CN111840207A - 一种体内植入性微孔囊袋及其使用方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于细胞治疗领域，公开了一种体内植入性微孔囊袋及其使用方法和应用，微孔囊袋包括袋状结构，所述袋状结构由至少一层生物组织或组织相容性材料制成的膜围成，膜上具有微孔，所述微孔的直径不大于0.45微米。袋状结构的内部具有空腔，空腔中装盛可分泌针对相应遗传代谢疾病的药物的细胞。本发明利用微孔囊袋孔径大小的物理屏蔽作用，可以有效隔离机体免疫因素对微孔囊袋中未经改造的或经基因编辑改造的自体细胞或者非自体的外源细胞的攻击，同时通过将此微孔囊袋植入患者右心房、骨髓腔或其它部位中，使微孔囊袋中的细胞能够获得充分的血供，便于微孔囊袋中细胞持续不断的产生机体所需的替代物质。

Description

一种体内植入性微孔囊袋及其使用方法和应用

技术领域

本发明属于细胞治疗领域，具体地说，涉及一种体内植入性微孔囊袋及其使用方法和应用，具体涉及一种治疗遗传代谢等多种疾病的体内植入性微孔囊袋和使用方法。

背景技术

遗传代谢疾病是指维持机体正常代谢所必需的某些由多肽和(或)蛋白组成的酶、受体、载体及膜泵生物合成发生遗传缺陷，即编码这类多肽(蛋白)的基因发生突变而导致的疾病，或称先天代谢缺陷性疾病。遗传代谢病是有代谢功能缺陷的一类遗传病，多为单基因遗传病，包括大分子类代谢疾病，包括溶酶体贮积症、线粒体病等；小分子代谢类疾病，包括氨基酸、有机酸、脂肪酸等代谢遗传疾病。一般而言，遗传代谢病一部分病因由基因遗传导致，还有一部分是后天基因突变造成，发病期不仅仅是新生儿，覆盖全年龄阶段。比较常见的遗传代谢病有糖原贮积病、粘多糖病、苯丙酮酸尿症、肝豆状核变性等。

遗传代谢类疾病是指基因突变来自于父母的遗传，或者后天的新生突变，个体的全部细胞或者部分细胞均具有相同的基因变异。与之相对的后天由于脏器功能损伤所致的代谢疾病，如糖尿病、高脂血症、肥胖等也或多或少与机体的遗传易感有关。

遗传代谢类疾病是大分子或者小分子代谢异常，而一些出血性疾病(如各种血友病、凝血酶缺陷症致血栓形成、低凝血酶原血症、先天性凝血酶原缺乏症等)和贫血(如丙酮酸激酶缺乏症、5`尿苷一磷酸水解酶缺乏症、葡萄糖6磷酸酶缺乏症、腺苷酸激酶缺乏症等)也是由于某些酶类编码的基因发生突变所致。

上述疾病中少数疾病可以通过酶替代治疗获得疾病缓解，某些疾病通过造血干细胞移植可获得疾病治愈，但更多的疾病缺乏有效的治疗方案，亟待新的治疗理念和治疗方法的革新。另外，即使采用酶替代治疗，很多疾病的酶替代物价格高昂，且需要终生替代治疗，对患者造成了极大的经济压力，严重的干扰了其正常的生活。同样，即使部分疾病可以采用造血干细胞移植或者组织移植等治疗方案，但难以找到HLA全相合供体，移植后出现的各种移植物抗宿主病(GVHD)可能非常严重，存在致命风险。

近年来，针对VIII因子和IX基因缺陷所致的血友病A和血友病B等基因治疗技术陆续开展，这些治疗技术中经基因编辑的细胞在体内的存活时间短，加之远期致瘤风险难以排除，限制了该方法在临床的大量开展。

随着下一代测序技术的逐步普及，越来越多的遗传代谢性疾病、后天获得性代谢病、血液遗传性贫血和出血性疾病被陆续诊断，然而相应的治疗措施欠缺，临床上亟需一种革命性的新治疗技术。一般而言，基于基因编辑技术的合适体细胞进行体外基因修正、体外扩增和回输是解决这些疾病的一种手段，但无论采用何种基因编辑技术，如采用TALEN、ZFN、CRISPR等技术对自体细胞进行基因组编辑，使之高效表达遗传缺陷相关的无突变基因，后者的表达产物用于纠正机体疾病；采用慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、转座子、质粒直接转染、蛋白转染、电转等各种方法对基因组、转录、转录后修饰、翻译等水平的改造，从而使得自体细胞获得表达特异性基因的目的；通过采用遗传学正常的诱导多能干细胞(IPS)技术进行的特定组织细胞类型的诱导表达，回输人体后达到替代治疗的目的等，这些方法均不可避免的引入非人体自身的蛋白成份(如抗性基因、转录因子、病毒包膜蛋白等)，使得人体免疫细胞识别被改造的基因编辑细胞，造成其体内不能持久发挥作用。另外，这些被改造的细胞由于可能造成基因组中抑癌基因的插入失活或癌基因的过度表达等，因而存在远期致癌风险。再次，这些细胞的基因组中插入了外来元件，可能造成基因组的稳定性发生问题，相应细胞的分裂传代次数可能减少，造成细胞衰老而丧失功能活性。基于此，目前临床上亟需一种可以持久发挥替代作用，且不被自体免疫细胞识别和攻击的技术来解决上述问题。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种可以持久发挥替代作用，且不被自体免疫细胞识别和攻击的体内植入性微孔囊袋，该植入性微孔囊袋由生物组织或相容性好的材料组成，其微孔孔径不大于0.45微米，优选不大于0.22微米，可以与机体交换蛋白等生物大分子，但可以阻挡免疫细胞进入囊袋，具备机体免疫庇护所作用。通过囊袋中细胞分泌的机体缺乏的各种酶等蛋白分子，从而对遗传代谢等多种疾病具有治疗作用。

为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：

本发明的第一目的是提供一种体内植入性的微孔囊袋，微孔囊袋包括袋状结构，所述袋状结构由至少一层生物组织或组织相容性材料制成的膜围成，膜上具有微孔，所述微孔的直径不大于0.45微米。

进一步的方案，所述微孔的直径不大于0.22微米。

本发明提出一种人体植入性免疫庇护所的新概念，通过提供一种可以持久发挥替代作用，且不被自体免疫细胞识别和攻击的体内植入性微孔囊袋，该种微孔囊袋可以取自人体正常组织，或者由生物组织或相容性好的材料制备而成，可以在人体内保留多年而不会造成机体细胞、组织功能的下降，组织不发生炎性反应、癌变和排异。囊袋可以是人体正常组织来源，也可以由一层或者多层生物组织或相容性好的材料构成，微孔的直径不大于0.22微米，可以有效的防止囊袋中的细胞、细菌等通过囊袋上微孔进入血液循环，也可以有效防止血液中的免疫细胞等进入囊袋排斥囊袋中的细胞，从而起到物理屏蔽作用，形成一个体内植入性免疫庇护所。

免疫庇护所是指免疫细胞无法到达的部位，因而机体的免疫细胞无法对囊袋中的经基因编辑的自体细胞或者非自体的外源细胞产生细胞毒作用，而囊袋中的经基因编辑的自体细胞或者非自体的外源细胞也无法对机体发生作用。虽然体液中的抗体、补体等成分可以自由通过微孔，但由于这些抗体、补体成分需要借助于淋巴细胞、单核-巨噬细胞等发挥作用，而由于后者无法进入微孔囊袋，从而也不会对囊袋内的细胞产生免疫攻击作用。另外，虽然微孔囊袋中的细胞成份可能由于细胞坏死而产生对于机体而言的外来抗原，但由于这些抗原只会刺激机体产生相应的抗体或者特异反应性淋巴细胞，后者只要于人体没有交叉反应性，对人体也不会由损害。

进一步的方案，所述袋状结构包括多层膜，每层膜上均具有微孔，各层膜的制备材料相同或者不同；

优选的，所述膜的制备材料包括生物组织、钛合金、天然高分子材料、人工合成高分子材料、纳米材料、人体来源材料中的一种或几种。

进一步的方案，袋状结构包括多层膜，位于较外层的膜的韧性不小于位于较内层的膜的韧性；优选的，位于较内层的膜由纳米材料制成，位于较外层的膜由钛合金材料制成。

本申请的微孔囊袋是由人体正常组织，也可以由生物组织或相容性好的材料制备而成，可以在人体内保留多年而不会造成机体细胞、组织功能的下降，组织不发生炎性反应、癌变和排异。生物组织或相容性好的材料可以选择钛合金、天然高分子材料、人工合成高分子材料、纳米材料等，这些材料具有很强的韧性和强度，可以耐受常年的血流冲击而不至于断裂和破损。这些材料可以由一层或者多层组成，其中最外层材料需要提供一定的强度，优选钛合金材料作为最外层，对内层材料起到保护作用；内层可以选择上述各种材料，优选纳米材料，为囊袋内细胞生长提供广阔的表面积。

进一步的方案，所述袋状结构的内部具有空腔，空腔中装盛可分泌药物的细胞，微孔囊袋形成免疫细胞无法达到的免疫庇护所。

细胞包括人体细胞和非人体细胞，人体细胞可以取自自体或者外源的健康人体，根据具体的疾病需求选择不同的供体细胞来源。

优选的，所述细胞包括自体细胞和/或外源细胞，可分泌治疗疾病的蛋白和/或小分子；本申请的体内植入性微孔囊袋中包含未经改造或者经基因编辑等不同方法改造的自体细胞或者非自体的外源细胞，这些细胞可以产生对患者疾病具有治疗价值的蛋白和小分子等多种药物。

优选的，所述细胞包括未经改造的细胞，和/或经过基因编辑的细胞。

本申请中使用的基因编辑技术包括采用TALEN、ZFN、CRISPR等技术对自体细胞进行基因组编辑，使之高效表达遗传缺陷相关的无突变基因，后者的表达产物可以用于纠正机体疾病；包括采用慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、转座子、质粒直接转染、蛋白转染、电转等各种方法对基因组、转录、转录后修饰、翻译等水平的改造，其目的均为使得自体细胞获得表达特异性基因的目的；另外还包括采用诱导多能干细胞(IPS)技术进行的特定组织细胞类型的诱导表达。

进一步的方案，所述的自体细胞包括取自自体的各种组织来源的细胞；所述的外源细胞包括取自非自体的各种组织来源的细胞；

优选的，自体细胞包括取自自体的骨髓造血干细胞、间质基质细胞、成纤维细胞、上皮细胞、肌细胞、脂肪细胞、脂肪干细胞、内皮细胞、心肌细胞、神经元和神经胶质细胞、皮肤细胞；

优选的，所述的外源细胞包括非自体的人源细胞、非人源细胞、细胞株、工程细胞；

优选的，非自体的人源细胞包括骨髓造血干细胞、间质基质细胞、成纤维细胞、上皮细胞、肌细胞、脂肪细胞、脂肪干细胞、内皮细胞、心肌细胞、神经元和神经胶质细胞、皮肤细胞；非人源细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、疟原虫、细菌。

进一步的方案，所述微孔囊袋还包括与空腔连通的管道结构，通过管道结构向微孔囊袋中添加物质或从微孔囊袋中抽取物质。

所述的微孔囊袋为一个完整整体，生物组织或相容性好的材料上微孔直径不大于0.22微米(M)。在这个尺度以下，蛋白等生物大分子可以自由通过，但细胞和细菌等无法通过微孔进出，从而可以有效的防止囊袋中的细胞、细菌等通过囊袋上微孔进入血液循环，也可以有效防止血液中的免疫细胞等进入囊袋排斥囊袋中的细胞，从而起到物理屏蔽作用，形成一个体内植入性免疫庇护所。完整囊袋与一个管道相连，管道也由组织相容性好的材料组成，管道的一个末端与微孔囊袋无缝连接，另外一个末端可以固定于皮下或者皮肤表面。如此，所述的体内植入性微孔囊袋可以通过相连的管道固定到皮下、皮肤表面等，便于进行微孔囊袋中细胞成分的观察和添加或者抽取。

进一步的方案，所述管道结构内部中空，且由生物组织或组织相容性材料制成；

优选的，管道结构与袋状结构的制备材料相同或者不同；

优选的，所述的管道结构的一端与袋状结构无缝连接，另一端固定在皮下或者皮肤表面。

本发明的第二目的是提供一种如上任意一种或者几种组合方案所述的体内植入性的微孔囊袋的使用方法，所述的微孔囊袋完全植入到体内，或者固定到皮下或者皮肤表面；

优选的，微孔囊袋的袋状结构完全植入到体内，管道结构的自由端固定到皮下或者皮肤表面。

本申请的植入性微孔囊袋中的细胞成分可以通过与囊袋相连的管道进行抽样检测，便于了解囊袋中细胞的生长情况。同时，可以通过检测血液中相应疾病蛋白和小分子药物浓度等进行疾病动态监测。

进一步的方案，微孔囊袋植入到心脏、腹腔、胸腔、骨髓腔、脾脏、肝脏、蛛网膜下腔、脑室、关节腔中的至少一处；

优选的，所述的微孔囊袋经右侧上臂贵要静脉—肱静脉—腋静脉—锁骨下静脉—头臂静脉—上腔静脉—右心房，植入到心脏中。

需要指出的是，植入的具体部位不限于上述路径和最终位置，可以根据具体疾病和需要进行植入。

本发明的第三目的在于提供一种如上任意一种或者几种组合方案所述的体内植入性的微孔囊袋在遗传代谢疾病治疗中的应用，遗传代谢病包括先天性代谢性疾病，脏器功能低下导致的后天代谢性疾病，出血性疾病；

优选的，所述的先天性代谢性疾病包括糖原贮积病、粘多糖贮积症、先天性糖基化异常、高脂蛋白血症、脑白质营养不良、神经元腊样脂褐质沉积症、肝豆状核变性、芳香族氨基酸脱羧酶缺乏症、细胞过氧化物酶缺乏症、果糖-1,6-二磷酸激酶缺陷症、G6PD缺陷导致的溶血性贫血、戈谢病、法布里病、神经节苷脂贮积症、粘脂贮积症、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷症、透明质酸酶缺乏症、乳糖不耐症、髓过氧化物酶缺陷症、无β脂蛋白血症、丙酮酸羧化酶缺陷症、乳酸血症、磷酸甘油酸脱氢酶缺乏症、丙酮酸激酶缺陷症、高尿酸血症、先天性蔗糖不耐受/先天性蔗糖-异麦芽糖酶缺乏症、巴特综合征、芬兰型唾液酸尿症、小儿唾液酸储存障碍、脂肪酸β-氧化缺陷所致原发性肉碱缺乏症、血色素沉着症、黄嘌呤尿症、家族性高胆红素血症、吉尔伯特综合征、恰克-马利-杜斯氏症、苯丙酮尿症、肝磷酸化酶激酶缺乏所致肝硬化、甲基丙二酸尿症、同型半胱氨酸血症、色素性视网膜炎、脂肪肝、肥胖、果糖-1,6-二磷酸激酶缺陷症、延胡索酸酶缺乏症/延胡索酸尿症、半乳糖血症、胱氨酸病、酰化氨基酸水解酶1缺乏症、天冬氨酰葡糖胺尿症、脂酰辅酶A脱氢酶家族成员9缺陷症、长链酰基辅酶A脱氢酶缺陷症、高胆固醇血症、原发性α低脂蛋白血症、中性脂质贮积病伴鱼鳞病、中性脂质贮积症等、新生儿永久性糖尿病、新生儿暂时性糖尿病2型、婴儿持续性高胰岛素血症性低血糖症；家族性高胰岛索血症性低血糖症1型、亮氨酸敏感的婴儿期低血糖、脯肽酶缺乏症、家族性内脏淀粉样贮积症、载脂蛋白缺乏症；

优选的，脏器功能低下导致的后天代谢性疾病包括各型糖尿病、肥胖、尿崩症、高脂血症、甲状旁腺功能低下、甲状腺功能低下、肾上腺皮质功能低下、矮小；

优选的，出血性疾病包括血友病甲、血友病乙、血友病丙、血管性血友病、凝血酶缺陷症致血栓形成、低凝血酶原血症、先天性凝血酶原缺乏症、前凝血酵素不良血症、由于凝血酶缺陷血栓形成、遗传性凝血因子V缺乏症、易栓症、X连锁IX因子缺乏造成的血小板减少、凝血因子XII缺乏症、遗传性凝血因子XⅢA型缺乏症、遗传性凝血因子XⅢB型缺乏症、高分子量激肽原缺乏症、凝血因子V和凝血因子VIII联合缺乏症、先天性无/低纤维蛋白原血症、纤溶酶原激活物抑制因子1缺乏症、α2-纤维蛋白溶酶抑制剂缺乏症、血浆酶原缺乏症，丙酮酸激酶缺乏症、5-尿苷一磷酸水解酶缺乏症、葡萄糖6磷酸酶缺乏症、腺苷酸激酶缺乏症、谷胱甘肽合成酶缺乏症、已糖激酶缺乏症、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶缺乏症、谷胱甘肽过氧化物酶缺乏症、磷酸丙糖异构酶缺乏症、溶血性贫血、磷酸葡萄糖异构酶缺乏症、转铁蛋白缺乏症。

采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

本发明提供了一种可以持久发挥替代作用，且不被自体免疫细胞识别和攻击的体内植入性微孔囊袋，该植入性微孔囊袋由生物组织或相容性好的材料组成，其微孔孔径不大于0.45微米，优选0.22微米，可以与机体交换蛋白等生物大分子，同时还可以阻挡免疫细胞进入微孔囊袋，具备机体免疫庇护所作用。通过微孔囊袋中细胞分泌的机体缺乏的各种酶等蛋白分子，从而对遗传代谢等多种疾病具有治疗作用。

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。

附图说明

附图作为本发明的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：

图1是本发明植入人体内的微孔囊袋的体内位置选择示意图；具体的，体内植入性微孔囊袋可以经右侧上臂贵要静脉—肱静脉—腋静脉—锁骨下静脉—头臂静脉—上腔静脉—右心房；也可以植入到包含腹腔、胸腔、骨髓腔、脾脏、肝脏、蛛网膜下腔、脑室、关节腔等身体中任意部位；

图2是本发明的微孔囊袋的结构示意图；图中：1袋状结构，2管道结构；

图3是体内植入性微孔囊袋外层结构；采用钛合金网组成，网孔大小10-100μM，主要对内层的生物膜结构提供支撑作用。

图4是体内植入性微孔囊袋内层结构；内层是由体外合成的有机生物膜组成，是由人体外周血单核细胞经诱导分化为成纤维细胞，然后经表达多种黏附分子后相互多层交联而成，具有比较强的韧性；

图5是体内植入性微孔囊袋制作方法；将生物膜折叠成一个袋状，袋口部用手术线先轻轻捆扎，待将一定数量转染外源基因的经诱导的心肌细胞注入囊袋后，手术线结扎封闭袋口。

图6是体外诱导心肌细胞步骤；具体是在体外将外周血单核细胞诱导成心肌细胞的步骤；

图7是体外诱导成功的心肌细胞；经体外诱导后心肌细胞出现了节律性搏动，提示诱导成功；

图8是体外诱导心肌细胞的鉴定；经多种心肌细胞特异性抗原检测，确定了心肌细胞被成功诱导；

图9是人胰岛素表达载体pWPXL-Insulin-2A-myc的构建；选择载体pWPXL作为目标载体，将人胰岛素全长CDS序列、经2A序列相连的myc抗原结构表达连接入上述载体中，并与相应的病毒骨架共转染人293T细胞获得相应的慢病毒。

图10是在Hela和经诱导的心肌细胞中Insulin的表达检测；过表达人胰岛素的慢病毒感染人宫颈癌细胞株-Hela和经诱导的心肌细胞，抽提总蛋白后通过western blot进行胰岛素表达水平的检测，图10中左侧第一道为Hela细胞中胰岛素的表达水平，中间为经诱导的心肌细胞中胰岛素的表达水平，右侧为对照转染空载病毒细胞中的胰岛素表达水平，从图中可见Hela和经诱导的心肌细胞中均看到特异性胰岛素的表达。

需要说明的是，这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

如图1和图2所述，本实施例提供一种体内植入性的微孔囊袋，微孔囊袋包括袋状结构，所述袋状结构由至少一层生物组织或组织相容性材料制成的膜围成，膜上具有微孔，所述微孔的直径不大于0.45微米。优选的方案，所述微孔的直径不大于0.22微米。

本方案提出一种人体植入性免疫庇护所的新概念，通过提供一种可以持久发挥替代作用，且不被自体免疫细胞识别和攻击的体内植入性微孔囊袋，该种微孔囊袋可以取自人体正常组织，或者由生物组织或相容性好的材料制备而成，可以在人体内保留多年而不会造成机体细胞、组织功能的下降，组织不发生炎性反应、癌变和排异。微孔囊袋的材料可以是人体正常组织来源，也可以由一层或者多层生物组织或相容性好的材料构成，微孔的直径不大于0.45微米，优选小于等于0.22微米，可以有效的防止囊袋中的细胞、细菌等通过囊袋上微孔进入血液循环，也可以有效防止血液中的免疫细胞等进入囊袋排斥囊袋中的细胞，从而起到物理屏蔽作用，形成一个体内植入性免疫庇护所。

免疫庇护所是指免疫细胞无法到达的部位，因而机体的免疫细胞无法对囊袋中的经基因编辑的自体细胞或者非自体的外源细胞产生细胞毒作用，而囊袋中的经基因编辑的自体细胞或者非自体的外源细胞也无法对机体发生作用。虽然体液中的抗体、补体等成分可以自由通过微孔，但由于这些抗体、补体成分需要借助于淋巴细胞、单核-巨噬细胞等发挥作用，而由于后者无法进入微孔囊袋，从而也不会对囊袋内的细胞产生免疫攻击作用。另外，虽然微孔囊袋中的细胞成份可能由于细胞坏死而产生对于机体而言的外来抗原，但由于这些抗原只会刺激机体产生相应的抗体或者特异反应性淋巴细胞，后者只要于人体没有交叉反应性，对人体也不会由损害。

所述袋状结构包括多层膜，每层膜上均具有微孔，各层膜的制备材料相同或者不同；

所述膜的制备材料包括生物组织、钛合金、天然高分子材料、人工合成高分子材料、纳米材料、人体来源材料中的一种或几种。

袋状结构包括多层膜，位于较外层的膜的韧性不小于位于较内层的膜的韧性；优选的，位于较内层的膜由纳米材料制成，位于较外层的膜由钛合金材料制成。

本申请的微孔囊袋是由人体正常组织，也可以由生物组织或相容性好的材料制备而成，可以在人体内保留多年而不会造成机体细胞、组织功能的下降，组织不发生炎性反应、癌变和排异。生物组织或相容性好的材料可以选择钛合金、天然高分子材料、人工合成高分子材料、纳米材料等，这些材料具有很强的韧性和强度，可以耐受常年的血流冲击而不至于断裂和破损。这些材料可以由一层或者多层组成，其中最外层材料需要提供一定的强度，优选钛合金材料作为最外层，对内层材料起到保护作用；内层可以选择上述各种材料，优选纳米材料，为囊袋内细胞生长提供广阔的表面积。

所述袋状结构的内部具有空腔，空腔中装盛可分泌药物的细胞，微孔囊袋形成免疫细胞无法达到的免疫庇护所。

袋状结构由至少一层生物组织或组织相容性材料制成的膜围成，具有开口，该开口可以用于向空腔中填装可分泌药物的细胞。当微孔囊袋没有管道结构，仅具有袋状结构时，在向空腔中填装可分泌药物的细胞，可以将开口封闭，再向人体内植入。

所述细胞包括人体细胞和非人体细胞，人体细胞可以取自自体或者外源的健康人体，根据具体的疾病需求选择不同的供体细胞来源。

所述细胞包括自体细胞和/或外源细胞，可分泌治疗疾病的蛋白和/或小分子；本申请的体内植入性微孔囊袋中包含未经改造或者经基因编辑等不同方法改造的自体细胞或者非自体的外源细胞，这些细胞可以产生对患者疾病具有治疗价值的蛋白和小分子等多种药物。

所述细胞包括未经改造的细胞，和/或经过基因编辑的细胞。

本申请中使用的基因编辑技术包括采用TALEN、ZFN、CRISPR等技术对自体细胞进行基因组编辑，使之高效表达遗传缺陷相关的无突变基因，后者的表达产物可以用于纠正机体疾病；包括采用慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、转座子、质粒直接转染、蛋白转染、电转等各种方法对基因组、转录、转录后修饰、翻译等水平的改造，其目的均为使得自体细胞获得表达特异性基因的目的；另外还包括采用诱导多能干细胞(IPS)技术进行的特定组织细胞类型的诱导表达。

所述的自体细胞包括取自自体的各种组织来源的细胞；所述的外源细胞包括取自非自体的各种组织来源的细胞；

自体细胞包括取自自体的骨髓造血干细胞、间质基质细胞、成纤维细胞、上皮细胞、肌细胞、脂肪细胞、脂肪干细胞、内皮细胞、心肌细胞、神经元和神经胶质细胞、皮肤细胞；

所述的外源细胞包括非自体的人源细胞、非人源细胞、细胞株、工程细胞；

非自体的人源细胞包括骨髓造血干细胞、间质基质细胞、成纤维细胞、上皮细胞、肌细胞、脂肪细胞、脂肪干细胞、内皮细胞、心肌细胞、神经元和神经胶质细胞、皮肤细胞；非人源细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、疟原虫、细菌。

本实施例还提供微孔囊袋的另一种实施方式，本方案中，微孔囊袋包括袋状结构和管道结构，袋状结构内部具有空腔，管道结构与空腔连通，通过管道结构向袋状结构中添加物质或从袋状结构中抽取物质。

所述的微孔囊袋为一个完整整体，生物组织或相容性好的材料上微孔直径不大于0.22微米。在这个尺度以下，蛋白等生物大分子可以自由通过，但细胞和细菌等无法通过微孔进出，从而可以有效的防止囊袋中的细胞、细菌等通过囊袋上微孔进入血液循环，也可以有效防止血液中的免疫细胞等进入囊袋排斥囊袋中的细胞，从而起到物理屏蔽作用，形成一个体内植入性免疫庇护所。完整囊袋与一个管道相连，管道也由组织相容性好的材料组成，管道的一个末端与微孔囊袋无缝连接，另外一个末端可以固定于皮下或者皮肤表面。如此，所述的体内植入性微孔囊袋可以通过相连的管道固定到皮下、皮肤表面等，便于进行微孔囊袋中细胞成分的观察和添加或者抽取。

所述管道结构内部中空，且由生物组织或组织相容性材料制成；

管道结构与袋状结构的制备材料相同或者不同；

所述的管道结构的一端与袋状结构无缝连接，另一端固定在皮下或者皮肤表面。

另外，本方案还提供一种如上任意一种或者几种组合方案所述的体内植入性的微孔囊袋的使用方法，所述的微孔囊袋完全植入到体内，或者固定到皮下或者皮肤表面；微孔囊袋的袋状结构完全植入到体内，管道结构的自由端固定到皮下或者皮肤表面。

本申请的植入性微孔囊袋中的细胞成分可以通过与囊袋相连的管道进行抽样检测，便于了解囊袋中细胞的生长情况。同时，可以通过检测血液中相应疾病蛋白和小分子药物浓度等进行疾病动态监测，也可以向微孔囊袋中添加成分。

微孔囊袋植入到心脏、腹腔、胸腔、骨髓腔、脾脏、肝脏、蛛网膜下腔、脑室、关节腔中的至少一处；

作为一种具体的实施方式，所述的微孔囊袋经右侧上臂贵要静脉—肱静脉—腋静脉—锁骨下静脉—头臂静脉—上腔静脉—右心房，植入到心脏中。

需要指出的是，植入的具体部位不限于上述路径和最终位置，可以根据具体疾病和需要进行植入。

另外，本方案还提供一种如上任意一种或者几种组合方案所述的体内植入性的微孔囊袋在遗传代谢疾病治疗中的应用，遗传代谢病包括先天性代谢性疾病，脏器功能低下导致的后天代谢性疾病，出血性疾病；

优选的，所述的先天性代谢性疾病包括糖原贮积病、粘多糖贮积症、先天性糖基化异常、高脂蛋白血症、脑白质营养不良、神经元腊样脂褐质沉积症、肝豆状核变性、芳香族氨基酸脱羧酶缺乏症、细胞过氧化物酶缺乏症、果糖-1,6-二磷酸激酶缺陷症、G6PD缺陷导致的溶血性贫血、戈谢病、法布里病、神经节苷脂贮积症、粘脂贮积症、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷症、透明质酸酶缺乏症、乳糖不耐症、髓过氧化物酶缺陷症、无β脂蛋白血症、丙酮酸羧化酶缺陷症、乳酸血症、磷酸甘油酸脱氢酶缺乏症、丙酮酸激酶缺陷症、高尿酸血症、先天性蔗糖不耐受/先天性蔗糖-异麦芽糖酶缺乏症、巴特综合征、芬兰型唾液酸尿症、小儿唾液酸储存障碍、脂肪酸β-氧化缺陷所致原发性肉碱缺乏症、血色素沉着症、黄嘌呤尿症、家族性高胆红素血症、吉尔伯特综合征、恰克-马利-杜斯氏症、苯丙酮尿症、肝磷酸化酶激酶缺乏所致肝硬化、甲基丙二酸尿症、同型半胱氨酸血症、色素性视网膜炎、脂肪肝、肥胖、果糖-1,6-二磷酸激酶缺陷症、延胡索酸酶缺乏症/延胡索酸尿症、半乳糖血症、胱氨酸病、酰化氨基酸水解酶1缺乏症、天冬氨酰葡糖胺尿症、脂酰辅酶A脱氢酶家族成员9缺陷症、长链酰基辅酶A脱氢酶缺陷症、高胆固醇血症、原发性α低脂蛋白血症、中性脂质贮积病伴鱼鳞病、中性脂质贮积症等、新生儿永久性糖尿病、新生儿暂时性糖尿病2型、婴儿持续性高胰岛素血症性低血糖症；家族性高胰岛索血症性低血糖症1型、亮氨酸敏感的婴儿期低血糖、脯肽酶缺乏症、家族性内脏淀粉样贮积症、载脂蛋白缺乏症；

优选的，脏器功能低下导致的后天代谢性疾病包括各型糖尿病、肥胖、尿崩症、高脂血症、甲状旁腺功能低下、甲状腺功能低下、肾上腺皮质功能低下、矮小；

优选的，出血性疾病包括血友病甲、血友病乙、血友病丙、血管性血友病、凝血酶缺陷症致血栓形成、低凝血酶原血症、先天性凝血酶原缺乏症、前凝血酵素不良血症、由于凝血酶缺陷血栓形成、遗传性凝血因子V缺乏症、易栓症、X连锁IX因子缺乏造成的血小板减少、凝血因子XII缺乏症、遗传性凝血因子XⅢA型缺乏症、遗传性凝血因子XⅢB型缺乏症、高分子量激肽原缺乏症、凝血因子V和凝血因子VIII联合缺乏症、先天性无/低纤维蛋白原血症、纤溶酶原激活物抑制因子1缺乏症、α2-纤维蛋白溶酶抑制剂缺乏症、血浆酶原缺乏症，丙酮酸激酶缺乏症、5-尿苷一磷酸水解酶缺乏症、葡萄糖6磷酸酶缺乏症、腺苷酸激酶缺乏症、谷胱甘肽合成酶缺乏症、已糖激酶缺乏症、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶缺乏症、谷胱甘肽过氧化物酶缺乏症、磷酸丙糖异构酶缺乏症、溶血性贫血、磷酸葡萄糖异构酶缺乏症、转铁蛋白缺乏症。

实施例1：微孔囊袋的一种实现方式

该微孔囊袋由两层构成，外层为由钛合金网组成(图3)，对囊袋起到物理支撑作用。钛合金网的网孔大小10～100μM，可以允许血液中的各种成分自由通过网孔。内层是由体外合成的有机生物膜组成，该生物膜是通过取材于人体外周血单核细胞经诱导分化为成纤维细胞，然后经表达多种黏附分子后相互多层交联而成，光滑而有韧性，无血管和神经分布，且含有大量的胶原物质，形成致密结构。另外，该生物膜没有免疫原性，可以通过该生物膜种的细胞结构产生免疫隔离作用，是微孔囊袋的关键组成部分。该有机生物膜在培养基中的图像如图4所示。

具体的，在制备微孔囊袋时，首先将有机生物膜折叠成一个袋状，袋口部用手术线先轻轻捆扎，待将一定数量转染外源基因的经诱导的心肌细胞注入囊袋后，手术线结扎封闭袋口(如图5所示)。然后用钛合金网包裹生物膜囊袋，对其起到物理支撑作用。

上述囊袋放置到人体后，生物膜具有半透明的作用，虽然没有神经血管分布，但膜周围的体液可以提供其生长所需，且水分、无机盐等小分子以及血浆蛋白等大分子可以穿透生物膜，对囊袋中的细胞起到滋养作用，但囊袋内的细胞无法通过生物膜，因此生物囊袋可以起到免疫隔离作用。

实施例2：体外诱导心肌细胞

由于心肌细胞具有寿命长、无增殖分裂和可以自主搏动的特点，是进行微孔囊袋中表达外源基因的最合适基因工程细胞载体。心肌细胞可以通过自体外周血中单核细胞经转染Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4这四种转录因子获得诱导多能干细胞(iPS)，并经一系列外源小分子物质刺激后获得(过程如图6所示)。简言之，取外周血单核细胞体外培养，转染插入Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4这四种转录因子的慢病毒载体，继续培养后获得iPS。iPS经传代培养，当细胞密度达到80％以上时加入分化培养液I，继续培养48小时。随后去除培养液I，加入培养液III继续培养24小时。接着去除培养液III并加入培养液II再培养48小时。然后去除培养基II并加入培养液III培养48小时。使用培养基III连续换液，直至出现细胞搏动，此时便诱导成功心肌细胞(如图7所示)。

使用抗人心肌肌钙蛋白T(Troponin T)和肌钙蛋白I(Troponin I)特异性单克隆荧光抗体，和抗人a辅肌动蛋白(Alpha Actinin)特异性单克隆荧光抗体对诱导成功的心肌细胞进行染色鉴定，同时使用DNA染料(DAPI)标记细胞核，可以看到诱导成功的心肌细胞(如图8)。

实施例3：外源基因表达

糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病，主要是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。糖尿病时长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。在治疗方面，口服降糖药和注射动物胰岛素、人胰岛素和胰岛素类似物是主要措施。人胰岛素基因含有110个氨基酸，从氨基端开始依次由信号肽(氨基酸1～24)、B链肽(氨基酸25～54)、C链肽(氨基酸57～88)和A链肽(氨基酸90～110)组成，B链肽和C链肽之间为氨基酸Arg～Arg，C链肽和A链肽之间是氨基酸Lys～Arg，为翻译后修饰的蛋白水解位点。有生物活性的胰岛素分子是含有51个氨基酸的小分子蛋白质，是由上述A链肽(21个氨基酸)与B链肽(30个氨基酸)通过二硫键结合构成，如果二硫键被打开则失去活性。在人体内胰岛B细胞先合成一个大分子的前胰岛素原，信号肽切除后被加工成为86肽的胰岛素原，后者再经水解成为胰岛素(A链肽与B链肽)与连接肽(C链肽)。

采取基因合成的方式将带有酶切位点的人胰岛素基因序列和特异性膜蛋白表达标签(myc)插入到慢病毒载体pWPXL中，构建成载体pWPXL-Insulin-2A-myc(图9)。经与VSVG等骨架载体联合转染293T细胞，制备、浓缩和纯化出慢病毒。

将上述病毒转染到人宫颈癌细胞系-Hela和上述经体外诱导的心肌细胞中，48小时后收集细胞进行蛋白抽提，蛋白定量后在15％的胶中进行蛋白电泳。然后在100V电压下将蛋白条带从聚丙烯酰胺凝胶上转移至PVDF膜表面，电转一个小时后与特异性抗体进行结合，二抗和显色剂着色摄片，可以看到分子量大概在10kd左右的条带，见图10所示。

图10中左侧第一道为Hela细胞中胰岛素的表达水平，中间为经诱导的心肌细胞中胰岛素的表达水平，右侧为对照转染空载病毒细胞中的胰岛素表达水平，从图中可见Hela和经诱导的心肌细胞中均看到特异性胰岛素的表达。

本实施例中将改造后的可以表达胰岛素的心肌细胞注入实施例1中的囊袋，手术线结扎封闭袋口，然后用钛合金网包裹生物膜囊袋，放置到糖尿病患者体内后，诱导的心肌细胞持续产生胰岛素，弥补胰岛素缺失，达到治疗糖尿病的目的。

对于治疗其它疾病的方案，类似的，构建可分泌相应药物的细胞，注入实施例1中的囊袋，放置到患者体内，达到相应的治疗目的，在此不再一一陈述。

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

Claims (10)

1.一种体内植入性的微孔囊袋，其特征在于，微孔囊袋包括袋状结构，所述袋状结构由至少一层生物组织或组织相容性材料制成的膜围成，膜上具有微孔，所述微孔的直径不大于0.45微米；

优选的，所述微孔的直径不大于0.22微米。

2.根据权利要求1所述的一种体内植入性的微孔囊袋，其特征在于，所述袋状结构包括多层膜，每层膜上均具有微孔，各层膜的制备材料相同或者不同；

优选的，所述膜的制备材料包括生物组织、钛合金、天然高分子材料、人工合成高分子材料、纳米材料、人体来源材料中的一种或几种。

3.根据权利要求1或2所述的一种体内植入性的微孔囊袋，其特征在于，袋状结构包括多层膜，位于较外层的膜的韧性不小于位于较内层的膜的韧性；

优选的，位于较内层的膜由纳米材料制成，位于较外层的膜由钛合金材料制成。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的一种体内植入性的微孔囊袋，其特征在于，所述袋状结构的内部具有空腔，空腔中装盛可分泌药物的细胞，微孔囊袋形成免疫细胞无法达到的免疫庇护所；

优选的，所述细胞包括自体细胞和/或外源细胞，可分泌治疗疾病的蛋白和/或小分子；

优选的，所述细胞包括未经改造的细胞，和/或经过基因编辑的细胞。

5.根据权利要求4所述的一种体内植入性的微孔囊袋，其特征在于，所述的自体细胞包括取自自体的各种组织来源的细胞；所述的外源细胞包括取自非自体的各种组织来源的细胞；

优选的，自体细胞包括取自自体的骨髓造血干细胞、间质基质细胞、成纤维细胞、上皮细胞、肌细胞、脂肪细胞、脂肪干细胞、内皮细胞、心肌细胞、神经元和神经胶质细胞、皮肤细胞；

优选的，所述的外源细胞包括非自体的人源细胞、非人源细胞、细胞株、工程细胞；

优选的，非自体的人源细胞包括骨髓造血干细胞、间质基质细胞、成纤维细胞、上皮细胞、肌细胞、脂肪细胞、脂肪干细胞、内皮细胞、心肌细胞、神经元和神经胶质细胞、皮肤细胞；非人源细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、疟原虫、细菌。

6.根据权利要求1-5任意一项所述的一种体内植入性的微孔囊袋，其特征在于，所述微孔囊袋还包括与空腔连通的管道结构，通过管道结构向微孔囊袋中添加物质或从微孔囊袋中抽取物质。

7.根据权利要求6所述的一种体内植入性的微孔囊袋，其特征在于，所述管道结构内部中空，且由生物组织或组织相容性材料制成；

优选的，管道结构与袋状结构的制备材料相同或者不同；

优选的，所述的管道结构的一端与袋状结构无缝连接，另一端固定在皮下或者皮肤表面。

8.一种如权利要求1-7任意一项所述的体内植入性的微孔囊袋的使用方法，其特征在于，所述的微孔囊袋完全植入到体内，或者固定到皮下或者皮肤表面；

优选的，微孔囊袋的袋状结构完全植入到体内，管道结构的自由端固定到皮下或者皮肤表面。

9.根据权利要求8所述的一种体内植入性的微孔囊袋，其特征在于，微孔囊袋植入到心脏、腹腔、胸腔、骨髓腔、脾脏、肝脏、蛛网膜下腔、脑室、关节腔中的至少一处；

优选的，所述的微孔囊袋经右侧上臂贵要静脉—肱静脉—腋静脉—锁骨下静脉—头臂静脉—上腔静脉—右心房，植入到心脏中。

10.一种如权利要求1-9任意一项所述的体内植入性的微孔囊袋在遗传代谢疾病治疗中的应用，其特征在于，遗传代谢病包括先天性代谢性疾病，脏器功能低下导致的后天代谢性疾病，出血性疾病；

优选的，所述的先天性代谢性疾病包括糖原贮积病、粘多糖贮积症、先天性糖基化异常、高脂蛋白血症、脑白质营养不良、神经元腊样脂褐质沉积症、肝豆状核变性、芳香族氨基酸脱羧酶缺乏症、细胞过氧化物酶缺乏症、果糖-1,6-二磷酸激酶缺陷症、G6PD缺陷导致的溶血性贫血、戈谢病、法布里病、神经节苷脂贮积症、粘脂贮积症、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷症、透明质酸酶缺乏症、乳糖不耐症、髓过氧化物酶缺陷症、无β脂蛋白血症、丙酮酸羧化酶缺陷症、乳酸血症、磷酸甘油酸脱氢酶缺乏症、丙酮酸激酶缺陷症、高尿酸血症、先天性蔗糖不耐受/先天性蔗糖-异麦芽糖酶缺乏症、巴特综合征、芬兰型唾液酸尿症、小儿唾液酸储存障碍、脂肪酸β-氧化缺陷所致原发性肉碱缺乏症、血色素沉着症、黄嘌呤尿症、家族性高胆红素血症、吉尔伯特综合征、恰克-马利-杜斯氏症、苯丙酮尿症、肝磷酸化酶激酶缺乏所致肝硬化、甲基丙二酸尿症、同型半胱氨酸血症、色素性视网膜炎、脂肪肝、肥胖、果糖-1,6-二磷酸激酶缺陷症、延胡索酸酶缺乏症/延胡索酸尿症、半乳糖血症、胱氨酸病、酰化氨基酸水解酶1缺乏症、天冬氨酰葡糖胺尿症、脂酰辅酶A脱氢酶家族成员9缺陷症、长链酰基辅酶A脱氢酶缺陷症、高胆固醇血症、原发性α低脂蛋白血症、中性脂质贮积病伴鱼鳞病、中性脂质贮积症等、新生儿永久性糖尿病、新生儿暂时性糖尿病2型、婴儿持续性高胰岛素血症性低血糖症；家族性高胰岛索血症性低血糖症1型、亮氨酸敏感的婴儿期低血糖、脯肽酶缺乏症、家族性内脏淀粉样贮积症、载脂蛋白缺乏症；

优选的，脏器功能低下导致的后天代谢性疾病包括各型糖尿病、肥胖、尿崩症、高脂血症、甲状旁腺功能低下、甲状腺功能低下、肾上腺皮质功能低下、矮小；

优选的，出血性疾病包括血友病甲、血友病乙、血友病丙、血管性血友病、凝血酶缺陷症致血栓形成、低凝血酶原血症、先天性凝血酶原缺乏症、前凝血酵素不良血症、由于凝血酶缺陷血栓形成、遗传性凝血因子V缺乏症、易栓症、X连锁IX因子缺乏造成的血小板减少、凝血因子XII缺乏症、遗传性凝血因子XⅢA型缺乏症、遗传性凝血因子XⅢB型缺乏症、高分子量激肽原缺乏症、凝血因子V和凝血因子VIII联合缺乏症、先天性无/低纤维蛋白原血症、纤溶酶原激活物抑制因子1缺乏症、α2-纤维蛋白溶酶抑制剂缺乏症、血浆酶原缺乏症，丙酮酸激酶缺乏症、5-尿苷一磷酸水解酶缺乏症、葡萄糖6磷酸酶缺乏症、腺苷酸激酶缺乏症、谷胱甘肽合成酶缺乏症、已糖激酶缺乏症、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶缺乏症、谷胱甘肽过氧化物酶缺乏症、磷酸丙糖异构酶缺乏症、溶血性贫血、磷酸葡萄糖异构酶缺乏症、转铁蛋白缺乏症。

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