KR20070017974A - 말초 혈관 질환 및 관련 장애의 치료에서의 재생 세포의이용 방법 - Google Patents

Abstract

지방 조직에 존재하는 세포는 PVD 및 관련 질환 또는 장애를 가진 환자를 포함한 환자를 치료하는데 이용된다. 환자의 치료 방법은 지방 조직으로부터 수득한 농축된 양의 줄기 세포를 환자에게 전달하기 위해 지방 조직을 프로세싱하는 것을 포함한다. 그 방법은 줄기 세포가 환자에게 투여되기 전에 외부 환경에 노출되지 않도록 밀폐 시스템에서 실행될 수 있다. 따라서, 바람직한 방법에서, 지방 조직에 존재하는 세포는 치료 효과를 촉진시키거나, 유발하거나 또는 지지하는데 필요한 그러한 첨가제와 함께 수용자에게 직접 위치된다.

말초 혈관 질환, 재생 세포, 줄기 세포, 지방 조직

Description

말초 혈관 질환 및 관련 장애의 치료에서의 재생 세포의 이용 방법{METHODS OF USING REGENERATIVE CELLS IN THE TREATMENT OF PERIPHERAL VASCULAR DISEASE AND RELATED DISORDERS}

관련 출원

본 출원은 2001년 12월 7일자로 출원된 미국 가출원 제60/338,856호의 이익을 청구하는, 2002년 12월 9일자로 출원된 미국 출원 제10/316,127호(발명의 명칭: "SYSTEMS AND METHODS FOR TREATING PATIENTS WITH PROCESSED LIPOASPIRATE CELLS")의 일부 계속 출원이다. 이 출원은 또한 2003년 9월 17일자로 출원된 미국 가출원 제60/503,589호(발명의 명칭: "METHODS OF USING ADIPOSE TISSUE-DERIVED CELLS IN THE TREATMENT OF PERIPHERAL VASCULAR DISEASE AND RELATED CONDITIONS")에 대해 우선권을 주장한다. 상기 모든 출원들의 내용은 명백히 본원에 참고로 인용된다.

본 발명은 일반적으로 지방 조직으로부터 유래된 세포, 및 더욱 상세하게는 말초 혈관 질환 및 관련 상태, 질환 또는 장애의 치료에 이용되는, 지방 유래된 재생 세포(예를 들면, 줄기 및(또는) 선구 세포(progenitor cell)), 지방 유래된 재생 세포의 이용 방법, 지방 유래된 재생 세포를 함유하는 조성물, 및 지방 유래된 재생 세포를 제조하고 이용하기 위한 시스템에 관한 것이다.

말초 혈관 질환(Peripheral Vascular Disease; PVD) 및 관련 장애는 종종 사지 혈관의 협착시에 직면하는 심장 및 중추 신경계 외측 혈관의 질환으로서 정의된다. 이들 장애의 2가지 주요 유형으로는, 혈관에는 결함이 없지만 감기, 스트레스 또는 흡연과 같은 자극으로부터 발생하는 기능적 질환, 및 죽상경화증 병변, 국소 염증 또는 외상성 손상과 같은 혈관계의 구조적 결함으로부터 발생되는 기질적 질환이 있다. 이는 혈관 폐색, 이상 혈류 및 궁극적으로는 조직 허혈로 유도될 수 있다.

임상적으로 더욱 유의한 형태의 PVD 중 하나는 관상동맥 질환(Coronary Artery Disease; CAD)과 공통의 요소를 갖고 있는 말초 혈관 질환(PVD)이다. CAD와 마찬가지로, PAD는 종종 스텐트의 혈관성형술 및 이식에 의해 또는 동맥 우회술에 의해 치료된다. 임상 증상은 폐색 혈관의 위치에 따라 다르다. 예를 들면, 장으로 혈액을 공급하는 동맥(즉, 상장 간막 동맥)의 협착 결과 폐색 혈관이 소화 및 흡수 과정에서 발생되는 증가된 산소 요구량을 충족시키지 못함으로써 심각한 식후 하복부 통증이 생길 수 있다. 몇가지 형태의 허혈은 장 괴사를 유도할 수 있다. 마찬가지로, 다리의 PAD는 일반적으로 송아지에서, 활동함에 따라 생기는 간헐성 통증을 유발할 수 있다. 이러한 장애는 간헐성 파행(Intermittent Claudication; IC)으로 알려져 있으며, 쉬는 동안의 지속적인 통증, 허혈성 궤양 및 심지어는 절단으로 진행될 수 있다. PVD에 대한 현재 이용가능한 치료적 요법으로는 혈전용해약 및 항혈전제(헤파린, 아스피린, 쿠마딘), 운동(IC의 경우), 항동맥경화약(예를 들면, 스타틴) 및 혈관재생 수술이 있다. 그러나, 많은 환자들은 해부학적으로 수술적 요법에 적합하지 않은 형태의 질환을 갖고 있다.

말초 혈관 질환은 또한 신허혈 및 신장 기능장애를 유도할 수 있는, 신동맥의 죽상경화성 협착으로 나타난다. 생물학적 혈관재생은 수술적 방법의 가능한 대안을 제공한다. 그것은 폐색 주위의 혈류를 우회시키기 위한 새로운 측부 혈류 기술의 개발을 유도하도록 조합된 혈관신생(angiogenesis) 및 동맥형성 과정을 포함한다. 생물학적 혈관재생은 혈관신생 인자를 제공하는 약물 및 유전자 요법에 의해 또는 혈관신생 인자의 파라크린 분비에 의해 및(또는) 내피를 형성할 수 있는 세포 공급원을 제공함으로써 혈관신생에 기여하는 세포를 전달하는 세포 요법에 의해 이루어질 수 있다.

세포 요법 연구는 골수 내의 비조혈 줄기 세포 및 내피 선구 세포의 존재의 검출을 기반으로 하였다(Prockop, Azizi et al. 2000)(Pittenger, Mackay et al. 1999)(Shi, Rafii et al. 1998; Carmeliet and Luttun 2001). 이들 연구는 수용자에서의 새로운 혈관 형성의 일부분이 공여자 골수 세포로부터 유래된 것임을 증명하기 위해 공여 및 숙주 세포의 유전자 마커가 구별될 수 있는 골수 이식 수여 동물을 이용하였다(Carmeliet and Luttun 2001)(Takahashi, Kalka et al. 1999; Murayama, Tepper et al. 2002). 이러한 연구는 골수가 그러한 세포를 포함한다는 것을 명확하게 입증하지만, 골수 중의 중간엽 줄기 세포 빈도는 유핵 세포 100,000 중 1 내지 1,000,000 중 1로 추정된다 (D'Ippolito et al., 1999; Banfi et al., 2001; Falla et al., 1993). 마찬가지로, 이들 세포를 피부 또는 기타 조직으로부 터 추출하는 과정은 몇 주에 걸친 복잡한 일련의 세포 배양 단계를 포함하며(Toma et al., 2001), 골격근 유도된 줄기 세포의 임상적 응용은 2 내지 3주 배양 단계를 필요로 한다 (Hagege et al., 2003). 따라서, 그러한 조직으로부터 수득한 줄기 세포의 제안된 임상적 응용을 위해서는 세포 정제 및 세포 배양의 과정에 의한 세포 수, 순도 및 성숙도의 증가를 필요로 한다.

세포 배양 단계들이 세포 수, 순도 및 성숙도를 증가시킬 수 있긴 하지만, 그러기 위해서는 비용이 든다. 이러한 비용으로는 다음과 같은 하나 이상의 기술적 문제점, 예를 들면 세포 노화로 인한 세포 기능의 상실, 잠재적으로 유용한 비-줄기 세포군의 손실, 환자에 대한 잠재적 세포 이용의 지연, 금전적 비용의 증가 및 배양 중 환경적 미생물에 의한 세포 오염의 위험 증가를 포함할 수 있다. 골수 유래된 ASC의 치료 효과를 시험하는 최근의 연구는 세포 배양과 관련된 문제점을 피하기 위해 거의 전체 골수를 이용하였다(Horwitz et al., 2001; Orlic et al., 2001; Stamm et al., 2003; Strauer et al., 2002). 그러나, 임상적 이점은 골수에서 본래 이용가능한 제한된 ASC 용량과 순도와 거의 특정하게 관련된 준최적의 결과였다.

최근에, 지방 조직은 줄기 세포 공급원인 것으로 밝혀졌다(Zuk et al., 2001; Zuk et al., 2002). 지방 조직(골수, 피부, 근육, 간 및 뇌와 다르게)은 낮은 이환율로 비교적 대량으로 동등하게 쉽게 수거된다(Commons et al., 2001; Katz et al., 2001b). 그러나, 당업계에는 지방 유래된 줄기 세포를 수거하는 적당한 방법이 없다. 기존의 방법들은 많은 단점들을 갖고 있다. 예를 들면, 기존의 방 법들은 부분 또는 완전 자동화, 부분 또는 완전 밀폐 시스템, 구성품들의 일회성 등 면에서 부족할 수 있다.

지방 줄기 세포를 이용한 PVD 치료 가능성의 가정하에, 성체 줄기 세포군을 증가된 수율, 일관성 및(또는) 순도로 생산하고 추출후 조작 필요성을 감소시키거나 배제시키며 신속하고 신뢰성있게 생산하는 지방 조직으로부터 세포를 수거하는 방법이 당업계에 요망된다.

발명의 요약

본 발명은 PVD 및 관련 질환 또는 장애의 치료에 이용될 수 있는 재생 세포, 예를 들면 성체 줄기 및 선구 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 조직, 예를 들면 지방 조직으로부터 재생 세포를 분리하고 농축시키는 시스템 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 PVD 및 관련 질환 또는 장애를 치료하기 위한 재생 세포의 조성물에 관한 것이다. 따라서, 일반적인 실시양태에서, 본 발명은 수용자에게 직접 위치되는 조직으로부터 유래된 재생 세포를, 치료 효과를 촉진시키거나, 유발하거나 또는 지지하는데 필요한 첨가제와 함께 이용하는 조성물, 방법 및 시스템에 관한 것이다.

특정 실시양태에서, 본 발명은 일정 농도의 재생 세포를, 바람직하게는 주사에 의해 투여하여, PVD 및 관련 질환 또는 장애, 혈관 결함 또는 장애, 관상외 조직 장애, 말초 동맥 질환, 죽상경화증 및 염증성 동맥염을 치료하는 방법에 관한 것이다. 재생 세포는 예를 들어, 줄기 세포, 선구 세포(progenitor cell) 또는 그의 조합으로 이루어질 수 있다. 특정 실시양태에서, 치료 효과를 유도하기 위해 재생 세포의 다회 용량 투여가 필요할 수도 있다. 또한, 1종 이상의 성장 인자와 같은 첨가제를 재생 세포와 함께 투여할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 재생 세포를 단독의 또는 다른 첨가제와 배합된 혈관신생 성장 인자와 함께 투여할 수도 있다. 재생 세포는 또한 1종 이상의 면역억제제와 함께 투여될 수 있다.

재생 세포의 투여 경로는 당업계에 알려져 있으며, 그 예로는 정맥내, 근육내 및 피하 투여 경로가 있다. 세포는 예를 들어, 환자의 혈관계로 투여될 수 있다. 세포는 또한 당업계에 공지된 스캐폴드, 예를 들면 재흡수성 스캐폴드를 통해 투여될 수 있다.

환자에게 투여하기 전에, 재생 세포는 세포 배양액에서 성장되어 예를 들어, 혈관신생 및(또는) 내피 표현형으로의 분화를 촉진시킬 수 있다. 스캐폴드 소재, 예를 들면 재흡수성 스캐폴드 상에서 세포 배양을 실시하여 환자 위에 또는 환자 내에 위치될 수 있는 2차원 또는 3차원 구조물을 형성할 수 있다. 환자에게 투여하기 전에, 변형된 재생 세포에서의 하나 이상의 유전자, 예를 들면 혈관신생 유전자 또는 세포사멸 유전자의 발현이 변화되도록 세포를 유전자 전달(gene transfer)에 의해 변형시킬 수 있다.

본 발명은 또한 대상에게 재주입하기에 적당한 재생 세포, 예를 들면 줄기 및 선구 세포를 소정의 조직으로부터 분리하고 농축시킬 수 있는 다능성 시스템 및 방법에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 시스템은 자동화된다. 본 발명의 시스템은 일반적으로 수집 챔버, 프로세싱 챔버, 폐기물 챔버, 생산 챔버 및 시료 챔버 중 하나 이상을 포함한다. 각종 챔버는 생물학적 재료를 함유하는 유체가 밀 폐된 멸균 유체/조직 경로로 한 챔버에서 다른 챔버로 통과할 수 있도록 하나 이상의 도관을 통해 함께 결합된다. 특정 실시양태에서, 폐기물 챔버, 생산 챔버 및 시료 챔버는 선택적이다. 한 실시양태에서, 조직 추출에서부터 장치의 프로세싱을 거쳐 수용자로의 배치까지의 전체 절차는 모두 동일 설비에서, 사실상 심지어는 절차를 경험하는 환자의 동일한 공간 내에서 수행될 것이다.

따라서, 한 실시양태에서 PVD 또는 관련 질환 또는 장애를 가진 환자를 치료하는 방법은 a) 조직 제거 시스템을 제공하는 단계; b) 조직 제거 시스템을 이용하여 일정 농도의 줄기 세포를 갖는 지방 조직을 환자로부터 제거하는 단계; c) 프로세싱 전의 지방 조직의 재생 세포의 농도와 다른 농도의 재생 세포를 수득하기 위해 지방 조직의 적어도 일부를 프로세싱하는 단계; 및 d) 환자에게 투여하기 전에 조직 제거 시스템으로부터 재생 세포를 제거하지 않고, 바람직하게는 주사에 의해 재생 세포를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.

본원에 기재된 임의의 특징 또는 특징들의 조합은, 상황, 설명 및 당업자의 지식으로부터 명확해지는 바와 같이 그러한 조합에 포함된 특징들이 서로 불일치하지 않는다면 본 발명의 영역 내에 포함된다. 본 발명의 추가의 이점 및 국면들은 다음의 상세한 설명에서 명확해진다.

도 1은 하나의 필터 어셈블리를 포함하는, 조직으로부터 재생 세포를 분리하는 시스템의 도해이다.

도 2는 다수의 필터 어셈블리를 직렬 구조로 갖는, 도 1과 유사한 시스템의 도해이다.

도 3은 다수의 필터 어셈블리를 병렬 구조로 갖는, 도 1과 유사한 시스템의 도해이다.

도 4는 원심 챔버를 포함하는, 조직으로부터 재생 세포를 분리하는 시스템의 도해이다.

도 5는 조직으로부터 재생 세포를 분리하는 시스템에 이용되는, 전치 필터를 포함하는 수집 챔버의 단면도이다.

도 6은 삼투 여과 시스템을 이용하는, 조직으로부터 재생 세포를 분리하는 시스템의 프로세싱 챔버의 단면도이다.

도 7은 재생 세포를 농축시키기 위해 원심 장치를 이용하는, 재생 세포를 분리하는 시스템의 프로세싱 챔버의 단면도이다.

도 8은 도 7의 프로세싱 챔버의 또 다른 단면도이다.

도 9.1, 9.2 및 9.3은 본 발명의 시스템과 함께 사용되는 분급 구성품을 예시한다.

도 10은 시스템을 통해 유체를 이동시키기 위해 진공압을 이용하는, 조직으로부터 재생 세포를 분리하는 시스템의 도해이다. 진공 시스템은 유동 방향 및 시기를 조절하기 위해 스탑콕, 벤트 및 클램프의 시스템을 이용하여, 조직 및 유체를 시스템을 거쳐 일정한 속도로 밀어내도록 진공 펌프 또는 진공원을 시스템의 출구에 적용함으로써 제조될 수 있다.

도 11은 시스템을 통해 유체를 이동시키기 위해 정압을 이용하는, 조직으로 부터 재생 세포를 분리하는 시스템의 도해이다. 정압 시스템은 유동 방향 및 시기를 조절하기 위해 밸브, 스탑콕, 벤트 및 클램프의 시스템을 이용하여, 유체 및 조직을 시스템을 거쳐 일정한 속도로 밀어내거나 추진하기 위해 연동 펌프와 같은 기계적 수단을 이용한다.

도 12A는 유체의 공급 스트림이 필터의 기공에 접선 방향으로 흐르는 여과 방법을 예시한다. 도 12B는 유체의 공급 스트림이 필터의 기공에 수직으로 흐르는 여과 방법을 예시한다.

도 13은 본 발명의 시스템에 대한 예시적인 일회용 세트의 도해이다.

도 14는 본 발명의 시스템에 대한 예시적인 재사용가능한 구성품의 도해이다.

도 15A는 도 13의 일회용 세트 및 도 14의 재사용가능한 구성품을 이용하여 조립된 본 발명의 예시적인 장치의 도해이다.

도 15B는 본 발명의 시스템의 자동화된 실시양태를 제어하는, 소프트웨어 프로그램을 통해 이행되는 예시적인 미리-프로그래밍된 단계를 나타내는 플로우챠트이다. 시스템의 다능성을 나타내는 2개의 대안적 프로세싱 변수가 나타내어져 있다.

도 16A 및 16B는 배양된 지방 줄기 세포에 의한 VEGF(5A) 및 PlGF(5B)의 발현을 나타낸다.

도 17은 지방 줄기 세포군 내의 내피 선구 세포의 검출을 나타낸다.

도 18A 및 18B는 정상(7A) 및 스트렙토조토신-처리된 (7B) 마우스에서의 혈 관 구조의 시험관내 발생을 나타낸다.

도 19는 음성 대조군에 비해 지방 줄기 세포로 처리된 뒷다리 허혈 마우스에서의 혈류량의 평균 회복 증가를 나타낸다.

도 20A 및 20B는 지방 줄기 세포 용량을 증가시키면 이식 생존 및 혈관신생이 개선되고 (20A) 조직 표본에서의 지방 조직 구조가 유지됨을 나타낸다 (20B).

본 발명은 지방 유래된 재생 세포("ADCs")를 이용하는 PVD를 위한 방법을 제공한다. PVD는 일반적으로 혈관의 죽상경화증성 협착이 그 자체로 조직 허혈 정도까지 유도하면서 동시에 협착 지점의 혈병 또는 다른 색전증으로부터 발생되는 임상적으로 유의한 관류 결함의 가능성을 증가시키는 동맥혈전성 진행으로부터 발생된다. 허혈은 심각한 또는 진행성 형태로 괴사 과정을 유도할 수 있는 현재 폐색된 혈관에 의해 정상적으로 관류되는 조직 내의 대사 기능이상(요구량을 충족시키기에 부적절한 산소 공급)을 유도한다. 본 발명은 부분적으로 본 발명의 재생 세포가 (1) PlGF, VEGF, bFGF, IGF-II, 에오탁신, G-CSF, GM-CSF, IL-12 p40/p70, IL-12 p70, IL-13, IL-6, IL-9, 렙틴, MCP-1, M-CSF, MIG, PF-4, TIMP-1, TIMP-2, TNF-α 및 트롬보포이에틴을 포함한 혈관신생 성장 인자 및 사이토킨을 발현하고, (2) 혈관 형성에서 잘 확립된 기능을 갖는 내피 선구 세포(EPC)를 포함하고, (3) 시험관내에서 혈관내에 발생되고 (4) 생체내 허혈성 조직 생존을 지지하는 발견에 기초한 것이다. 따라서, 본 발명의 재생 세포는 예를 들어, 혈관신생을 촉진시킴으로써 PVD를 치료하는데 유용하다.

본 발명은 또한 지방, 골수, 혈액, 피부, 근육, 간, 결합 조직, 근막, 뇌 및 기타 신경계 조직, 혈관, 및 기타 연부 또는 액상 조직 또는 조직 성분 또는 조직 혼합물(예를 들면, 피부, 혈관, 지방 및 결합 조직을 포함한 조직의 혼합물)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 각종 조직으로부터 재생 세포, 예를 들면 줄기 세포 및(또는) 선구 세포를 분리하고 농축시키는 신속하고 신뢰성있는 시스템 및 방법에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 시스템은 지방 조직으로부터 재생 세포를 분리하고 농축시킨다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 시스템은 전체 방법이 최소한의 사용자 개입 또는 전문 식견에 의해 수행될 수 있도록 자동화된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 시스템 및 방법을 이용하여 수득한 재생 세포는 PVD 또는 관련 질환 또는 장애를 가진, 조직을 추출해낸 수용자에게 직접 배치하기에 적합하다.

바람직하게는, 조직 추출에서부터 재생 세포의 분리, 농축을 거쳐 수용자로의 배치(예를 들면, 주사)까지의 전체 절차는 모두 동일 설비에서, 사실상 심지어는 절차를 경험하는 환자의 동일한 공간에서 수행될 것이다. 재생 세포는 추출 및 농축 후에 비교적 단시간 내에 사용될 수 있다. 예를 들면, 재생 세포는 환자로부터 조직을 수거한 후로부터 약 1시간 내에 사용할 준비가 되고, 특정 상황에서 조직을 수거한 후로부터 약 10 내지 40분 내에 사용할 준비가 될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 재생 세포는 조직 수거로부터 약 20분 내에 사용할 준비가 될 수 있다. 추출에서부터 분리 및 농축을 거치는 절차의 전체 기간은 환자 프로필, 수거되는 조직의 유형 및 정해진 치료 용도에 필요한 재생 세포의 양을 포함한 많은 요인들에 따라 변화될 수 있다. 세포는 또한 수용자에게 치료, 구조 또는 미용 효과를 유도할 목적으로 단일 수술 절차로 다른 세포, 조직, 조직 단편, 스캐폴드 또는 세포 성장 및(또는) 분화의 다른 자극물질과 함께 수용자에게 제공될 수 있다. 시스템의 분리 및 농축 주기 이상의 재생 세포의 임의의 추가의 조작은 그러한 조작 방식에 상응하는 추가의 시간을 필요로 할 것으로 이해된다.

본 발명이 더욱 쉽게 이해될 수 있도록 하기 위해, 특정 용어들을 먼저 정의한다. 추가의 정의들은 상세한 설명 전반에 걸쳐 기술된다.

본원에 사용된 용어 "재생 세포"는 기관, 조직 또는 생리 단위 또는 계통의 구조 또는 기능의 완전 또는 부분 재생, 회복 또는 대체를 일으키거나 또는 그에 기여함으로써 치료, 구조 또는 미용 효과를 제공하는 본 발명의 시스템 및 방법을 이용하여 수득한 임의의 이종성 또는 동종성 세포를 의미한다. 재생 세포의 예로는 ASCs, 내피 세포, 내피 전구(precursor) 세포, 내피 선구(progenitor) 세포, 대식세포, 섬유아세포, 혈관주위 세포, 평활근 세포, 지방 전구세포(preadipocyte), 분화 또는 탈분화된 지방세포, 각질 형성세포, 단능성 및 다능성 선구 및 전구 세포 (및 그의 후대 개체) 및 림프구가 있다.

재생 세포가 치료, 구조 또는 미용 효과를 제공할 수 있는 한가지 기전은 그자체 또는 그의 후대 개체를 새로 발생된, 기존의 또는 회복된 조직 또는 조직 성분 내로 함입시키는 것이다. 예를 들면, ASCs 및(또는) 그의 후대 개체는 새로 형성된 뼈, 근육 또는 다른 구조 또는 기능적 조직에 함입됨으로써 치료, 구조 또는 미용적 개선을 일으키거나 또는 그에 기여할 수 있다. 마찬가지로, 내피 세포 또는 내피 전구 또는 선구 세포 및 그의 후대 개체는 기존의, 새로 발생된, 회복 또는 확장된 혈관 내에 함입됨으로써 치료, 구조 또는 미용 효과를 일으키거나 또는 그에 기여할 수 있다.

재생 세포가 치료, 구조 또는 미용 효과를 제공할 수 있는 다른 기전은 제공된 조직 또는 조직 성분의 구조 또는 기능의 형성, 유지, 회복 및(또는) 재생을 촉진시키는 분자, 예를 들면 성장 인자를 발현 및(또는) 분비하는 것이다. 예를 들면, 재생 세포는 조직 또는 세포의 성장을 증강시키고 그후에 개선된 구조 또는 기능에 직접 또는 간접적으로 참여하는 분자를 발현 및(또는) 분비할 수 있다. 재생 세포는 다음 기능: 새로운 혈관의 발생을 자극하고, 즉 혈관형성을 촉진시키고; 기존의 소혈관(측부 혈관)의 혈액 운반량을 확장시켜 그의 산소 공급을 개선시키고; 손상 부위와 별개의 부위로부터의 재생 세포의 이동을 유도함으로써 그러한 세포가 손상 부위로 귀환 및 이동하는 것을 개선시키고; 손상 부위 내의 세포의 성장을 자극하고(하거나) 생존을 촉진시킴으로써 기능 또는 구조의 유지를 향상시키고; 항-세포사멸 특성을 가진 분자를 전달함으로써 세포 괴사 및 영구적인 기능 상실의 속도 또는 가능성을 감소시키고; 내인성 재생 세포 및(또는) 다른 생리학적 기전과 상호작용하는 기능 중 하나 이상을 수행할 수 있는 성장 인자, 예를 들면 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 태반 성장 인자(PlGF), bFGF, IGF-II, 에토탁신, G-CSF, GM-CSF, IL-12 p40/p70, IL-12 p70, IL-13, IL-6, IL-9, 렙틴, MCP-1, M-CSF, MIG, PF-4, TIMP-1, TIMP-2, TNF-α, 트롬보포이에틴 및 그의 이성체를 분비 및(또는) 발현할 수 있다.

재생 세포는 본 발명의 시스템 및 방법을 이용하여 조직으로부터 분리 및 농축되거나 또는 조직에 존재하는 그의 '원래' 형태로 사용될 수 있거나 또는 재생 세포는 성장 인자 또는 다른 생물학적 반응 변형제에 의한 자극 또는 프라이밍에 의해, 유전자 전달(일시적 또는 안정한 전달)에 의해, 물리적 특성(예를 들면, 크기 또는 밀도)를 기초로 한 결과 집단의 추가의 하위-분획에 의해, 고체상 물질에 대한 차별 부착, 세포 표면 또는 세포내 분자의 발현, 세포 배양 또는 본원에 더 설명되는 기타 생체외 또는 생체내 조작, 변형 또는 분획에 의해 변형될 수 있다. 재생 세포는 또한 본원에 더 설명되는 바와 같은 세포의 관련 특징을 변형시키거나 향상시키는 인자, 약물, 화합물 또는 기타 제제를 전달하는 합성 또는 생물학적 스캐폴드, 재료 또는 장치와 같은 다른 세포 또는 장치와 함께 이용될 수 있다.

본원에 사용된 "재생 세포 조성물"은 조직, 예를 들면 지방 조직을 세척하고 적어도 부분적으로 분리시킨 후에 일정 양의 액체에 전형적으로 존재하는 세포의 조성물을 의미한다. 예를 들면, 본 발명의 재생 세포 조성물은 상이한 여러 유형의 재생 세포, 예를 들면 ASCs, 내피 세포, 내피 전구 세포, 내피 선구 세포, 대식세포, 섬유아세포, 혈관주위 세포, 평활근 세포, 지방 전구세포, 분화 또는 탈분화된 지방세포, 각질 형성세포, 단능성 및 다능성 선구 및 전구 세포 (및 그의 후대 개체) 및 림프구가 있다. 재생 세포 조성물은 또한 1종 이상의 오염물질, 예를 들면 조직 단편에 존재할 수 있는 콜라겐, 또는 본원에 기재된 조직 분리(tissue disaggregation) 과정에 이용되거나 그 과정에서 생긴 잔류 콜라게나제 또는 기타 효소 또는 제제를 함유할 수 있다.

본원에 사용된 "재생 의학"은 재생 세포를 대상에게 직접 또는 간접적으로 배치함으로써 얻는 임의의 치료, 구조 또는 미용 효과를 의미한다. 본원에 사용된 "말초 혈관 질환(PVD)"은 심장 및 뇌 외측의 혈관의 질병 및 순환 장애를 의미하며, 기능적 PVD, 유기 PVD, 말초 혈관 질환(PVD), 죽상경화성 폐색성 질환, 죽상경화증, 혈관의 외상성 손상 및 염증성 동맥염을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 특별하게는, PVD는 종종 다리 및 팔 근육에 혈액을 운반하는 혈관의 협착에 의해 특징지워진다. 예를 들면, 관상동맥 질환 및 경동맥 질환과 유사한 상태인 PVD에서, 지방 침착물은 주로 다리 및 발에 이르는 동맥에서 동맥벽을 따라 축적되고 혈액 순환에 영향을 미친다. PVD를 가진 사람은 혈병의 위험으로 인해 졸중 및 심장마비 때문에 사망할 위험성이 높다.

본원에 사용된 용어 "혈관신생(angiogenesis)"은 새로운 혈관이 기존의 혈관계 및 조직으로부터 발생되는 과정을 의미한다(Folkman, 1995). "복구 또는 재형성"이란 문구는 기존의 혈관계의 재형성을 의미한다. 조직 허혈의 완화는 임상적으로 혈관신생에 좌우된다. 새로운 혈관의 자발적인 성장은 허혈 부분내 및 부분 주위의 측부 순환을 제공하며, 혈류를 개선시키고, 허혈에 의해 야기되는 증상을 완화시킨다. 혈관신생 매개된 질환 및 장애는 급성 심근경색, 허혈성 심근증, 말초 혈관 질환, 허혈성 졸중, 급성 세뇨관 괴사, AFT를 포함한 허혈성 창상, 패혈증, 허혈성 장 질환, 당뇨병성 망막증, 신경병증 및 신증, 혈관염, 허혈성 뇌증, 발기 부전-생리적, 허혈성 및 외상성 척수 손상, 다장기 부전, 허혈성 잇몸 질환 및 이식 관련 허혈을 포함한다.

본원에 사용된 "줄기 세포"는 하나 이상의 특정 기능을 수행하며 자가 재생 능력을 가진, 다양한 다른 세포 유형으로 분화할 가능성을 가진 다능성 재생 세포를 의미한다. 본원에 개시된 줄기 세포의 일부는 다능성일 수 있다.

본원에 사용된 "선구 세포(progenitor cell)"는 하나 이상의 세포 유형으로 분화할 가능성을 가진 다능성 재생 세포를 의미하며 자가 재생 능력이 제한되거나 또는 없다. 본원에 사용된 "선구 세포"는 또한 하나 이상의 특정 기능을 수행하며 자가 재생 능력이 제한되거나 없는, 단일 세포 유형만으로 분화할 가능성을 가진 단능성 세포를 의미한다. 특히, 본원에 사용된 "내피 선구 세포"는 혈관 내피 세포로 분화할 가능성을 가진 다능성 또는 단능성 세포를 의미한다.

본원에 사용된 "전구 세포"는 하나의 세포 유형으로 분화할 가능성을 가진 단능성 재생 세포를 의미한다. 전구 세포 및 그의 후대 개체, 예를 들면 적절한 조건하에 증식할 수 있는 림프구 및 내피 세포는 광범위한 증식 능력을 보유할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "혈관신생 인자" 또는 "혈관신생 단백질"은 기존의 혈관계로부터 새로운 혈관 성장("혈관신생")을 촉진시킬 수 있는 임의의 공지된 단백질, 펩티드 또는 기타 제제를 의미한다. 본 발명에 사용하기에 적당한 혈관신생 인자로는 태반 성장 인자 (Luttun et al., 2002), 대식세포 콜로니 자극 인자 (Aharinejad et al., 1995), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (Buschmann et al., 2003), 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-A, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E (Mints et al., 2002), 뉴로필린 (Wang et al., 2003), 섬유아세포 성장 인자 (FGF)-1, FGF-2(bFGF), FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6 (Botta et al., 2000), 안지오포이에틴 1, 안지오포이에틴 2 (Sundberg et al., 2002), 에리트로포이에틴 (Ribatti et al., 2003), BMP-2, BMP-4, BMP-7 (Carano and Filvaroff, 2003), TGF-beta (Xiong et al., 2002), IGF-1 (Shigematsu et al., 1999), 오스테오폰틴 (Asou et al., 2001), 플레이오트로핀 (Beecken et al., 2000), 액티빈 (Lamouille et al., 2002), 엔도텔린-1 (Bagnato and Spinella, 2003) 및 그의 조합이 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 혈관신생 인자는 서로 독립적으로 또는 함께 작용할 수 있다. 혈관신생 인자들은 조합될 때, 또한 상승적으로 작용할 수 있으므로, 인자들의 조합된 효과는 별개로 얻은 개개의 인자들의 효과들의 총합보다 크다. 용어 "혈관신생 인자" 또는 "혈관신생 단백질"은 또한 그러한 인자들의 기능적 유사체를 포함한다. 기능적 유사체는 예를 들면, 인자들의 기능적 부분을 포함한다. 기능적 유사체는 또한 인자들의 수용체에 결합하는 항-이디오타입 항체를 포함하며, 따라서 혈관신생 및(또는) 조직 재형성을 촉진시키는 인자들의 활성을 모방한다. 그러한 항-이디오타입 항체를 생성시키는 방법은 당업계에 공지되어 있으며 본원에 참고로 인용된 WO 97/23510호에 기재되어 있다.

본 발명에 사용되는 혈관신생 인자는 임의의 적당한 공급원으로부터 생산되거나 수득될 수 있다. 예를 들면, 인자는 그의 천연 공급원으로부터 정제되거나, 또는 합성적으로 또는 재조합 발현에 의해 생산될 수 있다. 인자는 단백질 조성물로서 환자에게 투여될 수 있다. 다르게는, 인자는 그 인자를 코딩하는 발현 플라스미드 형태로 투여될 수 있다. 적당한 발현 플라스미드의 구조는 당업계에 공지되어 있다. 발현 플라스미드를 제작하기 위한 적당한 벡터는 예를 들면, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, RNA 벡터, 리포좀, 양이온성 지질, 렌티바이러스 벡터 및 트랜스포손을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "동맥형성"은 측부 동맥 및(또는) 기존의 세동맥 연결로부터의 다른 동맥의 성장을 증강시키는 과정을 의미한다 (Carmeliet, 2000; Scholz et al., 2001; Scholz et al., 2002). 더욱 상세하게는, 동맥형성은 허혈성 조직, 종양 또는 염증 부위에 혈액을 공급하는 기존의 세동맥 연결로부터의 내피 세포 및 평활근 세포의 증식에 의한 동맥의 동소에서의 동원 및 확장이다. 이들 혈관은 영향받은 조직 외부에서 크게 성장하며 허혈 부위, 종양 또는 염증 부위에 영양분을 전달하는데 중요하다. 동맥형성은 심근 허혈에 대한 정상적인 반응의 일부이다 (Mills et al., 2000; Monteiro et al., 2003). 또한, 관상 동맥 우회로 이식술(CABG)의 통상의 외과적 기술은 사실상 단지 인공 측부 혈관의 형성이다 (Sergeant et al., 1997). 따라서, 경색 이후에 동맥형성을 증강시키는 과정은 허혈 조직으로의 혈류를 개선시켜 세포사와 경색 크기를 감소시킨다. 이들 개선은 개선된 심장 기능 및 치료 효과를 일으킬 것이다.

본원에 사용된 "줄기 세포수" 또는 "줄기 세포 빈도"는 지방 유래 세포(ADC)를 낮은 세포 밀도(<10,000 세포/웰)로 평판 배양하고 MSC 성장 배지(예를 들면, 10% 태아 송아지 혈청, 5% 말 혈청 및 항생물질/항진균제로 보충된 DMEM/F12 배지)에서 성장시키는 콜로니형성 분석법으로 관찰된 콜로니 수를 의미한다. 배양액을 헤마톡실린으로 염색한 후 2주 동안 세포를 성장시키고 50 세포 이상의 콜로니를 CFU-F로서 계산한다. 줄기 세포 빈도는 평판 배양된 100 유핵 세포 당 관찰된 CFU-F의 수로서 계산된다 (예를 들면, 1,000 유핵 재생 세포로 개시된 평판에서 계수된 15 콜로니는 1.5%의 줄기 세포 빈도를 제공함). 줄기 세포수는 줄기 세포 빈도와 수득된 유핵 ADC 세포의 총수의 곱으로 계산한다. 재생 세포에서 성장된 높은 비율(~100%)의 CFU-F는 골수 유래된 줄기 세포에 의해서도 발현되는 세포 표면 분자 CD105를 발현한다 (Barry et al., 1999). CD105는 또한 지방 조직 유래된 줄기 세포에 의해 발현된다 (Zuk et al., 2002).

본원에 사용된 용어 "지방 조직"은 지방을 저장하는 결합 조직을 포함하는 지방을 의미한다. 지방 조직은 ASCs 및 내피 선구 및 전구 세포를 포함하는 여러 재생 세포 유형을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "지방 조직의 단위"는 지방 조직의 분리된 또는 측정가능한 양을 의미한다. 지방 조직의 단위는 그 단위의 중량 및(또는) 부피를 확인하여 측정할 수 있다. 상기 확인된 데이타를 기준으로, 환자로부터 제거된 프로세싱된 지방흡입물 단위는 세포 성분의 0.1% 이상이 줄기 세포인 세포 성분을 가지며; 즉 그것은 상기한 바와 같이 결정되는, 0.1% 이상의 줄기 세포 빈도를 갖는다. 본원의 개시를 참고로 하여, 지방 조직 단위는 환자로부터 제거된 지방 조직의 전체 양 또는 환자로부터 제거된 지방 조직의 전체 양보다 적은 양을 의미할 수 있다. 따라서, 지방 조직 단위는 지방 조직의 또 다른 단위와 조합되어 개개의 단위의 합인 중량 또는 부피를 갖는 지방 조직 단위를 형성할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "부분"은 전체보다 적은 재료의 양을 의미한다. 미량 부분은 50% 미만의 양을 의미하며, 주요 부분은 50%를 초과하는 양을 의미한다. 따라서, 환자로부터 제거된 지방 조직의 전체 양보다 적은 지방 조직의 단위는 제거된 지방 조직의 부분이다.

본원에 사용된 용어 "프로세싱된 지방흡입물"은 성숙 지방세포 및 결합 조직으로부터 활성 세포 성분(예를 들면, 재생 세포 함유 성분)을 분리하도록 프로세싱된 지방 조직을 의미한다. 이러한 분획은 본원에서 "지방 유래 세포" 또는 "ADC"로서 칭해진다. 전형적으로, ADC는 지방 조직으로부터 세포를 세척하고 분리하고 농축시켜 수득한 재생 세포 펠릿을 의미한다. 펠릿은 전형적으로 세포가 원심분리 챔버 또는 세포 농축기 바닥에서 응집되도록 세포 현탁액을 원심분리시켜 얻는다.

본원에 사용된 용어 "투여하는", "도입하는", 전달하는", "배치" 및 "이식"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 예를 들어 각 경우에 본 발명의 재생 세포를 원하는 위치에서 적어도 부분적으로 정위화하는 방법 또는 경로에 의해 재생 세포를 대상에게 주입하여 배치하는 것을 의미한다. 재생 세포는 세포 또는 세포 성분의 적어도 일부분이 생육가능한 것으로 남아있는 경우 대상에서 원하는 위치로 전달하게 하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 대상에게 투여한 후 세포의 생존력 기간은 수 시간 정도의 짧은 시간, 예를 들면 24 시간 내지 수 일 내지 수 년일 수 있다.

본원에 사용된 용어 "치료하는"은 질환 또는 장애의 하나 이상의 부작용 또는 증상을 경감 또는 완화시키는 것을 포함한다.

본원에 사용된 "재생 세포의 치료 유효 용량"은 유리한 또는 원하는 임상적 효과를 나타내기에 충분한 재생 세포의 양을 의미한다. 상기 용량은 하나 이상의 용법으로 투여될 수 있다. 그러나, 한정되는 것은 아니지만, 환자의 연령, 몸집, 질환의 유형 및 정도, 질환의 병기, 재생 세포의 투여 경로, 이용되는 보충 요법의 유형 및 정도, 지속 질환 과정 및 요구되는 치료 유형(예를 들면, 적극적 대 통상적인 치료법)를 포함하는, 각 환자에 대한 개별적인 인자를 기초로 하여 정확한 유효량을 결정할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "대상"은 온혈 동물, 바람직하게는 인간을 포함한 포유동물을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 대상은 영장류이다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 대상은 인간이다.

본원에 이전에 설명된 바와 같이, 재생 세포, 예를 들면 줄기 및 선구 세포는 각종 조직으로부터 수거될 수 있다. 본 발명의 시스템은 그러한 모든 조직에 이용될 수 있다. 그러나, 지방 조직은 재생 세포의 특히 풍부한 공급원이다. 따라서, 본 발명의 시스템은 제한적이 아니라 예시적으로만 지방 조직을 재생 세포의 공급원으로서 이용하는 것으로 본원에 예시된다.

지방 조직은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를 들면, 지방흡입술(시린지 또는 파워 이용)에 의해 또는 지방제거술, 예를 들면 단순기계식 지방흡입술, 초음파 지방흡입술 및 절제식 지방제거술 또는 그의 조합에 의해 지방 조직을 환자로부터 제거할 수 있다. 지방 조직은 제거되고 수집되어 본원에 설명된 본 발명의 시스템의 임의의 실시양태에 따라서 프로세싱될 수 있다. 수집된 조직의 양은 공여자의 체질량 지수 및 연령, 수집하는데 이용가능한 시간, 접근가능한 지방 조직 수거 부위의 이용성, 동시 및 기존의 약물 및 상태(예를 들면, 항응고 요법), 및 조직이 수집되는 임상적 목적을 비롯한 많은 인자들에 좌우된다. 예를 들면, 야윈 개체로부터 추출된 지방 조직 100 ㎖의 재생 세포 백분율은 비만 공여자로부터 추출된 것보다 크다(표 I). 이는 아마도 비만 개체에서의 증가된 지방 함량의 희석 효과를 반영하는 것이다. 그러므로, 본 발명의 한 면에 따라서 더 야윈 환자로부터 회수될 양과 비교하여 과체중 공여자로부터 더 많은 양의 조직을 수득할 필요가 있다. 이러한 관찰은 또한 본 발명의 유용성이 다량의 지방 조직을 가진 개체에만 제한되는 것이 아님을 나타낸다.

조직 및 세포 수율에 대한 체질량 지수의 효과

체질량 지수 상태	수득된 조직의 양 (g)	총 재생 세포 수율 (x107)
정상	641±142	2.1±0.4
비만	1.225±173	2.4±0.5
p 값	0.03	0.6

지방 조직을 프로세싱한 후에, 결과의 재생 세포에는 실질적으로 성숙 지방 조직 및 결합 조직이 존재하지 않는다. 따라서, 본 발명의 시스템은 연구 및(또는) 치료 목적에 사용될 수 있는 다수의 이종성 지방 재생 세포를 발생시킨다. 바람직한 실시양태에서, 세포는 수용자의 체내에 배치 또는 재주입하기에 적당하다. 다른 실시양태에서, 세포는 연구에 사용될 수 있으며, 예를 들면 세포를 이용하여 장기간 동안 생존할 수 있는 줄기 또는 선구 세포주를 형성하고 추가의 연구에 사용할 수 있다.

이제 본 발명의 바람직한 실시양태에 대해 상세히 참조할 것이며, 그의 예는 첨부 도면에 예시되어 있다. 가능하다면, 동일하거나 유사한 참조 번호가 도면에 사용되며 그에 대한 설명은 동일하거나 유사한 부분을 의미한다. 도면은 단순화된 형태이며 정확한 축척이 아님에 유의하여야 한다. 본원의 개시를 참조로 하면, 단지 편리함과 명확함을 위하여, 상부, 하부, 좌측, 우측, 위로, 아래로, 바로 위에, 위에, 아래에, 바로 아래에, 뒤에, 앞에, 원위 및 부근과 같은 방향 용어가 첨부 도면에 대해 사용된다. 그러한 방향 용어는 본 발명의 범위를 임의의 방식으로 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

본원의 개시가 예시된 특정 실시양태를 언급하긴 하지만, 이들 실시양태는 제한적이 아니라 예로써 제시됨을 이해하여야 한다. 다음의 상세한 설명의 의도는, 예시적인 실시양태를 논의하긴 하지만, 첨부된 청구 범위에 의해 정의된 본 발명의 취지 및 범위 내에 속하는 실시양태의 모든 변형, 대안 및 등가사항을 커버하는 것으로 해석되어야 한다. 본 발명은 당 분야에서 통상적으로 사용되는 각종 의학적 절차와 함께 이용될 수 있다.

이제 도면들에 대해서 보면, 본 발명의 시스템(10)은 일반적으로 조직 수집 챔버(20), 프로세싱 챔버(30), 폐기물 챔버(40), 생산 챔버(50) 및 시료 챔버(60) 중 하나 이상을 포함한다. 각종 챔버는 생물학적 재료를 함유하는 유체가 폐쇄된 멸균 유체/조직 경로를 유지하면서 한 챔버에서 다른 챔버로 통과할 수 있도록 하나 이상의 도관(12)를 통해 함께 결합된다. 도관은 본원에 각각 관내강(lumen) 및 튜브(tubing)로서 상호교환적으로 언급된 강체 또는 유연체를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 도관은 연질 튜브, 예를 들면 임상적 셋팅에 통상적으로 사용되는 폴리에틸렌 튜브, 실리콘 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 재료 형태이다. 도관(12)는 유체 또는 조직의 통과가 필요한 지에 따라 크기가 변화될 수 있다. 도관(12)는 또한 시스템을 통해 순환되는 조직 또는 유체의 양에 따라 크기가 변화될 수 있다. 예를 들면, 유체의 통과를 위한 도관의 직경은 약 0.060 내지 약 0.750 인치일 수 있으며, 조직을 통과를 위한 도관의 직경은 약 0.312 내지 약 0.750 인치일 수 있다. 일반적으로, 도관의 크기는 도관이 수용할 수 있는 부피 및 상기 도관을 통해 조직 또는 유체를 운반하는데 필요한 시간의 균형이 맞도록 선택된다. 시스템의 자동화 실시양태에서, 상기 변수들, 즉 운반을 위한 부피 및 시간은 시스템의 프로세싱 장치로 적절한 신호가 전송될 수 있도록 식별되어야 한다. 이로써 장치가 정확한 부피의 액체 및 조직을 한 챔버에서 다른 챔버로 이동할 수 있게 된다. 사용된 연질 튜브는 파괴 가능성을 감소시키기 위해 부압을 견딜 수 있어야 한다. 사용된 연질 튜브는 또한 예를 들어, 시스템에 사용될 수 있는 정변위 펌프에 의해 발생되는 정압을 견딜 수 있어야 한다.

시스템의 모든 챔버는 표준 IV, 시린지 및 흡입 튜브 연결을 끼우게 하는 하나 이상의 포트, 예를 들면 출구 포트(22) 또는 입구 포트(21)를 포함할 수 있다. 포트는 고무 마개 밀폐된 주사침 접근 포트(51)과 같은 밀폐 포트일 수 있다. 입구 포트는 도관에 의해 하나 이상의 카뉼라(나타내지 않음)에 결합될 수 있다. 예를 들면, 조직 입구 포트(21)은 통합된 일회용 지방흡입 카뉼라에 결합되고 도관은 연질 튜브일 수 있다. 도관은 일반적으로 시스템의 한 챔버에서 다른 챔버로의 유체 통로를 제공하도록 위치된다. 이를 위하여, 도관 및 포트는 예를 들어, 수동으로 또는 자동으로 작동될 수 있는 흡입 장치(나타내지 않음)에 결합될 수 있다. 흡입 장치는 예를 들어, 시린지 또는 전기 펌프일 수 있다. 흡입 장치는 환자로부터 조직을 흡입해내기에 충분한 부압을 제공할 수 있어야 한다. 일반적으로, 외과의사와 같은 당업자에게 공지된 임의의 적합한 흡입 장치를 사용할 수 있다.

도관(12)는 시스템의 각종 구성품들 사이에서의 재료의 유동을 조절하기 위해 하나 이상의 클램프(나타내지 않음)를 더 포함할 수 있다. 클램프는 시스템의 다른 영역을 효과적으로 밀폐하여 시스템의 멸균성을 유지하는데 유용하다. 다르게는, 도관(12)는 시스템을 통한 재료의 유동을 조절하는 하나 이상의 밸브(14)를 포함할 수 있다. 밸브(14)는 도면에서 열린 원으로 식별된다. 바람직한 실시양태에서, 밸브는 전기기계적 핀치 밸브일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 밸브는 공압 밸브일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 밸브는 수압 밸브 또는 기계적 밸브일 수 있다. 그러한 밸브는 바람직하게는 레버에 결합될 수 있는 제어 시스템에 의해 작동된다. 레버는 수동 조작으로 작동될 수 있다. 자동화 실시양태에서, 제어 시스템은 레버 뿐만 아니라 일정 작동 조건에서 밸브를 작동시킬 수 있는 프로세싱 장치에 결합될 수 있다. 특정 자동화 실시양태에서, 밸브의 작동은 프로세스가 최적화될 수 있도록 부분적으로 자동화되고 부분적으로 사용자의 선호도에 맞추어질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 특정 밸브는 수동으로 작동되고 다른 것은 프로세싱 장치를 통해 자동화될 수 있다. 밸브(14)는 또한 하나 이상의 펌프, 예를 들면 튜브연동식 펌프(34) 또는 정변위 펌프(나타내지 않음)와 함께 이용될 수 있다. 도관(12) 및(또는) 밸브(14)는 또한 센서(29), 예를 들면 광센서, 초음파 센서, 압력 센서 또는 시스템을 거쳐 유동되는 각종 유체 성분 및 유체 수위를 구별할 수 있는 당업계에 공지된 다른 형태의 모니터를 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 센서(29)는 광센서일 수 있다.

시스템은 또한 다수의 필터(36)를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 필터는 시스템(28)의 챔버 내에 있을 수 있다. 시스템 내의 다른 챔버가 다른 필터를 포함할 수도 있다. 필터는 시스템에 따라서 사용될 수 있는 불필요한 세포 및 분리제로부터 재생 세포, 예를 들면 줄기 세포 및(또는) 선구 세포를 분리하는데 효과적이다. 한 실시양태에서, 필터 어셈블리(36)은 중공 섬유 여과 장치를 포함한다. 다른 실시양태에서, 필터 어셈블리(36)은 침강 과정과 함께 사용되거나 함께 사용되지 않을 수 있는 삼투 여과 장치를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 필터 어셈블리(36)은 분급 장치 및 과정과 함께 사용되거나 함께 사용되지 않을 수 있는 원심분리 장치를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 시스템은 이들 여과 장치의 조합을 포함한다. 본 발명의 여과 기능은 콜라겐, 유리 지방, 유리 지방세포 및 잔류 콜라게나제와 같은 최종 농축액으로부터 물질을 제거하는 일부 필터에 의해 또한 최종 생성물을 농축시키는데 사용되는 다른 필터에 의해 2배가 될 수 있다. 시스템의 필터는 20 내지 800 ㎛의 직경 및(또는) 길이 범위의 다수의 기공을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 수집 챔버(20)은 80 내지 400 ㎛의 다수의 기공을 가진 전치(prefixed) 필터(28)을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 수집 챔버(20)은 265 ㎛의 다수의 기공을 가진 전치 필터(28)을 갖는다. 다른 실시양태에서, 필터는 탈부착가능하거나 일회용일 수 있다.

시스템은 또한 시스템의 하나 이상의 챔버 내에 포함된 재료의 온도를 조정하도록 위치된 하나 이상의 온도 제어 장치(나타내지 않음)를 포함할 수 있다. 온도 제어 장치는 히터, 냉각기 또는 둘다일 수 있으며, 즉 그것은 히터와 냉각기로 변환될 수 있다. 온도 장치는 조직, 분리제, 재현탁제, 헹굼제, 세척제 또는 첨가제를 포함한, 시스템을 통과하는 임의의 재료의 온도를 조정할 수 있다. 예를 들면, 지방 조직의 가열은 분리를 촉진시키는 반면 배출 재생 세포의 냉각은 생존력을 유지하는데 바람직하다. 또한, 최적의 조직 프로세싱을 위해 미리 가온된 시약이 필요한 경우, 온도 장치의 역할은 온도를 증가 또는 감소시키기보다는 일정 온도를 유지하는 것이다.

밀폐된 멸균 유체/조직 경로를 유지하기 위해, 모든 포트 및 밸브는 시스템의 밀폐 구조를 유지하는 클로져를 포함할 수 있다. 클로져는 유체, 공기 및 다른 오염물질에 대해 불투과성인 막이거나 또는 당업계에 공지된 다른 적당한 클로져일 수 있다. 또한, 시스템의 모든 포트는 그들이 시스템의 멸균 상태를 손상시키지 않고 챔버 내의 재료를 회수하기 위해 주사기, 침 또는 다른 장치를 수용하도록 고안될 수 있다.

본원에 설명된 바와 같이, 조직은 당업계에 인정된 방법을 통해 환자로부터 추출될 수 있다. 흡입된 조직은 프로세싱을 위해 시스템에 놓여지기 전에 추출될 수 있다. 흡입된 조직은 전형적으로 고무 마개 밀폐된 주사침 접근 포트(수집 챔버 상에 나타내지 않음)와 같은 밀폐 입구 포트를 통해 도관(12)를 거쳐 수집 챔버(20)에 전달된다. 다르게는, 조직 추출 단계는 시스템의 일부일 수 있다. 예를 들면, 수집 챔버(20)은 환자에게 삽입된 표준 카뉼라를 사용하여 조직 제거를 용이하게 하는 진공 라인(11)을 포함할 수 있다. 따라서, 이러한 실시양태에서 전체 시스템은 환자에게 부착된다. 조직은 밀폐 멸균 경로의 일부인 도관(12a)와 같은 도관을 통해 입구 포트(21)을 거쳐 수집 챔버(20) 내로 도입될 수 있다. 수집 챔버(20)은 다수의 연질 또는 경질 캐니스터(canister) 또는 실린더 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들면, 수집 챔버(20)은 각종 크기의 하나 이상의 경질 캐니스터를 포함할 수 있다. 수집 챔버(20)은 또한 하나 이상의 연질 백을 포함할 수 있다. 그러한 시스템에서, 백에는 바람직하게는 백에 흡입력 적용시에 백이 파괴될 가능성을 줄이는, 내부 또는 외부 프레임과 같은 지지체가 제공된다. 수집 챔버(20)은 프로세싱 챔버(30)에서 수행되는 과정의 세척 및 농축 단계 전에 조직을 적절하게 세척하고 분리하기 위해 필요량의 식염수를 보유하는 크기를 갖는다. 바람직하게는, 수집 챔버(20)에 존재하는 조직 또는 유체의 부피는 육안으로 쉽게 확인가능하다. 예를 들면, 지방 조직으로부터 재생 세포를 수득하기 위해, 적당한 수집 챔버는 800 ㎖의 지방흡입물 및 1200 ㎖의 식염수를 수용하는 용량을 갖는다. 따라서, 한 실시양태에서 수집 챔버(20)은 2 리터 이상의 용량을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 혈액으로부터 적혈구를 분리하고 농축시키기 위해 수집 챔버(20)은 1.5 리터 이상의 용량을 갖는다. 일반적으로, 수집 챔버(20)의 크기는 환자로부터 수집된 조직의 유형 및 양에 따라 변화될 것이다. 수집 챔버(20)은 약 5 ㎖ 내지 약 2 리터의 조직을 수용하는 크기를 가질 수 있다. 예를 들어, 5 ㎖ 내지 100 ㎖와 같이 더 작은 용적의 조직의 경우, 조직은 수집 챔버(20)에 전달되기 전에 시린지에 모일 수 있다.

수집 챔버(20)은 멸균될 수 있는 임의의 적당한 생체적합성 물질을 이용하여 제조할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 수집 챔버(20)은 ISO 10993 표준에 설명된 바와 같이 혈관내 접촉을 위한 생체적합성 요건을 충족시키는 일회용 재료로 제조된다. 예를 들면, 폴리카보네이트 아크릴 또는 ABS가 사용될 수 있다. 수집 챔버(20)의 유로는 질병 전파의 위험없이 혈액 사용에 적합한 무발열성인 것이 바람직하다. 한 실시양태에서, 수집 챔버(20)은 사용자가 챔버 내에 존재하는 조직의 대략의 부피를 가시적으로 확인할 수 있도록 하는 재료로 제조된다. 다른 실시양태에서, 수집 챔버(20) 내의 조직 및(또는) 유체의 부피는 자동화 센서(29)에 의해 결정된다. 수집 챔버(20)은 바람직하게는 자동화 실시양태에서 시스템이 합리적인 정확도로 챔버 내의 조직 및(또는) 유체의 부피를 확인할 수 있도록 고안된다. 바람직한 실시양태에서, 시스템은 ±15%의 정확도로 수집 챔버 내의 부피를 감지한다.

단지 예로써 제공되는 특정 실시양태에서, 수집 챔버(20)은 경질 챔버, 예를 들면 265 ㎛의 메쉬 크기를 갖는 의약 등급 폴리에스테르의 원추형 전치 필터(28)을 포함하는 의약 등급 폴리카보네이트로 제조된 챔버 형태이다(도 5 참조). 경질 조직 수집 용기는 높이가 약 8 인치이고 직경이 약 5 인치인 크기를 가질 수 있으며, 벽 두께는 약 0.125 인치일 수 있다. 실린더의 내부는 예를 들어, 흡입 튜브를 위한 하나 이상의 포트, 멸균 도킹(docking) 기술을 통한 연결 튜브를 가진 하나 이상의 포트 및(또는) 고무 마개를 통한 침 천자 접근을 위한 하나 이상의 포트를 통해 접근될 수 있다. 수집 챔버(20) 내부의 전치 필터(28)은 바람직하게는 예를 들어, 조직을 환자로부터 제거할 때 지방 조직은 보유하고 비-지방 조직은 통과하도록 구성된다. 더욱 상세하게는, 필터(28)은 유리 지방, 혈액 및 식염수의 통과를 가능하게 하면서 지방 조직의 초기 수거 중에 또는 다른 실시양태에서 초기 수거 후에 지방 조직의 단편을 보유할 수 있도록 한다. 이러한 면에서, 필터(28)은 동일하거나 상이한 크기를 갖지만 약 20 ㎛ 내지 5 ㎜의 크기를 갖는 다수의 기공을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 필터(28)은 다수의 400 ㎛ 기공을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 필터(28)은 약 265 ㎛의 기공 크기 및 약 47%의 기공 면적과 약 200 ㎛ 두께의 의약 등급 폴리에스테르 메쉬이다. 이 재료는 헹굼 중에는 조직을 유지하지만 조직 분리 이후에는 세포가 메쉬를 통과해 나가도록 한다. 따라서, 조직을 환자로부터 흡입할 때, 비-지방 조직과 지방 조직을 분리할 수 있다. 다른 재료, 메쉬 크기 및 포트의 수 및 유형에 의해 동일한 기능성을 얻을 수도 있다. 예를 들면, 100 ㎛보다 작거나 수천 미크론만큼 큰 메쉬 기공 크기로써 지방 조직 응집물 및 단편을 보유하면서 식염수 및 혈구를 통과시키는 동일한 목적을 이룰 수가 있다. 마찬가지로, 대체 경질 플라스틱 재료를 사용하여 또는 당업자에게 공지된 많은 다른 변형에 의해 동일한 목적을 이룰 수도 있다.

시스템(10)은 또한 하나 이상의 용액 공급원(22)를 포함할 수 있다. 용액 공급원은 세척액 공급원(23), 및 콜라게나제와 같은 조직 분리제 공급원(24)를 포함할 수 있다. 수집 챔버(20)은 세척 및 분리 용액 또는 제제가 무균 방식으로 조직에 첨가되도록 하는 밀폐된 유체 경로를 포함한다.

세척액(23) 및 분리제(24)에 대한 용기는 그들의 내용물을 멸균 방식으로 보유할 수 있는 임의의 적당한 용기, 예를 들면 임상적 셋팅에 사용되는 IV 백과 같은 접이식 백일 수 있다. 이들 용기는 세척액 및 분리제가 수집 챔버(20)의 내부에 전달될 수 있도록 수집 챔버(20)에 결합된 도관(12e)와 같은 도관(12)를 가질 수 있다. 세척액 및 분리제는 식염수(23) 및(또는) 분리제(24)를 위한 용기의 외측에 가해진 단순 중력을 포함한 당분야에 인정된 방식을 통하여 또는 도관, 예를 들면 도 4의 도관(12d) 위에 정변위 펌프를 배치함으로써 수집 챔버(20)의 내부로 전달될 수 있다. 자동화 실시양태에서, 시스템의 프로세싱 장치는 사용자에 의해 초기에 습득된 정보(예를 들면, 프로세싱되는 조직의 부피)를 기초로 하여 각종 변수, 예를 들면 세척하는데 필요한 식염수의 부피 및 주기 시간 또는 수, 및 분리제의 농도 또는 양 및 분리에 필요한 시간을 계산한다. 다르게는, 양, 시간 등은 사용자에 의해 수동으로 조작될 수 있다.

수집 챔버 내의 조직 및(또는) 유체는 30 ℃ 내지 40 ℃의 온도로 유지되어야 한다. 바람직한 실시양태에서, 수집 챔버 내측의 현탁액의 온도는 37 ℃로 유지된다. 특정 실시양태에서, 수술 절차 또는 치료 적용을 지연시킬 필요가 있다면, 이후의 사용을 위해 선택된 조직을 수집 챔버에 저장할 수 있다. 조직은 대략 실온에서 또는 약 4 ℃에서 96시간까지 저장될 수 있다.

세척액은 식염수 또는 임의의 다른 완충 또는 비완충 전해질 용액을 포함한, 당업자에게 공지된 임의의 용액일 수 있다. 프로세싱되는 조직의 유형에 따라 사용되는 세척액의 유형 또는 배합이 정해질 것이다. 전형적으로, 식염수와 같은 세척액은 지방 조직이 환자로부터 제거되고 수집 챔버에 놓여진 후에 수집 챔버(20)에 유입된다. 그러나, 세척액은 지방 조직이 추출되기 전에 수집 챔버(20)에 전달되거나, 또는 지방 조직과 동시에 수집 챔버(20)에 전달될 수 있다. 수집 챔버(20)에서, 세척액 및 추출된 지방 조직은 아래에 기재된 방법을 포함한 임의의 수단에 의해 혼합될 수 있다.

예를 들면, 조직은 교반(세포 생존력을 최대화하고 방출된 유리 지방의 양을 최소화함)에 의해 세척될 수 있다. 한 실시양태에서, 조직은 가변 속도, 예를 들면 약 30 rpm으로 가변 각도의 호(예를 들면, 약 45° 내지 약 90°의 호)에 걸쳐 전체 수집 챔버(20)를 회전시킴으로써 교반된다. 다른 실시양태에서, 조직은 가변 속도, 예를 들면 약 30 rpm으로 가변 각도의 호(예를 들면, 약 45° 내지 약 90°의 호)에 걸쳐 전체 수집 챔버(20)(수집 챔버(20)은 수집 챔버의 내표면에 단단하게 부착된 하나 이상의 패들 또는 돌출부를 포함함)을 회전시킴으로써 교반된다. 상기한 수집 챔버(20)의 회전은 수집 챔버(20)에 부착되거나 또는 그에 인접한 구동 기구에 의해 수행될 수 있다. 구동 기구는 단순 벨트 또는 기어 또는 당업계에 공지된 다른 구동 기구일 수 있다. 회전 속도는 예를 들면 30 rpm일 수 있다. 일반적으로, 더 빠른 속도는 더 큰 부피의 유리 지방을 발생시키는 것으로 밝혀졌지만 그것이 최적이 아닐 수도 있다.

다른 실시양태에서, 회전하면서 혼합물을 통과하는 회전축(25)에 단단하게 부착된 하나 이상의 패들(25a) 또는 돌출부를 포함하는 회전축(25)를 수집 챔버(20) 안에 놓아서 조직을 교반한다. 특정 실시양태에서, 패들(25a)가 단단하게 부착되어 있는 회전축(25)를 수집 챔버(20) 바닥 위에 얹어놓을 수도 있다. 이는 예를 들어, 패들형 장치를 회전 자기장(예를 들면, 자석 교반기)에 놓음으로써 이루어질 수 있다. 다르게는, 당업계에 공지된 단순 교반기, 즉 회전없이 상하 진탕을 실시하는 장치를 이용하여 조직을 교반시킬 수 있다. 또한, 요동, 교반, 역전 등을 포함한 다른 업계 인정된 임의의 수단을 이용하여 조직을 세척할 수도 있다.

목적량의 세척 주기 후에, 조직 분리제를 수집 챔버(20)에 전달하여 나머지 지방 조직 성분으로부터 재생 세포를 분리할 수 있다. 분리제는 당업자에게 공지된 임의의 분리제일 수 있다. 사용될 수 있는 분리제로는 중성 프로테아제, 콜라게나제, 트립신, 리파제, 히알루로니다제, 데옥시리보뉴클레아제, 블렌드자임 효소 혼합물류, 예를 들면 리베라제 H1, 펩신, 초음파 또는 기타 물리적 에너지, 레이저, 마이크로웨이브, 다른 기계적 장치 및(또는) 그의 조합이 있다. 본 발명의 바람직한 분리제는 콜라게나제이다. 분리제는 다른 용액과 함께 첨가될 수 있다. 식염수, 예를 들면 상기한 바와 같은 식염수 공급원(23)으로부터 전달되는 식염수를 콜라게나제와 함께 지방 조직에 첨가하거나 또는 지방 조직에 첨가하고 바로 이어서 콜라게나제를 첨가할 수 있다. 한 실시양태에서는, 세척된 지방 조직을 약 37 ℃에서 약 20-60분 동안 콜라게나제 함유 효소 용액과 혼합한다. 다른 실시양태에서는, 더 높은 농도의 콜라게나제 또는 유사 제제를 첨가하여 분해 시간을 단축시킬 수 있다. 그후에, 세척된 지방 조직 및 조직 분리제를 세척된 지방 조직이 분리될 때까지 상기한 교반 방법과 유사한 방식으로 교반시킬 수 있다. 예를 들면, 세척된 지방 조직 및 조직 분리제는 약 90°의 호에 걸쳐 전체 수집 챔버를 회전시킴으로써, 회전하면서 용액을 통과하는 하나 이상의 패들을 갖는 축을 이용함으로써 및(또는) 수집 챔버 내표면 상에 패들 또는 돌출부를 갖는 전체 수집 챔버를 회전시킴으로써 교반시킬 수 있다.

지방 세포를 사용하는 목적에 따라서, 지방 조직은 부분적으로 분리(disaggregated)되거나 또는 완전히 분리될 수 있다. 예를 들면, 지방 세포를 지방 조직 단위와 조합하는 실시양태에서, 수거된 지방 조직을 부분적으로 분리하고, 부분적으로 분리된 지방 조직의 일부분을 제거하고 그후에 수집 챔버에 남아있는 지방 조직의 나머지 부분을 계속 분리하는 것이 바람직할 수 있다. 다르게는, 세척된 지방 조직의 일부를 제거하고 분해하기 전에 시료 용기에 따로 둔다. 또 다른 실시양태에서, 수거된 지방 조직은 환자에게 다시 재도입되기 전에 농축 세포로 부분적으로 분리된다. 한 실시양태에서, 지방 조직을 약 20분 미만의 기간 동안 조직 분리제와 혼합한다. 그후에, 부분적으로 분리된 조직의 일부분을 수집 챔버에서 제거하고, 나머지 부분적으로 분리된 조직을, 지방 조직과 조직 분리제를 추가로 40분 동안 혼합함으로써 더 분리할 수 있다. 지방 세포가 재생 세포의 본질적으로 순수한 콜로니로서 사용될 경우, 지방 조직을 완전히 분리할 수 있다.

분해 후에, 조직 및 분리제 용액을 그 용액의 부유 및 비부유 성분이 수집 챔버 내에서 분화하도록 하기에 충분한 시간 동안 가라앉게 둔다. 전형적으로, 약 15초 내지 수 분의 시간(다른 시간도 가능) 동안 변형된 실시양태로 이행될 수 있다. 부유층은 추가의 세척 및 농축을 필요로 하는 재생 세포를 포함한다. 비-부유층은 혈액, 콜라겐, 지방 및 조직의 다른 비-재생 세포 성분을 포함한다. 비-부유층은 폐기물 챔버로 제거되어야 한다.

따라서, 수집 챔버(20)은 바람직하게는 혈액 및 조직의 다른 비-부유 성분이 하나 이상의 도관(12)를 통해 하나 이상의 폐기물 용기(40)으로 배출될 수 있도록 챔버의 최저점에 출구 포트(22)를 포함한다. 수집 챔버(20)은 일반적으로 출구 포트(22)가 수집 챔버 바닥에 위치되도록 직립 위치이다 (또는 직립 위치에 놓여질 수 있다). 배출은 수동적 또는 능동적일 수 있다. 예를 들면, 상기한 비-부유 성분은 중력을 이용하여, 정압 또는 부압을 가하여, 펌프(34)를 이용하여 또는 벤트(32)를 이용하여 배출될 수 있다. 자동화 실시양태에서, 프로세싱 장치는 수집 챔버(20)으로부터 비-부유층을 배출하기 위해 특정 밸브 및(또는) 펌프에 신호를 보낼 수 있다. 자동화 실시양태는 또한 부유 액체와 비-부유 액체 사이에 계면이 형성되었을 때를 감지할 수 있는 센서(29)를 포함할 수 있다. 자동화 실시양태는 또한 수집 챔버 밖으로 유도해내는 도관에서 흐르고 있는 유출물의 빛 굴절의 변화를 감지할 수 있는 센서(29), 예를 들면 광센서를 포함할 수 있다. 빛 굴절의 적절한 변화는 비-부유층이 배출되었다는 것을 나타내는 출발 도관 내의 부유층의 존재를 신호할 수 있다. 그후에, 센서(29)는 다음 단계를 진행하도록 프로세싱 장치에 신호를 보낼 수 있다.

그러나, 특정 실시양태에서 조직은 그 조직의 비-재생 세포 성분을 회수하도록 프로세싱될 수 있다. 예를 들면, 특정 치료 또는 연구 분야에서, 콜라겐, 단백질, 기질 또는 간질 성분, 지방, 지방세포 또는 조직의 다른 성분들이 필요할 수 있다. 그러한 실시양태에서, 그것은 상기한 바와 같이 폐기물 챔버로 제거되어야 하는 재생 세포를 포함하는 부유층이다. 그후에, 비-부유층은 필요에 따라 추가의 프로세싱을 위해 시스템에 보유된다.

일단 비-부유층이 제거되면, 재생 세포를 포함하는 부유층은 잔류 오염물질을 제거하기 위해 1회 이상 세척될 수 있다. 따라서, 수집 챔버(20)은 전형적으로 세척액이 챔버의 내부로 전달되도록 하기 위한 하나 이상의 포트(21) 및 폐기물 및 기타 재료가 수집 챔버(20)으로부터 빠져나가도록 하나 이상의 포트(22)를 포함한다. 예를 들면, 수집 챔버는 본원에 개시된 바와 같은 하나 이상의 밀폐 입구 포트를 포함할 수 있다. 수집 챔버(20)은 또한 더 확실하게 시스템을 멸균 상태로 유지하면서 폐용액이 수집 챔버로 전달되고 및(또는) 폐기물이 운반되어 나오도록 하기 위해 상부 캡 및 하부 캡과 같은 하나 이상의 캡(나타내지 않음)을 포함할 수 있다. 포트(21)은 수집 챔버의 캡 상에 또는 수집 챔버의 측벽 상에 제공될 수 있다.

새로운 세척액에 의한 세척 과정은 용액 중의 비-부유 오염물질의 잔류 함량이 일정 수준에 도달할 때까지 반복될 수 있다. 즉, 지방 조직 단편을 비롯하여 상기한 혼합물의 부유 재료를 포함하는, 수집 챔버(20) 내의 나머지 재료는 원치않는 재료의 양이 소정의 수준으로 감소될 때까지 추가로 1회 이상 세척될 수 있다. 세척의 종결점을 결정하는 한가지 방법은 조직 용액 중의 적혈구의 양을 측정하는 것이다. 이러한 과정은 540 ㎚ 파장에서 흡수되는 빛을 측정하는 것이다. 바람직한 실시양태에서, 약 0.546 내지 약 0.842의 범위가 허용가능한 것으로 간주된다.

세척 및(또는) 분리 중에, 필요에 따라 결과를 향상시키기 위해 1종 이상의 첨가제를 각종 용기에 첨가할 수 있다. 일부 첨가제의 예로는 세척 및 분리를 최적화하는 제제, 프로세싱 중의 활성 세포군의 생존력을 증강시키는 첨가제, 항미생물제(예를 들면, 항생물질), 지방세포 및(또는) 적혈구를 용해시키는 첨가제 또는 당해 세포군을 풍부하게 하는(고체상 성분에 대한 차별적인 부착에 의한 또는 세포군의 실질적인 감소 또는 풍부를 촉진시키기 위한) 첨가제가 있다. 다른 가능한 첨가제로는 재생 세포(예를 들면, 카스파제 억제제)의 회복 및 생존력을 증진시키는 것 또는 주입 또는 고정에 대한 부작용의 가능성을 감소시키는 것(예를 들면, 세포 또는 결합 조직의 재응집의 억제제)이 있다.

충분한 침강 시간이 경과한 후에, 세척된 지방 조직 단편 및 조직 분리제의 결과 혼합물의 비-부유 분획은 재생 세포, 예를 들면 줄기 세포 및 다른 지방 유래 선구 세포를 함유할 것이다. 본원에 논의된 바와 같이, 재생 세포를 함유하는 비-부유 분획은 지방 유래 줄기 세포와 같은 당해 재생 세포가 혼합물의 비-부유 분획에 존재하는 다른 세포 및 물질로부터 분리될 프로세싱 챔버(30)으로 전달될 것이다. 이러한 비-부유 분획은 본원에서 재생 세포 조성물로서 칭해지며, 줄기 세포, 선구 세포, 내피 전구 세포, 지방세포 및 본원에 기재된 기타 재생 세포를 포함한 다른 여러 유형의 세포를 포함한다. 재생 세포 조성물은 또한 1종 이상의 오염물질, 예를 들면 지방 조직 단편에 존재했던 콜라겐 및 다른 결합 조직 단백질 및 그의 단편, 또는 조직 분리 과정에서의 잔류 콜라게나제를 포함할 수 있다.

본 발명의 프로세싱 챔버(30)은 바람직하게는 재생 세포 조성물이 멸균 방식으로 튜브(12), 밸브(14) 및 펌프(34)에 의해 수집 챔버(20)으로부터 프로세싱 챔버(30)으로 이동하도록 시스템 내에 위치된다. 프로세싱 챔버는 10 mL 내지 1.2 L 범위의 조직/유체 혼합물을 수용하는 크기를 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 프로세싱 챔버는 800 mL를 수용하는 크기를 갖는다. 특정 실시양태에서, 수집 챔버(20)으로부터의 전체 재생 세포 조성물은 프로세싱 챔버(30)으로 향한다. 그러나, 다른 실시양태에서 재생 세포 조성물의 일부분은 프로세싱 챔버(30)으로 향하고, 다른 부분은 시스템의 다른 부분, 예를 들면 시료 챔버(60)으로 향하여 나중에 프로세싱 챔버(30)에서 프로세싱된 세포와 재조합된다.

프로세싱 챔버(30)은 멸균될 수 있는 임의의 적합한 생체적합성 재료를 이용하여 제조될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 프로세싱 챔버(30)은 ISO 10993 표준에 기재된 바와 같은 혈관내 접촉을 위한 생체적합성 요건을 충족시키는 일회용 재료로 제조된다. 예를 들면, 폴리카보네이트, 아크릴 수지, ABS, 에틸렌 비닐 아세테이트 또는 스티렌-부타디엔 코폴리머(SBC)를 사용할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 일회용 프로세싱 챔버의 유로는 무발열성이다. 프로세싱 챔버는 혈액 은행에서 혈액을 프로세싱하는데 통상적으로 사용되는 것과 같은 플라스틱 백 형태이거나; 또는 다른 실시양태에서 그것은 구조적으로 경질일 수 있다(도 6). 한 실시양태에서, 프로세싱 챔버(30)은 2001년 12월 7일에 출원된 공동 소유된 미국 출원 10/316,127호 및 2002년 12월 20일에 출원된 미국 출원 10/325,728호(본원에 전문이 참고로 포함됨)에 개시된 프로세싱 챔버와 유사할 수 있다.

프로세싱 챔버(30)은 여과 및 원심분리 및(또는) 그의 조합을 포함한, 세포를 분리 및 농축시키는데 적합한 임의의 방식으로 제조될 수 있다. 특정 실시양태에서, 수집 챔버(20)으로부터의 재생 세포 조성물은 그 조성물을 여과하여 특정 재생 세포군을 분리 및(또는) 농축시킬 수 있는 프로세싱 챔버(30)으로 도입된다. 세포 여과는 특정 성분 및 세포를 다른 성분 또는 세포 유형으로부터 분리하는 방법이다. 예를 들면, 본 발명의 재생 세포 조성물은 줄기 세포, 선구 세포 및 지방세포를 포함한 다른 여러 유형의 세포 뿐만 아니라 1종 이상의 오염물질, 예를 들면 지방 조직 단편에 존재했던 콜라겐, 또는 조직 분리 과정에서의 잔류 콜라게나제를 포함한다. 프로세싱 챔버(30)에 존재하는 필터(36)은 재생 세포, 예를 들면 줄기 세포 또는 내피 전구 세포 등의 특정 아군의 분리 및 농축을 가능하게 할 수 있다.

액체로부터의 세포 여과와 관련된 일부 변수로는 필터 매체의 기공 크기, 기공의 기하학(형태), 필터의 표면적, 여과 용액의 유동 방향, 막횡단압, 특정 세포군의 희석, 입자 크기 및 형태, 및 세포 크기 및 세포 생존력이 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본원의 개시에 따라서, 분리 또는 여과되어야 하는 특정 세포는 전형적으로 지방 줄기 세포이다. 그러나, 특정 실시양태에서 특정 세포는 단독의 또는 줄기 세포와 조합된 내피 전구 세포와 같은 지방 유래된 선구 세포를 포함할 수 있다.

재생 세포 조성물은 필터 어셈블리(36)과 같은 필터 어셈블리를 거쳐 전개될 수 있다. 특정 실시양태에서, 필터 어셈블리(36)은 다른 기능을 수행하고 재생 세포 조성물을 별개의 부분 또는 성분으로 분리하도록 하는 구조를 갖는 다수의 필터를 포함한다. 예를 들면, 필터 중의 하나는 재생 세포 조성물로부터 콜라겐을 분리하도록 구성될 수 있으며, 필터 중의 하나는 재생 세포 조성물로부터 지방세포 및(또는) 지방 성분을 분리하도록 구성될 수 있으며 필터 중의 하나는 재생 세포 조성물로부터 조직 분리제와 같은 잔류 효소를 분리하도록 구성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 필터 중의 하나는 조성물로부터 콜라겐 및 조직 분리제를 분리하는 것과 같은 2가지 기능을 수행할 수 있다. 다수의 필터는 전형적으로 직렬로 배열되지만, 필터의 적어도 일부는 병렬로 배열될 수도 있다. 필터 어셈블리(36)의 필터의 직렬 배열은 도 2에 나타내어져 있다. 필터 어셈블리(36)의 필터의 병렬 배열은 도 3에 나타내어져 있다.

한 실시양태에서, 필터 어셈블리(36)은 제1 필터, 제2 필터 및 제3 필터를 포함한다. 제1 필터는 재생 세포 조성물에 존재하는 콜라겐 입자를 제거하도록 구성된다. 이들 콜라겐 입자는 전형적으로 직경이 약 0.1 미크론이며 길이가 20 미크론 이하일 수 있다. 콜라겐 입자는 분해에 따라서 다양한 크기를 가질 수 있다. 그들은 또한 꼬임 및 회전이 있음을 의미하는 피브릴일 수 있다. 본원에 기재된 임의의 필터는 폴리에테르술폰, 폴리에스테르, PTFE, 폴리프로필렌, PVDF 또는 셀룰로오스로 제조될 수 있다. 콜라겐을 여과시키는 2가지 가능성이 있다. 하나는 먼저 더 큰 입자들을 제거하여 세포들이 빠져나가게 하는 것이며, 이를 위해서는 아마도 10 미크론 범위 내의 필터를 필요로 할 것이다. 두번째 방법은 세포를 포획하고 콜라겐을 통과시키도록 콜라겐을 잘 분해하기 위해 4.5 미크론과 같은 더 작은 크기의 필터를 사용하는 것이다. 이는 세포를 필터에서 후퇴시켜 부유시키는 수단을 필요로 한다. 콜라겐 섬유를 끌어당기고 보유하는 필터를 사용할 수도 있다.

제2 필터는 재생 세포 조성물에서 부유되지 않는 미성숙 유리 지방세포를 제거하도록 구성된다. 한 실시양태에서, 제2 필터는 폴리에스테르로 제조되고 약 30 내지 약 50 미크론의 기공 크기를 가지며 바람직한 기공 크기는 약 40 미크론이다. 제2 필터에 관해서 언급되어 있지만, 그러한 장치의 배치는 더 큰 세포 및 입자의 초기 제거를 용이하게 하기 위해 두번째보다는 첫번째 위치일 수 있다. 제3 필터는 조성물에 존재하는 미사용된 또는 잔류하는 콜라게나제 또는 다른 조직 분리제를 제거하도록 구성된다. 바람직한 이행에서, 콜라게나제는 시간이 지남에 따라 변성될 수 있다. 한 실시양태에서, 제3 필터는 1 ㎛ 미만의 직경 또는 길이를 갖는 다수의 기공을 포함한다. 특정 실시양태에서, 기공은 1 ㎛ 미만의 직경을 가질 수 있다. 다른 실시양태에서, 기공은 10 kD와 5 미크론 사이의 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 제3 필터는 본원에 논의된 바와 같이 재생 세포군을 작은 부피의 식염수 또는 다른 세척액으로 농축시키도록 구성될 수 있다. 현재 바람직한 것으로, 유일한 최종 필터는 중공 섬유 단위이다. 필터가 반드시 중공 섬유 유형을 가질 필요는 없다. 중공 섬유 단위는 재생 세포에 최소한의 유해 효과를 나타내며 콜라게나제를 제거하는데 가장 효율적이므로 바람직한 이행에서 최종 필터에 사용된다. 장치가 기성품의 집합체인 실시양태에서, 3개의 필터는 별개의 하우징 내에 있다. 중공 섬유 단위가 제3 필터에 사용되는 경우 하나의 하우징 내에 통합된 제1 및 제2 필터를 가질 수 있다. 최종 필터가 중공 섬유 셋-업이 아닌 경우, 모든 3개의 필터가 하나의 하우징 내에 포함될 수 있다.

필터 어셈블리(36)의 필터는 프로세싱 챔버(30) 내에 위치될 수 있거나 또는 프로세싱 챔버(30)과 별개의 성분으로서 제공될 수 있다. 또한, 필터 어셈블리(36)의 필터는 다중 프로세싱 챔버에 또는 일렬로 제공될 수 있다. 특정 실시양태에서, 도관 또는 튜브는 프로세싱 챔버(들)로서 작용할 수 있다. 프로세싱 챔버는 그것이 필터를 연결하는 도관의 부피 내에 들도록 크기 감소될 수 있다. 이러한 유형의 시스템은 조직 용액의 부피가 적절한 크기를 갖는다면 바르게 기능할 것이다. 따라서, 도관은 필터를 통해 전개되는 세포 포함 유체를 함유시킴으로써 프로세싱 챔버로서 작용할 수 있다. 시스템을 준비하고 전개하는 과정에서 세포/조직이 불필요하게 손실되지 않도록 도관의 부피를 최소화하게 주의를 기울여야 한다.

상기한 실시양태에 대해서 보면, 세척된 세포 및 잔류 콜라겐, 지방세포 및 및(또는) 비분해 조직 분리제를 함유하는 재생 세포 조성물이 제1 필터를 통과하여 적어도 일부, 바람직하게는 실질적으로 모든 콜라겐 입자가 조성물로부터 제거되므로 여과된 용액에 콜라겐 입자가 거의 또는 전혀 존재하지 않게 된다. 지방세포 및(또는) 비분해 조직 분리제를 함유하는 여과된 재생 세포 조성물이 제2 필터를 통과하여 적어도 일부, 바람직하게는 실질적으로 모든 유리 지방세포가 여과된 재생 세포 조성물로부터 제거될 수 있다. 이후에, 비분해 조직 분리제를 함유하는 2회 여과된 재생 세포 조성물이 본원에 논의된 바와 같은 중공 섬유 여과 장치와 같은 제3 필터를 통과하여 비분해 조직 분리제가 재생 세포 조성물로부터 제거되거나 감소될 수 있다.

3회 여과된 재생 세포 조성물(즉, 제1, 제2 및 제3 필터를 통과한 후에 잔류하는 조성물)은 다중 출구를 포함하는 프로세싱 챔버(30)의 일부를 포함할 수 있는 다중 출구로 향할 수 있다. 이들 출구는 필요한 압력을 유지하고, 도관을 통해 수집 챔버(20), 생산 챔버(50) 및(또는) 폐기물 용기(40)을 포함할 수 있는 다른 용기로의 연결을 제공할 수 있다.

한 실시양태에서, 필터 어셈블리(36)의 필터는 중공 섬유 여과 매체를 포함한다. 또는, 즉 필터는 여과 매체를 갖도록 형성된 중공 튜브의 집합체를 포함한다. 개시된 시스템(10)과 함께 사용될 수 있는 여과 매체의 예로는 폴리술폰, 폴리에테르술폰 또는 혼합 에스테르 재료 등이 있다. 이들 여과 매체의 중공 섬유 또는 중공 튜브는 필터 어셈블리(36)의 원통형 카트리지에 포함될 수 있다. 여과 매체의 개개의 튜브 또는 섬유는 약 0.1 ㎜ 내지 약 1 ㎜의 내경을 가지며, 바람직한 값은 약 0.5 ㎜이다. 적당한 원통형 카트리지의 직경 및 길이는 카트리지 내측에 놓여질 수 있는 여과 매체의 개개의 튜브의 수를 결정할 것이다. 적당한 중공 섬유 필터 카트리지의 일례는 파이버플로(FiberFlo)^® 접선류 필터, 카탈로그 #M-C-010-JK(Minntech, Minneapolis, Minnesota)이다. 여과 매체의 기공 크기는 약 10 킬로달톤 내지 약 5 미크론일 수 있으며, 바람직한 기공 크기는 약 0.5 미크론이다.

중공 섬유 필터에서, 각 중공 튜브는 제1 단부, 제2 단부, 및 제1 단부와 제2 단부 사이에 걸쳐져 내부에 관내강(lumen)이 위치된 본체를 갖는다. 각 중공 튜브의 본체는 다수의 기공을 포함한다. 일반적으로 기공은, 재생 세포 조성물이 본체의 관내강을 통해 흐름으로써 여과되고 도 12A에 나타낸 바와 같이 여과될 생성물이 기공을 접선 방향으로 통과하도록 본체 내에 배향된다. 즉, 액체 내의 더 작은 입자는 본체의 관내강을 통한 유체의 흐름에 대해 접선 방향으로 기공을 통과한다. 재생 세포를 가진 조성물은 그 조성물이 여과될 때 각 중공 튜브의 관내강을 통과한다. 바람직하게는, 조성물의 흐름은 각 중공 튜브의 본체의 기공에 접선 방향이다.

줄기 세포의 여과 효율은 유체의 접선 흐름을 이용함으로써 다른 여과 기술에 비해 향상될 수 있다. 예를 들면, 일부 여과 기술에 따라서, 여과 매체의 기공은 필터가 유체 흐름에 대해 수직으로 배향되는 방식으로 놓여지므로, 필터 매체가 도 12B에 예시된 바와 같이 유체의 여과 경로를 차단하게 된다. 이러한 유형의 여과에서, 재생 세포 조성물에서 여과되고 있는 입자, 예를 들면 줄기 세포는 필터의 한쪽에 축적되어 기공을 통한 유체의 흐름을 차단하는 경향이 있다. 이러한 차단은 필터의 효율을 감소시킬 수 있다. 또한, 세포는 항상 유체 흐름의 압력과 필터의 상류측에 축적되는 세포의 중량에 의해 압축된다. 이는 줄기 세포의 용해를 증가시킬 수 있다. 따라서, 유체의 흐름이 필터의 기공 배향과 병렬인 여과 기술에서, 큰 세포와 작은 입자는 둘다 유체가 기공을 통과할 때 바람직하지 못하게 여과 매체로 향할 수가 있다. 결과적으로, 세포와 같은 액체 중의 더 큰 생성물은 기공을 차단할 수 있으며, 따라서 여과 효과가 감소되고 세포 파괴 또는 손상이 증가하게 된다.

대조적으로, 본 발명의 시스템(10)의 중공 섬유 구조에서, 여과되는 유체는 중공 튜브의 관내강 내측으로 흐른다. 필터의 본체의 기공을 통과하는 능력을 가진 유체의 일부는 본체 내측에 대한 유체의 정압 및 본체 외측에 가해지는 부압의 도움으로 그러한 능력을 갖는다. 이러한 실시양태에서, 세포는 전형적으로 유체 흐름의 압력 또는 다른 세포의 중량을 받지 않으며, 따라서 줄기 세포에 대한 전단력이 감소된다. 따라서, 여과의 효율 및 효능은 막힘 속도를 감소시키고 재생 세포 용해를 감소시킴으로써 향상될 수 있다. 식염수 및 불필요한 단백질 분자의 크기로 인해, 여과 중에 이들 분자 및 다른 작은 성분들은 중공 튜브의 본체의 기공을 거쳐 중공 튜브의 외측으로 통과하고 폐기물 챔버(40)으로 향한다. 한 실시양태에서, 중공 튜브 여과 매체 외측 상에 진공 발생시킴으로써 여과능이 향상될 수 있다. 재생 세포, 예를 들면 줄기 세포 또는 선구 세포의 크기로 인해, 이들 세포는 본체의 기공을 통과할 수가 없으며 따라서 중공 튜브 필터의 내측에 (예를 들면, 튜브의 관내강 내에) 남아있으며 필터와 프로세싱 챔버 사이의 도관을 통해 프로세싱 챔버(30)으로, 또는 생산 챔버(50)으로 다시 향한다.

하나의 특정 실시양태에서, 중공 섬유 필터는 약 0.05 미크론 기공 크기를 가지며, 약 550 ㎠의 여과 매질 표면적을 갖는다. 개개의 매체 튜브는 전형적으로 약 0.5 ㎜의 직경을 갖는다. 130 ㎖의 재생 세포 조성물의 프로세싱시에, 약 120 ㎖의 추가의 식염수를 조성물에 첨가할 수 있다. 프로세싱 또는 여과 시간은 약 8분일 수 있다. 중공 섬유 튜브의 본체의 어느 면 상의 압력(예를 들면, 본체의 관내강 내측과 본체의 외측의 압력) 차이는 막횡단압으로 간주된다. 막횡단압은 약 1 ㎜Hg 내지 약 500 ㎜Hg일 수 있으며, 바람직한 압력은 약 200 ㎜Hg이다. 중공 섬유 여과를 이용한 평균 유핵 세포 회수 및 생존력은 살아있는 세포의 약 80%일 수 있다.

그러한 시스템에서 전형적으로 제거되는 콜라게나제의 양은 3 log 감소 정도이다. 예를 들어, 수집 챔버로부터 프로세싱 챔버로 전달되는 재생 세포 조성물 중의 콜라게나제의 초기 농도가 0.078 U/㎖인 경우, 최종 재생 세포 조성물의 콜라게나제 농도는 0.00078 U/㎖일 것이다. 콜라게나제는 중공 섬유 필터에서 제거되며, 중공 섬유 필터는 상기 논의된 제3 필터에 해당한다.

상기한 하나 이상의 세포 여과 방법을 예시하는 프로세싱 챔버는 도면, 특히 도 1-3에 나타내어져 있다. 도 1-3에 대해서 보면, 프로세싱 챔버(30)과 필터 어셈블리(36)의 여과 챔버 사이에는 펌프(34)와 같은 펌프가 제공될 수 있다. 또한, 벤트 및 압력 센서, 예를 들면 벤트(32) 및 압력 센서(39)는 프로세싱 챔버(30) 및 필터 어셈블리(36)과 일렬로 제공될 수 있다. 생산 챔버(50)을 위한 피팅이 제공될 수도 있다. 이들 선택적 구성품(예를 들면, 펌프(34), 벤트(32), 압력 센서(39) 및 생산 챔버(50)을 위한 피팅)이 프로세싱 챔버(30)과 필터 어셈블리(36) 사이에 제공되어 프로세싱 챔버(30)에 함유된 액체가 필터 어셈블리(36)를 통해 유동되기 전에 이들 선택적 구성품 중 하나 이상을 통해 유동될 수 있다. 예를 들면, 액체는 필터 어셈블리(36)으로 통과하기 전에 펌프(34)를 통해 유동될 수 있다. 또는, 액체는 필터 어셈블리를 통과하기 전에 압력 센서(39)를 통과하여 시스템 내 전치 필터 액체 압력을 얻을 수 있다. 특정 상황에서, 이들 구성품 중 하나 이상은 또한 도 6에 예시된 바와 같이 벤트(32)와 같은, 프로세싱 챔버(30)의 요소로서 제공될 수도 있다. 예시된 실시양태에서, 압력 센서(39)는 재생 세포 조성물이 필터 어셈블리(36)의 여과 챔버로 유입될 때 펌프(34)에 의해 발생되는 재생 세포 조성물의 압력을 확인하기 위해 일렬로 놓여진다. 이러한 구조는 여과 막을 가로지른 막횡단압의 모니터링을 용이하게 할 수 있다. 추가의 식염수 또는 다른 완충액 및 세척액은 재생 세포 조성물에 첨가되어 조성물이 필터 어셈블리(36)을 통해 여과될 때 불필요한 단백질의 제거를 도울 수 있다. 이러한 세척은 재생 세포의 순도를 증강시키기 위해 여러번 반복될 수 있다. 특정 실시양태에서, 식염수는 여과를 증강시키는데 필요한 것으로 간주되는 임의의 단계로 첨가될 수 있다.

제한되지는 않지만 예로써만 제공되는 하나의 특정 실시양태에서, 불필요한 단백질 및 식염수 또는 다른 세척액은 다음 방식으로 제거된다. 재생 세포 뿐만 아니라 콜라겐 및 결합 조직 입자 또는 단편, 지방세포 및 콜라게나제를 포함한 조성물은 최소 부피에 이를 때까지 일련의 필터를 통해 순환된다. 최소 부피는 시스템의 총 체류 부피 및 일정 상수의 함수이다. 체류 부피는 프로세싱 챔버 모두가 비어있는 경우, 튜브 및 도관 내에 함유된 액체의 부피이다. 한 실시양태에서, 최소 부피는 15 ㎖이다. 최소 부피가 될 때, 일정 부피의 세척액이 재생 세포 조성물과 혼합될 시스템에 도입된다. 다시 최소 부피가 될 때 세척액과 재생 세포 조성물의 혼합물이 필터를 통해 순환된다. 이러한 순환은 재생 세포의 순도를 증강시키기 위해, 또는 즉 조성물 내의 재생 세포와 조성물 내의 다른 물질과의 비를 증가시키기 위해 여러번 반복될 수 있다(도 10 및 11 참조).

재생 세포 조성물이 세정되어 불필요한 단백질이 제거되고 충분하게 농축되었는지를 확인한 후에(예시적인 실시양태에서, 약 1 x 10⁵ 내지 약 1 x10⁷ 세포/㎖의 최소 농도를 이용하고, 바람직한 실시양태에서 최소 농도는 약 1 x10⁷ 세포/㎖일 수 있음), 배출 백(output bag)과 같은 생산 챔버(50)이 특정 실시양태에 따라서 프로세싱 챔버(30) 및(또는) 필터 어셈블리(36)의 출구 포트에 연결될 수 있다. 벤트(32)와 같은 벤트가 열려서 농축 재생 세포의 배출을 용이하게 할 수 있다. 하나의 이행에서, 최소 농도가 되었을 때의 확인은 실험이 장치의 전자 제어로 진행되고 프로그램화된 후에 실험적으로 이루어진다. 이러한 측정이 과정에 입력되어 목적하는 수율, 즉 얼마나 많은 줄기/선구 세포가 필요한지 또는 세포 농도 범위를 알 수 있다. 과학적 데이타를 기준으로, 미리 정해진 양의 지방 조직이 목적하는 배출물을 얻기 위해 시스템 내에 얻어지고 놓여질 필요가 있다. 벤트(32)가 열리는 경우, 펌프(34)와 같은 펌프는 농축된 재생 세포를 배출 백에 전달하는 기능을 할 수 있다. 한 실시양태에서, 배출 백(50)은 한 단부에 피팅이 장치된 튜브를 갖는 비어있는 채혈 백과 유사하다. 멸균 방식으로, 배출 백 상의 피팅은 출구 포트에 부착될 수 있으며, 농축 재생 세포는 배출 백에 전달될 수 있다.

도 1-3에 예시된 바와 같이, 진공 펌프(26)은 시스템(10)에 제공되어 특히 시스템의 압력을 변화시킬 수 있다. 예를 들면, 진공 펌프(26)은 도관(12b)와 같은 도관을 통해 수집 챔버(20)에 결합되어 수집 챔버(20) 내의 압력 감소를 야기시킬 수 있다. 진공 펌프(26)은 도관(12g)와 같은 도관에 의해 프로세싱 챔버(30)에 결합될 수 있다. 펌프(34)와 연결된 진공 펌프(26)의 작동에 관해서 보면, 2개의 별개의 진공 펌프 또는 진공원이 작동되거나 또는 과정의 특정 지점에서 진공을 필요로 하는 다른 도관으로 진공을 끌어내는 밸브를 사용하여 하나 만의 진공 펌프 또는 진공원이 작동될 수 있다. 또한, 진공 펌프(26)은 도관(12f)와 같은 도관을 통해 폐기물 용기(40)에 결합될 수 있다.

도 10 및 11에 대해서 보면, 진공 펌프(26)에 의해 발생되는 압력을 이용하여 재생 세포를 포함한 유체를 도관(12)를 통해 유동시킬 수 있다. 이 압력은 예를 들어, 시스템(10) 내의 하나 이상의 밸브(14)의 위치를 자동적으로 또는 수동적으로 제어하여 여러 방향으로 공급될 수 있다. 시스템(10)은 정압을 이용하여 또는 부압을 이용하여, 또는 둘다를 조합하여 적당하게 기능하게 될 수 있다. 예를 들면, 재생 세포는 상기한 제1 및 제2 필터를 거쳐 제3 필터에 연결된 연질 용기에 넣어질 수 있다. 연질 용기는 제3 필터의 앞에 일렬 (직렬) 연결될 수 있다. 최종 생산 챔버는 제3 필터의 다른 쪽(예를 들면, 하류쪽)에 있는 연질 용기일 수 있다. 이 실시양태에서는, 압력을 이용하여 필터를 통해 하나의 연질 용기에서 제2 연질 용기로 재생 세포를 이동시킨다.

시스템(10)의 다른 실시양태에서, 줄기 세포 및(또는) 지방 유래 선구 세포는 삼투 여과 및 침강의 조합을 이용하여 여과될 수 있다. 예를 들면, 그러한 시스템은 조직 재생 세포 조성물(예를 들면, 줄기 세포 및(또는) 지방 선구 세포를 함유하는 조성물)을 통과하고 그후에 필터를 통과하는 식염수를 이용한다. 재생 세포 조성물로부터의 세포의 삼투 여과와 관련된 일부 변수로는 필터 매체의 기공 크기, 기공의 기하학 또는 형태, 필터의 표면적, 여과되는 재생 세포 조성물의 유동 방향, 주입된 식염수의 유량, 막횡단압, 세포군의 희석, 세포 크기 및 생존력이 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

시스템(10)의 한 실시양태에서, 프로세싱 챔버(30)은 삼투 여과 및 침강을 이행하는 필터 어셈블리(36)을 이용하여 재생 세포를 분리하고 농축시킨다. 제한되는 것은 아니지만 예로써, 도 6에 나타낸 바와 같이 프로세싱 챔버(30)은 일반적으로 측벽(30a), 상부 표면(30b) 및 하부 표면(30c)를 갖는 원통체로서 형성된다. 멸균 벤트(32)가 상부 표면(30b)에 제공된다.

도 6의 실시양태에서, 프로세싱 챔버(30)은 대기공 필터(36a) 및 소기공 필터(36b)와 같은 2개의 필터를 포함하는 필터 어셈블리(36)을 포함하는 것으로 예시되어 있다. 필터(36a 및 36b)의 기공 크기는 전형적으로 약 0.05 미크론 내지 약 10 미크론이다. 대기공 필터(36a)는 직경이 약 5 ㎛인 기공을 포함할 수 있으며, 소기공 필터(36b)는 직경이 약 1-3 ㎛인 기공을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 필터는 약 785 ㎟의 표면적을 갖는다. 필터(36a 및 36b)는 제1 챔버(37a), 제2 챔버(37b) 및 제3 챔버(37c)를 포함하도록 프로세싱 챔버(30)의 내부를 분할한다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 제1 챔버(37a)는 제2 챔버(37b)와 제3 챔버(37c) 사이에 위치한다. 또한, 제1 챔버(37a)는 입구 포트(31a) 및 출구 포트(31b)를 갖는 프로세싱 챔버(30)의 영역으로 나타내어져 있다. 예시된 프로세싱 챔버(30)은 프로세싱 챔버(30)의 외부에서 프로세싱 챔버(30)의 내부로의 교류 경로를 제공하는 다수의 포트, 예를 들면 포트(31a), (31b) 및 (31c)를 포함한다. 포트(31a), (31b) 및 (31c)는 프로세싱 챔버(30)의 본체의 측벽(30a)에 배치되는 것으로 나타내어져 있다. 그러나, 포트(31a), (31b) 및 (31c)는 다른 영역에 위치될 수도 있다. 포트(31a)는 재생 세포 함유 조성물이 프로세싱 챔버(30)의 내부로 통과되도록 도관에 연결되게 구성된 시료 입구 포트로서 예시된다. 포트(31b)는 분리 및 농축된 세포가 프로세싱 챔버(30)의 내부로부터 제거될 수 있도록 도관에 연결되게 구성된 출구 포트로서 예시된다. 포트(31c)는 식염수와 같은 새로운 세척액을 프로세싱 챔버(30)의 내부로 전달하기 위해 도관에 연결되게 구성된 입구 포트로서 예시된다.

사용시에, 재생 세포는 입구 포트(31a)를 통해 중앙 챔버(37a)에 도입될 수 있다. 식염수 또는 다른 완충액은 입구 포트(31c)를 통해 하부 챔버(37b)로 도입된다. 식염수는 약 10 ㎖/분의 유량으로 챔버(37a) 내의 재생 세포 조성물로 향할 수 있다. 식염수의 유량은 중력에 반작용하도록 하는 것이다. 식염수의 유동은 챔버 내의 세포에 그 세포의 밀도를 기준으로 하는 분리능을 제공한다. 전형적으로, 식염수가 조성물을 통해 밀려 올라갈 때 조성물 중의 더 큰 세포는 중앙 챔버(37a)의 바닥에 가라앉고 더 작은 세포와 단백질은 제2 필터(36b)를 통해 상부 챔버(37c)로 휩쓸려 운반될 것이다. 이러한 여과는 더 작은 입자가 자유로워지고 식염수에 의해 운반되어지는 자리에서 더 큰 세포가 굴려지도록 식염수의 유량을 조정함으로써 이루어진다. 프로세싱 유니트 내의 3개의 챔버에서 올바른 압력 구배가 유지되도록 하기 위해 멸균 벤트(32)가 챔버(30)에 포함된다. 상부 챔버(37c)는 흡수 매체(33)을 포함할 수 있다. 흡수 매체의 목적은, 식염수 유량이 감소하는 경우 용액 중의 불필요한 단백질들이 여과 매체를 가로질러 프로세싱 용액에 되돌아가지 않도록 하기 위해 불필요한 단백질을 포획하는 것이다. 흡수 매체는 여과해낼 재료 또는 성분을 유인하거나 또는 흡수성인 필터 재료 유형일 수 있다. 폐기물을 빼내는 것을 돕기 위해 유출 포트를 상부 필터 위에 추가할 수 있다. 이의 또 다른 실시양태는 폐기물을 떼내는 것을 돕기 위해 상부로부터 약한 진공을 가하는 것이다. 예시된 실시양태에서와 같이 유량이 비교적 작을 때 흡수 매체의 효력이 생길 수 있다. 그후에, 과량의 식염수 및 단백질은 폐기물 용기로 운반된다.

더 큰 세포(예를 들면, 지방 줄기 세포 및(또는) 선구 세포)가 더 작은 세포 및 단백질로부터 충분히 분리되었을 때, 분리된 세포를 함유하는 조성물은 본원에 논의된 바와 같이 농축될 수 있다. 조성물은 그것이 챔버(37a)로부터 출구 포트(31b)를 거쳐 제거된 후에 또는 그것이 챔버(37a)에 있는 동안 더 농축될 수 있다. 한 실시양태에서, 조성물 중의 세포의 농도는 다음 방식으로 증가된다. 세포가 충분히 분리된 후에, 필터, 예를 들면 필터(36a 및 36b)는 서로를 향해 이동할 수 있다. 이러한 이동은 2개의 필터 사이의 부피(예를 들면, 챔버(37a)의 부피)를 감소시키는 효과를 갖는다. 조성물 중의 세포의 농축을 용이하게 하기 위해 진동 부재가 프로세싱 챔버(30)과 연결되어 제공될 수도 있다. 한 실시양태에서, 진동 부재는 필터(36b)(예를 들면, 작은 기공 필터)에 결합될 수 있다. 진동은 필터 내에 포획되는 세포 빈도를 감소시킬 수 있다. 조성물의 부피 감소에 의해 과량의 식염수는 폐기물로서 제거되고 세포는 더 작은 부피로 농축된다.

또 다른 실시양태에서, 재생 세포의 농축은 다음 방식으로 이루어진다. 세포가 충분히 분리된 후에, 재생 세포 조성물은 중력을 이용하여 과량의 식염수를 여과해내는 또 다른 챔버(나타내지 않음)로 전달될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 침강은 삼투와 동시에 일어날 수 있다. 이러한 침강은 약 10 kD 내지 약 2 미크론의 기공 크기를 갖는 필터 위에 조성물을 도입함으로써 이루어질 수 있다. 한 실시양태에서, 적당한 필터는 약 1 미크론의 기공 크기를 갖는다. 중력은 조성물 중의 세포가 필터를 통해 유동되는 것을 방지하면서 식염수 및 더 작은 입자가 필터를 통과하도록 할 것이다. 소정 농도의 세포가 수득된 후에 또한 여과된 더 작은 입자가 필터 아래로부터 제거된 후에, 재생 세포 조성물이 교반되어 필터로부터 세포가 제거되고 이후에 농축된 재생 세포가 배출 백으로 전달될 수 있다. 더 작은 입자는 출구를 통해 폐기물로서 빼내어질 수 있다.

특정 실시양태에서, 수집 챔버(20)으로부터의 재생 세포 조성물은 그 조성물을 원심분리하여 재생 세포를 분리하고 농축시키는 프로세싱 챔버(30)으로 운반된다. 원심분리 원리는 당업계에 잘 알려져 있으며 간략하게 하기 위해 본원에 반복되지 않을 것이다. 당업계에 인정된 표준 원심분리 장치, 성분 및 변수가 본원에 이용된다. 원심분리 장치의 일부로서 사용하기 위한 예시적인 프로세싱 챔버는 도 7 및 8에 나타내어져 있다. 전형적으로, 원심분리 장치는 원심분리 챔버(예를 들면, 도 7에 나타낸 것)가 축 주위에 회전되도록 함으로써 용액 중의 세포에 대한 힘이 중력보다 커지게 된다. 용액 중의 더 조밀하거나 더 비중있는 재료는 전형적으로 원심분리 챔버, 즉 도 7의 생산 챔버(50)의 한 단부에 가라앉아서 재생 세포 펠릿을 형성한다. 그후에, 펠릿은 재현탁되어 목적하는 세포 농도 및(또는) 목적하는 세포 및 매체의 부피를 가진 용액을 얻을 수 있다. 도 7에 나타낸 프로세싱 챔버는 원심분리력 및 중력 둘다를 이용하여 세포를 분리 및 농축하도록 구성된다. 특별하게는, 원심분리 중에 원심분리력은 재생 세포 조성물의 더 조밀한 성분, 예를 들면 재생 세포가 원심분리 챔버의 가장 바깥쪽 단부로 향하게 한다. 원심분리 챔버가 느려지고 결국 중지될 때, 중력은 재생 세포가 원심분리 챔버의 가장 바깥쪽 단부에 남아서 세포 펠릿을 형성하는 것을 돕는다. 따라서, 재생 세포 조성물의 불필요한 성분, 즉 폐기물은 세포 펠릿을 혼란시키지 않고 제거될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 프로세싱 챔버는 회전 막 필터 형태의 세포 농축기를 포함할 수 있다. 원심분리 과정의 또 다른 실시양태에서, 원심분리 분급이 적용될 수도 있다. 이 실시양태에서, 세포는 개개의 세포 침강 속도를 기준으로 분리되어 원심분리에 의해 가해지는 방향성있는 (예를 들면, 바깥쪽) 힘이 세포 및 용질을 다른 속도로 침강되도록 한다. 분급시에, 표적 세포군의 침강 속도는 용액을 원심분리력에 반대 방향으로 펌핑함으로써 가해지는 반대쪽 (예를 들면, 안쪽) 유량에 의해 대조된다. 역류는 용액 내의 세포 및 입자가 분리되도록 조정된다. 분급은 많은 세포 분리 경우에 적용되었고(Inoue, Carsten et al. 1981; Hayner, Braun et al. 1984; Noga 1999), 유동 및 원심분리 변수를 최적화하는데 사용되는 원리 및 실시는 본 발명의 개시를 고려하여 당업자에 의해 본원에 적용될 수 있다.

도 9는 본 발명에 따른 분급 이행과 관련된 원리를 예시한다. 분급 실시양태는 회전 로터를 사용하여 용액에 힘이 가해지는 정도로 원심분리 이행과 유사할 수 있다. 현재 구체화된 분급 분리와 관련된 일부 변수로는 회전 챔버의 크기 및 형태, 로터 직경, 로터 속도, 역류 튜브의 직경, 역류의 유량, 및 용액으로부터 제거되어야 하는 입자 및 세포의 크기 및 밀도가 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 원심분리에서와 같이, 재생 세포는 개개의 세포 밀도를 기준으로 분리될 수 있다.

한 실시양태에서, 재생 세포 조성물, 예를 들면 재생 세포 및 콜라게나제를 함유하는 용액은 도 9.1에 나타낸 바와 같이 회전 로터의 챔버로 도입된다. 용액이 챔버에 첨가된 후에, 추가의 식염수가 일정한 유량으로 챔버에 첨가된다. 식염수의 유량은 로터 속도, 세포 직경 및 실험적으로 얻어지는 챔버 상수의 함수로서 정해질 수 있다. 유량은, 예를 들어 IV 펌프와 유사한 장치에 의해 조절될 것이다. 식염수를 추가하는 목적은 도 9.2에 예시된 바와 같이 더 큰 입자가 챔버의 한쪽으로 이동하고 더 작은 입자가 다른 쪽으로 이동하는 로터 챔버 내측 상태를 제공하는 것이다. 이러한 용도에서 유량은 도 9.3에 나타낸 바와 같이 더 작은 입자가 챔버에서 빠져나가고 폐기물 용기로 이동하도록 조정된다. 이러한 이동 결과 줄기 세포와 같은 실질적으로 균질한 세포군을 갖는 용액이 로터 챔버에 형성된다. 줄기 세포가 용액 중의 나머지 성분으로부터 분리되었는지(불필요한 단백질 및 유리 지방이 챔버로부터 제거됨) 확인한 후에, 역류가 중지된다. 그후에, 챔버 내측의 세포가 챔버의 외측벽 상에 농축된 펠릿을 형성할 것이다. 역류는 역전되고 세포 펠릿은 배출 백으로 전달된다.

본원에 이미 설명된 바와 같이, 프로세싱 챔버(30) 또는 생산 챔버(50)은 하나 이상의 포트, 예를 들면 포트(51 또는 52)를 포함할 수 있다. 이들 포트 중 하나 이상은 상기한 방법들 또는 그의 일부분의 임의의 조합을 이용하여 수득된 재생 세포를 도관을 통해 다른 수술 장치, 세포 배양 장치, 세포 매리네이딩 장치, 유전자 요법 장치 또는 정제 장치로 운반되도록 고안될 수 있다. 이들 포트는 또한 재생 세포를 도관을 통해 시스템 내의 추가의 챔버 또는 용기에 운반하도록 또는 상기한 동일한 목적을 위한 또다른 시스템의 일부로서 고안될 수 있다. 포트 및 도관은 또한 하나 이상의 첨가제, 예를 들면 세포에 유전자를 전달하는 제제를 포함하는 성장 인자, 재현탁 유체, 세포 배양 시약, 세포 팽창 시약, 세포 보존 시약 또는 세포 변형 시약을 첨가하는데 사용될 수 있다. 포트 및 도관은 또한 재생 세포를 이식 재료(예를 들면, 스캐폴드 또는 골격 단편)와 같은 다른 표적 뿐만 아니라 다른 외과적 이식물 및 장치로 운반하는데 사용될 수 있다.

세포의 추가의 프로세싱은 또한 기존 시스템의 일회용 세트의 상호연결을 재구성하고, 기존 시스템의 프로세싱 장치를 다시 프로그래밍하고, 기존 시스템에 대한 다른 또는 추가의 용기 및(또는) 챔버를 제공하고, 세포를 하나 이상의 추가의 시스템 또는 장치로 운반하고 및(또는) 그것을 조합함으로써 개시될 수 있다. 예를 들면, 시스템은 그 시스템을 이용하여 수득된 재생 세포가 다음 중 하나 이상: 세포 팽창 (하나 이상의 재생 세포 유형의) 및 세포 보존(세포 시트 헹굼 및 배지 변화 포함); 계대배양; 세포 접종; 일시 형질감염(대량 공급물로부터의 형질감염 세포의 접종 포함); 수거(효소적, 비효소적 수거 및 기계적 스크레이핑에 의한 수거 포함); 세포 생존력 측정; 세포 평판배양(예를 들면, 마이크로타이터 플레이트 상에서, 팽창시키기 위해 개개의 웰로부터 세포를 집고 세포를 새로운 웰에 팽창시키는 것을 포함); 고처리량 스크리닝; 세포 요법 분야; 유전자 요법 분야; 조직 공학 분야; 치료 단백질 분야; 바이러스 백신 분야; 뱅킹 또는 스크리닝, 세포 성장의 측정, 용해, 접종, 감염 또는 유도를 위한 재생 세포 또는 상등액의 수거; 세포주의 발생(하이브리도마 세포 포함); 투과성 연구를 위한 세포의 배양; RNAi 및 바이러스 내성 연구를 위한 세포; 녹아웃(knock-out) 및 유전자도입 동물 연구를 위한 세포; 친화성 정제 연구; 구조 생물학 이용; 분석법 개발 및 단백질 공학 분야에 적용되도록 상기한 임의의 수단에 의해 재구성될 수 있다.

예를 들면, 재생 세포군의 팽창이 특정 분야에 필요한 경우, 세포군을 우선적으로 팽창시키는 배양 조건을 이용하면서 다른 세포군이 유지되거나 (그럼으로써 선택된 세포의 성장에 따른 희석에 의해 감소됨) 또는 필요한 성장 조건의 부재로 인해 상실되는 방법을 사용할 수 있다. 세키야(Sekiya) 등은 이러한 면에서 골수 줄기 세포에 대해 이용될 수 있는 조건을 설명하였다(Sekiya et al., 2002). 이 방법(조직 배양 플라스틱에 대한 차별적인 부착이 있거나 없음)은 본 발명의 추가의 실시양태에 적용될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 최종 재생 세포 펠릿은 생산 챔버로부터 제거되고 세포 배양 성분을 제공하는 제2 시스템에 놓여진다. 이는 통상의 실험 조직 배양 인큐베이터 또는 바이오리액터-스타일 장치 형태, 예를 들면 짜오(Tsao) 등의 미국 특허 제6,001,642호에 의한 것 또는 암스트롱(Armstrong) 등의 미국 특허 제6,238,908호에 의한 것일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 세포 팽창 또는 세포 배양 성분은 기존의 시스템에, 예를 들면 생산 챔버내로 첨가되어 지방세포군의 단기간 부착 및(또는) 세포 배양을 가능하게 한다. 이러한 대안적인 실시양태는 세포 배양 및(또는) 세포 팽창 성분이 시스템에 통합되도록 하고 이 시스템으로부터 세포를 제거하여 또 다른 시스템 내에 배치할 필요를 없앤다.

프로세싱 중에, 1종 이상의 첨가제는 결과를 향상시키기 위해 필요에 따라 각종 챔버 또는 용기에 첨가되거나 제공될 수 있다. 이들 첨가제는 또한 기존의 시스템과 관련되거나 또는 기존 시스템과 별개인 또 다른 시스템의 일부로서 제공될 수 있다. 예를 들면, 특정 실시양태에서 첨가제는 시스템으로부터 재생 세포를 제거할 필요없이 첨가되거나 제공된다. 다른 실시양태에서, 첨가제는 그 첨가제를 포함하는 새로운 용기 또는 챔버를 멸균 방식으로 시스템의 사용되지 않은 포트내에 연결함으로써 첨가되거나 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 첨가제는 본 발명의 시스템에 연결되지 않은 제2 시스템 또는 장치에 첨가되거나 제공된다. 첨가제의 일부 예는 세척 및 분리를 최적화하는 제제, 프로세싱 중의 활성 세포군의 생존력을 증강시키는 첨가제, 항미생물제(예를 들면, 항생물질), 지방세포 및(또는) 적혈구를 용해시키는 첨가제 또는 본원에 기재된 바와 같은 당해 세포군을 풍부하게 하는 (고체상 성분에 대한 차별적인 부착에 의한 또는 세포군의 실질적인 감소 또는 풍부를 촉진시키기 위한) 첨가제가 있다.

예를 들면, 균질한 재생 세포군을 수득하기 위해, 특정 재생 세포 유형을 분리하고 농축시키는 임의의 적당한 방법, 예를 들어 줄기 세포 또는 선구 세포, 예를 들면 내피 전구 세포 상에 존재하는 항원을 인식하고 결합하는 세포특이적 항체를 사용하는 방법이 이용될 수 있다. 이들은 양성 선택(표적 세포의 선택), 음성 선택(불필요한 세포의 선택적인 제거), 또는 그들의 조합을 포함한다. 효소와 같은 세포내 마커는 특정 효소에 의한 작용시에 응집하는 분자들을 이용한 선택에 이용될 수 있다. 또한, 최종 세포 펠릿 내의 특정 재생 세포군의 차별적인 부착 및(또는) 용리를 가능하게 하도록 선택된 접착 특성을 가진 고체상 물질이 시스템의 생산 챔버내에 삽입될 수 있다.

이러한 차별적인 부착 방법의 대안적인 실시양태는 표적 재생 세포 및 불필요한 세포 상에 차별적으로 발현되는 표면 분자를 인식하는 항체 및(또는) 그의 조합을 이용한다. 특정 세포 표면 마커 (또는 그의 조합)의 발현을 기초로 한 선택은 항체를 고체상 지지체 구조에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착시키는 통용되는 또 다른 기술이다 (Geiselhart et al., 1996; Formanek et al., 1998; Graepler et al., 1998; Kobari et al., 2001; Mohr et al., 2001).

또 다른 실시양태에서, 세포 펠릿은 재현탁되고, 연속 또는 불연속 밀도 구배로 형성된 유체 재료 위에 (또는 아래에) 층 형성되고, 세포 밀도를 기준으로 한 세포군 분리를 위해 원심분리기 내에 놓여질 수 있다. 유사한 실시양태에서, 혈액성분 채집(Smith, 1997), 및 분급 (역류가 있거나 없음)(Lasch et al., 2000) (Ito and Shinomiya, 2001)과 같은 연속 유동 방법이 이용될 수도 있다.

첨가제의 다른 예는 추가의 생물학적 또는 구조적 성분, 예를 들면 본원에 논의된 바와 같은 세포 분화 인자, 성장 촉진인자, 면역억제제, 의학 장치 또는 그들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들면, 다른 세포, 조직, 조직 단편, 성장 인자, 예를 들면 VEGF 및 다른 공지된 혈관신생 또는 동맥형성 성장 인자, 생물학적 활성 또는 불활성 화합물, 재흡수성 스캐폴드, 또는 재생 세포군의 전달, 효능, 내성 또는 기능을 향상시키기 위한 다른 첨가제가 첨가될 수 있다. 재생 세포군은 또한 구조 또는 치료 목적을 위해 재생 세포의 기능을 변화, 향상 또는 보충시키도록 DNA를 삽입하거나 또는 세포 배양 시스템(본원에 기재되거나 당분야에 공지됨) 내에 배치함으로써 변형될 수 있다. 예를 들면, 줄기 세포에 대한 유전자 전달 기술은 문헌 (Morizono et al., 2003; Mosca et al., 2000)에 개시된 바와 같이 당업자에 의해 알려져 있으며, 그 예로는 바이러스 형질감염 기술 및 더욱 특별하게는 문헌 (Walther and Stein, 2000 및 Athanasopoulos et al., 2000)에 개시된 바와 같이 아데노-관련 바이러스 유전자 전달 기술을 포함할 수 있다. 비-바이러스 기반의 기술은 문헌 (Muramatsu et al., 1998)에 개시된 바와 같이 수행될 수도 있다. 하나 이상의 세포 분화 인자, 예를 들면 성장 인자(들) 또는 사이토킨(들)를 코딩하는 유전자가 또한 첨가될 수 있다. 각종 세포 분화제의 예는 문헌(Gimble et al., 1995; Lennon et al., 1995; Majumdar et al., 1998; Caplan and Goldberg, 1999; Ohgushi and Caplan, 1999; Pittenger et al., 1999; Caplan and Bruder, 2001; Fukuda, 2001; Worster et al., 2001; Zuk et al., 2001)에 개시되어 있다. 항-세포사멸 인자 또는 제제를 코딩하는 유전자가 또한 첨가될 수 있다. 유전자 (또는 유전자들의 조합)의 첨가는 한정되는 것은 아니지만, 아데노바이러스 형질도입, "유전자 총", 리포좀 매개된 형질도입 및 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 매개된 형질도입, 플라스미드, 아데노 관련 바이러스를 포함한 당업계에 공지된 임의의 기술에 의해 이루어질 수 있다. 그후에, 이러한 재생 세포는 형질도입이 동소에서 계속되거나 개시될 수 있도록 시간 경과에 따라 유전자를 세포에 방출하고(하거나) 제시할 수 있는 유전자 전달 매체를 갖고 있는 운반체 물질과 함께 이식될 수 있다.

세포 및(또는) 그 세포를 함유하는 조직이 세포 및(또는) 조직을 수득한 환자가 아닌 환자에게 투여(예를 들면, 주사)될 때, 하나 이상의 면역억제제가 이식 거부반응을 감소시키기 위해, 바람직하게는 방지하기 위해 세포 및(또는) 조직을 받는 환자에게 투여될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "면역억제 약물 또는 약제"는 정상적인 면역 기능을 억제하거나 저해하는 제약 제제를 포함하는 것으로 의도된다. 본원에 개시된 방법에 사용하기에 적합한 면역억제제의 예로는 미국 특허 공개 2002-0182211호에 개시된 바와 같이, CTLA4 및 B7 경로를 통한 T-세포 및 B-세포의 결합을 저해하는 제제와 같은, T-세포/B-세포 동시자극 경로를 억제하는 제제를 포함한다. 바람직한 면역억제제는 시클로스포린 A이다. 다른 예로는 미오페닐레이트 모페틸, 라파마이신, 및 항흉선세포 글로불린이 있다. 한 실시양태에서, 면역억제약은 1종 이상의 다른 치료제와 함께 투여된다. 면역억제약은 투여 경로에 적합한 제제로 투여되며 목적하는 치료 효과를 얻는데 충분한 용량으로 대상에게 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 면역억제약은 본 발명의 재생 세포에 내성을 유도하기에 충분한 시간 동안 일시적으로 투여된다.

이들 실시양태에서, 재생 세포는 교반 장치와 같은 장치 및 본원에 기재된 관련 방법을 포함한 업계 인정된 방식에 의해 첨가제에 접촉되거나, 배합되거나, 혼합되거나 또는 첨가될 수 있다. 예를 들면, 요동, 역전, 압축 펄스화 또는 이동 롤러를 사용할 수 있다.

또다른 면에서, 세포군은 수용자에게 위치되고 마크로포어 바이오서저리, 인크.(MacroPoreBiosurgery, Inc.)에 의해 제조되는 것과 같은 재흡수성 플라스틱 외피 또는 다른 재료 및 관련 구성품에 의해 둘러싸여질 수 있다 (예를 들면, U.S. 특허 제6,269,716호; 5,919,234호; 6,673,362호; 6,635,064호; 6,653,146호; 6,391,059호; 6,343,531호; 6,280,473호 참조).

상기 모든 실시양태에서, 분리 및 농축된 재생 세포의 적어도 일부는 2001년 9월 14일자로 출원된 미국 가출원 제60/322,070호의 이익을 청구하는, 2002년 9월 12일자로 출원된 미국 출원 제10/242,094호(발명의 명칭: "PRESERVATION OF NON EMBRYONIC CELLS FROM NON HEMATOPOIETIC TISSUES")에 기재된 바와 같이 냉동보존될 수 있다.

프로세싱 말기에, 재생 세포는 생산 챔버로부터 수동으로 회수될 수 있다. 세포는 피하, 근육내 또는 환자 내의 표적 부위로 세포를 전달하게 하는 다른 기술에 의해 수용자에게 배치하기 위해 시린지와 같은 전달 장치에 주입될 수 있다. 즉, 세포는 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 환자에게 배치될 수 있다. 바람직한 실시양태는 바늘 또는 카테터에 의한 배치를 포함하며, 변형된 실시양태는 직접적인 외과적 이식에 의한 배치를 포함한다. 다른 실시양태에서, 세포는 그 세포를 환자에게 배치하는데 이용될 수 있는 용기, 시린지 또는 카테터 등 형태일 수 있는 생산 챔버로 자동 운반될 수 있다. 용기는 또한 추후의 사용을 위해 또는 냉동보존을 위해 세포를 보관하는데 사용될 수 있다. 모든 회수 방법은 멸균 방식으로 수행된다. 외과적 이식의 실시양태에서, 세포들은 본원에 기재된 예형된 매트릭스 또는 스캐폴드와 같은 첨가제와 관련하여 이용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태(예를 들면, 도 4에 나타낸 실시양태)에서, 시스템은 자동화된다. 또 다른 실시양태에서, 시스템은 자동화 구성품 및 수동식 구성품 둘다를 갖는다. 시스템은 재사용가능한 하드웨어 구성품 또는 모듈에 연결되거나 또는 그 위에 장착된 하나 이상의 일회용 구성품을 포함할 수 있다. 본 발명의 자동화 시스템은 시스템의 적당한 운영을 유발하는 스크린 디스플레이(도 16 참조)를 제공한다. 자동화 시스템은 시스템의 일회용 구성품의 적당한 셋업에 대한 절차 상태 및(또는) 단계별 설명서를 나타내는 스크린을 제공할 수 있다. 스크린은 또한 시스템 내의 문제점 또는 고장을 나타낼 수 있으며 적절한 경우 "문제점 해결" 가이드를 제공한다. 한 실시양태에서, 스크린은 예를 들어, 터치 스크린을 통해 사용자가 시스템 내에 변수를 입력하도록 하는 사용자 인터페이스 스크린이다.

부분 및 완전 자동화 시스템은 프로세싱 장치 (예를 들면, 마이크로프로세서 또는 개인용 컴퓨터) 및 사용자 입력을 기준으로 한 프로세서의 하나 이상의 단계를 진행하고 자동화하기 위해 시스템에 대한 제어 논리를 제공하는 관련 소프트웨어 프로그램을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 시스템의 하나 이상의 면은 프로세싱 장치에 존재하는 소프트웨어를 통해 사용자-프로그램가능할 수 있다. 프로세싱 장치는 읽기전용 메모리(ROM)의 하나 이상의 미리 프로그래밍된 소프트웨어 프로그램을 가질 수 있다. 예를 들면, 프로세싱 장치는 혈액을 프로세싱하기 위해 맞춰지는 미리 프로그래밍된 소프트웨어, 작은 부피의 재생 세포를 수득하기 위해 지방 조직을 프로세싱하기 위한 또다른 프로그램 및 더 큰 부피의 재생 세포를 수득하기 위해 지방 조직을 프로세싱하기 위한 또다른 프로그램을 가질 수 있다. 프로세싱 장치는 또한 필요한 재생 세포의 양, 프로세싱되는 조직의 유형, 필요한 프로세싱후 조작 유형, 치료 용도의 유형 등과 같은, 관련 정보의 사용자 입력을 기준으로 한 프로세스를 최적화하기 위해 사용자에게 적절한 변수를 제공하는 미리 프로그래밍된 소프트웨어를 가질 수 있다.

소프트웨어는 또한 시스템의 펌프 및 밸브를 제어하고; 적당한 활성화 서열 및(또는) 방향을 제어하고; 압력 센서로 봉쇄를 검출하고; 기전을 혼합하고, 부피 측정 기전을 이용하여 특정 경로를 따라 이동될 조직 및(또는) 유체의 양을 측정하고; 열 제어 장치를 이용하여 각종 성분의 온도를 유지하고; 분리 및 농축 과정을 시간 측정 및 소프트웨어 기전과 통합하여 특정 튜브 경로를 따라 유체 및 조직의 수신 및 송신과 같은 단계들의 자동화를 가능하게 할 수 있다. 프로세싱 장치는 또한 프로세싱되는 조직 유형 및(또는) 수거되는 세포군 또는 세포 아군, 및 수행될 절차의 유형 (예를 들면, 재생 세포 코팅된 골 이식을 이용한 골 치유 용도를 위한 세포의 프로세싱 또는 재생 세포로 증강된 지방 조직을 이용한 조직 개선)을 기준으로 하여 원심분리 속도를 제어할 수 있다. 프로세싱 장치는 또한 표준 병렬 또는 직렬 포트 또는 다른 컴퓨터 또는 네트워크와 교류하는 다른 수단을 포함할 수 있다. 따라서, 프로세싱 장치는 세워놓은 단독 유니트일 수 있거나 또는 본원에 기재된 추가의 프로세싱 방법을 위한 관련된 하나 이상의 추가의 장치일 수 있다.

소프트웨어는 예를 들어, 일회용 구성품의 로트 번호, 온도 및 부피 측정치, 조직 부피 및 세포수 변수, 효소 적용량, 인큐베이션 시간, 항등 연산자, 일자 및 시간, 환자 식별 등을 포함한 "운영 데이타(run data)"의 자동화 수집을 가능하게 할 수 있다. 장치의 바람직한 실시양태에서는, 바 코드 리딩 시스템과 같은 문자 인식 시스템이 프로세싱의 문서화의 일부로서 프로세싱 장치에 이들 변수 (예를 들면, 일회용 세트 로트 번호 및 만료일, 콜라게나제의 로트 번호 및 만료일, 환자/시료 식별자 등)의 데이타 입력을 가능하게 하도록 통합될 것이다. 이는 데이타 입력 에러에 대한 기회를 감소시킬 것이다. 그러한 바 코드 리딩 시스템은 USB 또는 당업계에 공지된 다른 인터페이스 포트 및 시스템을 이용하여 프로세싱 장치에 쉽게 포함될 수 있다. 이러한 식으로, 장치는 프로세스의 데이타 입력 및 문서화의 통합 제어를 제공할 것이다. 이들 변수의 출력 보고는 시스템의 프로그래밍된 연산의 사용자 정의 변수의 일부일 것이다. 이는 장치의 하드웨어의 프린터에 대한 인터페이스 출력 코넥터 (예를 들면, USB 포트) + 소프트웨어의 프린터 드라이버 또는 프린터 구성품 (하드웨어 및 드라이버)의 통합을 필요로 한다.

특정 실시양태에서, 본 시스템은 완전 자동 시스템이다. 예를 들어, 사용자가 먼저 프로세싱될 조직의 부피를 선택하고 시스템을 환자에게 부착시킬 수 있으며, 시스템은 자동적으로 필요한 조직을 흡입하고 추가의 사용자의 입력 없이 연속적으로 재생 세포를 분리 및 농축할 수 있다. 또한, 사용자는 요구되는 재생 세포의 부피를 입력하여 시스템이 필요한 조직량을 흡입하고 조직을 프로세싱하게 할 수 있다. 또한, 완전 자동 시스템은 (예를 들어 2개 이상의) 사용자 입력 변수, 예를 들어 세척 주기수, 원심분리 속도 등에 기초하여 재구성될 수 있는 시스템을 포함한다. 또한, 시스템은 특정 단계에서는 사용자의 개입 없이 작동하나 특정 과정이 발생하기 전에 사용자의 개입을 필요로 하는 반자동 모드로 작동될 수 있다. 다른 실시양태에서, 이 시스템은 사용자가 예정된 시간에 예정된 작동을 수행하도록 유도하는 설명을 하는 단일 통합 시스템이다. 예를 들어, 프로세싱 장치는 사용자로 하여금 시스템의 튜브, 챔버 및 다른 성분의 적절한 삽입에 필요한 단계를 거치게 할 수 있다. 따라서, 사용자는 작동 순서가 적절한 지를 확신할 수 있다. 이러한 시스템은 추가적으로 사용자가 과정 단계를 부주의하게 작동시키거나 종료하는 것을 방지하도록 각각의 작동 단계에 대한 확인을 필요로 할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 이 시스템은 튜브, 챔버의 올바른 삽입, 장애물의 부재 등을 확인하기 위한 자동화된 테스트를 개시할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 시스템은 시스템을 통한 조직 유동의 자동 제어를 통해 다수의 분리 및 농축 과정을 수행하도록 프로그래밍될 수 있다. 이러한 특징은, 예를 들어 환자의 수술 동안 중요할 수 있으며 이때 다르게는 소실될 조직이 시스템에 수집되고, 조직으로부터의 재생 세포는 분리되고 농축되어 환자에게 되돌려진다.

상기된 바와 같이, 시스템의 성분은 일회용일 수 있어 (본원에서는 "일회용 세트(들)"로 언급됨) 시스템의 부분들이 한 번 사용 후 처분될 수 있다. 이러한 수행은 환자의 조직과 접촉하는 표면이 사용 후 적절히 처분되는 것을 확실하게 할 수 있다. 예시적인 일회용 세트가 도 13에 예시된다. 바람직한 실시양태에서, 시스템의 일회용 성분은 사용이 쉽고 로딩이 쉬우며 많은 튜브 연결물 및 튜브 연결물의 복잡한 선별에 대한 필요성을 배제시키는 유용한 "기성품"일 수 있도록 예비-멸균되어 포장된다. 이러한 일회용 성분은 제작비가 비교적 저렴하여 이의 처분에 기인한 실질적 비용을 발생시키지 않는다. 하나의 실시양태에서, 일회용 시스템 (본원에서는 "일회용 세트(들)"와 상호교환적으로 언급됨)은 수집 챔버(20), 프로세싱 챔버(30), 폐기물 챔버(40), 생산 챔버(50), 필터 어셈블리(36), 시료 백(60) 및 관련 도관(12) 또는 튜브를 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 시스템의 일회용 세트에 대한 바람직한 실시양태에서, 수집 챔버(20) 및 프로세싱 챔버(30)은 경질 프레임에 하우징된 도관(12)로 연결된다. 또한, 프로세싱 챔버(30)의 회전 시일(seal) 네트워크 (도 7 및 8)는 동일한 경질 프레임에 하우징될 수 있다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 일회용 세트의 다양한 챔버 및 용기는 펌프, 밸브, 센서 및 시스템을 자동화하는 다른 장치가 사용자의 개입 없이 필요할 때 적절히 작동하거나 비작동하도록 시스템의 프로세싱 장치와 교류할 수 있는 필요한 인터페이스를 포함한다. 또한, 인터페이스는 시스템을 조립하는데 필요한 시간 및 전문기술을 감소시키고 시스템을 적합하게 조립하는 방법을 가리키고 사용자가 잘못 조립하는 것을 경계시킴으로써 실수를 줄인다.

본 발명의 대부분의 일회용 세트는 많은 공통 요소를 가질 것이다. 그러나, 당업자라면, 시스템의 상이한 적용에는 일화용 세트의 부분일 수 있는 추가의 성분이 필요할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 일회용 세트는 환자로부터 지방 또는 다른 조직을 수득하고 재생 세포를 환자에게 되돌리는데 적합한 하나 이상의 바늘 또는 주사기를 더 포함할 수 있다. 포함되는 바늘 및 주사기의 유형 번호 및 다양성은 프로세싱되는 조직의 유형 및 부피에 따를 것이다. 일회용 세트는 세척액 및 시스템에 사용되는 다른 프로세싱 시약을 보유할 하나 이상의 경질 또는 연질 용기를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 일회용 세트는 식염수, 효소 및 절차에 필요한 다른 처리 또는 대체 유체를 포함할 수 있다. 또한, 적합한 세척 용액, 재현탁 유체, 첨가제, 작용제 또는 이식 물질이 본 발명의 시스템 및 방법과 함께 사용하기 위한 일회용 세트에 제공될 수 있다.

본원에 기술되거나 달리 본 발명을 실시하는데 필요한 시스템 구성품, 장비 또는 공급물의 조합이 키트의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트는, 예를 들어 소량의 조직의 프로세싱을 고려한 바람직한 필터 매체를 포함하는 멸균 주사기 및 지방흡입 주사기를 위한 최적 길이 및 게이지의 바늘을 포함한다. 본 발명에 사용되거나 본 발명의 키트에 포함될 수 있는 다른 예시적 장비 및 공급물이 표 II 및 III에 열거되어 있다.

하기 표 II는 본 발명의 시스템 및 방법에 따라 지방 재생 세포를 수득하는데 사용될 수 있는 공급물의 예를 나타낸다.

기술(description)	시판자	수량	비고
10 ㎖ 주사기	Becton-Dickinson	필요에 따라 결정	선택적, 지방흡입에 사용
14GA 무딘 끝 바늘		필요에 따라 결정	선택적, 지방흡입에 사용
단일 혈액 팩 (600 ㎖)	Baxter Fenwal	1	주요 세포 프로세싱 백: 백은 라인 상의 스파이크 어댑터 및 2개의 자유 스파이크 포트를 가짐
커플러를 갖는 이동 팩(transfer bag)(150 ㎖)	Baxter Fenwal	1	쿼드 백 세트
커플러를 갖는 이동 팩 (1 L)	Baxter Fenwal	1	폐기물 백
시료 부위 커플러	Baxter Fenwal	2
0.9 % 식염수 (주입용)	Baxter Fenwal	1
14GA 뾰족한 바늘	Monoject	필요에 따라 결정	백에 지방흡입 조직을 첨가하기 위함
20GA 뾰족한 바늘	Monoject	3	콜라게나제를 첨가하고 PLA 세포를 제거하기 위함
0.2 μm 스터플립 (Sterflip) 필터	Milipore	1	콜라게나제를 여과하기 위함
테루플렉스 (Teruflex) 알루미늄 밀폐 클립	Terumo	4	일시적 튜브 밀폐를 위한 ME*ACS121
포비돈 요오드 프렙 패드	Triadine	필요에 따라 결정	10-3201
리베라제 H1 콜라게나제	Roche		절차 노트 1을 참조
TSCD 웨이퍼	Terumo	2	TSCD 멸균 튜브 웰더와 함께 사용하기 위한 ISC*W017

하기 표 III은 본원에 기술된 시스템 및 방법과 함께 사용될 수 있는 장비를 나타낸다.

기술	시판자	수량	비고
소발 레전드 T 이지 세트 원심분리기	Fisher Scientific	1	75-004-367
로터	Kendro/Sorvall	1	TTH-750 로터
로터 버킷	Kenro/Sorvall	4	75006441 라운드 버킷
150 ㎖ 백용 어댑터	Kendro/Sorvall	4	00511
혈장 익스프레서 (plasma expressor)	Baxter Fenwall	1	4R4414
튜브 밀폐기	Sebra	1	모델 1060
TSCD 멸균 튜브 웰더	Terumo	1	3ME*SC201AD
랩라인 열 라커 (LabLine Thermal Rocker)	LabLine	1	4637
'일회용' 플라스틱 지혈겸자-스타일 클램프	Davron	3
균형 백 세트		2	원심분리를 균형잡는데 사용되는 물-충전된 백
생물유해물 샤프 챔버 (Biohazard Sharps Chamber)		1
생물유해물 폐기물 챔버		1

시스템의 재사용가능한 구성품은 수집 챔버용 교반 기전, 펌프, 밸브 및 펌프 조절을 작동시키는 다양한 센서, 원심분리기 모터, 원심분리기 모터의 회전 프레임, 사용자 인터페이스 스크린 및 USB 포트, 연동 또는 도킹 장치 또는 일회용 세트가 재사용 하드웨어 성분 및 다른 관련 장치에 안전하게 부착되고 접속되도록 일회용 세트를 연결하는 배치물을 포함하거나, 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다. 예시적 재사용 구성품이 도 14에 예시된다. 바람직한 실시양태에서, 재사용 구성품은 재생 세포 조성물로부터 재생 세포를 분리 및 농축시키기 위한 수단, 예를 들어 회전 원심분리기를 포함한다. 이러한 실시양태에서, 재사용 구성품은 도 15A에 나타난 바와 같이 일회용 세트의 프로세싱 챔버(원심분리 챔버를 포함)의 일부에 연결되어 접속되게 고안된다. 재사용 구성품에서 재생 세포를 분리 및 농축시키기 위한 수단은 회전 원심분리기 만이 아니라 또한 회전 막 필터를 포함한 본원에 기술된 다른 원심분리도 포함할 수 있다. 또한, 재사용 구성품은 수개의 다른 조직 프로세싱 절차를 수행하고 따라서 시스템의 다양한 펌프 및 밸브를 선택적으로 작동시키기 위한 예비-프로그래밍된 소프트웨어를 포함하는 본원에 기술된 프로세싱 장치를 하우징할 수 있다. 또한, 프로세서는 공여자/환자 정보를 저장하거나, 정보 및 나중에 다운로드 또는 편집하기 위한 데이터를 프로세싱 또는 수집하는 데이터 저장 능력을 포함할 수 있다. 재사용 구성품은 다양한 일회용 세트와 함께 사용될 수 있다. 일회용 세트는, 재사용 구성품에 존재하는 프로세싱 장치가 일회용 세트의 다양한 구성품, 재사용 구성품의 다양한 구성품 및 다른 관련된 장치 및 시스템으로 및 이들로부터 신호를 제어하고, 즉 보내고 수신할 수 있는 방식으로 일회용 세트가 재사용 하드웨어 구성품에 안전하게 부착되고 접속되도록, 일회용 세트를 연결할, 예를 들어 연동 장치 또는 배치물을 통해 재사용 구성품에 연결된다.

하나의 실시양태에서, 시스템에 사용하기 위한 일회용 세트는 약 800 mL의 조직을 수용할 수 있는 수집 챔버(20); 수집 챔버(20)에서 세척 및 분해되는 약 800 mL 조직에 의해 생성되는 재생 세포 조성물을 처리할 프로세싱 챔버(30); 0.5 mL의 재생 세포를 수용할 수 있는 생산 챔버(50); 및 약 10 L의 폐기물을 수용할 수 있는 폐기물 용기(40)으로 구성된다. 이러한 실시양태에서, 하드웨어 장치는 24"L X 18"W X 36"H 보다 크지 않다. 일회용 세트 및 하드웨어 장치의 다양한 구성품에 대한 다른 크기는 필요에 따라 제작될 수 있고, 제한 없이 본 발명에 포함시키고자 한다.

시스템의 일회용 성분은 장치에 위치시키기가 쉽다. 상응하는 재사용 구성품과 함께 조립되는 일회용 세트에 대한 설명이 도 15A에 예시되어 있다. 이 시스템은 바람직하게는 부적절하게 로딩된 일회용 성분을 인지할 수 있도록 고안된다. 예를 들어, 각각의 일회용 세트의 성분은 튜브, 챔버 등을 시스템 내의 적절한 위치에 적당하게 정렬하고 삽입하기 위한 색으로 구분되는 마크를 가질 수 있다. 추가의 실시양태에서, 본원에 기술된 시스템은 휴대용 유니트이다. 예를 들어, 휴대용 유니트는 지방 조직이 수거된 한 위치에서 지방 조직을 수거할 또 다른 위치로 이동될 수 있다. 특정 수행에서, 휴대용 유니트는 환자의 병상에서 지방 조직을 수거하고 프로세싱하는데 적합하다. 따라서, 휴대용 유니트는 환자들 사이에서 이동될 수 있는 시스템의 일부일 수 있다. 따라서, 휴대용 유니트는 적소에서 고정되어 쉽게 자리를 잡고 절차 내내 안정하고 안전한 장소에서 편리한 위치로 사용될 수 있는 휠 위에 있을 수 있다. 다른 실시양태에서, 휴대용 유니트는 테이블 윗면과 같은 평평한 표면에서 설치 및 작동되도록 고안된다. 또한, 휴대용 유니트는 하우징 유니트에 포함될 수 있다. 휴대용 유니트는 행거, 훅, 라벨, 스케일 및 절차를 돕는 다른 장치로 추가로 구성될 수 있다. 원심분리기, 프로세싱 장치, 디스플레이 스크린과 같은 시스템에 대한 본원에 기술된 재사용 구성품 모두가 시스템의 휴대용 유니트에 장착될 수 있다.

또한, 재생 세포를 수득하기 위한 수동 실시양태가 본 발명의 범위에 속한다. 예를 들어, 하나의 실시양태에서, 지방 세포는 본원에 기술된 시스템, 장비 및(또는) 공급물의 구성품들을 조합하여 처리될 수 있다.

본 발명의 시스템의 수동 실시양태는, 예시이지 제한하고자 하는 것이 아닌, 하기 단계 및 정보에 따라 실시될 수 있다. 먼저, 지방 조직을 환자로부터 수집한다. 조직 회수 라인 또는 샘플링 부위 커플러를 개방시키고 스파이크를 600 ㎖ 채혈 백의 측면 포트에 삽입한다. 약 10 ㎖의 지방 조직을 무딘 캐뉼러를 통해 10 ㎖ 주사기에 수집한다. 무딘 캐뉼러를 비교적 뾰족한 바늘(14G)로 대체한다. 샘플링 부위를 요오드 와이프로 닦는다. 지방 조직을 샘플링 부위를 통해 600 ㎖ 백에 주입한다. 이어서, 주사기 및 바늘을 샵 챔버에 버린다. 충분한 조직이 백에 놓일 때까지 이들 단계를 반복한다. 환자 및 적용에 대한 임상적 특성에 기초하여 건별로 충분한 조직을 결정한다.

두번째로, 흡입 지방 조직을 세척한다. 예비-가온된 (37 ℃) 식염수 백을 작업 표면 위에서 훅으로 채운다. 블루 지혈겸자 클램프를 600 ㎖ 백과 스파이크 사이의 튜브에 위치시킨다. 클램프를 닫아 튜브를 밀봉한다. 600 ㎖ 백 상의 스파이크를 사용하여 식염수 백을 삽입한다 (이러한 세팅 시, 고무 격막을 통해 식염수 백을 삽입하기 위해 600 ㎖ 백 상의 바늘을 사용하고, 바늘을 삽입하기 전에 요오드로 격막을 닦는다). 블루 클램프를 풀어주어 약 150 ㎖의 식염수가 600 ㎖ 백에 들어가게 한다. 목적하는 부피의 식염수가 600 ㎖ 백에 들어갔을 때 블루 클램프를 닫는다. 600 ㎖ 백은 약 15초에 걸쳐 10 내지 15회 앞뒤를 바꾼다. 제 2 블루 클램프를 3 L 폐기물 백으로부터 스파이크에 이르는 튜브에 적용한다. 3 L 백 상의 스파이크를 사용해 600 ㎖ 백을 삽입한다. 600 ㎖ 백을 작업 표면 위에 거꾸로 매달고, 약 1분 동안 방치시킨다. 3 L 백에 이르는 블루 클램프를 풀어준다. 폐기물 유체를 3 L 백으로 유동시킨다. 조직을 튜브에 삽입하기 전에 유동을 정지시키기 위해 블루 클램프를 적용시킨다. 600 ㎖ 백을 작업 표면으로 낮춘다. 이러한 단계를 2회 이상 반복한다. 식염수 폐기물이 여전히 두드러지게 적색을 띠면, 제 3의 추가의 사이클이 지시된다. 열 밀폐기를 사용하여 3 L 폐기물 백과 600 ml 백 사이의 튜브를 밀폐시킨다. 밀폐는 튜브의 약 1/2 지점에서 이루어진다. 3 L 폐기물 백을 제거하고 버린다. 600 ㎖ 백을 작업 표면으로 되돌린다.

세번째로, 세척된 지방 조직을 분해시킨다. 식염수와 600 ㎖ 백 사이의 튜브 상의 블루 클램프를 풀어 약 150 ㎖의 식염수가 600 ㎖ 백에 들어가게 한다. 600 ㎖ 백 상의 샘플링 부위를 요오드 와이프로 닦는다. 콜라게나제를 샘플링 부위를 통해 600 ㎖ 백으로 주입한다. 1개의 콜라게나제 바이알을 마이크로웨이브 처리 외에 37 ℃ 수조 또는 등가물에서 해동시켜 콜라게나제를 준비한다. 22G 바늘을 갖는 1 ㎖ 주사기를 바이알에 삽입한다. 콜라게나제를 바늘로 끌어당긴다. 바늘을 제거하고, 0.2 μm 필터 및 제 2의 22G 바늘로 대체한다. 이어서, 콜라게나제를 0.2 μm 필터 및 바늘을 통해 주사기로부터 방출시킨다. 0.1 내지 0.2 Wunsch 유니트/㎖의 최종 콜라게나제 농도로 지방 조직의 분해를 수행한다. 가열 패드를 라커에 놓는다. 이러한 시간 동안, 여전히 부착되어 있는 식염수 백은 라커의 측면에 배치된다. 식염수 백에 이르는 튜브가 움직일 때 라커에 걸리지 않게 위치되도록 주의를 기한다. 가열 패드 제어기를 37 ℃로 고정한다. 600 ㎖ 백을 라커에 놓는다. 라커를 최대로 고정한다. 백이 안정한가를 확인하고 약 1시간 (55±10 분) 동안 요동시킨다.

네 번째로, 재생 세포 조성물을 회수한다. 백을 라커로부터 제거시킨다. 블루 클램프를 이전에 폐기물 백으로 이끌린 닫힌 튜브에 적용한다. 멸균 연결 장치를 사용해 쿼드 백 세트 (하기 지시에 따라 미리-제조됨)를 이전에 폐기물 백에 부착시킨 튜브에 부착시킨다. 쿼드 팩은 2개의 연결된 쿼드 팩으로 보일 수 있다. 2개의 팩으로의 튜브 분할을 확인하고, 튜브를 그 자신의 뒤로 접고, 금속 루프를 접힌 튜브 위로 (튜브의 2개의 조각 위로) 살짝 들여보낸다. 루프를 약 0.5 inch 아래로 미끄러지게 한다. 밴드에 형성된 주름은 튜브를 밀폐시킨다. 지혈겸자를 사용하여 닫힌 루프가 부분적으로 주름지게 한다. 루프는 프로세싱 동안 제거될 필요가 있으므로 너무 단단하게 주름지게 하지 않는다. 600 ㎖ 백을 작업 표면 위에 거꾸로 매달고, 약 3분 동안 방치한다. 쿼드 세트에 이르는 튜브 상의 블루 클램프를 풀어 세포 분획 (황색/오렌지색 지방층 아래의 층)을 쿼드 세트로 배출시킨다. 지방층이 튜브로 들어가는 것을 방지하도록 주의를 기한다. 이러한 과정 동안, 튜브를 수동으로 주름지게 하여 지방층이 튜브에 가까워질 때 흐름이 느려지게 할 수 있다. 이어서, 쿼드 백 세트에 이르는 튜브를 블루 클램프로 잠그고, 600 ㎖ 백을 작업 표면으로 되돌린 후, 식염수 백을 매단다. 식염수와 600 ㎖ 백 사이의 튜브 상의 블루 클램프를 풀어 약 150 ㎖의 식염수가 600 ㎖ 백으로 들어가게 한다. 600 ㎖ 백을 약 15 초에 걸쳐 10 내지 15회 앞뒤를 바꾼다. 이어서, 600 ㎖ 백을 작업 표면 위에 거꾸로 매달고, 약 3 내지 5분 동안 방치시킨다. 쿼드 세트에 이르는 튜브 상의 블루 클램프를 풀고, 세포 분획 (황색/오렌지색 지방층 아래의 층)을 쿼드 세트로 배출시킨다. 지방층이 튜브로 들어가는 것을 방지하도록 주의를 요한다. 예를 들어, 지방층이 튜브에 가까울 때 튜브를 수동으로 주름지게 하여 흐름을 지연시킬 수 있다. 쿼드 백 세트에 이르는 튜브를 블루 클램프로 밀폐시킨다. 이어서, 쿼드 세트로부터 600 ㎖ 백에 이르는 튜브를 가열 밀폐한다. 이어서, 600 ㎖ 백을 제거하고 버린다.

다섯 번째로, 재생 세포 조성물을 세척한다. 금속 클립을 2개의 충전 백 사이의 튜브에 놓아 튜브를 밀폐시킨다. 쿼드 세트를 저울에 놓는다. 물을 제 2의 "모형 (dummy)" 쿼드 세트에 가해 쿼드 세트를 균형잡는다. 쿼드 세트 및 균형잡힌 세트를 원심분리기의 반대편 버킷에 놓는다. 중공 필터를 위해, 세포를 세척하고, 백에 넣은 후, 백과 상술된 중공 섬유 필터 어셈블리 사이의 튜브를 밀폐시킨다. 연동 펌프를 사용하여, 유체를 필터 어셈블리를 통해 진행시키고, 세포 농축물을 다운스트림 말단의 백에 수집한다. 쿼드 세트 백이 압축되지 않고 직립하도록 주의를 요한다. 원심분리기를 10분 동안 400 x g에서 작동시킨다. 쿼드 세트를 원심분리기로부터 제거시키고, 혈장 익스프레서에 놓는다. 백의 상단에 있는 단단한 튜브가 뒤 판의 바로 상단에 있도록 백을 익스프레서에 위치시키는데 주의를 기한다. 백이 너무 높으면, 너무 많은 식염수가 보유될 것이며, 너무 낮으면, 튜브는 전방 플레이트의 잠그는 능력을 방해하여 다시 너무 많은 식염수가 보유될 것이다. 블루 클램프를 충전 쿼드 세트로부터 비어있는 쿼드 세트에 이르는 각각의 라인에 적용한다. 금속 루프 및 블루 클램프를 제거하여 상등액이 비어있는 쿼드 세트로 흐르게 한다. 가능한 한 많은 식염수를 짜내고, 세포 펠릿이 제거되지 않도록 주의를 요한다. 각각의 상등액 포함 백에 이르는 튜브를 가열 밀폐시킨다. 상등액을 포함하는 폐기물 백을 제거한다. 각각의 세포 포함 쿼드 세트 백에 이르는 튜브에 블루 클램프를 적용한다. 백을 혈장 익스프레서 바깥으로 꺼낸다. 멸균 연결 장치를 사용해 쿼드 팩에 이르는 튜브를 식염수 백에 연결한다. 하나의 쿼드 세트 백에 이르는 블루 클램프를 제거하여 약 150 ㎖의 식염수를 백으로 유동시키고, 이어서 클램프를 재적용하여 식염수의 유동을 정지시킨다. 이어서, 충전 쿼드 세트 백을 약 15초에 걸쳐 약 10 내지 15회 앞뒤를 바꾼다. 이어서, 비어있는 쿼드 세트 백에 이르는 블루 클램프를 제거하고, 충전 백의 내용물 모두를 비어있는 백으로 배출시킨다. 금속 루프 클램프를 재적용하여 2개의 쿼드 세트 백 사이의 튜브를 밀폐시킨다. 이어서, 튜브를 열 밀폐시키고, 식염수 백을 제거한다. 충전 쿼드 세트 백을 약 15초에 걸쳐 약 10 내지 15회 앞뒤를 바꾼다. 또 다른 모형 쿼드 세트를 균형잡히게 놓고, 세포 쿼드 세트와 재균형을 맞춘다. 이어서, 쿼드 세트 백 (하나는 충전되고, 하나는 비어있음)이 압축되지 않고 직립하도록 원심분리기에 놓는다.

원심분리기를 약 400 x g에서 10분 동안 작동시킨다. 이어서, 쿼드 세트를 원심분리기로부터 제거하고, 백의 상단에 있는 단단한 튜브가 바로 뒤 판의 상단에 있도록 혈장 익스프레서에 조심스럽게 놓는다. 백이 너무 높으면 너무 많은 식염수가 보유되고, 너무 낮으면 전방 플레이트의 잠그는 능력을 방해하여 다시 너무 많은 식염수가 보유될 것이다. 금속 루프를 제거하여 재생 세포 펠릿이 제거되지 않도록 주의를 하면서 충전 백으로부터 비어있는 백으로 모든 상등액을 짜낸다. 백 사이의 튜브를 밀폐하고, 충전 (폐기물) 백을 제거하고 버린다. 이어서, 새로운 샘플링 부위 커플러를 나머지 백에 삽입한다. 이어서, 세포 펠릿의 세포를 나머지 식염수에 재현탁시켜 (존재하는 경우) 재생 세포의 농축물을 수득한다. 재현탁은 백을 적당히 조작 (예를 들면, 짜기 및 문지르기)하여 수행될 수 있다.

본 발명을 구체화하는 시스템의 특정 예가 도 4에 나타나 있다. 도 4는 환자에 재주입하기에 적합한 조직, 예로 지방 조직으로부터의 재생 세포를 분리 및 농축시키기 위한 자동 시스템 및 방법을 설명한다. 도 4에 나타낸 시스템의 특정 실시양태에서, 시스템은 환자로부터 일정량의 조직을 흡입하기 위한 자동화된 단계를 추가로 포함한다. 도 4에 나타낸 시스템은 도 15A에 나타낸 시스템의 자동화된 실시양태에 도달하도록 도 14에 나타낸 시스템의 재사용 구성품에 연결되는 도 13에 나타낸 일회용 세트로 구성된다. 일회용 세트는, 재사용 구성품에 존재하는 프로세싱 장치가 일회용 세트의 다양한 구성품, 재사용 구성품의 다양한 구성품 및 다른 관련된 장치 및 시스템으로 및 이들로부터 신호를 보내고 수신할 수 있는 방식으로 재사용 세트가 재사용 하드웨어 성분에 안전하게 부착되고 조화되도록, 일회용 세트를 재사용 구성품에 연결하는, 예를 들어 연동 또는 도킹 장치 또는 배치물을 통해 재사용 구성품에 연결된다.

사용자는 일회용 세트를 재사용 구성품에 연결하고, 사용자 인터페이스를 이용해 특정 변수, 예를 들어 수집되는 조직의 부피를 입력하며, 시스템을 환자에게 부착시킬 수 있으며, 시스템은 예비-프로그래밍되고/되거나 사용자 입력된 변수를 이용해 연속 순서로 도 4에 나타낸 모든 단계를 자동으로 수행한다. 하나의 이러한 순서가 도 15B에 예시된다. 다르게는, 조직은 사용자에 의해 환자로부터 수동으로 흡입되고 프로세싱, 즉 재생 세포의 분리 및 농축을 위해 시스템으로 운반될 수 있다.

구체적으로, 도 4에 나타낸 바와 같이, 조직, 예를 들면 지방 조직은 도관(12)를 사용해 환자로부터 빼내어 수집 챔버(20)에 도입될 수 있다. 도 4의 수집 챔버에대한 보다 상세한 설명이 도 5에 나타나 있다. 도 5에 나타난 바와 같이, 수집 챔버(20)은 표준 캐뉼라를 사용한 조직 제거를 용이하게 하는 진공 라인(11)로 구성될 수 있다. 사용자는 이 시점에서 예상된 조직의 부피를 수집 챔버(20)에 들여보낼 수 있다. 조직, 식염수 및 다른 작용제를 무균 방식으로 조직에 첨가시키는 닫힌 유체 경로의 일부인 입구 포트(21)을 통해 조직을 수집 챔버(20)에 도입한다. 이 시스템의 광센서, 예를 들면 센서(29)는 수집 챔버(20)에 사용자가 입력한 조직의 부피가 존재하는가를 검출할 수 있다. 특정 실시양태에서, 수집 챔버(20)에 사용자 입력보다 적은 조직이 존재하는 경우, 사용자는 수집 챔버(20)에 존재하는 조직의 부피로 프로세싱을 시작할 것인지를 선택할 것이다. 특정 실시양태에서, 환자로부터 제거된 조직의 일부를 사용자 인터페이스를 이용하는 사용자 입력을 통해 작동될 수 있는 도관을 통해 펌프, 예를 들면 연동 펌프를 사용해 시료 챔버(60)으로 유도할 수 있다.

센서(29)는 조직을 세척하고 분리시키는데 필요한 단계를 작동하도록 재사용 구성품에 존재하는 프로세싱 장치에 신호를 보낼 수 있다. 예를 들어, 프로세싱 장치는 자동 밸브 및 펌프를 사용해 수집되는 조직의 부피에 기초하여 미리 맞춰진 부피의 세척제를 도입할 수 있다. 이러한 사이클은 광센서가 유출액이 충분히 맑아 목적하지 않은 물질이 없다는 것을 결정할 때까지 수집 챔버에서 반복된다. 예를 들어, 수집 챔버(12b) 또는 (12d)에서 밖으로 나온 도관을 따른 광센서(29)가 목적하지 않은 물질이 제거되었다는 것을 검출하고, 필요한 밸브를 잠그고 다음 단계를 개시하도록 프로세싱 장치에 신호를 보낼 수 있다.

다음으로, 프로세싱 장치는 수집되는 조직의 부피에 기초하여 미리-프로그래밍된 양의 분리제를 도입할 수 있다. 또한, 프로세싱 장치는 수집되는 조직의 초기 부피 또는 사용자 입력에 기초하여 예정된 시간 동안 수집 챔버에서 조직을 교반하도록 작동할 수 있다. 도 4에 나타낸 실시양태에서, 일단 분리제, 예를 들어 콜라게나제가 콜라게나제 공급원 (24)를 통해 수집 챔버에 첨가되면, 수집 챔버(20)에 있는 모터가 프로세싱 장치를 통해 작동된다. 모터는 자석 교반기 및 패들형 장치 (하나 이상의 패들 (25a)가 수집 챔버(28)에 전치 필터의 필터 케이지 (27)에 단단히 부착된다)로 구성된 회전 축(25)를 작동시킨다. 패들은 재생 세포가 조직으로부터 분리되도록 분리제의 존재 하에 흔든다.

수집 챔버(20)의 용액을 예정된 시간 동안 가라앉힌다. 용액의 부유 부분을 용액의 상단으로 올린다. 일단 예정된 시간이 경과하면, 필요한 밸브 및 펌프를 프로세싱 장치로 작동시켜 비-부유 부분을 폐기물 챔버(40)으로 제거한다. 수집 챔버(12b) 또는 (12d)에서 밖으로 나온 도관을 따른 광센서(29)가 용액의 부유 분획물이 폐기물 챔버(30)으로 전달되려고 함을 검출할 수 있을 때까지, 폐기물 챔버(40)으로의 수송을 계속한다. 예를 들어, 수집 챔버(12b) 또는 (12d)에서 밖으로 나온 도관을 따른 광센서(29)는 목적하지 않는 물질이 제거되었다는 것을 검출하고, 필요한 밸브를 잠그도록 프로세싱 장치에 신호를 보낼 수 있다.

이때, 용액의 비-부유 분획물, 즉 재생 세포 조성물은 프로세싱 챔버(30)으로 이동된다. 이는 필요한 밸브 및 연동 펌프를 사용해 수행된다. 특정 실시양태에서, 재생 세포 조성물의 프로세싱 챔버(30)으로의 전달 전에, 추가 부피의 식염수를 수집 챔버(20)에 잔류하는 용액의 부유 분획물에 가할 수 있다. 또 다른 세척 사이클을 반복할 수 있다. 이러한 사이클 후, 용액을 가라앉히고, 비-부유 분획물 (재생 세포를 포함)을 프로세싱 챔버(30)으로 운반하고, 부유 분획물을 폐기물 챔버(40)으로 배출시킨다. 추가의 세척 사이클을 사용해 모든 분리된 재생 세포의 프로세싱 챔버(30)으로의 운반을 최적화한다.

일단 재생 세포 조성물이 도관(12)에 의해 프로세싱 챔버(30)으로 운반되면, 조성물은 농축 단계를 시작하기 전에 하나 이상의 추가의 세척 단계를 거칠 수 있다. 이는 수집 챔버(20)으로부터 폐기물 및 잔류 오염물을 확실히 제거시킨다. 유사하게, 농축 단계에 이어서, 재생 세포 조성물은 하나 이상의 추가의 세척 단계를 거쳐 잔류 오염물을 제거시킬 수 있다. 목적하지 않는 물질은 동일한 방식으로, 즉 상술된 바와 같이 프로세싱 장치로부터의 신호를 통해 밸브 및 펌프를 조절하여 프로세싱 챔버(30)으로부터 폐기물 챔버(40)으로 제거될 수 있다.

도 4에 나타낸 프로세싱 챔버(30)의 다양한 실시양태가 후술된다. 도 4에 나타낸 프로세싱 챔버(30)은 원심분리 챔버의 형태이다. 도 4의 프로세싱 챔버에 대한 상세한 설명이 도 7 및 8에 나타나 있다. 이러한 프로세싱 챔버(30)은 일반적으로 외부 하우징(30.2), 하나 이상의 시일(30.3), 하나 이상의 베어링(30.4) 및 프로세싱 챔버를 시스템의 재사용 구성품에 존재하는 원심분리 장치에 연결하기 위한 부착점(30.6)을 포함하는 회전 시일 네트워크(30.1); 회전 시일 밖으로 연장되고 각각 말단에 있는 원심분리 챔버(이는 하나 이상의 포트(52) 및 생산 챔버(50)을 수동으로 재위치시키기 위한 하나 이상의 핸들로 구성된 프레임 (53)에 하우징된 생산 챔버(50)의 형태이다)에서 끝나는 도관 형태의 하나 이상의 유체 경로(30.5)으로 구성된다.

회전 시일 네트워크(30.1)은 프로세싱 챔버의 유체 경로가 멸균 상태로 유지될 수 있도록 하기 위해 포함된다. 또한, 프로세싱 챔버의 유체 경로는 프로세싱 챔버의 원심분리 챔버가 돌고 있더라도 언제든지 (예를 들어, 작용제 또는 세척 용액을 가하기 위해) 멸균 방식으로 접근될 수 있다.

도 7 및 8에 나타낸 회전 시일 네트워크(30.1)은 2개 이상의 베어링(30.4), 3개 이상의 립 시일(30.3) 및 외부 하우징(30.2)로 구성된 회전 축을 포함한다. 이러한 실시양태에서, 베어링(30.4)는 본원에서 레이스 (race)로 언급되는 외부 및 내부 축(나타내지 않음)을 포함한다. 이들 레이스는 정확한 기초 구체에 의해 분리될 수 있다. 베어링을 포함한 레이스 및 구체는 바람직하게는 체액과 접촉하기에 적합한 물질로 제조되거나 체액과 접촉하는데 적합한 물질로 코팅된다. 바람직한 실시양태에서, 레이스 및 구체는, 예를 들어 실리콘 니트리드 또는 산화 지르코니아를 사용하여 제조된다. 또한, 이러한 실시양태에서, 3개의 립 시일은 둥근 "U" 형태의 채널 (나타내지 않음) 및 둥근 스프링 (나타내지 않음)으로 구성된다. 둥근 "U" 형태의 채널은 바람직하게는 회전 시일 네트워크(30.1)의 회전 축을 갖는 누출 방지 접합부가 형성되도록 연질 재료를 사용하여 제조된다. 추가로, 립 시일은 바람직하게는 프로세싱 챔버를 통해 유동하는 재생 세포 조성물로부터의 압력에 의해 시일 어셈블리가 증가된 장력으로 회전 축을 갖는 접합부를 죄는 방식으로 배향된다. 시일은 회전 시일 네트워크(30.1)의 외부 하우징(30.2)에 있는 홈을 맞물리게 하기 위해 필요한 경우 펼쳐지고(지거나) 접을 수 있는 하나 이상의 둥근 클립 (나타내지 않음)에 의해 제 위치에 단단히 접합될 수 있다. 회전 시일 네트워크(30.1)에 의해 또는 인접해서 발생되는 열은 통로를 통해 이동되는 용액 중의 세포가 분해되는 것을 방지하기 위해 조절되어야 한다. 이는, 예를 들어 회전 축을 제작하기 위해 경성 재료를 선택하고, 시일과 접촉하는 회전 축 영역을 닦고 회전 축과 시일 사이의 접촉을 최소화함으로써 달성될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 회전 시일 네트워크(30.1)은 단일 고무 시일(30.3) 및 공기 개스킷 (나타내지 않음)으로 구성된다. 이러한 시일 및 개스킷은 구불구불한 경로를 시스템의 멸균성을 저하시킬 수 있는 생물학적 물질에 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 회전 시일 네트워크(30.1)은 각각의 유체 경로를 분리시키는 다수의 스프링 로딩된 시일(30.3)으로 구성된다. 시일(30.3)은 멸균되고 윤활제 없이 회전 축을 밀폐시킬 수 있는 물질로 제작된다. 또 다른 실시양태에서, 회전 시일 네트워크(30.1)은 상이한 유체 경로를 만들어 시스템의 회전은 견디나 세포 분해는 일으키지 않을 수 있는 한 쌍의 세라믹 디스크 (나타내지 않음)로 구성된다. 또 다른 실시양태에서, 유체 경로는 유연하며, 프로세싱 챔버를 감고 푸는 것이 가능하다. 이는 유연한 유체 경로가 2 회전하는 프로세싱 챔버(30)에 대해 1회전씩 회전하게 함으로써 달성된다. 이는 시일을 함께 회전하는 필요성을 배제시킨다.

재생 세포 조성물은 회전 시일 네트워크(30.1)의 회전 축을 통한 유체 경로를 따라 수집 챔버(20)으로부터 펌핑되고, 최소한 2개의 유체 경로(30.5) (각각은 프로세싱 챔버(30)의 중심 축으로부터 바깥으로 퍼지며 프로세싱 챔버(30)의 외부 말단 근처, 즉 생산 챔버(50) (도 7 및 8)를 하우징하는 원심분리 챔버 내에서 끝난다)로 분할된다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 프로세싱 챔버(30)은 도 7 및 8에 나타낸 바와 같은 2개 이상의 생산 챔버(50)으로 구성된다. 이들 생산 챔버(50)은 프로세싱 (50) 동안 하나의 배향으로 있고(30.7) 농축된 재생 세포의 회수를 위해 또 다른 배향으로 있도록(30.8) 위치된다. 예를 들어, 생산 변화로 프로세싱 동안 하나의 각으로 기울고 세포 회수에 대해 또 다른 각으로 기운다. 세포 회수 각은 프로세싱 각보다 수직이다. 생산 챔버(50)의 2개의 위치는 프로세싱 챔버(30)의 외부로 돌출하는 핸들 (53)을 통해 수동으로 조작될 수 있다. 재생 세포는 이들이 회수 배향(30.8)으로 있을 때 주사기를 사용해 생산 챔버로부터 수동으로 회수될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 유체 경로(30.5)는 프로세싱 챔버의 외부에서 갈라져 프로세싱 챔버(30)의 바깥 말단과 연결되도록, 즉 생산 챔버(50) (나타내지 않음)를 하우징하는 원심분리 챔버 내에 있도록 제작된다. 이러한 실시양태에서, 다량의 재생 세포 조성물 및(또는) 첨가제, 용액 등이 원심분리 챔버 및(또는) 생산 챔버에 직접적으로 운반될 수 있다.

도 4 및 7 내지 9를 참조하여 살펴보면, 수집 챔버(20)와 프로세싱 챔버(30) 사이에 펌프(34) 및 하나 이상의 밸브(14)가 제공될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 밸브(14)는 전기 기계적 밸브이다. 또한, 압력 센서(29)와 같은 센서가 프로세싱 챔버(30) 및 수집 챔버(20)과 일렬로 제공될 수 있다. 밸브, 펌프 및 센서는 시스템의 농축 단계를 자동화하기 위해 재사용 구성품 (도 14)에 존재하는 프로세싱 장치와 협력하여 작동한다.

센서는 원심분리 챔버에서 재생 세포 조성물의 존재를 검출하고 시스템의 프로세싱 장치와 통신하여 원심분리 장치를 작동시킨다. 이어서, 재생 세포 조성물은 최초로 수집된 조직의 양 및(또는) 사용자 입력에 기초하여 미리-프로그래밍된 시간 동안 미리-프로그래밍된 로드를 받는다. 특정 실시양태에서, 이러한 단계는 자동적으로 또는 사용자 입력을 통해 반복될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 약 5분의 기간 동안 중력의 약 400배의 로드를 받는다. 생산 챔버(50)은 외부 양극단의 챔버가 조밀한 입자 및 세포를 위한 작은 저장소를 형성하도록 제작된다. 생산 챔버(50)은 '세포 펠릿'이라 불리는 조밀한 입자를 보유하며, 보다 가벼운 상등액은 유체 경로, 예를 들어 회전 시일 네트워크(30.1)의 축을 따르는 유체 경로를 통해 제거되고 회전 시일 네트워크(30.1)를 통해 프로세싱 챔버(30)의 중심에 있는 저점으로부터 폐기물 용기(40)으로 이동시킨다. 밸브(14) 및 펌프 (34)는 프로세싱 장치에 신호를 보내어 생산 챔버(50)에 존재하는 세포 펠릿을 흐트리지 않으면서 폐기물 용기(40)으로 상등액을 제거시키는 단계를 작동시킨다.

도 4에 나타낸 시스템을 사용하여 수득되는 세포 펠릿은 본 발명의 농축된 재생 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상등액은 제거되어 폐기물 챔버(40)에 보내진 후, 유체 경로(30.5)는 추가의 용액 및(또는) 다른 첨가제와 함께 원심분리 후 형성되는 세포 펠릿을 재현탁하는데 사용될 수 있다. 세포 펠릿을 이러한 방식으로 재현탁시켜 재생 세포를 추가로 세척함으로써 목적하지 않는 단백질 및 화합물을 제거하고 세포로의 산소 유동을 증가시킨다. 생성된 현탁물을 약 5분의 또 다른 기간 동안 중력의 약 400배의 또 다른 로드를 받게 될 수 있다. 제 2의 세포 펠릿을 형성하고 생성된 상등액을 폐기물 챔버(40)으로 제거한 후, 상술된 방식의 최종 세척을 식염수 또는 다른 적합한 완충 용액으로 수행할 수 있다. 이러한 반복된 세척을 수회 수행하여 재생 세포 용액의 순도를 향상시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 식염수는 프로세싱을 향상시키는데 필요한 것으로 간주되는 단계에서 첨가될 수 있다. 도 4에 나타낸 시스템을 이용하여 수득되는 재생 세포의 농축은 수집되는 조직의 양, 환자의 나이, 환자의 프로필 등에 따라 다양할 수 있다. 예시적 수율이 표 I에 제공되어 있다.

생산 챔버(50)을 세포 제거에 적합한 배향으로 위치시킨 후, 적합한 주사기를 사용해 생산 챔버(50)에 존재하는 최종 펠릿을 무균적으로 회수할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 최종 펠릿은 제거 및 저장되거나 필요한 경우에 사용될 수 있는 생산 챔버(50)에 있는 용기로 자동적으로 이동될 수 있다. 이러한 용기는 적합한 형태 또는 크기일 수 있다. 예를 들어, 용기는 주사기일 수 있다. 특정 실시양태에서, 생산 용기 (50) 자체는 (자동적으로나 수동적으로) 열 밀폐되고 이후의 회수 및 환자로의 재주입을 포함한 상술된 바와 같은 치료적 용도에 재생 세포를 사용하기 위해 프로세싱 챔버의 다른 성분으로부터 분리될 수 있다. 또한, 세포는 생산 챔버로부터 회수 전 또는 제 2 시스템 또는 장치로의 전달 후 본원에 기술된 바와 같이 추가 프로세싱될 수 있다. 도 14에 나타낸 재사용 구성품은 필요한 경우 추가의 프로세싱을 위해 하나 이상의 추가의 시스템 또는 장치에 연결되도록 제작된다.

본원에 기술된 바와 같이, 본 발명의 시스템 및 방법을 이용하여 수득된 재생 세포는 실시예에 기술된 바와 같은 특성에 기초하여 PVD 및 관련 질환 및 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 재생 세포는 새로운 혈관 형성을 자극하는 성장 인자를 합성 및 분비하는 능력, 세포 생존 및 증식을 자극하는 성장 인자를 합성 및 분비하는 능력 및 새로운 혈관 형성에 직접적으로 참여하는 세포로 증식 및 분화하는 능력을 갖는다. 따라서, 본 발명의 한 면에서, 재생 세포는 본 발명의 시스템 및 방법을 이용하여 공여자의 지방 조직으로부터 추출되고 본원에서 입증된 하나 이상의 기전을 통해 폐색된 혈관에 대한 치료적 이점을 유도하는데 사용된다. 바람직한 실시양태에서, 세포는 투여/이식될 사람의 지방세포로부터 추출되어 이식물에 대한 항원성 및(또는) 면역원성 반응과 관련된 잠재적 합병증을 감소시킨다. 환자는 의사 또는 다른 임상 부양자에 의해 수행되는 하나 이상의 절차 (환자의 건강 이력, 신체 검사 및 객관적 자료)에 의해 PVD를 검토하기 위해 통상적으로 평가된다.

하나의 실시양태에서, 수거 절차는 환자를 PVD 또는 관련된 장애의 치료와 관련하여 혈액 응고를 감소시키도록 고안된 제품으로 처리하기 전에 수행된다. 그러나, 특정 실시양태에서, 환자에게는 수거 절차 이전에 아스피린이 투여될 수 있다. 또한, 하나의 바람직한 방법은 시도된 절차 이전에 지방 조직을 수집하는 것을 포함한다. 그러나, 당업자라면 이해할 수 있는 바와 같이, 수집 시간은 다양할 수 있으며, 특히 환자의 안정성, 환자의 응고 프로필, 부양자 이용가능성 및 품질 보호 표준을 포함한 몇가지 요소에 좌우될 것이다. 궁극적으로, 수집 시간은 병에 걸린 환자를 보호할 책임이 있는 전문가에 의해 결정될 것이다.

환자로부터 수집되는 지방 조직의 부피는 약 0 cc 내지 약 2000 cc, 일부 실시양태에서는 약 3000 cc 이하로 다양할 수 있다. 제거되는 지방의 부피는 환자마다 다르며, 이로 제한되지 않고 나이, 신체 습관, 응고 프로필, 혈액역학적 안정성, 질병의 중증도, 공동-사망률 및 의사의 선호도를 포함한 다양한 요소에 좌우될 것이다.

세포는 PVD가 발생한 상황의 환자에 예를 들어 주입으로 투여될 수 있다. 세포는 먼저 추출되고 냉동보존 방식으로 저장되거나, 필요 시 또는 그 즈음에 추출될 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 세포는 예를 들어 주입으로 환자에게 투여되거나, 예를 들어 주입으로 손상 조직에 직접적으로 적용되거나, 세포를 추가로 정제하거나 변형하거나 자극하거나 달리 변화시키는 추가의 프로세싱 또는 다음의 추가의 절차없이, 예를 들어 주입으로 손상된 조직의 부근에 적용될 수 있다. 예를 들어, 환자로부터 수득된 세포는 이를 환자에게 투여하기 전에 세포를 배양하지 않고 이를 필요로 하는 환자에게 투여 (예를 들면, 주입)될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 지방 조직의 수집은 환자의 병상에서 수행될 수 있다. 혈액 역학 모니터링을 이용해 환자의 임상 상태를 모니터링할 수 있다.

본 발명에 따라, 재생 세포는 환자의 지방 조직을 수거한 직후 환자에게 전달될 수 있다. 예를 들어, 세포는 재생 세포의 조성물을 수득하기 위한 지방 조직의 프로세싱 직후 투여될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 전달 시간은 환자로 재주입될 세포가 본원에 기술된 바와 같이 추가의 변형, 정제, 자극 또는 다른 조작을 받는 경우 상대적으로 길어질 수 있다. 또한, 재생 세포는 수회 투여될 수 있다. 예를 들어, 재생 세포는 연장된 기간 (예를 들면, 시간)에 걸쳐 연속적으로 투여되거나 장기간에 걸친 다수의 볼루스 주입으로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포의 초기 투여는 약 12시간 내, 예를 들어 6시간 내에 투여될 것이며, 하나 이상의 세포 용량이 12시간 간격으로 투여될 것이다.

환자에게 투여될 세포의 수는, 지방 조직 프로세싱 후, 예를 들어 세포 수율에 관련될 수 있다. 총수의 세포 중 일부는 나중에 사용하기 위해 보유되거나 냉동 보존될 수 있다. 또한, 전달되는 용량은 세포의 환자로의 전달 경로에 따를 것이다. 본 발명의 하나의 실시양태에서, 환자에 전달될 재생 세포의 수는 약 5.5 x 10⁵ 세포인 것으로 예측된다. 그러나, 이러한 수는 목적하는 치료 효과를 달성하는 크기로 조절될 수 있다.

또한, 세포는 의도된 치료 효과를 향상시키거나 조절하거나 유도할 첨가제와 함께 적용될 수 있다. 예를 들어, 하나의 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같이, 세포는 항체-매개된 포지티브 및(또는) 네가티브 세포 선별을 이용해 더욱 정제하여 효능을 증가시키거나, 사망률을 감소시키거나 절차를 편리하게 하도록 세포군을 농축시킬 수 있다. 유사하게, 세포는 이식 세포를 지지하고(하거나) 운명을 유도함으로써 생체내 조직 조작을 용이하게 하는 생체적합성 매트릭스와 함께 적용될 수 있다. 동일한 방식으로, 세포는 이에 의해 제공되는 치료적 반응을 증진시킬 것으로 믿어지거나 의도되는 유전자 산물을 발현하도록 유전자 조작 후 투여될 수 있다. 조작의 예로는 혈관신생 또는 혈관형성을 증진시키는 인자 (예를 들어, VEGF)의 발현을 조절 (증가 또는 감소)하기 위한 조작을 포함한다. 또한, 세포는 본원에 기술된 바와 같이 이식 전에 스캐폴드 소재에서 세포 배양을 할 수 있다.

하나의 실시양태에서, 세포를 의도된 이익을 위한 부위에 간접적으로 투여하는 것이 바람직하다. 이는 말초 정맥 내 주입을 통해 이루어질 수 있다. 당업자에게 공지된 투여 경로는, 이로 제한됨이 없이, 정맥 내, 동맥 내 투여를 포함하며, 전달 기전에 기초한 혈관 내 카테터를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.

세포는 단일 볼루스로, 느린 주입으로, 또는 수 시간 또는 세포가 적절히 저장되는 경우엔 수 일 또는 수 주 간격의 시차적인 적용을 통해 주입될 수 있다. 상술된 바와 같이, 세포는 또한 허혈의 병에 걸린 조직의 영역에 직접적으로 전달되도록 카테터 설치를 이용해 적용될 수 있다. 말초 정맥 접근으로서, 세포는 단일 볼루스로 또는 다수의 작은 분취량으로 카테터를 통해 주입될 수 있다. 또한, 세포는 개방된 말초 우회 수술 시에 병든 조직에 직접적으로 적용될 수 있다.

하나의 실시양태에서, 전달 경로는 표준 말초 정맥 내 카테터 또는 중앙 정맥 카테터를 통한 정맥 내 전달을 포함할 것이다. 세포의 유동은 환자의 혈관계 내에 위치된 원근 벌룬의 순차적 팽창/수축에 의해 조절되어 세포의 융합 또는 세포의 치료적 작용을 증진시키는 일시적 비-유동 대역을 형성할 수 있다. 또한, 세포는 피하, 근육 내 및 설하 경로 단독 또는 하나 이상의 이들 방법의 조합을 통해 전달될 수 있다.

환자에게 투여되는 세포 용량은 수거되는 지방 조직의 양 및 (이용가능한 지방 조직의 양의 측정으로서) 공여자의 신체 질량 지수에 따를 것이다. 또한, 수거되는 조직의 양은 허혈의 분포 또는 병소 조직에 의해 결정될 것이다. 적용 사이에 적당한 세포 저장물을 갖는 다수 조직 수거물을 이용하거나 단일 수거물을 이용한 다수의 치료가 본 발명의 범위에 속한다.

프로세싱된 지방흡입물의 부분은 환자에게 투여하기 전에 저장될 수 있다. 단기간 저장 (6시간 미만 저장)을 위해, 세포는 영양 용액으로 보충하거나 또는 보충하지 않고 밀폐된 용기에서 실온 또는 그 이하에서 저장될 수 있다. 중간 기간 저장 (48시간 미만)은 바람직하게는 세포 부착을 방지하는 물질로 구성되거나 코팅된 용기 중의 등삼투압의 완충 용액 (예를 들면, 플라스말라이트(Plasmalyte)^®)으로 2 내지 8 ℃에서 수행된다. 장기간 저장은 바람직하게는 문헌(2002년 9월 13일에 출원된 공동 소유되고 양도된 PCT 출원 PCT/US02/29207호 및 2001년 9월 14일에 출원된 미국 가출원 60/322,070호, 이의 내용이 본원에 참조로 삽입됨)에 기술된 바와 같이 세포 기능의 보유를 증진시키는 조건 하에 적합한 냉동보관 및 저장에 의해 수행된다.

본 발명의 한 면에 따라, 환자에게 투여되는 지방-조직 세포는 성장 인자 전달 비히클로서 작용할 수 있다. 예를 들어, 세포가 말초 혈관 질환과 관련된 증후군을 완화시키기에 적합한 하나 이상의 성장 인자를 발현하도록 조작함으로써, 세포는 환자에게 투여되어 하나 이상의 성장 인자를 방출하도록 조작될 수 있다. 방출은 연장된 기간 동안 조절되는 방식으로 제공될 수 있다. 예를 들어, 병소 조직 영역에 인접하여 성장 인자의 양을 국소적으로 증가시키고(시키거나) 성장 인자의 양의 국소적 저하가 있도록 성장 인자가 펄스식 또는 주기적인 방식으로 방출되게 방출을 조절할 수 있다.

환자에게 투여되는 세포는 손상 또는 건강하지 못한 조직에 대해 기능의 회복을 도울 뿐만 아니라 손상된 조직의 재형성을 용이하게 한다. 세포 전달은, 이로 제한되지 않고 진료소, 진료 사무소, 투석 센터, 응급실, 병원, 집중 치료실, 수술실, 카테터 설치 슈트 및 방사선 슈트에서 수행할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 세포 전달 요법의 효과는, 이로 제한되지 않고 이중 초음파진단, 혈관조영 및 자기공명 혈관조영에 의해 측정되는 개선된 혈류; 증후군 (파행)의 감소; 허혈성 궤양의 치유; 신체 체적 변동 기록계로 측정되는 조직의 산소 함량의 증가; ABI(ankle-brachial index)의 개선에 의해 입증된다. 세포 요법의 효과는 절차 진행 후 수 일 내지 수 주의 경과에 걸쳐 명백해질 수 있다. 그러나, 유리한 효과는 절차 진행 후 수시간과 같이 조기에 관측될 수 있으며, 수년 동안 지속될 수 있다. 환자는 세포의 전달 전 및 전달 동안에 통상적으로 모니터링된다. 모니터링 절차는, 이로 제한되지 않고 응고 조사, 산소 포화 및 혈액 역학 모니터링을 포함할 수 있다.

하기 실시예는 이러한 기술이 적용되는 특정 상황 및 세팅을 입증하기 위해 제공된 것으로 본 발명의 범위 및 본 기술에 포함된 청구범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.

하기에 제시된 실시예에 사용되는 ACD 또는 재생 세포는 본 설명에 기술된 방법(들) 및(또는) 하기 문헌(2001년 12월 7일자로 출원된 미국 가출원 제60/338,856호의 우선권을 주장하는, 2002년 12월 9일자로 출원된 미국 출원 제10/316,127호 (발명의 명칭: "SYSTEMS AND METHODS FOR TREATING PATIENTS WITH PROCESSED LIPOASPIRATE CELLS"); 및 2002년 12월 9일자로 출원된 미국 출원 제10/316,127호 (발명의 명칭: "SYSTEMS AND METHODS FOR TREATING PATIENTS WITH PROCESSED LIPOASPIRATE CELLS")의 우선권을 주장하는, 2004년 6월 25일자로 출원된 미국 출원 제 호 (발명의 명칭: "SYSTEMS AND METHODS FOR SEPARATING AND CONCENTRATING REGENERATIVE CELLS FROM TISSUE"); 이들은 모두 일반 양도되고, 이들의 내용이 본원에 참조로 포함됨)에 기술된 방법(들)에 의해 얻어질 수 있다.

실시예 1: 재생 세포에 의한 혈관신생 성장 인자 VEGF의 발현

혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 혈관신생의 주요 조절자 중의 하나이다 (Nagy et al., 2003; Folkman, 1995). 또 다른 VEGF 부류인 태반 성장 인자도 혈관신생 및 동맥형성에 유사한 역할을 한다. 구체적으로, 야생형 (PlGF +/+) 세포의 PlGF 녹아웃(knock-out) 마우스로의 이식은 뒷다리 허혈로부터 빠른 회복을 유도하는 능력을 복구한다 (Scholz et al., 2003).

혈관재생 과정에 대한 혈관신생 및 동맥형성의 중요성을 고려하여, 본 발명 의 재생 세포에 의한 PlGF 및 VEGF 발현을 3명의 공여자로부터의 지방 재생 세포를 사용하여 ELISA 검정 (R&D Systems, Minneapolis, MN)으로 조사하였다. 한명의 공여자는 고혈당 및 타입 2 당뇨병 (마이크로혈관 및 마크로혈관 질환과 긴밀히 관련된 상태)의 병력을 가졌다. 각각의 공여자로부터의 재생 세포를 10 % FCS 및 5 % HS로 보충된 DMEM/F-12 배지에 1,000 세포/cm²로 평판 배양하고, 유착될 때까지 성장시켰다. 상등액 시료를 취해 PlGF 및 VEGF 단백질의 발현에 대해 검정하였다. 도 16A 및 16B에 나타난 바와 같이, 본 발명의 지방 재생 세포에 의해 VEGF (도 16A) 및 PlGF (도 16B)의 활발한 발현을 증명하였다.

별개의 연구로서, 정상적 성숙 마우스로부터의 배양된 재생 세포에 의해 분비되는 혈관신생 관련 사이토킨의 상대적 양을 측정하였다. 재생 세포를 10 % FBS로 보충된 알파-MEM에서 세포 유착을 지나 5일까지 배양하고, 세포 배양 배지를 수거하여 항체 어레이 분석 (RayBio^® Mouse Cytokine Antibody Array II (RayBiotech, Inc.))에 의해 평가하였다. 하기의 혈관신생 관련 성장 인자가 검출되었다: 혈관 내피 성장인자(VEGF), bFGF, IGF-II, 에오탁신, G-CSF, GM-CSF, IL-12 p40/p70, IL-12 p70, IL-13, IL-6, IL-9, 렙틴, MCP-1, M-CSF, MIG, PF-4, TIMP-1, TIMP-2, TNF-α, 및 트롬보포이에틴. 하기 혈관신생 관련 성장 인자 또는 사이토킨이 10 % FBS로 보충된 블랭크 대조군 배지에 비해 적어도 2배 증가하였다: 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 에오탁신, G-CSF, IL-6, MCP-1 및 PF-4.

이들 자료는 본 발명의 재생 세포가 다양한 어레이의 혈관신생 및 동맥형성 성장 인자를 발현한다는 것을 입증한다. 또한, 정상 환자와 동등한 수준으로 VEGF 및 PlGF를 발현한 당뇨병 환자는 당뇨병 환자도 자가 지방 재생 세포에 의한 혈관신생 요법을 위한 후보자가 될 수 있다는 것을 제시한다.

실시예 2: 혈관신생에 참여하는 세포군을 포함하는 재생 세포

내피 세포 및 이들의 전구체인 내피 선구 세포(EPC)가 혈관신생에 참여하는 것으로 공지되어 있다. EPC가 지방 재생 세포에 존재하는지를 결정하기 위해, 사람 지방 재생 세포를 EPC 세포 표면 마커, 예를 들어 CD-34에 대해 평가하였다.

ADC는 사람 피하 지방 조직의 효소적 분해에 의해 분리되었다. ADC (100 ㎕)를 0.2 % 태아 소 혈청(FBS)을 포함하는 포스페이트 식염수 완충액 (PBS)에서 인큐베이션하고, 사람 내피 마커 CD-31 (분화된 내피 세포 마커), CD-34 (EPC 마커) 및 다능성 세포에서 선택적으로 발현되는 사람 ABCG2 (ATP 결합 카세트 운반자)에 대한 형광 표지된 항체와 함께 4 ℃에서 20 내지 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 세척 후, FACSAria 분류기(Beckton Dickenson-Immunocytometry)에서 분석하였다. 이어서, FACSDiva 소프트웨어 (BD-Immunocytometry, CA)로 자료 획득 및 분석을 수행하였다. 그 결과 (나타내지 않음), 건강한 성인으로부터의 지방 재생 세포는 EPC 마커 CD-34 및 ABCG2를 발현하였으나 내피 세포 마커 CD-31은 발현하지 않았다. EPC 마커 CD-34 및 ABCG2를 발현하는 세포는 당뇨병 병력을 갖는 공여자로부터 유래된 재생 세포에서와 유사한 빈도로 검출되었다.

내피 세포 분화 배지에서의 배양 후 사람 지방 재생 세포에서의 EPC의 빈도를 측정하기 위해, 재생 세포를 피브로넥틴-코팅된 플레이트에 평판 배양하고, 3일 동안 내피 세포 배지에서 배양하여 성숙한 내피 세포를 제거하였다. 비부착 세포를 제거하고 다시 평판 배양하였다. 14일 후, 콜로니를 FITC-결합된 Ulex 유로패우스 (europaeus) 아글루티닌-1 (Vector Labs, Burlingame, CA) 및 DiI-표지된 아세틸화된 LDL (Molecular Probes, Eugene, OR)로 염색하여 확인하였다. 도 17에서 나타난 바와 같이, 약 500 EPC/10⁶ ADC 세포의 EPC 빈도를 나타내었다.

지방 세포 유래 재생 세포 내의 EPC의 존재는 이들 세포가 새로운 혈관의 발달에 직접적으로 참여하고 혈관신생 및 재관류를 향상시킬 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 3: 재생 세포에서 혈관 구조의 시험관내 발달

혈관신생에 대한 업계 인정된 분석법은 섬유아세포의 피더 층에서 성장된 내피 세포가 신생 모세관 네트워크에 대한 CD31-포지티브 튜브 연상의 복잡한 네트워크를 발달시키는 것이다 (Donovan et al., 2001). 지방 재생 세포는 내피 세포, EPC 및 다른 기질 세포 전구체를 포함하므로, 이들 재생 세포가 피더 층의 부재 하에서 모세관형 구조를 형성하는 능력을 시험하였다. 정상 마우스의 서혜부 지방 패드로부터 수득된 재생 세포는 배양 2주 후 모세관 네트워크를 발달시켰다 (도 18A). 두드러지게, 스트렙토조토신 (STZ) 투여 8주 후 STZ-유발된 타입 1 당뇨병을 앓는 고혈당 마우스로부터의 재생 세포는 정상 마우스로부터의 세포에 의해 형성된 것과 같이 동등한 모세관 네트워크를 형성하였다 (도 18B).

연속한 연구에서, 지방 재생 세포는 어떠한 추가의 성장 인자도 없는 완전 배양 배지 (10 % FCS로 보충된 α-MEM)에서 배양하였다. 또한, 이들 재생 세포도 모세관 네트워크를 형성하였다. 또한, 혈관 구조물은 내피 세포 마커 CD31, CD34, VE-카드헤린 및 폰 빌레브란트 인자/인자 VIII에 대해 양성인 염색을 보였으며, pan-림프구 마커 CD45에 대해서는 양성이 아니었다.

젊은 마우스와 늙은 마우스의 재생 세포가 모세관 네트워크를 형성하는 능력을 비교하기 위해, 정상의 젊은 마우스 및 늙은 마우스, (1, 12 또는 18개월)로부터의 재생 세포를 어떠한 추가의 성장 인자도 없이 완전 배양 배지 (10 % FCS로 보충된 α-MEM)에서 배양하였다. 모든 공여자로부터의 재생 세포의 배양물에서 동등한 모세관형 네트워크가 관측되었다 (나타내지 않음).

상기 데이타는 정상 환자, 당뇨병 환자 및 젊고 늙은 환자로부터의 지방 재생 세포가 신생 모세관 네트워크의 형성과 일치하는 혈관 구조를 형성할 수 있다는 것을 입증한다. 따라서, 본 발명의 재생 세포는 혈관신생 기능부전을 치료하는데 사용될 수 있다.

실시예 4: 재생 세포에서 혈관 구조물의 생체내 발달

세포가 생체내 혈관신생 활성을 발휘하지 않는다면 시험관내 혈관신생 가능성은 비록 기대는 되지만 가치가 적다. 수술적으로 유도된 뒷다리 허혈이 지정된 요법의 혈관신생 가능성을 확인할 수 있는 생체내 모델이다. 이 모델은 재관류를 유도하는 사람 세포의 능력이 관측되었던 면역결핍 (NOD-SCID) 마우스에서 개발되었다.

후술되는 바와 같이 양쪽 뒷다리에 대해 수술 전 혈류 값을 측정하였다. 마 취된 마우스의 혈관계를 하기 부위에서 4-0 실크 결찰사로 묶었다: 1) 분기에 입접한 장골 동맥, 2) 깊은 대퇴동맥 기원에 말단, 3) 얕은 대퇴동맥의 분지에 근접. 결찰 후, 혈관계를 전체적으로 제거하였다. 상처를 닫기 전에, 결찰된 대퇴동맥으로부터 분기하는 육안으로 관측가능한 측부지도 결찰시켰다. 24시간 후, 129S 마우스에 꼬리 정맥을 통해 5x10⁶개의 동계 마우스 지방 재생 세포를 주입하고, NOD SCID 마우스에 꼬리 정맥을 통해 사람 지방 재생 세포를 주입하였다. 수술 직후 및 하기 처리 후 간격으로 레이저 도플러 유동 영상기 (Moor Instruments Inc., Wilmington, DE)을 사용해 유동을 이미지 처리하였다. 24일 동안 주당 3회 취한 측정치를 이 다리에 대한 수술 전 값에 대해 표준화하고, 대조군 (수술하지 않음) 다리에 비교해 나타내었다.

뒷다리 허혈 모델은 사용되는 마우스의 계통(strain)에 아주 민감하다. NOD SCID 마우스는 급성 염증 반응을 자극할 능력이 부족한 면역결핍 동물이다. 이러한 마우스에서, 이러한 수술적 방법은 심각한 허혈을 발생시켜 비처리된 동물의 2/3가 대퇴 절개 부위 아래의 뒷다리 구조를 상실하였다. 세포-처리된 동물은 발가락 위의 구조를 상실하지 않았다. 면역력이 있는 129S 마우스에서, 비처리된 동물은 지골 위의 구조를 상실하지 않았으며 재관류를 부분적으로 재생할 내인성 능력을 나타내었다. 이는 급성 염증 반응과 관련된 고유한 혈관신생에 기인할 수 있다. 이것으로 상이한 계통(strain)의 처리 동물 대 대조군 동물의 비교 시에는 재관류가 덜 심했던 이유를 설명할 수 있다.

그러나, 결과는 지방 재생 세포로 처리된 마우스가 두 계통(strain)의 비처리된 마우스에 비해 상당히 개선된 관류를 나타내었음을 입증한다. 12일에 혈류는 사람 재생 세포로 처리된 NOD-SCID 마우스에서는 50±11 %로 회복되었고, 비처리된 마우스에서는 10±10 % 회복되었다 (p<0.05). 유사하게, 14일에 면역적격 129S 마우스에서는 80±12 % 회복되었고, 비처리된 마우스에서는 56±4 % 회복되었다. 또한, 마우스의 육안 절개 시 재생 세포 처리된 마우스의 뒷다리에서는 측부지 혈관의 모습을 보였으나, 비처리된 마우스의 뒷다리 또는 건강한 뒷다리에서는 보이지 않았다.

실시예 5: 개선된 이식물 생존 및 혈관신생과 관련된 ADC 용량 증가

자가 지방 조직의 이식물은 성형 및 재건 수술에서 비교적 일반적인 절차이다 (Fulton, 1998; Shiffman, 2001). 그러나, 이러한 절차는 혈관 공급 없이 지방 조직 단편이 이동되어 그 결과로서 이식물 생존이 신생혈관화에 의존한다는 사실에 미루어 볼 때 제한적이다 (Coleman, 1995; Eppley et al., 1990). 따라서, 제한된 방식으로, 이식된 조직은 허혈 조직을 나타낸다.

지방 조직 단편을 바깥 대퇴부의 근육 위 피하 공간에 이식하여, 피셔 (Fisher) 래트에서의 연구를 수행하였다. 오른쪽 다리에는 0.2 g의 지방 조직 단편만을 이식하고, 왼쪽 다리에는 3개의 상이한 용량 (1.7x10⁵ 내지 1.3x10⁶ 세포/이식물; 3마리 동물/용량)의 지방 유래 줄기 세포의 첨가로 보충된 0.2 g의 지방 조직 단편을 이식하였다; 이러한 과정에서, 반대쪽에 위치하는 다리는 대조군으로 작 용하였다. 하나의 방법으로서, 하나 이상의 용량이 주입에 의해 적용될 수 있다. 이어서, 동물을 한달 동안 지키고, 동물을 안락사시킨 후, 이식물을 회수하여 중량을 재고, 포르말린에 고정시키고, 조직학적 분석을 위해 파라핀에 봉매하였다.

도 9A에 나타낸 바와 같이, 대조군의 다리에서는 이식된 조직이 최소한으로 유지되었으며, 처리된 다리에서는 이식물 중량의 보유가 용량-의존적으로 증가하였다. 또한, 이식물의 면역조직학적 분석 결과는 지방 줄기 세포 처리된 이식물에서 상당한 신생혈관신생 및 관류를 나타내었다 (도 20B, 화살표). 이는 또한 지방 조직 형태의 보유와 관련되었다 (도 20B).

따라서, 실시예 1 내지 5는, 본 발명의 지방 재생 세포가 혈관신생 및 동맥형성 성장 인자를 분비하고; 시험관 내에서 신생 모세관 네트워크를 형성하며; 지방 이식물의 생존을 향상시키고; 허혈 재관류를 향상시킨다는 것을 입증한다. 따라서, 본 발명의 재생 세포는 혈관신생 및 동맥형성을 촉진시킬 수 있고 근본적인 순환 기능부전을 갖는 다수의 질환을 치료하는데 기능할 수 있다.

상기에서 많은 공개물 및 특허가 인용되었다. 각각의 인용 공개물 및 특허가 전부 본원에 참조로 삽입된다.

등가물

당업자라면 단지 일상적인 실험을 이용하여 본원에 기술된 발명의 구체적 실시양태에 대한 많은 등가물을 인지하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물도 하기 청구범위에 포함시키고자 한다.

Claims (26)

1. 일정 농도의 재생 세포를 주사에 의해 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 말초 혈관 질환(PVD)을 치료하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 대상이 인간인 방법.
3. 제1항에 있어서, 재생 세포가 줄기 세포를 포함하는 것인 방법.
4. 제1항에 있어서, 재생 세포가 선구 세포(progenitor cell)를 포함하는 것인 방법.
5. 제1항에 있어서, 재생 세포가 줄기 세포와 선구 세포의 조합을 포함하는 것인 방법.
6. 제1항에 있어서, 재생 세포가 혈관의 결함 또는 장애를 치료하기 위해 투여되는 것인 방법.
7. 제1항에 있어서, 재생 세포가 말초 동맥 질환(PAD)을 치료하기 위해 투여되는 것인 방법.
8. 제1항에 있어서, 재생 세포가 동맥경화증, 혈관의 외상성 손상 및 염증성 동맥염 중 하나 이상을 치료하기 위해 투여되는 것인 방법.
9. 제1항에 있어서, 재생 세포가 환자의 관상외 조직의 결함 또는 장애를 치료하기 위해 투여되는 것인 방법.
10. 제1항에 있어서, 재생 세포의 볼루스를 투여하는 것을 포함하는 방법.
11. 제1항에 있어서, 다회 용량의 재생 세포를 투여하는 것을 포함하는 방법.
12. 제1항에 있어서, 하나 이상의 혈관형성 인자를 투여하는 것을 더 포함하는 방법.
13. 제1항에 있어서, 1종 이상의 면역억제약을 투여하는 것을 더 포함하는 방법.
14. 제1항에 있어서, 재생 세포가 정맥내, 근육내 또는 피하 투여 경로 중 하나 이상을 통해 투여되는 것인 방법.
15. 제1항에 있어서, 환자의 혈관계에 재생 세포를 투여하는 것을 더 포함하는 방법.
16. 제1항에 있어서, 재생 세포가 환자에게 투여하기 전에 세포 배양액에서 성장되는 것인 방법.
17. 제15항에 있어서, 재생 세포가 혈관형성 표현형으로의 분화를 촉진시키는 배양 조건에서 성장되는 것인 방법.
18. 제15항에 있어서, 세포 배양 조건이 내피세포 표현형으로의 분화를 촉진시키는 것인 방법.
19. 제15항에 있어서, 세포 배양이 환자 위에 또는 환자 내에 위치될 수 있는 2차원 또는 3차원 구조물을 형성하기 위한 스캐폴드 소재 상에서 수행되는 것인 방법.
20. 제18항에 있어서, 스캐폴드 소재가 생체내에서 재흡수성인 방법.
21. 제1항에 있어서, 재생 세포가 유전자 전달(gene transfer)에 의해 변형되어 변형된 재생 세포에서의 하나 이상의 유전자의 발현이 변화된 것인 방법.
22. 제21항에 있어서, 변형의 결과로써 대상에서 혈관신생 정도가 변화되는 방법.
23. 제21항에 있어서, 변형의 결과로써 대상에서 기존의 소혈관의 산소 공급이 개선되는 방법.
24. 제21항에 있어서, 변형의 결과로써 재생 세포의 귀환 특성이 변화되는 방법.
25. 일정 농도의 지방 조직 유래된 재생 세포를 주사에 의해 환자에게 투여하는 것을 포함하며, 조성물이 지방세포를 원래 수거한 동일한 대상에게 투여되는 것인, 환자에서 PVD를 치료하는 방법.
26. 조직의 국소 영역 내의 혈관 성장이 유도되도록 조직의 국소 영역과 일정 농도의 재생 세포를 주사에 의해 접촉시키는 것을 포함하는, 환자에서 혈관 성장을 촉진시키는 방법.

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