CN110755609A - 一种特异性抗体的用途、一种植入医疗器械及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于一种特异性抗体的用途、一种植入医疗器械及制备方法。其用途为ATP结合盒蛋白的特异性抗体在制备促进内皮修复的药物中的应用。所述植入医疗器械表面负载有ATP结合盒蛋白的特异性抗体。所述制备方法包括将所述ATP结合盒蛋白的特异性抗体负载在所述植入医疗器械的至少一部分表面的工序和将ATP结合盒蛋白的特异性负载在所述植入医疗器械的孔内或槽内的工序。本发明提供的技术方案创造性的用ATP结合盒蛋白的特异性抗体来实现医疗器械的促进内皮修复功效，与现有内皮修复方式相比，其捕获人体自身的造血干细胞并诱导产生细胞实现有针对性的内皮修复，这种方式药物副作用小，不会带来其他不良影响，综合疗效更加理想。

Description

一种特异性抗体的用途、一种植入医疗器械及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种特异性抗体的用途、一种植入医疗器械及其制备方法。
背景技术
动脉粥样硬化疾病会导致血管内皮的损伤，从而造成血栓、炎症等病症，引发心肌梗死。如治疗时不能对损伤的组织进行修复，将导致内膜增生、血管再狭窄，危及患者生命。造血干细胞是血液系统中的成体干细胞，具有长期自我更新能力和分化成各类成熟血细胞的潜能。在植入血液系统的医疗器械表面负载上可以捕获造血干细胞的物质，并根据需求诱导造血干细胞原位分化为所需要的细胞类型，可完善器械的治疗和组织修复效果。
左心耳是从左心房伸出的耳状小囊，属于左心房的一部分，它是左心房主要组成部位。左心耳封堵术由波士顿科学研发，于2006年在欧洲获批上市，2013年12月31日，正式获得中国国家食品药品监督管理总局上市批准，并于2014年3月在中国正式上市。通过这种介入手术闭合了房颤病人血栓发生的根源部位——左心耳，由此可降低房颤病人中风的风险。封堵器表面覆盖的是可扩张的聚四氟乙烯膜，同一般植入医疗器械类似也需要负载一些对损伤组织进行修复的药物，以防止手术带来的不良后果。
1996年Margaret A.Goodell使用荧光染料Hoechst 33342活染骨髓细胞后进行流式分析，得到一群游离于主群之外的双阴性的细胞群，实验证明这群细胞具有干细胞的特性。Hoechst 33342是一种可以染活细胞DNA的荧光染料，其激发光为350nm，发射光分为两个波段，同时分析全骨髓细胞Hoechst 33342两个不同的发射光时，在双阴性区域有一群明显区别于主群的一小群细胞，经分析这群细胞的表面分子标记与造血干细胞一致。出现这一现象是因为造血干细胞膜上存在可以将Hoechst 33342染料泵出的蛋白。
目前促进内皮修复医疗器械一般都是在医疗器械表面负载小分子化合物或组合物来实现的，都是基于促进细胞生长的机理，但一般特异性差，促进内皮生长的同时也促进包括平滑肌、纤维细胞等其他细胞的生长，造成血管再狭窄、血栓等不良后果，这种方式药物副作用大，会带来其他不良影响。
发明内容
本发明提供一种特异性抗体的用途、一种植入医疗器械及制备方法，用以提供一种全新的促进内皮修复的方式。
本发明提供了一种特异性抗体的用途，所述特异性抗体是ATP结合盒蛋白的特异性抗体，用途为在制备促进内皮修复的药物中的应用。造血干细胞膜上存在可以将Hoechst33342染料泵出的蛋白，其包括ATP结合盒蛋白超蛋白家族，因此，这类蛋白可以被认为是造血干细胞的标志物。
可选地，所述ATP结合盒蛋白选自MDR-1或Bcrp-1。ATP结合盒蛋白超家族成员中多药耐药蛋白-1(MDR-1或称ABCB1或称P-glycoprotein 1或称CD243)和乳腺癌耐药蛋白-1(Bcrp-1或称Bcrp或称ABCG2或称CD338)，在用于促进内皮修复方面效果非常理想。
可选地，所述MDR-1的特异性抗体为Clone REA495。Clone REA495购于德国美天旎生物科技有限公司。
可选地，所述Bcrp-1的特异性抗体为Clone 5D3。Clone 5D3购于德国美天旎生物科技有限公司。
本发明还提供了一种植入医疗器械，所述植入医疗器械表面负载有ATP结合盒蛋白的特异性抗体。
可选地，所述ATP结合盒蛋白选自MDR-1或Bcrp-1。
可选地，所述MDR-1的特异性抗体为Clone REA495。
可选地，所述Bcrp-1的特异性抗体为Clone 5D3。
可选地，所述ATP结合盒蛋白的特异性抗体负载在所述植入医疗器械的至少一个面。
可选地，所述植入医疗器械为人工血管、人工瓣膜的膜、人工瓣膜支架、左心耳封堵器膜、左心耳封堵器支架、心脏封堵器膜、心脏封堵器支架或人工补片。
可选地，所述植入医疗器械为左心耳封堵器膜或心脏封堵器膜。
可选地，所述植入医疗器械表面单位面积上所述ATP结合盒蛋白的特异性抗体的浓度范围是：10～1000μg/mm2。浓度过低，抗体在血液中很快被溶解，浓度达到一定程度抗体结合位点饱和，效果不再增加。
本发明还提供了上述植入医疗器械的制备方法，包括将所述ATP结合盒蛋白的特异性抗体负载在所述植入医疗器械的至少一部分表面的工序和将ATP结合盒蛋白的特异性负载在所述植入医疗器械的孔内或槽内的工序。
可选地，所述ATP结合盒蛋白的特异性抗体通过直接涂覆法、化学接枝法和/或静电吸附法法负载到所述植入医疗器械的表面。
其中直接涂覆法是将抗体溶液直接涂覆到器械表面，涂覆的方法可以是喷涂、浸涂或旋涂。
其中化学接枝法可以是对抗体分子进行化学改性，使其能够和器械表面或器械涂层表面发生化学连接。也可以是通过使用抗体连接剂或交联剂将抗体分子和器械表面结合。
其中静电吸附法是在器械表面涂覆带相反电荷的涂层，使得抗体分子通过静电吸附力涂覆到器械表面。
本发明提供的技术方案创造性的用ATP结合盒蛋白的特异性抗体来实现医疗器械的促进内皮修复功效，与现有内皮修复方式相比，其捕获人体自身的造血干细胞并诱导产生细胞实现有针对性的内皮修复，这种方式药物副作用小，不会带来其他不良影响，综合疗效更加理想。
附图说明
图1是实施例5抗体负载实验中负载ATP结合盒蛋白的特异性抗体的样品用二抗荧光染料染色后的荧光图，从左至右的三图依次对应实施例1、2和4中的样品；
图2是实施例5细胞捕获实验中负载ATP结合盒蛋白的特异性抗体的样品捕获血液中的细胞，对细胞进行特异性抗体荧光染色的荧光图，从左到右的三图依次对应实施例1、2和4中的样品；
图3是实施例5动物实验中负载ATP结合盒蛋白的特异性抗体的支架和药物支架植入兔髂动脉14天后SEM表征图，图3a-图3c依次为实施例1、2和4的支架样品，图3d为对照组的支架样品；
图4是实施例6抗体负载实验中实施例3的膜用二抗荧光染料染色后的荧光图片；
图5是实施例6细胞捕获实验中实施例3的膜捕获血液中的细胞，对细胞进行特异性抗体荧光染色的荧光图，
图6是实施例6动物实验中样品膜缝织在左心耳封堵器支架植入体内14天后SEM表征图，左侧图为实施例3中负载了Clone REA495的样品膜，右侧图为未处理的样品膜作为对照。
具体实施方式
为了便于理解，下面结合实施例阐述所述ATP结合盒蛋白的特异性抗体的用途，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
本发明中所用的原材料及器械，如无特别指出，均为可市购商品。
本发明中所涉及的“医疗器械”可以是植入体内的器械。该器械可以短期暂时使用，或者长期永久性植入。在某些实施方式中，合适的器械是那些通常用于为心律失调、心力衰竭、瓣膜性疾病、血管病、糖尿病、神经疾病和失调症、整型外科、神经外科、肿瘤学、眼科学和ENT手术提供医疗和/或诊断的器械。本发明所涉及的医疗器械包括但不限于以下设备：支架、支架移植物、吻合连接器、合成贴片、引线、电极、针、导线、导管、传感器、手术仪器、血管成形球、创口引流管、分流管(shunt)、管子、输液套简(infusion sleeve)、尿道插管、小球、植入物、血液充氧发生器、泵、脉管移植物、埋入式介入药盒(vascular accessport)、心瓣膜、瓣环成形术环、缝合线、手术夹、手术钉、起博器、可植入去纤颤器、神经刺激器、整型外科器械、脑脊髓液分流管、可植入药泵、椎笼、人造椎间盘、髓核的替代器械、耳管、眼内晶状体和在介入手术中使用的任何管。优选地，本发明所涉及的医疗器械尤其是：支架、球囊、封堵器、瓣膜或人工血管。
实施例1
100g Bcrp1单克隆抗体Clone 5D3(购于德国美天旎生物科技有限公司)溶解于10mL抗体稀释液(武汉博士德)中，配制成浓度为10g/mL的抗体溶液。聚电解质透明质酸钠(HA)1mg/mL溶于0.1％的NaCl溶液中，聚电解质壳聚糖(CS)1mg/mL溶于0.1％的NaCl溶液中，基础涂层聚电解质聚酰亚胺(PEI)5
mg/mL溶于0.1％的NaCl溶液中。
将裸支架洗净吹干。首先浸于聚乙酰亚胺(PEI)溶液中，得到PEI层；将PEI处理过的支架浸于透明质酸钠(HA)溶液中，得到HA外层；接着将支架浸于壳聚糖(CS)溶液中,得到CS外层。重复上述HA/CS静电组装过程7次，得到透明质酸钠/壳聚糖自组装多层膜，记为PEI(HA/CS)7。将支架浸泡在抗体溶液中30min，取出N2吹干。完成Clone 5D3负载支架制备。经称重计算，最终测得支架表面单位面积的Clone 5D3的浓度为21g/mm2。
实施例2
100g MDR1单克隆抗体Clone REA495(购于德国美天旎生物科技有限公司)溶解于1mL抗体稀释液(武汉博士德)中，配制成浓度为100g/mL的抗体溶液。将激光切割的L605裸支架用H2SO4:H2O2＝3:1溶液浸泡30分钟，用纯化水漂洗3次，氮气吹干。浸于抗体溶液中，静置30分钟后取出，自然晾干，4℃条件保存。完成Clone REA495负载支架制备。经称重计算，最终测得支架表面单位面积的Clone REA495的浓度为89g/mm2。
实施例3
1mg MDR1单克隆抗体Clone REA495(购于德国美天旎生物科技有限公司)溶解于1mL抗体稀释液(武汉博士德)中，配制成浓度为1mg/mL的抗体溶液。用超声喷涂仪将抗体溶液喷涂到左心耳封堵器膜表面，自然晾干，4℃条件保存。完成Clone REA495负载膜制备。经称重计算，最终测得膜表面单位面积的Clone REA495的浓度为780g/mm2。
实施例4
1mg Bcrp1单克隆抗体Clone 5D3(购于德国美天旎生物科技有限公司)溶解于1mL抗体稀释液(武汉博士德)中，配制成浓度为1mg/mL的抗体溶液。聚电解质透明质酸钠(HA)1mg/mL溶于0.1％的NaCl溶液中，聚电解质壳聚糖(CS)1mg/mL溶于0.1％的NaCl溶液中，基础涂层聚电解质聚酰亚胺(PEI)5
mg/mL溶于0.1％的NaCl溶液中。抗体连接剂NHS(100mM)/EDC(400mM)溶解于0.1％的NaCl溶液中。
将裸支架洗净吹干。首先浸于聚乙酰亚胺(PEI)溶液中得到PEI层；将PEI处理过的支架浸于透明质酸钠(HA)溶液中得到HA外层；接着将支架浸于壳聚糖(CS)溶液中，得到CS外层。重复上述HA/CS静电组装过程7次，得到透明质酸钠/壳聚糖自组装多层膜，记为PEI(HA/CS)7。将支架浸泡在抗体连接剂NHS(100mM)/EDC(400mM)溶液中4℃作用2小时，取出放入抗体溶液中37℃作用2小时，取出N2吹干。完成Clone 5D3负载支架制备。支架表面单位面积的Clone 5D3的浓度为813g/mm2。
实施例5
本实施例是实施例1、2、4中的通过三种方式负载Clone 5D3或Clone REA495抗体的支架的体内外功能评价。
5.1抗体负载结果评价
将抗体负载支架用TRITC标记抗小鼠IgG二抗进行荧光染色，鉴定抗体是否负载成功。图1从左到右依次显示的是实施例1、实施例2和实施例4的样品用二抗荧光染料染色后的荧光图片。从图中可以看出，支架负载抗体后可以被染成荧光色。说明抗体能够成功的被负载到在支架杆表面。
5.2细胞捕获实验
采集兔静脉血液5mL，用PBS进行1:1稀释混匀；将稀释血液缓慢铺加到Ficoll淋巴细胞分离液表面，体积比为1:1；2500g速度离心30分钟；吸取中间云雾层至干净离心管中，加入5mL PBS，吸管吹打混匀，2000g速度离心10分钟；吸去上层澄清液，再加入5mL PBS，吸管吹打混匀，2000g速度离心10分钟，弃上清获得底部细胞，盖好离心管盖，转移到无菌操作台内。打开离心管盖，向瓶底加入6mL EGM-2培养基，吹打混匀。选用铺好纤粘连蛋白的6孔板，将实施例1、2、4中的负载抗体的支架分别置于不同的6孔板孔内。取混匀的细胞，每孔加入2mL细胞悬浮液。将六孔板置于37℃，CO2浓度为5％的培养箱内摇晃培养。2小时后，取出6孔板，固定细胞，分别用接枝藻红蛋白荧光基团的抗体染料(CD338-PE、CD243-PE)对细胞进行染色，鉴定细胞表现。
由于Bcrp1抗体捕获的细胞一定表达Bcrp-1，MDR1抗体捕获的细胞一定表达MDR-1，因此用Bcrp-1对应的抗体荧光染料CD338-PE和MDR-1对应的抗体荧光染料CD243-PE染料可以对捕获细胞进行荧光标记。实施例1、2和4中的样品捕获血液中的细胞，样品表面捕获的细胞可以被藻红蛋白荧光染料染成红色荧光，图2从左到右依次为对细胞进行特异性抗体荧光染色的荧光图，，说明负载了Bcrp1抗体或MDR1抗体的样品可以成功捕获到造血干细胞。
5.3动物实验
(一)样品制备
按照实施例1、2、4中的方法制备的Bcrp-1、MDR-1抗体负载支架。制备过程中使用的工具和试剂均需事前灭菌，制备工艺全程在无菌环境内完成。获得的支架在无菌环境内压握、吹塑、包装。最后在4℃温度下保存，待用。
(二)样品植入
准备体重为2.2-2.6kg的新西兰大白兔9只，动物体重与年龄相匹配。实验组为三种不同的细胞捕获支架，对照组为雷帕霉素药物支架，每组3只动物。每只动物在左右髂动脉各植入1枚支架作为平行样。器械按照目标支架:动脉尺寸＝1.10:1.0～1.20:1.0的比例进行植入。支架植入前将通过血管造影术对目标血管进行评价。支架植入后所有目标血管也将再次进行血管造影术评价。
(三)实验结果
支架植入14天后，取出植入支架段，沿血管轴向剖开，用含肝素的生理盐冲洗1分钟，然后将血管转移到2.5％戊二醛中固定，24小时后取出脱水、干燥进行扫描电镜观察内皮覆盖情况。支架样品植入兔髂动脉14天后通过SEM表征，图3a-图3c依次为实施例1、2和4的SEM表征图，图3d为对照组的支架样品的SEM表征图；，可以发现实施例1、2和4的支架样品14天后血管内皮有完整的内皮组织覆盖，内皮细胞形态良好。对照组药物支架血管内壁有大量的纤维蛋白和淋巴细胞覆盖，内皮不良。结果表明，所制备的干细胞捕获支架可以达到更好的促内皮修复效果。
实施例6
本实施例是实施例3中的负载Clone REA495的左心耳封堵器膜的体内外功能评价。
6.1抗体负载结果评价
将抗体负载膜用TRITC标记抗小鼠IgG二抗进行荧光染色，鉴定抗体是否负载成功。如图4所示，左心耳封堵器膜负载抗体后可以被染成荧光色。说明抗体能够成功的被负载到在膜表面。
6.2细胞捕获实验
按照实施例5中的细胞捕获方法对膜表面进行细胞捕获实验，如图5所示，样品表面捕获的细胞可以被藻红蛋白荧光染料染成荧光色，说明负载了抗体的样品可以成功捕获到造血干细胞。
6.3左心耳封堵器植入
(1)样品植入
将抗体负载膜缝织在左心耳封堵器支架表面，灭菌后待用。准备体重为30kg左右的比格犬6只，实验组、对照组各3只。实验组左心耳膜负载抗体，对照组左心耳膜未处理。动物麻醉后，在X射线透视环境下进行房间隔穿刺，穿刺成功后，推送穿刺鞘进入左心房，撤出穿刺针，沿扩张器插入超硬导丝，交换左心耳封堵器鞘管，沿鞘管送入6F猪尾导管至左心耳，进行造影，观察左心耳形状并测量左心耳开口宽度及深度，选择合适规格封堵器植入左心耳，造影观察封堵效果并牵拉测试封堵稳固性。封堵效果良好封堵器稳固则解脱封堵器。撤出鞘管，进行手术收尾工作，完成左心耳封堵器植入手术。
(2)实验结果
封堵器植入14天后，对动物实施安乐死，解剖取出左心耳封堵器，将左心耳封堵器膜从支架上取下。固定、脱水后用SEM观察膜表面的内皮化情况。如图6所示，左侧图为实施例3中负载了Clone REA495的样品膜，右侧图为未处理的样品膜作为对照，左侧图显示负载抗体后膜表面被内皮细胞完整覆盖，右侧图显示未处理的膜表面有大量纤维蛋白和血液细胞沉积。说明，使用负载抗体的膜的左心耳封堵器可迅速实现内皮化。
本发明提供的技术方案创造性的用ATP结合盒蛋白的特异性抗体来实现医疗器械的促进内皮修复功效，与现有内皮修复方式相比，其捕获人体自身的造血干细胞并诱导产生细胞实现有针对性的内皮修复，这种方式药物副作用小，不会带来其他不良影响，综合疗效更加理想。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制。尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种特异性抗体的用途，其特征在于，所述特异性抗体是ATP结合盒蛋白MDR-1或Bcrp-1的特异性抗体，用途为在制备促进内皮修复的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述特异性抗体的用途，其特征在于，所述ATP结合盒蛋白MDR-1或Bcrp-1的特异性抗体为Clone REA495或Clone 5D3。
3.一种植入医疗器械，其特征在于，所述植入医疗器械表面负载有ATP结合盒蛋白MDR-1或Bcrp-1的特异性抗体。
4.根据权利要求3所述植入医疗器械，其特征在于，所述ATP结合盒蛋白MDR-1或Bcrp-1的特异性抗体为Clone REA495或Clone 5D3。
5.根据权利要求4所述植入医疗器械，其特征在于，所述ATP结合盒蛋白的特异性抗体负载在所述植入医疗器械的至少一个面。
6.根据权利要求4所述植入医疗器械，其特征在于，所述植入医疗器械为人工血管、人工瓣膜的膜、人工瓣膜支架、左心耳封堵器膜、左心耳封堵器支架、心脏封堵器膜、心脏封堵器支架或人工补片。
7.根据权利要求5所述植入医疗器械，其特征在于，所述植入医疗器械为左心耳封堵器膜或心脏封堵器膜。
8.根据权利要求3-7任一项所述的植入医疗器械，其特征在于，所述植入医疗器械表面单位面积上所述ATP结合盒蛋白的特异性抗体的浓度范围是：10～1000μg/mm2。
9.权利要求3-8任一项所述的植入医疗器械的制备方法，其特征在于，包括将所述ATP结合盒蛋白的特异性抗体负载在所述植入医疗器械的至少一部分表面的工序或将ATP结合盒蛋白的特异性抗体负载在所述植入医疗器械的孔内或槽内的工序。
10.根据权利要求9所述植入医疗器械的制备方法，其特征在于，所述ATP结合盒蛋白的特异性抗体通过直接涂覆法、化学接枝法和/或静电吸附法法负载到所述植入医疗器械的表面。
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