지 약 10 ㎛의 범위이다. 대형 공극 필터 (36a)는 직경이 약 5 ㎛인 공극을 포함할 수 있고, 소형 공극 필터 (36b)는 직경이 약 1 내지 3 ㎛인 공극을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 필터의 표면적은 약 785 ㎟이다. 필터 (36a) 및 (36b)는 제1 챔버 (37a), 제2 챔버 (37b) 및 제3 챔버 (37c)를 포함하도록 프로세싱 챔버 (30)의 내부를 분할한다. 도 6에 제시된 바와 같이, 제1 챔버 (37a)는 제2 챔버 (37b)와 제3 챔버 (37c) 사이에 위치한다. 또한, 제1 챔버 (37a)는 입구 포트 (31a) 및 출구 포트 (31b)를 갖는 프로세싱 챔버 (30)의 영역인 것으로 제시된다. 예시된 프로세싱 챔버 (30)은 프로세싱 챔버 (30)의 외부에서 프로세싱 챔버 (30)의 내부로 소통 통로를 제공하는 복수 개의 포트, 예를 들어 포트 (31a), (31b) 및 (31c)를 포함한다. 포트 (31a), (31b) 및 (31c)는 프로세싱 챔버 (30)의 동체의 측벽 (30a)에 위치하는 것으로 예시된다. 그러나, 포트 (31a), (31b) 및 (31c)는 다른 영역에도 위치할 수 있다. 포트 (31a)는 재생 세포를 함유하는 조성물이 프로세싱 챔버 (30)의 내부로 통과할 수 있도록 도관에 커플링되도록 구축된 샘플 입구 포트로서 예시된다. 포트 (31b)는 분리 및 농축된 세포가 프로세싱 챔버 (30)의 내부로부터 제거될 수 있도록 도관에 커플링되도록 구축된 출구 포트로서 예시된다. 포트 (31c)는 염수와 같은 신선한 세정 용액을 프로세싱 챔버 (30)의 내부로 전달하기 위한 도관에 커플링되도록 구축된 입구 포트로서 예시된다.
사용시에, 재생 세포는 입구 포트 (31a)를 통해 중앙 챔버 (37a)로 도입될 수 있다. 염수 또는 다른 완충액은 입구 포트 (31c)를 통해 하부 챔버 (37b)로 도입된다. 염수는 약 10 ㎖/분의 속도로 챔버 (37a) 내의 재생 세포 조성물을 통하여 향할 수 있다. 염수의 유속은 중력을 거스르는 정도이다. 염수의 유동은 챔버 내의 세포에게 세포의 밀도를 기초로 분리되는 능력을 제공한다. 전형적으로, 염수를 조성물을 통해 밀어 올릴수록, 조성물 내의 보다 큰 세포들은 중앙 챔버 (37a)의 하부로 침강될 것이고, 보다 작은 세포 및 단백질은 제2 필터 (36b)를 통해 상부 챔버 (37c)로 운반될 것이다. 이러한 여과는 보다 큰 세포는 제자리에서 구르고, 보다 작은 입자는 자유로워져 염수와 함께 쓸려 나가도록 염수의 유속을 조정함으로써 달성된다. 멸균 통풍구 (32)는 정확한 압력 구배가 프로세싱 단위 내의 3개의 챔버 내에서 확실히 유지되도록 챔버 (30) 내에 포함된다. 상부 챔버 (37c)는 흡수성 매질 (33)을 포함할 수 있다. 흡수성 매질의 목적은 예를 들어 염수 유속이 감소될 때, 용액 중의 원치않는 단백질이 다시 프로세싱 용액 내로 필터 매체를 가로지르지 않는 것을 확실하게 하도록 이러한 단백질을 포획하는 것이다. 흡수성 매질은 여과해 낼 물질 또는 성분을 흡수하거나 유인하는 일종의 필터 물질일 수 있다. 유출 포트를 상부 필터의 위쪽에 첨가하여 폐기물 배출을 보조할 수 있다. 이의 또다른 실시양태는 상부로부터 완만한 진공을 적용하여 폐기물 인출을 보조하는 것일 수 있다. 흡수성 매질은 예시된 실시양태에서와 같이, 유속이 비교적 작은 경우 이용할 수 있다. 그 후, 과량의 염수 및 단백질을 폐기물 용기로 빼낼 수 있다.
보다 큰 세포 (예를 들어, 지방 유래 줄기 세포 및/또는 선조 세포)가 보다 작은 세포 및 단백질로부터 충분히 분리되었을 때, 본원에 논의된 바와 같이, 분리된 세포를 함유하는 조성물을 농축할 수 있다. 조성물은 출구 포트 (31b)를 통해 챔버 (37a)로부터 제거된 후, 또는 챔버 (37a) 내에 있는 동안에 추가로 농축될 수 있다. 한 실시양태에서, 조성물 중 세포의 농도가 하기의 방식으로 증가된다. 세포를 충분히 분리해 낸 후, 필터, 예컨대 필터 (36a) 및 (36b)를 서로를 향해 이동시킬 수 있다. 이러한 이동은 2개의 필터 사이의 부피 (예를 들어 챔버 (37a)의 부피)를 감소시키는 효과가 있다. 또한, 진동 부재가 프로세싱 챔버 (30)과 함께 제공되어, 조성물 내의 세포의 농축을 용이하게 할 수 있다. 한 실시양태에서, 진동 부재는 필터 (36b) (예를 들어, 소형 공극 필터)에 커플링될 수 있다. 진동은 필터 내에 포획되게 되는 세포의 빈도를 감소시킬 수 있다. 조성물의 부피 감소는 과량의 염수가 폐기물로서 제거되도록 하고, 세포가 보다 작은 부피로 농축되도록 한다.
또다른 실시양태에서, 재생 세포의 농축은 하기의 방식으로 수행된다. 세포가 충분히 분리된 후, 재생 세포 조성물을 과잉의 염수를 중력을 사용하여 여과 제거하는 또다른 챔버 (제시되지 않음)로 옮길 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 침강이 침출과 동시에 발생할 수 있다. 이러한 침강은 공극 크기가 약 10 kD 내지 약 2 ㎛인 필터의 상부에 조성물을 도입함으로써 수행될 수 있다. 한 실시양태에서, 적절한 필터의 공극 크기는 약 1 ㎛이다. 중력은 조성물 내의 세포가 필터를 통해 흘러나가는 것을 방지하면서 염수 및 보다 작은 입자들은 필터를 통과하도록 할 것이다. 원하는 세포 농도를 수득한 후, 그리고 여과된 보다 작은 입자들을 필터 아래쪽으로부터 제거한 후, 재생 세포 조성물을 진탕시켜 필터로부터 세포를 제거할 수 있고, 이어서 농축된 재생 세포를 산출 백으로 옮길 수 있다. 보다 작은 입자들은 출구를 통해 폐기물로서 버려질 수 있다.
특정 실시양태에서, 수집 챔버 (20)으로부터의 재생 세포 조성물을 프로세싱 챔버 (30)으로 운반하고, 여기서 조성물을 원심분리하여 재생 세포를 분리 및 농축할 수 있다. 원심분리의 원리는 당업계에 주지되어 있으므로, 간소함을 위해 본원에서는 반복되지 않을 것이다. 당업계에 알려진 표준적인 원심분리 장치, 성분 및 파라미터가 본원에서 사용된다. 원심분리 장치의 일부로서 사용하기 위한 예시적인 프로세싱 챔버가 도 7 및 도 8에 제시된다. 전형적으로 원심분리 장치는 원심분리 챔버 (예컨대 도 7에 제시된 것)를 축 주위로 스피닝시킴으로써 용액 내의 세포에 작용하는 힘을 중력보다 크게 증가시킨다. 용액 중의 더 치밀하거나 또는 더 무거운 물질은 전형적으로 원심분리 챔버의 한쪽 말단, 즉, 도 7의 산출 챔버 (50)으로 침강되어 재생 세포 펠렛을 형성할 것이다. 그 후에, 펠렛을 재현탁하여 원하는 농도의 세포 및/또는 원하는 부피의 세포 및 매질을 갖는 용액을 수득할 수 있다. 도 7에 제시된 프로세싱 챔버는 원심력 및 중력 모두를 사용하여 세포를 분리 및 농축하도록 구축된다. 구체적으로, 원심분리 동안, 원심력은 재생 세포 조성물의 더욱 치밀한 성분, 예를 들어 재생 세포를 원심분리 챔버의 최외곽 말단으로 보낸다. 원심분리 챔버가 속도를 줄이면서 마침내 멈추었을 때, 중력은 재생 세포가 원심분리 챔버의 최외곽 말단에 남아 세포 펠렛을 형성하도록 돕는다. 따라서, 세포 펠렛을 저해하지 않으면서 재생 세포 조성물의 원치않는 성분, 즉 폐기물을 제거할 수 있다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 프로세싱 챔버는 스피닝 막 필터 형태의 세포 농축기로 구성될 수 있다. 원심분리 공정의 추가적인 실시양태에서, 원심 수력분급도 적용할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 원심분리에 의해 인가된 방향성 (예컨대 외향성) 힘이 세포 및 용질을 서로 다른 속도로 침강시키도록 개별적인 세포 침강 속도를 기초로 세포를 분리할 수 있다. 수력분급에서, 표적 세포 집단의 침강 속도는 원심력과 반대 방향으로 용액을 펌핑함으로써 인가되는 반대 방향 (예컨대 내향성) 유속에 의해 저지된다. 역류를 조정하여 용액 내의 세포 및 입자들이 분리되도록 한다. 수력분급은 다양한 경우의 세포 분리에서 적용되어 왔으며 ([Inoue, Carsten et al. 1981]; [Hayner, Braun et al. 1984]; [Noga 1999]), 원심 파라미터 및 유동을 최적화시키는데 사용되는 원리 및 실행은 본원의 개시 내용의 견지에서 당업자에 의해 본원에 적용될 수 있다.
도 9는 본 발명에 따른 수력분급 실행과 연관된 원리를 예시한다. 수력분급 실시양태는 스피닝 로터를 사용하여 용액에 힘을 인가된다는 정도로 원심분리 실행과 유사할 수 있다. 현재 구현된 수력분급과 관련된 일부 변수로는 스피닝 챔버의 크기 및 형상, 로터의 직경, 로터의 속도, 역류 튜브의 직경, 역류의 유속, 뿐만 아니라 용액으로부터 제거되는 입자 및 세포의 크기 및 밀도가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 원심분리에서와 같이, 재생 세포를 개별적인 세포 밀도를 기초로 분리할 수 있다.
한 실시양태에서, 도 9.1에 제시된 바와 같이 재생 세포 조성물, 예를 들어 재생 세포 및 콜라게나제를 함유하는 용액을 스피닝 로터의 챔버 내로 도입한다. 용액을 챔버에 첨가한 후, 추가의 염수를 미리 정해진 유속으로 챔버에 첨가한다. 염수의 유속은 로터의 속도, 세포 직경 및 실험적으로 수립된 챔버 상수의 함수로서 미리 정할 수 있다. 유속은 예를 들어, IV 펌프와 유사한 장치로 제어될 것이다. 추가 염수의 목적은, 도 9.2에 제시된 바와 같이, 더 큰 입자들은 챔버의 한 쪽으로 이동하고, 더 작은 입자들은 다른 한 쪽으로 이동하는 로터 챔버의 내부 조건을 제공하기 위한 것이다. 본 출원에서는 도 9.3에 제시된 바와 같이, 가장 작은 입자들이 챔버를 빠져 나와 폐기물 용기로 이동하도록 유속이 조정된다. 이러한 이동으로 챔버 내의 용액이 실질적으로 균질한 집단의 세포, 예컨대 줄기 세포를 갖게 된다. 줄기 세포가 용액 내의 나머지 아이템 (챔버로부터 제거되는 원치않는 단백질 및 유리 지질)으로부터 분리된 것으로 결정된 후, 역류를 정지시킨다. 이어서, 챔버 내의 세포는 챔버의 외벽 상에 농축된 펠렛을 형성할 것이다. 역류를 역행시키고 세포 펠렛을 산출 백으로 옮긴다.
본원에서 앞서 기재된 바와 같이, 프로세싱 챔버 (30) 또는 산출 챔버 (50)은 1개 이상의 포트, 예를 들어 포트 (51) 또는 (52)를 포함할 수 있다. 상기 기술된 방법들의 임의의 조합을 사용하여 수득한 재생 세포 또는 이의 일부가 도관을 통해 다른 수술 장치, 세포 배양 장치, 세포 매리네이딩(marinading) 장치, 유전자 요법 장치 또는 정제 장치로 운반되도록 1개 이상의 이러한 포트를 고안할 수 있다. 이러한 포트들은 또한, 재생 세포를 도관을 통해 시스템 내의 추가적인 챔버 또는 용기로 운반하도록 고안되거나 또는 상기 기술된 것과 동일한 목적을 위한 또다른 시스템의 일부로서 고안될 수 있다. 또한, 포트 및 도관은 1종 이상의 첨가제, 예컨대 성장 인자, 재현탁액, 세포 배양 시약, 세포 확장 시약, 세포 보존 시약 또는 유전자를 세포로 전달하는 작용제를 포함한 세포 변형 시약을 첨가하는데 사용될 수도 있다. 포트 및 도관은 또한, 재생 세포를 이식 물질 (예를 들어, 스캐폴드 또는 골 단편), 뿐만 아니라 다른 수술용 이식물 및 장치와 같은 다른 표적으로 운반하는데 사용될 수도 있다.
기존 시스템의 일회용 세트간 상호연결의 재구성, 기존 시스템의 프로세싱 장치의 재-프로그래밍, 기존 시스템에 상이하거나 추가적인 용기 및/또는 챔버를 제공함, 하나 이상의 추가적인 시스템 또는 장치로의 세포 운반, 및/또는 이들의 임의의 조합에 의해 세포의 추가적인 프로세싱을 개시할 수도 있다. 예를 들어, 시스템을 사용하여 수득된 재생 세포가 하기의 것들 중 하나 이상에 적용될 수 있도록 상기 기술된 임의의 수단에 의해 시스템을 재구성할 수 있다: 세포 증식 (1가지 이상의 재생 세포 유형의 증식) 및 세포 유지 (세포 시트 헹굼 및 매질 변경을 포함); 계대배양; 세포 파종; 일시적인 형질감염 (대량 공급으로부터의 형질감염된 세포의 파종 포함); 수확 (효소적, 비효소적 수확 및 기계적 찰과에 의한 수확 포함); 세포 생존력 측정; 세포 평판배양 (예를 들어, 증식을 위해 개별 웰로부터 세포 채집하고, 신선한 웰로 세포를 확장시키는 것을 포함하는, 미량역가 플레이트 상에서의 평판배양); 고처리량 스크리닝; 세포 요법 용도; 유전자 요법 용도; 조직 공학 용도; 치료용 단백질 용도; 바이러스성 백신 용도; 저장 또는 선별을 위한 상청 또는 재생 세포의 수확, 세포 성장의 측정, 용해, 접종, 감염 또는 유도; 세포주 (하이브리도마 세포 포함)의 생성; 투과성 연구를 위한 세포의 배양; RNAi 및 바이러스 저항성 연구를 위한 세포; 녹아웃(knock-out) 및 트랜스제닉(transgenic) 동물 연구를 위한 세포; 친화성 정제 연구; 구조 생물학 용도; 분석법 개발 및 단백질 공학 용도.
예를 들어, 특정 용도를 위해 재생 세포 집단의 확장이 필요할 경우, 이 집단을 우세하게 증식시키면서, 다른 집단은 유지시키거나 (이로써 선택된 세포의 성장에 따라 희석되어 감소함) 또는 필요한 성장 조건의 부재로 인해 소실되도록 하는 배양 조건을 사용한 접근법을 이용할 수 있다. Sekiya 등은 이와 관련하여 골수-유래 줄기 세포에 사용할 수 있는 조건을 기술하였다 ([Sekiya et al, 2002]). 이러한 접근법 (조직 배양 플라스틱에 대한 차등 부착이 있거나 또는 없음)은 본 발명의 추가 실시양태에서 적용될 수 있다. 이러한 실시양태에서는, 최종 재생 세포 펠렛을 산출 챔버로부터 제거하고, 세포 배양 성분을 제공하는 제2 시스템 내에 위치시킨다. 이것은 통상적인 실험실 조직 배양 인큐베이터 또는 Tsao 등의 미국 특허 제6,001,642호 또는 Armstrong 등의 미국 특허 제6,238,908호에서 기술된 것들과 같은 바이오리액터(Bioreactor) 스타일의 장치의 형태일 수 있다. 별법인 실시양태에서, 세포 확장 또는 세포 배양 성분을 기존 시스템에, 예를 들어 산출 챔버 내에 첨가하여 지방 유래 세포 집단의 단기 부착 및/또는 세포 배양을 허용할 수 있다. 이러한 별법인 실시양태는 세포 배양 및/또는 세포 확장 성분을 시스템에 통합시킬 수 있게 하고, 이러한 시스템으로부터 세포를 제거하여 또다른 시스템 내에 배치할 필요를 없앨 것이다.
프로세싱 동안, 결과를 향상시키기 위해 필요할 경우, 여러 챔버 또는 용기에 1종 이상의 첨가제를 첨가하거나 또는 제공할 수 있다. 이러한 첨가제는 또한, 기존 시스템과 연관된, 또는 기존 시스템과 분리된 또다른 시스템의 일부로서 제공될 수도 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서 첨가제는 시스템으로부터 재생 세포를 제거할 필요없이 첨가 또는 제공될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 첨가제를 포함하는 새로운 용기 또는 챔버를 시스템의 사용되지 않은 포트에 무균 방식으로 연결함으로써 첨가제를 첨가 또는 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 시스템에 연결되지 않은 제2의 시스템 또는 장치에 첨가제를 첨가 또는 제공한다. 첨가제의 일부 예로는 세정 및 해리를 최적화시키는 작용제, 프로세싱 동안에 활성 세포 집단의 생존력을 증강시키는 첨가제, 항균제 (예를 들어 항생제), 지방세포 및/또는 적혈구 세포를 용해하는 첨가제, 또는 (고체상 모이어티에의 차등 접착에 의해, 또는 다르게는 세포 집단의 실질적인 감소 또는 강화를 촉진함으로써) 당해 세포 집단을 강화시키는 첨가제가 포함된다.
예를 들어, 균질한 재생 세포 집단을 얻기 위해, 특정 유형의 재생 세포를 분리하는데 적절한 임의의 방법, 예컨대 줄기 세포 또는 선조 세포, 예를 들어 내피 전구 세포 상에 존재하는 항원을 인식하고 이에 결합하는 세포-특이적 항체를 사용하는 방법을 이용할 수 있다. 이러한 방법에는 포지티브 선별 (표적 세포를 선별)과 네가티브 선별 (원치않는 세포의 선별 제거) 모두, 또는 이들의 조합이 포함된다. 효소와 같은 세포내 마커를 특정 효소에 의해 활성화될 때 형광을 내는 분자를 사용하는 선별에 사용할 수도 있다. 추가적으로, 최종 세포 펠렛 내의 특정 재생 세포 집단이 차등 접착되고/되거나 용출되도록 선택된 접착성을 갖는 고체상 물질을 시스템의 산출 챔버 내로 삽입할 수도 있다.
이러한 차등 접착 접근법의 별법인 실시양태는, 표적 재생 세포 및 원치않는 세포에서 차등 발현되는 표면 분자를 인식하는 항체 및/또는 항체 조합물의 사용을 포함할 것이다. 특정 세포 표면 마커 (또는 이들의 조합물)의 발현을 기초로 하는 선별은 항체가 고체상 지지 구조물에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착되는, 또다른 통상적으로 적용되는 기술이다 ([Geiselhart et al., 1996]; [Formanek et al., 1998]; [Graepler et al., 1998]; [Kobari et al., 2001]; [Mohr et al., 2001]).
또다른 실시양태에서, 세포 펠렛을 재현탁시키고, 연속적 또는 불연속 밀도 구배가 형성된 유체 물질 위 (또는 밑)에서 층을 이루게 하고, 원심분리기에 배치시켜, 세포 밀도를 기초로 세포 집단을 분리할 수 있다. 유사한 실시양태에서, 연속 유동 접근법, 예컨대 성분채집술 ([Smith, 1997]) 및 수력분급 (역류의 존재 또는 부재) ([Lasch et al., 2000], [Ito and Shinomiya, 2001])도 이용할 수 있다.
첨가제의 또다른 예로는, 본원에 논의된 바와 같은 추가적인 생물학적 또는 구조적 성분, 예를 들어 세포 분화 인자, 성장 촉진제, 면역억제제, 의료 장치 또는 이들의 임의의 조합이 포함될 수 있다. 예를 들어, 기타 세포, 조직, 조직 단편, 성장 인자 예컨대 VEGF 및 기타 공지된 혈관신생 또는 동맥신생 성장 인자, 생물학적으로 활성 또는 불활성인 화합물, 재흡수성 스캐폴드, 재생 세포 집단의 전달, 효능, 허용성 (tolerability) 또는 기능을 증강시키도록 의도된 기타 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 재생 세포 집단은 구조적 또는 치료적 목적의 유도를 위해 재생 세포의 기능을 변화시키거나, 증강시키거나 보충하는 방식으로의 DNA 삽입 또는 세포 배양 시스템 내의 배치에 의해 변형시킬 수 있다 (본원에 기술되거나 당업계에 공지된 바와 같이). 예를 들어, 줄기 세포용 유전자 전달 기술은 [Morizono et al., 2003] 및 [Mosca et al., 2000]에 개시된 바와 같이 당업자에게 공지되어 있으며, [Walther and Stein, 2000] 및 [Athanasopoulos et al., 2000]에 개시된 바와 같이, 바이러스 형질감염 기술, 더욱 구체적으로는 아데노-관련 바이러스 유전자 전달 기술을 포함할 수 있다. 비-바이러스를 기초로 하는 기술 또한, [Muramatsu et al., 1998]에 개시된 바와 같이 수행할 수 있다. 또한, 1종 이상의 세포 분화 인자, 예컨대 성장 인자(들) 또는 사이토카인(들)을 코딩하는 유전자를 첨가할 수 있다. 다양한 세포 분화제의 예는 [Gimble et al., 1995]; [Lennon et al., 1995]; [Majumdar et al., 1998]; [Caplan and Goldberg, 1999]; [Ohgushi and Caplan, 1999]; [Pittenger et al., 1999]; [Caplan and Bruder, 2001]; [Fukuda, 2001]; [Worster et al., 2001]; [Zuk et al., 2001]에 개시되어 있다. 또한, 항-아폽토시스 인자 또는 작용제를 코딩하는 유전자를 첨가할 수 있다. 유전자 (또는 유전자의 조합물)의 첨가는 아데노바이러스 형질도입, "유전자 총", 리포솜-매개 형질도입, 및 레트로바이러스 또는 렌티바이러스-매개 형질도입, 플라스미드, 아데노-관련 바이러스를 포함하지만 이에 한정되지 않는 당업계에 공지된 임의의 기술에 의할 수 있다. 그 후에, 이러한 재생 세포를 형질도입이 계내에서 지속되거나 개시될 수 있도록 하는 시간에 걸쳐 세포에 유전자를 방출시키고/시키거나 제시할 수 있는 유전자 전달 비히클을 함유한 담체 물질과 함께 이식할 수 있다.
세포 및/또는 세포를 함유하는 조직을 세포 및/또는 조직이 수득된 환자 이외의 환자에게 투여하는 경우에, 1종 이상의 면역억제제를 세포 및/또는 조직을 수여받는 환자에게 투여하여 이식 거부를 감소시키고, 바람직하게는 예방할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "면역억제 약물 또는 면역억제제"는 정상 면역 기능을 억제하거나 또는 방해하는 제약 작용제를 포함하도록 의도된다. 본원에 개시된 방법에 적절한 면역억제제의 예로는 T-세포/B-세포 공동자극 경로를 억제하는 작용제, 예컨대 미국 특허 공보 제20020182211호에 개시된 바와 같이, CTLA4 및 B7 경로를 통해 T-세포와 B-세포의 커플링을 방해하는 작용제가 포함된다. 바람직한 면역억제제는 시클로스포린 A이다. 또다른 예로는 미오페닐레이트 모페틸, 라파미신, 및 항-흉선세포 글로불린이 포함된다. 한 실시양태에서, 면역억제 약물은 1종 이상의 다른 치료제와 함께 투여된다. 면역억제 약물은 투여 경로와 상용성인 제형으로 투여되고, 원하는 치료 효과를 달성하기에 충분한 투여량으로 대상에게 투여된다. 또다른 실시양태에서, 면역억제 약물은 본 발명의 재생 세포에 대한 내성을 유발하기에 충분한 시간 동안 일시적으로 투여된다.
이러한 실시양태에서, 재생 세포는 진탕 장치와 같은 장치 및 본원에 기술된 관련 방법을 포함하여 당업계에 공지된 임의의 방식을 통해 첨가제와 접촉, 배합, 혼합되거나 또는 이에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 로킹, 반전, 압축 펄스화 또는 이동형 이동 롤러를 사용할 수 있다.
또다른 측면에서, 세포 집단을 수용자에게 배치시키고 재흡수성 플라스틱 쉬쓰(sheath) 또는 기타 물질 및 관련 성분 예컨대 MacroPore Biosurgery, Inc.에 의해 제조된 것으로 둘러쌀 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제6,269,716호; 제5,919,234호; 제6,673,362호; 제6,635,064호; 제6,653,146호; 제6,391,059호; 제6,343,531호; 제6,280,473호 참조).
전술한 모든 실시양태에서, 본원과 공동 명의인 미국 특허 가출원 제60/332,070호 (2001년 9월 14일 출원)를 우선권으로 청구하는, 발명의 영문 명칭이 [PRESERVATION OF NON EMBRYONIC CELLS FROM NON HEMATOPOIETIC TISSUES]인 미국 특허 출원 제10/242,094호 (2002년 9월 12일 출원)에 기재되어 있는 바와 같이, 분리 및 농축된 재생 세포의 적어도 일부를 저온 보관할 수 있고, 상기 특허들의 전체적인 내용은 거명에 의해 본원에 명백하게 포함된다.
프로세싱 종료시, 재생 세포를 산출 챔버로부터 수동으로 회수할 수 있다. 피하 기술, 근육내 기술, 또는 세포가 환자의 표적 부위 내에 전달되도록 하는 기타 기술에 의해 수용자 내로 배치하기 위해, 세포를 주사기와 같은 전달 장치에 로딩할 수 있다. 즉, 세포를 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 환자 내로 배치할 수 있다. 바람직한 실시양태는 바늘 또는 카테터에 의한, 또는 직접적인 수술 이식에 의한 배치를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 세포는 세포를 환자 내에 배치하는데 사용될 수 있는 용기, 주사기 또는 카테터 등의 형태일 수 있는 산출 챔버로 자동적으로 운반될 수 있다. 또한, 용기는 추후의 사용 또는 냉동보관을 위해 세포를 저장하는데 사용될 수 있다. 모든 회수 방법은 무균 방식으로 수행된다. 수술 이식의 실시양태에서, 세포를 본원에 기술된 바와 같은 미리 형성된 매트릭스 또는 스캐폴드와 같은 첨가제와 함께 적용시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태 (예를 들어, 도 4에 제시된 실시양태)에서, 시스템이 자동화된다. 또다른 실시양태에서, 상기 시스템은 자동화 및 수동 성분 모두를 갖는다. 시스템은 재사용가능한 하드웨어 성분 또는 모듈에 연결 또는 탑재된 하나 이상의 일회용 성분으로 구성될 수 있다. 본 발명의 자동화 시스템은 시스템의 적합한 작동을 촉구하는 스크린 디스플레이 (도 16 참조)를 제공한다. 자동화 시스템은 시스템의 일회용 성분의 적절한 셋업에 관하여 절차의 상태 및/또는 단계적 지시를 제공하는 스크린도 제공할 수 있다. 스크린은 또한, 시스템에서의 문제나 고장이 발생하는 경우 이를 가리킬 수 있고, 적절하다면 "고장수리(troubleshooting)" 지침을 제공할 수 있다. 한 실시양태에서, 스크린은 사용자가 시스템에 파라미터를 입력할 수 있도록 하는 사용자 인터페이스 스크린, 예를 들어, 터치 스크린이다.
부분적 및 완전 자동화 시스템은 프로세싱 장치 (예를 들어 마이크로프로세서 또는 개인용 컴퓨터) 및 시스템에 제어 논리를 제공하는 관련 소프트웨어 프로그램을 포함하여, 사용자의 입력을 기초로 하나 이상의 공정 단계를 작동 및 자동화시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 시스템의 1가지 이상의 양상이 프로세싱 장치 내에 속해 있는 소프트웨어를 통해 사용자가 프로그램할 수 있는 것일 수 있다. 프로세싱 장치는 리드 온리 메모리(Read Only Memory) (ROM)에 있는 하나 이상의 미리 프로그래밍된 소프트웨어 프로그램을 가질 수 있다. 예를 들어, 프로세싱 장치는 혈액 프로세싱에 맞춰진 미리 프로그래밍된 소프트웨어, 지방 조직을 프로세싱하여 적은 부피의 재생 세포를 수득하기 위한 또다른 프로그램, 및 지방 조직을 프로세싱하여 보다 큰 부피의 재생 세포를 수득하기 위한 또다른 프로그램을 가질 수 있다. 프로세싱 장치는 사용자에게 적절한 파라미터를 제공하여, 요구되는 재생 세포의 양, 프로세싱되는 조직의 유형, 프로세싱 후 필요한 조작의 유형, 치료 용도의 유형 등과 같은 관련 정보의 사용자 입력을 기초로 공정을 최적화시키는 미리 프로그래밍된 소프트웨어도 가질 수 있다.
또한, 소프트웨어는 시스템의 펌프 및 밸브를 제어함으로써 특정 튜브 경로에 따른 유체 및 조직의 진입 및 배출을 제어하는 단계; 적절한 활성화 시퀀스 및/또는 방향을 제어하는 단계; 압력 센서로 차단 상태를 검출하는 단계; 부피측정 메커니즘을 이용하여 특정 경로에 따라 이동되는 조직 및/또는 유체의 양을 측정하는, 메커니즘들을 혼합하는 단계; 열 제어 장치를 이용하여 다양한 성분들의 온도를 유지시키는 단계; 및 분리 및 농축 공정을 시간 설정 및 소프트웨어 메커니즘과 통합하는 단계와 같은 단계들의 자동화를 가능하게 한다. 또한, 프로세싱 장치는 프로세싱되는 조직의 유형 및/또는 수확되는 세포 집단 또는 하위-집단, 및 수행되는 절차의 유형 (예를 들어, 재생 세포가 증대된 지방 조직을 이용한 조직 증강, 또는 재생 세포가 코팅된 골 이식물을 사용한 골 복구 용도를 위한 세포의 프로세싱)을 기초로 원심분리 속도를 제어할 수 있다. 또한, 프로세싱 장치는 표준 병렬 또는 직렬 포트, 또는 다른 컴퓨터 또는 네트워크와 소통시키는 기타 수단을 포함할 수 있다. 따라서, 프로세싱 장치는 단독 유닛일 수 있거나, 또는 본원에 기술된 추가의 프로세싱 방법을 위한 하나 이상의 추가 장치와 회합될 수 있다.
소프트웨어는 일회용 성분의 제품 번호, 온도 및 부피 측정치, 조직 부피 및 세포 수 파라미터, 사용된 효소의 용량, 인큐베이션 시간, 사용자 신원, 날짜 및 시간, 환자 신원 등이 예를 들어 포함되는 "런 데이타(run data)"의 수집을 자동화할 수 있다. 장치의 바람직한 실시양태에서, 바 코드 판독 시스템과 같은 문자 인식 시스템이 통합되어, 프로세싱의 문서화의 일부로서 이러한 변수들 (예를 들어 일회용 세트의 제품 번호 및 만기일, 콜라게나제의 제품 번호 및 만기일, 환자/샘플 식별자 등)이 프로세싱 장치로 데이타 입력되도록 할 것이다. 이는 데이타 입력 에러에 대한 기회를 감소시킨다. 이같은 바 코드 판독 시스템은 USB 또는 당업계에 공지된 다른 인터페이스 포트 및 시스템을 사용하여 프로세싱 장치로 쉽게 도입될 수 있다. 이러한 방식으로, 장치는 공정의 데이타 입력과 문서화의 통합된 제어를 제공할 것이다. 이러한 파라미터들의 인쇄된 리포트는 시스템의 프로그래밍된 작동의 사용자-한정 파라미터의 일부일 것이다. 자연적으로, 소프트웨어 내의 프린터 성분 (하드웨어 및 드라이버) 또는 프린터 드라이버, 및 장치의 하드웨어 내의 프린터용 인터페이스 출력 연결부 (예를 들어 USB 포트)의 통합이 요구될 것이다.
특정 실시양태에서, 상기 시스템은 완전히 자동화된 시스템이다. 예를 들어, 사용자는 초기에 프로세싱될 조직의 양을 선택하고, 시스템을 환자에게 부착시킬 수 있으며, 시스템은 사용자의 추가 입력 없이 중단되지 않는 시퀀스로 자동적으로 필요한 조직을 흡인하여 재생 세포를 분리 및 농축시킬 수 있다. 또한, 사용자는 필요한 재생 세포의 양을 입력하고, 시스템이 필요량의 조직을 흡인하여 조직을 프로세싱하도록 할 수 있다. 완전히 자동화된 시스템은 사용자 입력 파라미터, 예를 들어 세정 사이클의 횟수, 원심분리 속도 등의 수 (예를 들어 2 이상)에 따라 재구성될 수 있는 시스템도 포함한다. 시스템은 또한, 특정 단계는 사용자 개입 없이 시스템이 진행되지만, 특정 프로세싱이 수행될 수 있기 전에는 사용자 개입이 요구되는 반자동 모드로 가동될 수도 있다. 또다른 실시양태에서, 시스템은 미리 정해진 시간에 미리 정해진 작동을 수행하도록 사용자를 인도하는 지시를 나타내는 단일 통합 시스템이다. 예를 들어, 프로세싱 장치는 시스템의 튜브, 챔버 및 다른 성분의 적절한 삽입을 필요로 하는 단계를 통해 사용자를 촉구할 수 있다. 따라서, 사용자는 적절한 작동 시퀀스가 수행되고 있는지 확인할 수 있다. 이같은 시스템은 공정에서 단계의 부주의한 활성화 및 종결을 방지하기 위해, 사용자가 각각의 작동 단계를 확인할 것을 추가로 요구할 수 있다. 추가적인 실시양태에서, 상기 시스템은 자동화된 테스트를 개시하여 튜브, 챔버의 올바른 삽입, 차단 상태의 부재 등을 확인할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 시스템은 시스템에서의 조직 유동의 자동화 제어를 통해 다중 분리 및 농축 프로세싱을 수행하도록 프로그램될 수 있다. 이러한 특징은, 예를 들어, 그렇지 않으면 손실될 조직을 시스템 내로 수집하고 조직으로부터의 재생 세포를 분리하고 농축하여 환자에게 복귀시키는 환자의 수술 동안 중요할 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 시스템의 성분은 일회용일 수 있어서 ("일회용 세트(들)"로 본원에서 지칭됨), 시스템의 부분은 1번 사용 후에 폐기될 수 있다. 이러한 구현은 환자의 조직과 접촉된 임의의 표면이 사용된 후에 적절히 처분되는 것을 확실히 하는 것을 도울 수 있다. 일회용 세트의 예가 도 13에 예시된다. 바람직한 실시양태에서, 사용하기 쉽고, 로딩하기 쉬우며, 다수의 튜브 연결 및 튜브 연결의 복잡한 경로화가 필요하지 않은 사용하기 편리한 "기성품(off the shelf)"이도록 시스템의 일회용 성분들은 미리 멸균되고 포장된다. 이같은 일회용 성분들은 비교적 저렴하게 제조되고, 따라서 이들의 폐기로 인한 실질적인 비용을 발생시키지 않는다. 한 실시양태에서, 일회용 시스템 (본원에서 "일회용 세트(들)"로 상호교환적으로 지칭됨)은 수집 챔버 (20), 프로세싱 챔버 (30), 폐기물 챔버 (40), 산출 챔버 (50), 필터 조립체 (36), 샘플 백 (60) 및 연관된 도관 (12) 또는 튜브를 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나, 이들로 구성된다. 시스템의 일회용 세트의 바람직한 실시양태에서, 수집 챔버 (20) 및 프로세싱 챔버 (30)은 강성 프레임에 하우징된 도관 (12)에 의해 연결된다. 프로세싱 챔버 (30)의 회전 밀봉 네트워크 (도 7 및 8) 또한, 동일한 강성 프레임에 하우징될 수 있다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 일회용 세트의 다양한 챔버 및 용기는 시스템을 자동화하는 펌프, 밸브, 센서 및 기타 장치가 사용자 개입 없이 필요에 따라 적절하게 활성화되거나 비활성화되도록 시스템의 프로세싱 장치와 소통할 수 있는 필수적인 인터페이스로 구성된다. 인터페이스는 또한, 시스템을 셋업하는데 요구되는 시간 및 전문 지식을 감소시키고, 또한 시스템을 어떻게 적절하게 셋업할 것인지를 나타내고 잘못된 셋업의 경우에 사용자를 주의시킴으로써 실수를 줄일 수 있다.
본 발명의 대부분의 일회용 세트는 다수의 공통적인 요소를 가질 것이다. 그러나, 당업자는 시스템의 상이한 용도들이 일회용 세트의 일부일 수 있는 추가적인 성분들을 필요로 할 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 일회용 세트는 환자로부터 지방 또는 다른 조직을 수득하고 재생 세포를 환자에게 되돌리는데 적절한 하나 이상의 바늘 또는 주사기를 추가로 포함할 수 있다. 포함되는 바늘 및 주사기의 유형, 개수 및 종류는 프로세싱될 조직의 유형 및 양에 따라 달라질 것이다. 일회용 세트는 시스템에서 사용되는 세정액 및 기타 프로세싱 시약을 보유하기 위한 하나 이상의 강성 또는 가요성 용기를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 일회용 세트는 절차에 필요한 염수, 효소 및 임의의 기타 처리용 또는 대체용 유체를 담는 용기를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 시스템 및 방법과 함께 사용하기 위해, 적절한 세정 용액, 재현탁액, 첨가제, 작용제 또는 이식 물질을 일회용 세트에 제공할 수 있다.
본원에 기술된 또는 본 발명의 실시에 필요한 시스템 성분, 설비 또는 공급물의 임의의 조합은 키트의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트는 주사기를 기초로 하는 지방흡입에 필요한 최적의 길이 및 게이지의 바늘, 및 소형 부피의 조직이 프로세싱되도록 하는 바람직한 여과 매체를 함유하는 무균 주사기를 예를 들어 포함할 수 있다. 본 발명과 함께 사용할 수 있고, 또한 본 발명의 키트에 포함될 수 있는 다른 예시적인 설비 및 공급물이 표 II 및 III에 열거된다.
하기의 표 II는 본 발명의 시스템 및 방법에 따라 지방 유래 재생 세포를 수득하는데 사용될 수 있는 공급물의 예를 나타낸다.
설명 판매 회사 양 주
10 ㎖ 주사기 Beckton-Dickinson 필요한 만큼 선택적, 지방흡입에 사용됨
14GA 끝이 무딘 바늘 필요한 만큼 선택적, 지방흡입에 사용됨
단일 혈액 팩
(600 ㎖)		 Baxter Fenwal 1 주 세포 프로세싱 백; 백에는 온라인 스파이크 어댑터 및 2개의 자유 스파이크 포트가 있음
커플러(coupler)가 있는 전달 팩
(150 ㎖)		 Baxter Fenwal 1 쿠아드(Quad) 백 세트
커플러가 있는
전달 팩 (1 L)		 Baxter Fenwal 1 폐기물 백
샘플 부위 커플러 Baxter Fenwal 2
0.9％ 염수 (주사용) Baxter Fenwal 1
14GA 날카로운 바늘 Monoject 필요한 만큼 지방흡입 조직을 백에 첨가하기 위한 것
20GA 날카로운 바늘 Monoject 3 콜라게나제 첨가 및 PLA 세포 제거용
0.2 ㎛ 스터플립(Sterflip) 필터 Milipore 1 콜라게나제 여과용
테루플렉스(Teruflex) 알루미늄 밀봉 클립 Terumo 4 일시적인 튜브 밀봉을 위한 ME*ACS121
포비돈 요오드 프렙(prep) 패드 Triadine 필요한 만큼 10-3201
리베라제 H1
콜라게나제		 Roche 주 1의 절차 참조
TSCD 웨이퍼 Terumo 2 TSCD 무균 튜브 용접기와 함께 사용하기 위한 1SC*W017
하기의 표 III은 본원에 개시된 시스템 및 방법에 사용될 수 있는 설비를 나타낸다.
설명 판매 회사 양 주
소르발 레전드 티 이지 세트
(Sorvall Legend T Easy Set)
원심분리기		 Fisher Scientific 1 75-004-367
로터 Kendro/Sorvall 1 TTH-750 로터
로터 버킷 Kendro/Sorvall 4 75006441 둥근 버킷
150 ㎖백용 어댑터 Kendro/Sorvall 4 00511
플라즈마 익스프레서
(Plasma Expressor)		 Baxter Fenwal 1 4R4414
튜브 밀봉기 Sebra 1 모델 1060
TSCD 무균 튜브 용접기 Terumo 1 3ME*SC201 AD
랩라인(LabLine) 열 진동기 LabLine 1 4367
"일회용" 플라스틱
헤모스타트형 클램프		 Devron 3
밸런스 백 세트 2 원심분리기의 균형을 잡기 위한 물이 충전된 백
바이오해저드 샤프스 챔버
(Biohazard Sharps Chamber)		 1
바이오해저드 웨이스트 챔버
(Biohazard Waste Chamber)		 1
시스템의 재사용가능한 성분은 수집 챔버용 교반 메커니즘, 펌프, 및 밸브 및 펌프 제어를 활성화시키는 다양한 센서, 원심분리 모터, 원심분리 모터의 회전 프레임, 사용자 인터페이스 스크린 및 USB 포트, 및 일회용 세트가 재사용가능한 하드웨어 성분 및 다른 관련 장치에 확실하게 부착되고 이에 인터페이스 접속되도록 일회용 세트를 연결하는 연동 또는 도킹 장치 또는 구성을 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나, 또는 이들로 구성된다. 예시적인 재사용가능한 성분이 도 14에 예시된다. 바람직한 실시양태에서, 재사용가능한 성분은 재생 세포 조성물로부터 재생 세포를 분리 및 농축하기 위한 수단, 예를 들어 회전 원심분리기를 포함한다. 이러한 실시양태에서, 재사용가능한 성분은 도 15A에 제시된 바와 같이 일회용 세트의 프로세싱 챔버 (원심분리 챔버 포함)의 일부분에 연결되고 이에 인터페이스 접속되도록 고안된다. 재사용가능한 성분에서 재생 세포를 분리하고 농축하기 위한 수단은 회전 원심분리기에 제한되지 않으며, 또한 스피닝 막 필터를 포함하여 본원에 기술된 임의의 다른 구성을 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 여러 상이한 조직 프로세싱 절차를 수행하여 그에 따라 시스템의 여러 펌프 및 밸브를 선택적으로 활성화시키기 위한 미리 프로그래밍된 소프트웨어를 함유하는 본원에 기술된 프로세싱 장치 또한, 재사용가능한 성분에 하우징될 수 있다. 프로세서는 또한, 추후의 다운로드 또는 편집을 위해 공여자/환자 정보, 프로세싱 또는 수집 정보 및 기타 정보를 저장하기 위한 데이터 저장 성능을 포함할 수 있다. 재사용가능한 성분은 다양한 일회용 세트와 함께 사용될 수 있다. 일회용 세트는 예를 들어 연동 장치 또는 구성을 통해 재사용가능한 성분에 연결되며, 연동 장치 또는 구성은 재사용가능한 성분 상에 존재하는 프로세싱 장치가 일회용 세트의 다양한 성분들, 뿐만 아니라 재사용가능한 성분 및 기타 관련 장치 및 시스템의 다양한 성분들을 제어할 수 있는, 즉 이들로부터 신호를 주고 받을 수 있는 방식으로 일회용 세트가 재사용가능한 하드웨어 성분에 확실하게 부착되고 인터페이스 접속되도록 일회용 세트를 연결한다.
한 실시양태에서, 시스템에 사용하기 위한 1회용 세트는 약 800 ㎖의 조직을 수용할 수 있는 수집 챔버 (20); 수집 챔버 (20)에서 세정 및 소화된 약 800 ㎖의 조직에 의해 생성된 재생 세포 조성물을 프로세싱할 수 있는 프로세싱 챔버 (30); 0.5 ㎖ 이상의 재생 세포를 수용할 수 있는 산출 챔버 (50); 및 약 10 L의 폐기물을 수용할 수 있는 폐기물 용기 (40)으로 구성된다. 이러한 실시양태에서, 하드웨어 장치는 24"L × 18"W × 36"H 이하이다. 1회용 세트뿐만 아니라 하드웨어 장치의 다양한 성분의 별법인 치수가 필요시 구축될 수 있고, 비제한적으로 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
시스템의 1회용 성분은 장치에 배치하기가 용이하다. 상응하는 재사용가능한 성분과 함께 조립된 1회용 세트의 예시가 도 15A에 예시된다. 시스템은 바람직하게는 부적절하게 로딩된 1회용 성분을 검출할 수 있도록 고안된다. 예를 들어, 각 1회용 세트의 성분은 튜브, 챔버 등을 시스템 내 적절한 위치에 적당히 정렬시키고 삽입하기 위한 색상-표시 마크를 가질 수 있다. 추가적인 실시양태에서, 본원에 개시된 시스템은 휴대용 단위이다. 예를 들어, 휴대용 단위는 지방 조직 수확이 발생하는 한 위치에서 지방 조직 수확을 위한 또다른 위치로 옮길 수 있다. 특정 실행에서, 휴대용 단위는 환자의 병상에서 지방 조직을 수확하고 프로세싱하기에 적절하다. 따라서, 휴대용 단위는 환자에서 환자에게로 이동시킬 수 있는 시스템의 일부일 수 있다. 따라서, 휴대용 단위는 제자리에 고정시키는 바퀴 위에 있을 수 있어서, 절차 전반에 걸쳐 안정적이고 고정된 위치에서 편리한 장소에서 쉽게 놓여 사용될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 휴대용 단위는 테이블 상단과 같은 평평한 표면 상에서의 셋업 및 작동용으로 고안된다. 휴대용 단위는 또한, 하우징 단위에 동봉될 수 있다. 휴대용 단위는 행거, 후크, 라벨, 저울 및 절차를 보조하는 기타 장치로 추가로 구성될 수 있다. 원심분리기, 프로세싱 장치, 디스플레이 스크린과 같은 본원에 기술된 시스템의 모든 재사용가능한 성분이 시스템의 휴대용 단위에 고정될 수 있다.
재생 세포를 수득하기 위한 별도의 수동 실시양태가 또한, 본 발명의 범주 내에 속한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 지방 조직을 본원에 기술된 시스템의 성분, 설비 및/또는 공급물의 임의의 조합을 이용하여 프로세싱할 수 있다.
본 발명의 시스템의 수동 실시양태는 하기의 단계 및 정보에 따라 실행될 수 있고, 이는 예로서 제공된 것이며 제한을 위해 제공된 것이 아니다. 먼저, 지방 조직을 환자로부터 수집한다. 조직 회수 라인 또는 샘플링 부위 커플러를 개방하고 스파이크(spike)를 600 ㎖ 혈액 백의 측면 포트 내로 삽입한다. 약 10 ㎖의 지방 조직을 무딘 캐뉼라를 통해 10 ㎖ 주사기에 수집한다. 무딘 캐뉼라를 비교적 날카로운 바늘 (14G)로 대체한다. 샘플링 부위를 요오드 와이프로 닦는다. 지방 조직을 샘플링 부위를 통해 600 ㎖ 백에 주입한다. 이어서, 주사기와 바늘을 샤프스 챔버에 폐기한다. 이러한 단계를 반복하여 충분한 조직을 백에 모은다. 충분한 조직은 환자 및 용도의 임상적 특이점을 기초로 하는 사례별 근거로 결정한다.
두번째로, 흡인된 지방 조직을 세정한다. 미리 가온된 (37℃) 염수 백을 작업 표면 위에 건다. 청색 지혈기 클램프를 600 ㎖ 백과 스파이크 사이의 튜브 위에 위치시킨다. 클램프를 닫아 튜브를 밀봉한다. 600 ㎖ 백 상의 스파이크를 사용하여 염수 백에 넣었다 (이러한 세팅에서, 바늘을 삽입하기 전에 요오드로 고무 마개를 닦고, 600 ㎖ 백 상에 바늘을 사용하여 고무 마개를 통해 염수 백에 넣는다). 청색 클램프를 풀어 약 150 ㎖의 염수가 600 ㎖ 백에 들어가도록 한다. 원하는 부피의 염수가 600 ㎖ 백에 들어갔을 때 청색 클램프를 닫는다. 600 ㎖ 백을 약 15초 동안 10회 내지 15회 뒤집는다. 제2 청색 클램프를 3L 폐기물 백으로부터 스파이크로 이어지는 튜브에 적용한다. 3L 백 상의 스파이크를 사용하여 600 ㎖ 백에 넣는다. 600 ㎖ 백을 작업 표면 위에 뒤집어 걸어, 약 1분 동안 그대로 둔다. 3L 백으로 이어지는 청색 클램프를 푼다. 폐기물 유체가 3L 백으로 흘러들어가게 한다. 조직이 튜브에 들어가기 전에 청색 클램프를 적용하여 유동을 중단시킨다. 600 ㎖ 백을 작업 표면으로 낮춘다. 이러한 단계를 2회 더 반복한다. 염수 폐기물이 여전히 현저하게 붉게 보일 경우, 추가적인 제3 사이클이 지적된다. 열 밀봉기를 사용하여 3L 폐기물 백과 600 ㎖ 백 사이의 튜브를 밀봉한다. 밀봉은 튜브의 대략 중간 지점에서 수행한다. 3L 폐기물 백을 제거하고 폐기한다. 600 ㎖ 백을 작업 표면으로 되돌린다.
세번째로, 세정한 지방 조직을 분해한다. 염수 및 600 ㎖ 백 사이의 튜브 상의 청색 클램프를 풀어 약 150 ㎖의 염수가 600 ㎖ 백에 들어가도록 한다. 600 ㎖ 백 상의 샘플링 부위를 요오드 와이프로 닦는다. 콜라게나제를 샘플링 부위를 통해 600 ㎖ 백에 주입한다. 콜라게나제는, 마이크로웨이브처리 이외에, 37℃ 수조 또는 균등물 중에서 콜라게나제 바이알 하나를 해동하여 제조한다. 22G 바늘이 있는 1 ㎖ 주사기를 바이알에 삽입한다. 콜라게나제를 바늘 내로 빼낸다. 바늘을 제거하고, 0.2 ㎛ 필터 및 두번째의 22G 바늘로 대체한다. 이어서, 콜라게나제를 0.2 ㎛ 필터 및 바늘을 통해 주사기로부터 방출시킨다. 지방 조직의 소화를 0.1 내지 0.2 분쉬(Wuensch) 단위/㎖의 최종 콜라게나제 농도로 수행한다. 가열 패드를 로커(rocker) 상에 놓는다. 이러는 동안, 여전히 부착되어 있는 염수 백을 로커의 측면에 설치한다. 염수 백으로 이어지는 튜브가 로커 (움직일 때) 상에 걸리지 않는 방식으로 상기 튜브가 위치하도록 주의를 기울인다. 가열 패드 제어기는 37℃로 설정한다. 600 ㎖ 백을 로커 상에 놓는다. 로커를 최대치로 설정한다. 백이 안정적인지를 확실히 관찰하고, 약 1시간 (55±10분) 동안 록킹시킨다.
네번째로, 재생 세포 조성물을 회수한다. 백을 로커로부터 제거한다. 청색 클램프를 이전에는 폐기물 백으로 이어진 밀폐된 튜브에 적용한다. 무균 연결 장치를 사용하여, 이전에는 폐기물 백에 부착된 튜브에 쿼드(quad) 백 세트 (하기 지시에 따라 미리 제조됨)를 부착한다. 쿼드 팩은 2개의 연결된 쿼드 팩으로 보일 수 있다. 쿼드 팩을 2개의 팩으로 분할하는 튜브를 확인하고, 튜브를 자체 뒤로 접고, 접힌 튜브 위로 (튜브의 양쪽 조각 위로) 금속 루프를 놓는다. 루프를 약 0.5 인치 아래로 미끄러지게 한다. 굴곡에서 형성된 주름은 튜브를 밀봉하는 역할을 한다. 지혈기를 사용하여 루프에 부분적으로 주름을 형성하여 밀폐시킨다. 루프가 프로세싱 동안 제거될 필요가 있기 때문에 루프를 너무 단단하게 주름지게 하지 않는다. 600 ㎖ 백을 작업 표면 위에 뒤집어 걸어 약 3분 동안 그대로 방치한다. 쿼드 세트로 이어지는 튜브 상의 청색 클램프를 풀어 세포 분획 (황색/주황색 지방질 층의 아래 층)을 쿼드 세트로 배수시킨다. 지방질 층이 튜브로 유입되지 않도록 주의한다. 이러한 공정 동안, 지방질 층이 튜브에 인접하였을 때 튜브를 수동으로 주름지게 하여 유동을 느리게 할 수 있다. 이어서, 쿼드 백 세트에 이르는 튜브를 청색 클램프로 밀봉하고, 600 ㎖ 백을 작업 표면으로 되돌리고, 염수 백을 건다. 염수 및 600 ㎖ 백 사이의 튜브 상의 청색 클램프를 풀어 약 150 ㎖의 염수가 600 ㎖ 백에 들어가도록 한다. 600 ㎖ 백을 약 15초 동안 약 10회 내지 15회 뒤집는다. 이어서, 600 ㎖ 백을 작업 표면 위에서 뒤집어 걸고 약 3 내지 5분 동안 그대로 방치한다. 쿼드 세트로 이어지는 튜브 상의 청색 클램프를 풀어, 세포 분획 (황색/주황색 지방질 층 아래의 층)을 쿼드 세트로 배수시킨다. 지방질 층이 튜브에 유입되지 않도록 주의한다. 예를 들어, 지방질 층이 튜브에 근접하였을 때 튜브를 수동으로 주름지게 함으로써 유동을 느리게 할 수 있다. 쿼드 백 세트로 이어지는 튜브를 청색 클램프로 폐쇄시킨다. 이어서, 쿼드 세트로부터 600 ㎖ 백으로 이어지는 튜브를 열 밀봉시킨다. 이어서, 600 ㎖ 백을 제거하고 폐기한다.
다섯번째로, 재생 세포 조성물을 세정한다. 금속 클립을 2개의 충전된 백 사이의 튜브 상에 위치시켜 튜브를 밀봉한다. 쿼드 세트를 천칭 상에 놓는다. 물을 제2 "모조" 쿼드 세트에 가하여 쿼드 세트의 균형을 잡는다. 쿼드 세트 및 균형잡힌 세트를 원심분리기의 맞은편의 버킷 상에 놓는다. 중공 필터의 경우, 세포를 세정하고 백에 위치시키고, 튜브를 백과 상기한 중공사 필터 조립체 사이에서 밀봉한다. 연동 펌프를 사용하여, 유체를 필터 조립체를 통해 흐르게 하고, 세포 농축물을 하류 말단에서 백에 수집한다. 쿼드 세트 백이 압축되지 않고 직립이 되도록 주의한다. 원심분리기를 10분 동안 400×g에서 작동시킨다. 쿼드 세트를 원심분리기로부터 제거하고 플라즈마 익스프레서에 위치시킨다. 백의 상부의 경질 튜브가 단지 뒤판의 상부에 있는 방식으로 백이 익스프레서에 위치되도록 주의한다. 백이 너무 높을 경우 너무 많은 염수가 보유될 것이고, 백이 너무 낮을 경우 튜브가 앞판의 밀폐 능력을 방해하여 또한 너무 많은 염수가 보유될 것이다. 충전된 쿼드 세트로부터 빈 쿼드 세트로 이어지는 각 라인에 청색 클램프를 적용한다. 금속 루프 및 청색 클램프를 제거하여 상청액이 빈 쿼드 세트 내로 흐르도록 한다. 가능한 한 많은 염수를 급송하지만, 세포 펠렛이 제거되지 않도록 주의한다. 상청액을 함유하는 각 백 내로 지나가는 튜브를 열 밀봉시킨다. 상청액을 함유하는 폐기물 백을 제거한다. 세포를 함유하는 각 쿼드 세트 백으로 이어지는 튜브에 청색 클램프를 적용한다. 백을 플라즈마 익스프레서에서 제거한다. 무균 연결 장치를 사용하여 쿼드 팩으로 이어지는 튜브를 염수 백에 연결한다. 쿼드 세트 백 중 하나로 이어지는 청색 클램프를 제거하여 약 150 ㎖의 염수가 백 내로 흘러들어가도록 한 후, 클램프를 재적용하여 염수의 유동을 중단시킨다. 이어서, 충전된 쿼드 세트 백을 약 15초 동안 약 10회 내지 15회 뒤집는다. 이어서, 빈 쿼드 세트 백으로 이어지는 청색 클램프를 제거하고, 충전된 백의 내용물 모두를 빈 백으로 배수시킨다. 금속 루프 클램프를 재적용하여 2개의 쿼드 세트 백 사이의 튜브를 밀봉한다. 이어서, 튜브를 열 밀봉시키고, 염수 백을 제거한다. 이어서, 충전된 쿼드 세트 백을 약 15초 동안 약 10회 내지 15회 뒤집는다. 또다른 모조 쿼드 세트를 천칭 상에 위치시키고, 세포 쿼드 세트로 다시 균형을 맞춘다. 이어서, 쿼드 세트 백이 압축되지 않고 직립되도록 쿼드 세트 백 (하나는 충전되고, 하나는 비어 있음)을 원심분리기 내에 위치시킨다.
원심분리기를 10분 동안 약 400×g에서 작동시킨다. 이어서, 쿼드 세트를 원심분리기로부터 제거하고, 백의 상부의 경질 튜브가 단지 뒷판의 상부에 있도록 쿼드 세트를 플라즈마 익스프레서에 주의하여 놓는다. 백이 너무 높을 경우 너무 많은 염수가 보유될 것이고, 백이 너무 낮을 경우 튜브가 앞판의 밀폐 능력을 방해하여 또한 너무 많은 염수가 보유될 것이다. 금속 루프를 제거하여, 재생 세포 펠렛이 제거되지 않도록 주의하면서 모든 상청액을 충전된 백으로부터 빈 백으로 급송시킨다. 백 사이의 튜브를 밀봉하고, 충전된 (폐기물) 백을 제거하고 폐기한다. 그 후, 새로운 샘플링 부위 커플러를 나머지 백에 삽입한다. 이어서, 세포 펠렛의 세포를 나머지 염수 (있을 경우)에 재현탁시켜 재생 세포의 농축물을 수득한다. 재현탁은 백의 온화한 조작 (예를 들어, 압착 및 문지르기)으로 수행할 수 있다.
본 발명을 구현하는 시스템의 특정 예가 도 4에 제시된다. 도 4는 환자 내로의 재주입에 적합한, 조직, 예를 들어 지방 조직으로부터의 재생 세포를 분리하고 농축하는 자동화 시스템 및 방법을 예시한다. 도 4에 제시된 시스템의 일부 실시양태에서, 시스템은 환자로부터 소정의 양의 조직을 흡인하는 자동화된 단계를 추가로 포함한다. 도 4에 제시된 시스템은 도 15A에 제시된 시스템의 자동화 실시양태에 도달하도록 도 14에 제시된 시스템의 재사용가능한 성분에 연결된 도 13에 제시된 1회용 세트로 구성된다. 일회용 세트는 예를 들어 연동 또는 도킹 장치 또는 구성을 통해 재사용가능한 성분에 연결되며, 이는 재사용가능한 성분 상에 존재하는 프로세싱 장치가 일회용 세트의 다양한 성분들, 뿐만 아니라 재사용가능한 성분 및 기타 관련 장치 및 시스템의 다양한 성분들을 제어할 수 있는, 즉 이들로부터 신호를 주고 받을 수 있는 방식으로 일회용 세트가 재사용가능한 하드웨어 성분에 확실하게 부착되고 인터페이스 접속되도록 일회용 세트를 재사용가능한 성분에 연결한다.
사용자는 1회용 세트를 재사용가능한 성분에 연결하고, 사용자 인터페이스를 이용하는 특정 파라메터, 예를 들어 수집될 조직의 부피를 입력하고, 시스템을 환자에게 부착시킬 수 있고, 시스템은 미리 프로그래밍되고/되거나 사용자가 입력한 파라메터를 사용하여 중단되지 않은 시퀀스로 도 4에 제시된 모든 단계를 자동으로 수행한다. 한 이같은 시퀀스가 도 15B에 예시되어 있다. 별법으로, 조직이 수동으로 사용자에 의해 환자로부터 흡인되고, 프로세싱, 즉 재생 세포의 분리 및 농축을 위해 시스템으로 이송될 수 있다.
구체적으로, 도 4에 제시된 바와 같이, 조직, 예를 들어 지방 조직을 도관 (12)를 사용하여 환자로부터 배출시켜 수집 챔버 (20)으로 도입할 수 있다. 도 4의 수집 챔버의 상세한 예시가 도 5에 제시된다. 도 5에 예시된 바와 같이, 수집 챔버 (20)은 표준 캐뉼라를 사용하여 용이하게 조직을 제거할 수 있게 하는 진공 라인 (11)로 구성될 수 있다. 사용자는 이때 수집 챔버 (20)으로 향하는 조직의 추정 부피를 입력할 수 있다. 조직은 조직, 염수 및 기타 작용제가 무균 방식으로 조직에 첨가되도록 하는 밀폐된 유체 통로의 일부인 입구 포트 (21)을 통해 수집 챔버 (20) 내로 도입된다. 시스템의 광학 센서, 예를 들어 센서 (29)는 언제 조직의 사용자 입력 부피가 수집 챔버 (20)에 존재하는지를 감지할 수 있다. 특정 실시양태에서, 사용자 입력보다 수집 챔버 내에 조직이 덜 존재할 경우, 사용자는 수집 챔버 (20)에 존재하는 조직의 부피의 프로세싱의 시작에 대한 선택권을 가질 것이다. 특정 실시양태에서, 환자로부터 제거된 조직의 일부분은 사용자 인터페이스를 이용하는 사용자 입력을 통해 활성화될 수 있는, 도관을 통한 펌프, 예를 들어 연동 펌프의 사용을 통해 샘플 챔버 (60)으로 향할 수 있다.
센서 (29)는 재사용가능한 성분에 존재하는 프로세싱 장치에 신호를 보내, 조직을 세정하고 해리시키는데 필요한 단계를 활성화시킬 수 있다. 예를 들어, 프로세싱 장치는 자동화 밸브 및 펌프를 사용하여 수집된 조직의 부피를 기초로 미리 설정된 부피의 세정제를 도입할 수 있다. 이러한 사이클이 광학 센서가 유출액이 충분히 청결하고 유출액에 원하지 않는 물질이 없다고 결정할 때까지 수집 챔버에서 반복될 수 있다. 예를 들어, 수집 챔버 외부로 이어지는 도관 (12b) 또는 (12d)를 따라 있는 광학 센서 (29)는 원하지 않는 물질이 제거된 것을 검출할 수 있고, 필요한 밸브를 닫고 다음 단계를 개시하도록 프로세싱 장치에 신호를 보낼 수 있다.
이어서, 프로세싱 장치는 수집된 조직의 부피를 기초로 미리 프로그래밍된 양의 해리제를 도입할 수 있다. 또한, 프로세싱 장치는 수집된 조직의 초기 부피를 기초로, 또는 사용자 입력을 기초로 미리 설정한 기간 동안 수집 챔버에서의 조직 진탕을 활성화시킬 수 있다. 도 4에 제시된 실시양태에서, 해리제, 예를 들어 콜라게나제가 콜라게나제 공급원 (24)를 통해 수집 챔버 (20)에 일단 첨가되면, 수집 챔버 (20) 내의 모터가 프로세싱 장치를 통해 활성화된다. 모터는 자석 교반기 및 패들형 장치로 구성된 회전축 (25)를 활성화시키며, 여기서 하나 이상의 패들 (25a)는 수집 챔버 (28)에 예비 고정된 필터의 필터 케이지(cage) (27)에 단단히 부착된다. 패들은 재생 세포가 조직으로부터 분리되도록 해리제의 존재하에 진탕시킨다.
수집 챔버 (20) 내의 용액은 미리 설정한 기간 동안 침강되게 된다. 용액의 부유성 부분은 용액의 상부로 올라오게 된다. 미리 설정된 기간이 일단 경과되면, 필요한 밸브 및 펌프가 프로세싱 장치에 의해 활성화되어, 비-부유성 부분이 폐기물 챔버 (40)으로 제거된다. 폐기물 챔버 (40)으로의 이송은 수집 챔버 외부로 이어지는 도관 (12b) 또는 (12d)을 따라 있는 센서 (29)가 용액의 부유성 부획이 폐기물 챔버 (30)으로 이송되려는 것을 검출할 수 있을 때까지 지속된다. 예를 들어, 수집 챔버 외부로 이어지는 도관 (12b) 또는 (12d)을 따라 있는 센서 (29)는 원치 않는 물질이 제거되었음을 검출할 수 있고, 필요한 밸브를 닫도록 프로세싱 장치에 신호를 보낼 수 있다.
이때, 용액의 비-부유성 분획, 즉 재생 세포 조성물은 프로세싱 챔버 (30)으로 이동한다. 이는 필요한 밸브 및 연동 펌프를 사용함으로써 달성된다. 특정 실시양태에서, 재생 세포 조성물이 프로세싱 챔버 (30)으로 이송되기 전에, 추가적인 부피의 염수가 수집 챔버 (20)에 남아 있는 용액의 부유성 분획에 첨가될 수 있다. 또다른 세정 사이클을 반복할 수 있다. 이러한 사이클 후, 용액이 침강되게 되고, 비-부유성 분획 (재생 세포 함유)은 프로세싱 챔버 (30)으로 이송되고, 부유성 분획은 폐기물 챔버 (40)으로 배수된다. 추가적인 세정 사이클을 사용하여 프로세싱 챔버 (30)으로의 모든 분리된 재생 세포의 이송을 최적화한다.
재생 세포 조성물이 도관 (12)를 경유하여 프로세싱 챔버 (30)으로 일단 이송되면, 농축 단계를 시작하기 전에 조성물에 대해 1회 이상의 추가적인 세정 단계를 수행할 수 있다. 이는 수집 챔버 (20)으로부터의 폐기물 및 잔여 오염물을 확실히 제거한다. 유사하게, 농축 단계에 이어서 재생 세포 조성물에 대해 1회 이상의 추가적인 세정 단계를 수행하여 잔여 오염물을 제거할 수 있다. 원치 않는 물질을 동일한 방식으로, 즉 상기 기술된 바와 같이 프로세싱 장치로부터의 신호를 통한 밸브 및 펌프의 제어로 프로세싱 챔버 (30)으로부터 폐기물 챔버 (40)으로 제거할 수 있다.
도 4에 제시된 프로세싱 챔버 (30)의 다양한 실시양태가 하기에서 상세하게 기술된다. 도 4에 제시된 프로세싱 챔버 (30)은 원심분리 챔버의 형태이다. 도 4의 프로세싱 챔버의 상세한 도해가 도 7 및 8에 제시된다. 일반적으로 이러한 프로세싱 챔버 (30)은 외측 하우징 (30.2), 하나 이상의 밀봉재 (30.3), 하나 이상의 베어링 (30.4), 및 프로세싱 챔버를 시스템의 재사용가능한 성분에 존재하는 원심분리 장치에 연결하는 부착점 (30.6)을 포함하는 회전 밀봉 네트워크 (30.1); 회전 밀봉재로부터 바깥쪽으로 연장되어 각 말단 상의 원심분리 챔버 (하나 이상의 포트 (52) 및 산출 챔버 (50)을 수동으로 재배치하기 위한 하나 이상의 핸들로 구성된 프레임 (53)에 하우징된 산출 챔버 (50)의 형태임)에서 끝나는 도관 형태의 하나 이상의 유체 통로 (30.5)로 구성된다.
회전 밀봉 네트워크 (30.1)은 프로세싱 챔버의 유체 통로가 무균 상태로 유지될 수 있는 것을 보장하기 위해 포함된다. 또한, 프로세싱 챔버의 유체 통로는 언제나, 심지어 프로세싱 챔버의 원심분리 챔버가 스피닝되는 동안에도 무균 방식으로 접근될 수 있다 (예를 들어, 작용제 또는 세정 용액을 부가).
도 7 및 8에 제시된 회전 밀봉 네트워크 (30.1)은 2개 이상의 베어링 (30.4), 3개 이상의 립 밀봉재 (30.3) 및 외측 하우징 (30.2)로 구성된 회전축을 포함한다. 이러한 실시양태에서, 베어링 (30.4)는 본원에서 레이스(race)로 지칭되는 외측 및 내측 축 (제시되지 않음)를 추가로 포함한다. 이러한 레이스들은 정밀 연삭 구에 의해 분리될 수 있다. 베어링을 포함하는 레이스 및 구는 체액과의 접촉에 적절한 물질로 제작되거나, 체액과의 접촉에 적절한 물질로 코팅되는 것이 바람직하다. 바람직한 실시양태에서, 레이스 및 구는, 예를 들어, 질화실리콘 또는 지르코니아를 사용하여 제작된다. 또한, 이러한 실시양태에서, 3개의 립 밀봉재는 원형 "U" 형상 채널 (제시되지 않음) 뿐만 아니라 원형 스프링 (제시되지 않음)으로 구성된다. 원형 "U" 형상 채널은 회전 밀봉 네트워크 (30.1)의 회전축과의 누출 방지 접합이 형성되도록 가요성 물질을 사용하여 제작하는 것이 바람직하다. 또한, 프로세싱 챔버를 통해 유동하는 재생 세포 조성물로부터의 압력이 증가된 장력에 의해 밀봉 조립체가 회전축과 립 밀봉재의 접합을 단단하게 하도록 하는 방식으로 립 밀봉재가 배치되는 것이 바람직하다. 밀봉재는 회전 밀봉 네트워크 (30.1)의 외측 하우징 (30.2)의 홈을 맞물리게 하기 위해 필요에 따라 팽창하고/하거나 접힐 수 있는 하나 이상의 원형 클립 (제시되지 않음)에 의해 제자리에 고정될 수 있다. 회전 밀봉 네트워크 (30.1)에 의해 또는 그 근처에서 발생된 열은 통로를 통해 이동되는 용액 내 세포의 용해를 방지하도록 제어되어야 한다. 이는, 예를 들어, 회전축의 구축을 위해 단단한 물질을 선택하고, 밀봉재와 접촉하게 되는 회전축 영역을 매끄럽게 하고, 회전축과 밀봉재 사이의 접촉을 최소화시킴으로써 달성될 수 있다.
또다른 실시양태에서, 회전 밀봉 네트워크 (30.1)은 단일 고무 밀봉재 (30.3) 및 에어 개스킷 (제시되지 않음)으로 구성된다. 이러한 밀봉재 및 개스킷은 시스템의 무균성을 손상시킬 수 있는 임의의 생물학적 물질에 구불구불한 통로를 제공한다. 또다른 실시양태에서, 회전 밀봉 네트워크 (30.1)은 개별적인 유체 통로들을 단리시키는 다중 스프링 로딩 밀봉재 (30.3)으로 구성된다. 밀봉재 (30.3)은 멸균될 수 있을 뿐만 아니라 윤활제 없이 회전축을 밀봉할 수 있는 물질로 제작된다. 또다른 실시양태에서, 회전 밀봉 네트워크 (30.1)은 여러 유체 통로를 생성시키고 시스템의 회전을 견딜 수 있으며 세포 용해를 일으키지 않는 한 쌍의 세라믹 디스크 (제시되지 않음)로 구성된다. 또다른 실시양태에서, 유체 통로는 가요성이고, 프로세싱 챔버와 관련하여 감기게 되거나 풀어지게 된다. 이는 프로세싱 챔버 (30)의 매 2회 회전에 대해 가요성 유체 통로를 1회 회전하도록 함으로써 달성된다. 이것은 회전 밀봉재에 대한 필요가 완전히 없어지게 한다.
재생 세포 조성물은 회전 밀봉 네트워크 (30.1)의 회전 축을 통해 유체 통로를 따라 수집 챔버 (20)으로부터 펌핑된 다음, 각각 프로세싱 챔버 (30)의 중심축으로부터 바깥쪽으로 뻗어나가 프로세싱 챔버 (30)의 외측 말단 근처, 즉, 산출 챔버 (50)을 하우징하는 원심분리 챔버 내에서 끝나는 최소 2개의 유체 통로 (30.5)로 분할된다 (도 7 및 8). 따라서, 바람직한 실시양태에서, 프로세싱 챔버 (30)은 도 7 및 8에 제시된 바와 같이 2개 이상의 산출 챔버 (50)으로 구성된다. 이러한 산출 챔버 (50)은, 프로세싱 동안 한 방향으로 존재하고 (30.7) 농축된 재생 세포의 회수 시에 또다른 방향으로 존재하도록 (30.8) 배치된다. 예를 들어, 산출 챔버는 프로세싱 동안 한 각도로 기울어지고, 세포 회수 시에 또다른 각도로 기울어진다. 세포 회복 각도는 프로세싱 각도보다 더 수직이다. 산출 챔버 (50)의 2가지 위치는 프로세싱 챔버 (30) 밖으로 돌출된 핸들 (53)을 통해 수동으로 조작될 수 있다. 산출 챔버 (50)이 회수 방향으로 존재할 때, 주사기를 사용하여 산출 챔버 (50)으로부터 수동으로 재생 세포를 회수될 수 있다. 또다른 실시양태에서는, 프로세싱 챔버의 외측에서 나누어진 후 프로세싱 챔버 (30)의 외측 말단, 즉, 산출 챔버 (50)이 하우징된 원심분리 챔버 내에 연결되도록 유체 통로 (30.5)이 구축된다 (제시되지 않음). 이러한 실시양태에서, 큰 부피의 재생 세포 조성물 및/또는 첨가제, 용액 등은 원심분리 챔버 및/또는 산출 챔버로 직접 이송될 수 있다.
도 4 및 7 내지 9를 참조로, 펌프 (34) 및 하나 이상의 밸브 (14)가 수집 챔버 (20)과 프로세싱 챔버 (30) 사이에 제공될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 밸브 (14)는 전기 기계 밸브이다. 또한, 압력 센서 (29)와 같은 센서가 프로세싱 챔버 (30) 및 수집 챔버 (20)과 일렬로 제공될 수 있다. 밸브, 펌프 및 센서는 재사용가능한 성분 상에 존재하는 프로세싱 장치 (도 14)와 협동하여 시스템의 농축 단계를 자동화한다.
센서는 원심분리 챔버 내의 재생 세포 조성물의 존재를 검출하고, 시스템의 프로세싱 장치와의 소통을 통해 원심분리 장치를 활성화시킨다. 이어서, 재생 세포 조성물은 최초 수집된 조직의 양 및/또는 사용자 입력에 기초하여 미리 프로그래밍된 시간 동안 미리 프로그래밍된 로드에 적용된다. 특정 실시양태에서, 이러한 단계는 자동적으로 또는 사용자 입력을 통해 반복될 수 있다. 예를 들어, 조성물에 약 5분 동안 중력의 약 400배의 로드가 적용된다. 산출 챔버 (50)은 챔버의 최외측이 조밀한 입자 및 세포에 대한 작은 저장소를 형성하도록 구축된다. 산출 챔버 (50)은 '세포 펠렛'으로 명명되는 조밀한 입자를 보유하는 동시에, 더 가벼운 상청액이 유체 통로, 예를 들어, 회전 밀봉 네트워크 (30.1)의 회전 축을 따라 존재하며 프로세싱 챔버 (30)의 센터 내의 저점으로부터 회전 밀봉 네트워크 (30.1)를 통해 폐기물 용기 (40)으로 이동하는 유체 통로를 통해 제거되도록 한다. 밸브 (14) 및 펌프 (34)는 프로세싱 장치에 신호를 보내, 산출 챔버 (50)에 존재하는 세포 펠렛을 파열시키지 않으면서 상청액을 폐기물 용기 (40)으로 제거하는 단계를 활성화시킨다.
도 4에서 제시된 시스템을 이용하여 수득된 세포 펠렛은, 본 발명의 농축된 재생 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상청액을 제거하여 폐기물 용기 (40)으로 보낸 후, 유체 경로 (30.5)를 사용하여 원심분리된 후 형성된 세포 펠렛을 추가적인 용액 및/또는 다른 첨가제로 재현탁시킬 수 있다. 이러한 방식으로의 세포 펠렛의 재현탁은 재생 세포를 추가로 세정하여 원치않는 단백질 및 화학 화합물이 제거되도록 할 뿐만 아니라, 세포로의 산소 유동을 증가시킨다. 생성된 현탁액에 약 5분간의 추가적인 기간 동안 중력의 약 400배의 추가적인 로드가 적용될 수 있다. 제2 세포 펠렛이 형성되고, 생성된 상청액을 폐기물 용기 (40)으로 제거한 후, 상기 기술된 방식으로의 최종 세정을 염수 또는 기타 적절한 완충 용액으로 실행할 수 있다. 이러한 반복된 세정은 재생 세포 용액의 순도를 증강시키기 위해 여러번 실행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 염수가 프로세싱을 증강시키기 위해 필요하다고 생각되는 임의의 단계에서 추가될 수 있다. 도 4에서 제시된 시스템을 이용하여 수득된 재생 세포의 농도는 수집된 조직의 양, 환자 연령, 환자 프로필 등에 따라 변할 수 있다. 예시적인 수율이 표 1에 제공된다.
이어서, 산출 챔버 (50)을 세포 제거에 적절한 방향으로 위치시킨 후, 산출 챔버 (50)에 존재하는 최종 펠렛을 적합한 주사기를 사용하여 무균 방식으로 회수할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 최종 펠렛은 산출 챔버 (50) 내 용기에 자동적으로 이동될 수 있으며, 이 용기는 제거되어 필요에 따라 저장 또는 사용될 수 있다. 이러한 용기는 임의의 적절한 형태 또는 크기일 수 있다. 예를 들어, 용기는 주사기일 수 있다. 특정 실시양태에서, 배출 용기 (50) 자체가 열 밀봉되고 (자동적으로 또는 수동에 의해), 이어지는 재생 세포의 회수 및 환자 내로의 재-주입이 포함되는 본원에서 기술된 바와 같은 치료 용도에서의 사용을 위해, 프로세싱 챔버의 다른 성분들로부터 단리될 수 있다. 또한, 산출 챔버로부터의 회수 전 또는 제2 시스템 또는 장치로의 이송 후에, 본원에서 기술된 바와 같은 추가적 프로세싱에 세포를 적용할 수 있다. 도 14에 제시된 재사용가능한 성분은 필요에 따라 추가적인 프로세싱을 위한 1개 이상의 추가적 시스템 또는 장치에 연결될 수 있도록 구축된다.
본원에서 논의된 바와 같이, 본 발명의 시스템 및 방법을 사용하여 수득된 재생 세포는 실시예에 기술된 바와 같은 이들의 성질을 기초로 상처 치유에 사용될 수 있다. 예를 들어, 재생 세포는 혈관신생 성장 인자 및 사이토카인을 발현하고, 상처 치유 관련 사이토카인을 분비하며, 시험관 내에서 콜라겐을 분비하고, 생체 내에서 상처 치유를 촉진하는 능력을 갖는다. 따라서, 본 발명의 한 양상에서, 재생 세포를 공여자의 지방 조직으로부터 본 발명의 시스템 및 방법을 사용하여 추출하여, 본원에 설명된 한가지 이상의 메커니즘을 통해 상처(들)를 치유하는데 사용한다. 바람직한 실시양태에서, 세포를 이들이 이식될 사람의 지방 조직으로부터 추출함으로써, 이식에 대한 항원성 및/또는 면역원성 반응과 관련된 잠재적인 합병증을 감소시킨다. 환자들은, 예를 들어, 신체 검사 및 환자의 병력에 의해, 상처 치유 장애를 평가하도록 전형적으로 사정된다.
한 실시양태에서, 수확 절차는 혈액 응고를 감소시키도록 고안된 임의의 제품을 환자에게 수여하기 전에 실행된다. 그러나, 특정 실시양태에서, 수확 절차 전에 환자에게 아스피린을 수여할 수 있다. 또한, 한 바람직한 방법은 임의의 시도된 절차 전에 지방 조직을 수확하는 것을 포함한다. 그러나, 당업자에게 이해된 바와 같이, 수집 시기는 다양하고, 환자의 안정성, 환자의 응고 프로필, 제공자의 이용가능성, 및 품질 케어 표준이 특히 포함되는 여러 인자에 좌우될 것이다. 궁극적으로, 수집 시기는 영향을 받은 환자의 투여 케어를 담당하는 진료의에 의해 결정될 것이다.
환자로부터 수집된 지방 조직의 부피는 약 0 cc 내지 약 2000 cc로 다양할 수 있고, 일부 실시양태에서는 약 3000 cc까지일 수 있다. 제거된 지방질의 부피는 환자에 따라 다를 것이고, 연령, 체질, 응고, 프로필, 혈역학적 안정성, 질환의 심각도, 동반이환율, 및 의사의 선호도가 포함되지만 이에 한정되지 않는 다수의 인자에 좌우될 것이다.
세포를 비정상적인 상처 치유가 발생한 임의의 환경에서 환자에게 투여할 수 있다. 세포를 미리 추출하여 냉동보관 방식으로 저장할 수 있거나, 또는 명시된 요구 시간에 또는 이러한 시간 가까이에 추출할 수 있다. 본원에 논의된 바와 같이, 추가적인 프로세싱 또는 세포를 추가적으로 정제, 변형, 자극 또는 다른 방식으로 변화시키는 추후의 추가적인 절차 없이, 세포를 환자에게 투여할 수 있거나, 또는 손상된 조직에 또는 손상된 조직 주변에 직접 적용할 수 있다. 예를 들어, 환자로부터 수득된 세포를, 세포를 환자에게 투여하기 전에 이를 배양하지 않고, 이를 필요로 하는 환자에게 투여할 수 있다. 한 실시양태에서, 지방 조직의 수집은 환자의 병상에서 수행될 것이다. 혈역학적 모니터링을 사용하여, 환자의 임상 상태를 모니터링할 수 있다.
본 발명에 따라, 환자로부터 지방 조직을 수확한 후에 재빨리 재생 세포를 환자에게 전달할 수 있다. 예를 들어, 재생 세포의 조성물을 수득하기 위한 지방 조직의 프로세싱 직후에 세포를 투여할 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에서 논의된 바와 같이, 환자에게 재주입될 세포에 추가적인 변형, 정제, 자극 또는 기타 조작이 적용될 수 있다. 또한, 재생 세포는 여러 번 투여될 수 있다. 예를 들어, 세포를 연속적으로 장기간 (예를 들어, 수시간)에 걸쳐 투여할 수 있거나, 또는 장기간에 걸쳐 다중 볼루수 주사로 투여할 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포의 초기 투여는 약 12시간 이내에, 예컨대 약 6시간에 투여될 것이고, 1회 이상의 용량의 세포가 12시간 간격으로 투여될 것이다.
환자에게 투여되는 세포의 수는, 예를 들어, 지방 조직 프로세싱 후의 세포 수율과 관련될 수 있다. 전체 세포 개수의 일부를 추후 사용을 위해 보유하거나 냉동보관할 수 있다. 또한, 전달되는 용량은 환자에게 세포를 전달하는 경로에 좌우될 것이다.
또한, 세포는 목적된 치료 효과를 증강시키거나, 제어하거나 또는 다른 방식으로 지시하기 위한 첨가제와 함께 적용될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 그리고 본원에 기술된 바와 같이, 세포 집단을 강화시켜 효율을 증가시키거나, 이환율을 감소시키거나, 또는 절차의 용이성을 촉진하기 위해 항체-매개 양성 및/또는 음성 세포 선별을 사용함으로써 세포를 추가로 정제할 수 있다. 유사하게, 세포를 이식된 세포의 운명을 지지 및/또는 지시함으로써 생체내 조직 조작을 용이하게 하는 생체적합성 매트릭스와 함께 적용될 수 있다. 동일한 방식으로, 세포는 세포에 의해 제공되는 치료 반응(들)을 촉진할 것으로 여겨지거나 촉진하도록 의도된 유전자 생성물을 발현하도록 유전자 조작 후에 투여될 수 있다. 조작의 예로는 혈관신생 또는 혈관형성을 촉진하는 인자 (예를 들어 VEGF)의 발현의 제어 (증가 또는 감소)를 위한 조작이 포함된다. 또한, 세포를 본원에 기술된 바와 같이 이식하기 전에 스캐폴드 물질 상에서 배양시킬 수 있다.
한 실시양태에서, 잇점이 의도되는 부위에 세포를 직접 투여하는 것이 바람직하다. 이는 정맥내 주사에 의해 달성될 수 있다. 당업자에게 공지된 투여 경로로는 피하, 피부 또는 근육내 투여가 포함되지만, 이에 한정되지 않고, 카테터를 기초로 하는 전달 메커니즘이 포함되거나 포함되지 않을 수 있다. 세포를 단일 볼루스로, 저속 주입을 통해, 또는 수시간 간격으로 분리된 일련의 시차가 있는 적용을 통해 주사할 수 있거나, 또는 제공된 세포를 적합하게 수일 또는 수주 동안 저장한다. 한 실시양태에서, 전달 경로에는 표준 말초 정맥내 카테터 또는 중심 정맥 카테터를 통한 정맥내 전달이 포함된다. 세포의 유동은 환자의 혈관구조 내에 위치한 원거리 및 근거리 풍선의 일련의 팽창/수축에 의해 제어될 수 있어, 세포 생착성(engraftment) 또는 세포 치료 작용을 촉진하는 일시적인 비-유동 구역을 생성시킨다. 또다른 실시양태에서, 세포는 환자에게 투여되기 전에 인공적 또는 천연 매질 또는 조직 스캐폴드 내에 재현탁될 수 있다. 전신 요법은 혈관계 내로의 주사를 수반할 것이다.
프로세싱된 지방흡인물의 일부를 환자에게 투여하기 전에 저장할 수 있다. 단기간 (6시간 미만)의 저장을 위해, 세포를 실온에서 또는 실온 미만의 온도에서 영양소 용액이 보충된 또는 보충되지 않은 밀봉된 용기에서 저장할 수 있다. 중간 정도의 기간 (48시간 미만)의 저장은 2-8℃에서 세포 흡착을 방지하는 물질로 구성되거나 이러한 물질로 코팅된 용기 내의 등삼투압의 완충 용액 (예를 들어 Plasmalyte®)에서 수행하는 것이 바람직하다. 장기간의 저장은, 거명에 의해 본원에 그 내용이 포함되는, 본원과 공동 명의인 PCT 출원 PCT/US02/29207 (2002년 9월 13일 출원) 및 미국 가출원 번호 제60/322,070호 (2001년 9월 14일 출원)에 개시된 것과 같이, 적합한 냉동보관 및 세포 기능의 유지를 촉진하는 조건 하에서의 세포의 저장에 의해 수행하는 것이 바람직하다.
본 발명의 한 양상에 따르면, 환자에게 투여되는 지방-조직 유래 세포는 성장 인자 전달 비히클로 작용할 수 있다. 예를 들어, 상처 치유를 촉진하는데 적절한 1가지 이상의 성장 인자를 발현하도록 세포를 조작함으로써, 세포를 환자에게 투여할 수 있고, 1가지 이상의 성장 인자를 방출하도록 조작할 수 있다. 방출은 제어 방식으로 장기간 동안 제공될 수 있다. 예를 들어, 성장 인자(들)이 펄스 방식 또는 주기적인 방식으로 방출되어 손상된 조직 영역에 인접한 곳에서 성장 인자의 국소적인 상승 및/또는 성장 인자 양의 후퇴가 있도록 방출이 제어될 수 있다.
환자에게 투여되는 세포는 손상된 또는 다른 방식으로 건강하지 않은 조직에게 기능을 복원시키는 것을 도울 뿐만 아니라, 또한 손상된 조직의 리모델링을 용이하게 한다. 세포 전달은 하기의 장소에서 일어날 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다: 진료실, 임상실, 응급실, 병실, 집중치료실, 수술실, 카테터삽입실 및 방사선실. 세포 요법의 효과는 절차 후 수일 내지 수주에 걸쳐 나타날 수 있다. 그러나, 이로운 효과가 절차 후 수시간 정도로 빨리 관찰될 수 있으며, 수년간 지속될 수 있다. 세포 전달 전 및 전달 도중 전형적으로 환자를 모니터링한다. 모니터링 절차는 하기 것들을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다: 응고 연구, 산소 포화도 및 혈역학적 모니터링. 세포 전달 후, 환자를 약 24시간 동안 유해사례에 대해 모니터링할 필요가 있을 수 있다.
하기의 실시예는 이러한 기술을 적용할 수 있는 특정 상황 및 환경을 나타내기 위해 제공하는 것이고, 본 발명의 범주 및 본 명세서에 포함된 청구의 범위를 한정하는 것으로 의도되지 않는다.
하기에 기재된 실시예에 전반적으로 사용된 ADC 또는 재생 세포는 본 출원에 기술된 방법(들) 및/또는 미국 가출원 제60/338,856호 (2001년 12월 7일 출원)를 우선권으로 청구하는 발명의 영문 명칭이 [SYSTEMS AND METHODS FOR TREATING PATIENTS WITH PROCESSED LIPOASPIRATE CELLS]인 미국 출원 제10/316,127호 (2002년 12월 9일 출원), 뿐만 아니라 발명의 영문 명칭이 [SYSTEMS AND METHODS FOR TREATING PATIENTS WITH PROCESSED LIPOASPIRATE CELLS]인 미국 출원 제10/316,127호 (2002년 12월 9일 출원)를 우선권으로 청구하는 발명의 영문 명칭이 [SYSTEMS AND METHODS FOR SEPARATING AND CONCENTRATING REGENERATIVE CELLS FROM TISSUE]인 미국 특허출원 (2004년 6월 25일 출원)에 기술된 방법(들)에 의해 수득될 수 있고, 이들 특허들은 모두 본원과 공동 명의이고, 이들 모두의 내용은 이러한 거명에 의해 본원에 명백하게 포함된다.
실시예 1: 재생 세포에 의한 혈관신생 성장 인자 VEGF 의 발현
혈관 내피 성장 인자 (VEGF)는 혈관신생의 중요한 조절인자 중 하나이다 ([Nagy et al., 2003]; [Folkman, 1995]). VEGF 패밀리의 또다른 구성원인 태반 성장 인자는 혈관신생뿐만 아니라 동맥신새 모두에서 유사한 역할을 수행한다. 구체적으로, PIGF 녹아웃 마우스 내로의 야생형 (PIGF +/+) 세포의 이식은 뒷발 허혈로부터의 신속한 회복을 유도하는 능력을 복원시킨다 ([Scholz et al., 2003]).
혈관재형성 프로세스에 대해 혈관신생 및 동맥신생이 중요하기 때문에, 본 발명의 재생 세포에 의한 PIGF 및 VEGF 발현을 3명의 공여자로부터의 지방 유래 재생 세포를 사용하며 ELISA 분석법 (R&D Systems, Minneapolis, MN)으로 시험하였다. 1명의 공여자는 고혈당증 및 제2형 당뇨병의 병력이 있었다 (미세혈관 및 거대혈관 질환과 고도로 관련된 상태). 각 공여자로부터의 재생 세포를 10% FCS 및 5% HS가 보충된 DMEM/F-12 배지에 1 ㎠ 당 1,000개의 세포로 플레이팅하고, 전면성장까지 성장시켰다. 상청액 샘플을 취하고, PIGF 및 VEGF 단백질의 발현에 대해 분석하였다. 도 16A 및 16B에 나타난 바와 같이, 결과는 본 발명의 지방 유래 재생 세포에 의한 VEGF (도 16A) 및 PIGF (도 16B) 모두의 왕성한 발현을 나타낸다.
별도의 연구에서, 정상 성체 마우스로부터 배양된 재생 세포에 의해 분비된 혈관신생 관련 사이토카인의 상대적 양을 측정하였다. 재생 세포를 10% FBS가 있는 알파-MEM에서 세포 전면성장 후 5일까지 배양하고, 이때 세포 배양 배지를 수확하여, 항체 어레이 분석 (RayBio® Mouse Cytokine Antibody Array II (RayBiotech, Inc.))으로 평가하였다. 하기의 혈관신생 관련 성장 인자들을 검출하였다: 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), bFGF, IGF-11, 에오탁신, G-CSF, GM-CSF, IL-12 p40/p70, IL-12 p70, IL-13, IL-6, IL-9, 렙틴, MCP-1, M-CSF, MIG, PF-4, TIMP-1, TIMP-2, TNF-α, 및 트롬보포에틴. 하기의 혈관신생 관련 성장 인자 또는 사이토카인을 10% FBS가 있는 블랭크 대조군 배지와 비교하여 2회 이상 평가하였다: 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 에오탁신, G-CSF, IL-6, MCP-1 및 PF-4,
이러한 데이타들은 본 발명의 재생 세포가 광범위한 혈관신생 및 동맥신생 성장 인자를 발현한다는 것을 나타낸다. 더욱이, 당뇨병 환자가 VEGF 및 PIGF를 정상 환자의 수준과 동등한 수준으로 발현한 것의 발견은 당뇨병 환자가 자가 지방 유래 재생 세포에 의한 혈관신생 요법에 대한 후보일 수 있음을 제안한다.
실시예 2: 재생 세포는 혈관신생에 참여하는 세포 집단을 함유한다
내피 세포 및 이의 전구체인 내피 선조 세포 (EPC)는 혈관신생에 참여하는 것으로 공지되어 있다. EPC가 지방 유래 재생 세포에 존재하는지 여부를 결정하기 위해, 인간 지방 유래 재생 세포를 EPC 세포 표면 마커, 예를 들어 CD-34에 대해 평가하였다.
ADC를 인간 피하 지방 조직의 효소 소화에 의해 단리하였다. ADC (100 ㎕)를 0.2% 소 태아 혈청 (FBS)을 함유한 포스페이트 염수 완충액 (PBS)에서 인큐베이션하고, 인간 내피 마커 CD-31 (분화된 내피 세포 마커) 및 CD-34 (EPC 마커), 뿐만 아니라 다분화성 세포 상에서 선택적으로 발현되는 인간 ABCG2 (ATP 결합 카세트 트랜스포터)에 대해 지시된 형광 표지된 항체와 함께 20 내지 30분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 세정 후, 세포를 FACSAria 분류기 (Beckton Dickenson-Immunocytometry) 상에서 분석하였다. 이어서 데이타 획득 및 분석을 FACSDiva 소프트웨어 (BD-Immunocytometry, CA)에 의해 수행하였다. 결과 (제시되지 않음)는 건강한 성인으로부터의 지방 유래 재생 세포는 EPC 마커 CD-34 및 ABCG2를 발현하였지만, 내피 세포 마커 CD-31은 발현하지 않았음을 나타냈다. EPC 마커 CD-34를 발현하는 세포가 당뇨병 병력이 있는 공여자로부터 유래된 재생 세포에서 유사한 빈도로 검출되었다.
내피 세포 분화 배지에서의 배양 후 인간 지방 유래 재생 세포 내의 EPC의 빈도를 측정하기 위해, 재생 세포를 피브로넥틴이 코팅된 플레이트 상에 플레이팅하고, 내피 세포 배지에서 3일 동안 배양하여 성숙 내피 세포를 제거하였다. 접착되지 않은 세포를 제거하고 다시 플레이팅하였다. 14일 후에, FITC-접합 울렉스 에우로파에우스 아글루티닌-1(Ulex europaeus Agglutinin-1) (Vector Labs, Burlingame, CA) 및 DiI-표지 아세틸화 LDL (Molecular Probes, Eugene, OR)로 염색함으로써 콜로니를 확인하였다. 도 17에 제시된 바와 같이, 결과는 대략 500개의 EPC/106개 ADC 세포의 EPC 빈도를 가리킨다.
지방 조직 유래 재생 세포 내에 EPC가 존재하는 것은 이러한 세포들이 새로운 혈관의 발생에 직접적으로 참여하고, 혈관신생 및 재관류를 증강시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 3: 재생 세포에서의 혈관 구조물의 시험관내 발달
당업계에 인지되는 혈관신생에 대한 분석법 중 하나는 섬유아세포의 피더(feeder) 층 상에서 성장된 내피 세포가 신생 모세관 네트워크를 암시하는 CD31-양성 튜브의 복합 네트워크를 발생시키는 것이다 ([Donovan et al., 2001]). 지방 유래 재생 세포가 내피 세포, EPC 및 기타 간질 세포 전구체를 함유하기 때문에, 본 발명자들은 피더 층의 부재 하에 모세관-유사 구조를 형성하는 이러한 재생 세포의 능력을 시험하였다. 정상 마우스의 사타구니 지방 패드로부터 수득된 재생 세포는 배양 2주 후에 모세관 네트워크를 발생시켰다 (도 18A). 특히, 스트렙토조토신 (STZ)를 투여한 지 8주 후에 STZ-유도 제1형 당뇨병을 앓는 고혈당 마우스로부터의 재생 세포는, 정상 마우스로부터의 세포에 의해 형성되는 것과 동등한 모세관 네트워크를 형성하였다 (도 18B).
후속 연구에서, 지방 유래 재생 세포를 추가적인 성장 인자 없이 완전 배양 배지 (10% FCS가 보충된 α-MEM)에서 배양하였다. 이러한 재생 세포 또한, 모세관 네트워크를 형성하였다. 또한, 형성된 혈관 구조는 내피 세포 마커 CD31, CD34, VE-카드헤린 및 폰 빌레브란트 인자/인자 VIII에 대해 염색 양성을 나타냈지만, 팬(pan)-림프구 마커 CD45에 대해서는 그렇지 않았다.
청년기 마우스 대 노년기 마우스로부터의 재생 세포의 모세관 네트워크를 형성하는 능력을 비교하기 위해, 정상 청년기 마우스 및 노년기 마우스 (1, 12 또는 18월령)로부터의 재생 세포를 2주 동안 추가 성장 인자 없이 완전 배양 배지 (10% FCS가 보충된 α-MEM)에서 배양하였다. 동등한 모세관-유사 네트워크가 모든 공여자로부터의 재생 세포의 배양물에서 관찰되었다 (제시되지 않음).
상기 데이타는 정상인 및 당뇨병 환자, 뿐만 아니라 청년기 환자 및 노년기 환자로부터의 지방 유래 재생 세포가 신생 모세관 네트워크의 형성과 일치하는 혈관 구조물을 형성할 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 재생 세포는 혈관신생 기능부전을 치료하는데 사용될 수 있다.
실시예 4: 재생 세포에서의 혈관 구조물의 생체내 발달
시험관내 혈관신생 잠재력은 장래성이 있긴 하지만, 세포가 생체내 혈관신생 활성을 발휘하지 않는다면 그 가치가 낮다. 수술로 유도된 뒷발 허혈은 소정의 요법의 혈관신생 잠재력을 확인할 수 있는 생체내 모델이다. 이러한 모델을 인간 세포가 재관류를 유발하는 능력을 관찰할 수 있는 면역결핍 (NOD-SCID) 마우스에서 발생시켰다.
수술 전의 혈류 값을 하기 기술된 바와 같이 양쪽 뒷발에서 측정하였다. 마취 상태의 마우스의 혈관구조를 하기의 부위에서 4-0 실크 봉합사로 묶었다: 1) 분 지 근위의 장골 동맥, 2) 내재 대퇴 동맥의 기시점 원위, 3) 표재 대퇴 동맥의 분기 근위. 결찰 후에, 혈관구조를 총괄적으로 제거하였다. 창상을 봉합하기 전에, 결찰된 대퇴 동맥으로부터 분기된 덩어리로 관찰가능한 측부혈관을 또한, 결찰시켰다. 24시간 후에, 129S 마우스에 5 × 106개의 유전적 동계(同系)의 마우스 지방 유래 재생 세포를 주사하고, NOD SCID 마우스에 꼬리 정맥을 통해 인간 지방 유래 재생 세포를 주사하였다. 혈류를 [Laser Doppler Flow Imager (Moor Instruments Inc., Wilmington, DE)]를 사용하여 수술 직후 및 처치 후 소정의 간격으로 영상촬영하였다. 24일 동안 주마다 3회 측정한 것을 이 사지의 수술전 값에 대해 표준화하고, 대조군 (수술하지 않음) 사지와 비교하여 표시하였다.
뒷발 허혈의 모델은 사용된 마우스 계통에 대해 매우 민감하다. NOD SCID 마우스는 급성 염증성 반응을 발화하는 능력이 결여된 면역결핍 동물이다. 이러한 마우스들에 있어서, 이러한 수술적 접근법은 처치하지 않은 동물의 2/3가 대퇴 절제 부위보다 아래에서 뒷발 구조를 상실하도록 심각한 허혈을 생성시킨다. 세포로 처치된 동물은 발가락 위쪽의 어떠한 구조도 상실하지 않았다. 그러나, 면역적격 129S 마우스에 있어서, 처치되지 않은 동물은 족지골 위쪽의 어떠한 임의 구조도 상실하지 않았고, 부분적으로 재관류를 재생하는 내인성 능력을 보였다. 이는 급성 염증성 반응과 관련된 내재성 혈관신생으로 인한 것일 수 있다. 이는 상이한 계통의 처치 동물과 대조군 동물을 비교하였을 때 재관류가 왜 덜 극심한지를 설명할 수 있다.
그러나, 결과는 지방 유래 재생 세포로 처치된 마우스가 두 계통 모두의 처치되지 않은 마우스와 비교하였을 때 상당히 개선된 관류를 나타냈음을 나타냈다. 12일째까지, 혈류는 처치되지 않은 마우스에서 10 ± 10％인 것에 비하여, 인간 재생 세포로 처치된 NOD-SCID 마우스에서 50 ± 11％까지 복원되었다 (p＜0.05). 유사하게, 처치되지 않은 마우스에서 56 ± 4％인 것에 비하여, 면역적격 129S 마우스는 14일째에 80 ± 12％의 혈류 복원을 나타냈다.
또한, 마우스의 전체 해부시 재생 세포로 처치된 마우스의 뒷발에서 측부 혈관의 출현이 나타났지만, 처치되지 않은 마우스 또는 임의 마우스의 건강한 사지에서는 관찰되지 않았다.
실시예 5: ADC 용량의 증가는 개선된 이식 생존률 및 혈관신생과 관련된다
자가 지방 조직의 이식은 성형 수술 및 재건 수술에서 비교적 통상적인 수술이다 ([Fulton, 1998]; [Shiffman, 2001]). 그러나, 이러한 절차는 지방 조직 단편이 혈관 공급 없이 이식된다는 한계점이 있고, 그 결과 이식 생존률이 신생혈관증식에 좌우된다 ([Coleman, 1995]; [Eppley et al., 1990]). 따라서, 제한된 방식에 의해, 이식된 조직은 허혈 조직이 된다.
지방 조직 단편을 대퇴부 바깥쪽 근육에 걸쳐 피하 공간에 이식하는, 피셔(Fisher) 래트에서의 연구를 행하였다. 오른쪽 다리에는 지방 조직 단편 0.2 g을 단독으로 이식하고, 왼쪽 다리에는 3가지 상이한 용량 (1.7 × 105 내지 1.3 × 106개 세포/이식물; 용량마다 동물 3마리)의 지방 유래 줄기 세포의 첨가로 보충된 지 방 조직 단편 0.2 g을 이식하였고; 이러한 방식으로 반대쪽 다리가 대조군으로 작용하였다. 이어서, 동물을 1개월간 유지시킨 후, 조직학적 분석을 위해 동물을 안락사시켜 이식물을 회수하고, 칭량하고, 포르말린에 고정시키고 파라핀에 포매시켰다.
도 9A에 제시된 바와 같이, 결과는 대조군 다리에서는 이식된 조직이 최소로 보존되고 처치된 다리에서는 이식물 중량의 유지가 용량-의존적으로 증가하는 것을 나타낸다. 추가로, 이식물의 면역조직화학적 분석은 지방 유래 줄기 세포로 처치된 이식물에서 상당한 혈관신생 및 관류를 나타냈다 (도 20B, 화살표). 이것은 지방 조직 형태의 보존과도 관련되었다 (도 20B).
따라서, 실시예 1 내지 5는 본 발명의 지방 유래 재생 세포가 혈관신생 및 동맥신생 성장 인자를 분비하고; 시험관 내에서 신생 모세혈관 네트워크를 형성하며; 지방 이식물의 생존을 증강시키고; 허혈성 재관류를 증강시킨다는 것을 설명한다. 따라서, 본 발명의 재생 세포는 혈관신생 및 동맥신생을 촉진할 수 있고, 잠재적인 순환 장애로 인한 복합 질환을 치료하는데 기능성일 수 있다.
실시예 6: 재생 세포가 시험관 내에서 상처 치유 관련 사이토카인을 분비한다
케모카인은 피부 상처 치유에서 기능한다. 백혈구 아형의 동원(動員)은 케모카인에 의해 엄격하게 조절된다. 또한, 이러한 케모카인은 상피화, 조직 리모델링 및 혈관신생에도 기여한다.
따라서, 정상 성체 마우스로부터 배양된 ADC에 의해 분비된 상당한 양의 상처 치유 관련 사이토카인이 측정되었다. ADC를 10％ FBS가 있는 알파-MEM에서 세 포 전면성장 후 5일까지 배양하고, 이때 세포 배양 배지를 수확하고, 항체 어레이 분석 (RayBio® Mouse Cytokine Antibody Array III (RayBiotech, Inc.))에 의해 평가하였다.
결과 (표 A 참조)는 재생 세포가 상처 치유 프로세스에서의 재-상피화에 기여하는 시험관내 중성구, 대식세포, 비만 세포 및 림프구 동원을 위한 성장 인자 및 사이토카인을 분비하는 것을 나타낸다. 구체적으로, 재생 세포는 대식 세포 동원에서 기능하는 MIP-1 알파, RANTES 및 MCP-1; 단핵구 및 비만 세포 동원에서 기능하는 MCP-1; 림프구 동원에서 기능하는 MIG 및 TARC; 상처 복구 및 상피화에 기여하는 MIP-2 및 KC; 및 치유를 돕기 위해 만성 상처에서의 불균형 메탈로프로테이나제를 역전시킬 수 있는 메탈로프로테이나제-1 조직 억제제인 TIMP를 분비한다. 대식세포 및 림프구 모두 조절 및 성장 촉진 인자를 생산한다. 또한, 비만 세포는 Il-4를 방출하고, 이는 섬유아세포 활성화를 자극할 수 있다.
Figure 112007009566399-pct00001
실시예 7: 재생 세포가 시험관 내에서 콜라겐을 분비한다
재생 세포를 3가지 상이한 배양 배지, 즉 DMEM, 맥코이(McCoy) 5A 및 AMEM에서 로사(Rosa) 마우스로부터의 신생아 마우스 섬유아세포와 배합하였다. 배지를 2주 동안 매주 교체하였다. 3주째에에는 배치를 교체하지 않았다.
모든 배지를 수집하고, 콜라겐 분석법을 표준 프로토콜에 따라 수행하였다. 간략하게, 100 ㎕ 상청액 + 100 ㎕ 6N HCl을 100℃에서 16시간 동안 인큐베이션하고, 냉각시키고, 클로르아민(Chloramine)-T 및 디메틸아미노벤즈알데히드 시약과 반응시키고, 550에서 OD를 검출하였다.
ADC와 섬유아세포 사이에서는 콜라겐 분비의 상당한 차이가 관찰될 수 없는 반면, 상이한 배지들 사이에서는 상당한 차이가 관찰될 수 있었다. 구체적으로, 맥코이 5A 배지에서, ADC 및 섬유아세포 모두가 DMEM 또는 AMEM에서보다 더 많은 콜라겐을 분비한다 (p<0.05). 도 21 참조.
실시예 8: 재생 세포가 STZ 처치된 당뇨병 마우스의 상처 치유를 가속화시킨다
지방 유래 재생 세포가 생체 내에서 상처 치유를 촉진할 수 있는지를 결정하기 위해, 10마리의 마우스를 STZ로 7주 동안 처치하였다. 이때, 양측성 8㎜ 전체 두께의 피부 상처를 펀치(punch) 생검을 통해 생성시켰다. 이어서 5마리의 마우스를 0.05 ㎖ 부피로의 상처 당 1 ×1OE6 (lacZ 공여자로부터)의 국소적인 직접 주사에 의해 ADC로 처치하고, 나머지 5마리는 염수로 처치하여 대조군으로 사용하였다. 10일째에, 양쪽 군의 상처 크기는 상당한 차이에 도달하였다 (p=0.002, n=10개의 상처, 마우스 5마리). 도 22 참조. 이러한 결과는 지방 유래 재생 세포가 마우스에서 상처 치유를 보조할 수 있음을 나타낸다.
또한, 상처에서의 공여자 유래 세포의 생착을 설명하기 위해, 상처에서 β-갈락토시다제 염색을 수행하였다. 결과 (제시되지 않음)는 공여자 ADC 베타 gal-양성 세포가 주사 부위 주변에, 혈관 근처에, 그리고 상처 베드에 인접하게 국소화될 수 있음을 나타냈다.
실시예 9: 재생 세포가 상처가 있는 마우스에서의 모발 재성장을 가속화시킨다
10마리의 마우스를 STZ로 7주 동안 처치하였다. Nair 모발 제거기로 처치한 후, 양측성 8㎜ 전체 두께 피부 상처를 펀치 생검을 통해 생성시켰다. 이어서, 5마리의 마우스를 0.05 ㎖ 부피로의 상처 당 1 ×1OE6의 국소적인 직접 주사에 의해 ADC로 처치하고, 나머지 5마리는 염수로 처치하여 대조군으로 사용하였다. 동일한 절차를 8마리의 정상 B6C57 129 F1 마우스에 수행하고, 이중 4마리는 ADC를 국소 처치하고, 4마리는 대조군으로서 염수로 처치하였다.
14일째에, 양쪽 실험군의 상처 크기를 측정하고, 사진을 촬영하여 모발 회복속도를 기록하였다. 결과 (제시되지 않음)는 지방 유래 재생 세포가 마우스 상처 치유를 보조할 뿐만 아니라, 모발 성장 속도도 상당히 가속화시켰음을 나타냈다 (p<0.05). 수행된 조직학적 분석은 공여자 유래 지방에서 유래된 세포를 모낭 주변에서 나타냈다. 따라서, ADC는 상처 치유를 촉진함과 동시에 정상적인 모발 복원에 기여할 수 있다.
다수의 간행물 및 특허가 상기에서 언급되었다. 각각의 언급된 간행물 및 특허 문헌은 전체적으로 거명에 의해 본원에 포함된다.
등가물
당업자는 단지 일상적 것에 지나지 않는 실험들을 사용하여 본원에 기술된 본 발명의 구체적인 실시양태에 대한 여러 등가물을 인지하거나 확인할 수 있을 것이다. 이같은 등가물은 하기의 청구의 범위에 포함되는 것으로 의도된다.

Claims (34)

  1. 줄기 세포를 포함하는 지방 유래 재생 세포의 농축된 집단을 포함하고, 상기 세포의 농축된 집단은 배양되지 않은 것인, 상처 부위에서 상피화(epithelialization) 및 신생진피(neodermis) 형성을 촉진하기 위한 의약.
  2. 제1항에 있어서, 상기 줄기 세포를 포함하는 지방 유래 재생 세포의 농축된 집단이 MIP-1α, RANTES, MCP-1, MIG, TARC, MIC-1, KC 및 TIMP를 분비하는 것인 의약.
  3. 제1항에 있어서, 상기 세포의 농축된 집단이 IL-4, IL-6, 림포탁틴, LIX, MIP-1γ, RANTES, MCP-1, MCP-5, SDF-1α, KC 및 TIMP-1을 분비하는 것인 의약.
  4. 제1항에 있어서, 상기 지방 유래 재생 세포의 농축된 집단이 상처 부위에서 콜라겐을 분비하는 것인 의약.
  5. 제1항에 있어서, 상기 줄기 세포를 포함하는 지방 유래 재생 세포의 농축된 집단이 내피 세포를 추가로 포함하는 것인 의약.
  6. 제1항에 있어서, 상기 줄기 세포를 포함하는 지방 유래 재생 세포의 농축된 집단이 선조 세포(progenitor cell)를 추가로 포함하는 것인 의약.
  7. 제1항에 있어서, 상기 줄기 세포를 포함하는 지방 유래 재생 세포의 농축된 집단이 내피 세포 및 선조 세포의 배합물을 추가로 포함하는 것인 의약.
  8. 제1항에 있어서, 상기 지방 유래 재생 세포의 농축된 집단이 MIP-2 및 KC를 분비하는 것인 의약.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상처 부위에서 모발 성장을 촉진하는 의약.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 볼루스(bolus) 투여를 위해 제제화된 의약.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 용량 투여를 위해 제제화된 의약.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 혈관신생 인자를 추가로 포함하는 의약.
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 면역억제 약물을 추가로 포함하는 의약.
  14. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 피하, 피부 또는 근육내 전달을 위해 제제화된 의약.
  15. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 혈관계로의 전달을 위해 제제화된 의약.
  16. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지방 유래 재생 세포가 유전자 전달에 의해 변형되어, 변형된 세포 내의 1종 이상의 유전자 발현이 변경된 것인 의약.
  17. 제16항에 있어서, 상기 변형에 의해 혈관신생 수준이 변경되는 것인 의약.
  18. 제16항에 있어서, 상기 변형에 의해 상피화 수준이 변경되는 것인 의약.
  19. 제16항에 있어서, 상기 변형이 MIP-1α, RANTES, MCP-1, MIG, TARC, MIP-2, KC 및 TIMP, 또는 이들의 임의의 조합의 수준을 변경시키는 것인 의약.
  20. 제16항에 있어서, 상기 변형이 지방 유래 재생 세포의 귀환 성질(homing properties)을 변경시키는 것인 의약.
  21. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 의약이 투여될 대상의 지방 유래 재생 세포의 농축된 집단으로부터 제제화된 의약.
  22. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 지방 유래 재생 세포를 1×105 내지 1×107개/㎖의 최소 농도로 제공하는 의약.
  23. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상처가 허혈성 궤양 상처, 당뇨병 상처, 또는 외상성 상처인 의약.
  24. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지방 유래 재생 세포의 농축된 집단이 밀폐된 시스템에서 얻어지는 것인 의약.
  25. 제1항에 있어서, 첨가제를 추가로 포함하는 의약.
  26. 제25항에 있어서, 상기 첨가제가 조직 단편인 의약.
  27. 제25항에 있어서, 상기 첨가제가 무손상 지방 조직인 의약.
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
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  33. 삭제
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