CN1206044A - 遗传修饰的细胞和它们在预防或治疗疾病中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于基因治疗的细胞,所说的细胞是通过下列步骤获得的:a)从血液或者含有细胞的体液中分离细胞;b)在含有神经节苷脂、磷脂、糖脂和/或生长因子的细胞培养基中培养步骤a)获得的细胞;c)或者通过转化癌基因、活化癌基因或者灭活抑制基因使a)或b)中获得的细胞无限增殖化;d)或者使用用于基因治疗的核酸构建体转染步骤a)和b)或c)中获得的细胞,所说的核酸构建体包含可以由合适的启动子系统靶细胞特异性、细胞周期特异性、病毒特异性地和/或通过低氧被活化的效应基因;本发明也涉及这些细胞用于治疗下列疾病的用途:肿瘤、白血病、自身免疫疾病、变态反应、关节炎、发炎、器官排斥、移植物对宿主的反应、血液凝固疾病、循环疾病、贫血、感染、激素疾病和CNS损害。

Description

遗传修饰的细胞和它们在预防或治疗疾病中的用途

本发明涉及用于基因治疗的细胞，这种细胞可通过下列过程获得：

a)从血液或者含有细胞的体液中分离单核细胞；

b)在含有神经节苷脂、磷脂、糖脂和／或内皮细胞生长因子(包括影响分化、存活、迁移和／或血管形成的生长因子)的细胞培养基中培养步骤a)获得的细胞；

c)或者通过转化癌基因、活化癌基因或者灭活抑制基因使a)或b)中获得的细胞无限增殖化；

d)或者使用用于基因治疗的核酸构建体转染步骤a)和b)或c)中获得的细胞，所说的核酸构建体包含可以由合适的启动子系统靶细胞特异性、细胞周期特异性、病毒特异性地和／或通过低氧被活化的效应基因；

1)概述

施用体外转染的体细胞(转导这些细胞目的是表达活性化合物)是目前广泛用于临床前实验和临床实验的基因治疗方法。本文使用的不同细胞包括成纤维细胞、淋巴细胞、角质形成细胞和肿瘤细胞。

1989年首次使用内皮细胞用于此目的。为此，通过逆转录病毒载体对内皮细胞进行了体外转染(Zwiebel等，科学243：220(1989))以便表达活性化合物。

这种体外生长在塑料血管假体上的转导的内皮细胞，在将这种假体移植到体内后，能够表达转基因(Zwiebel等，科学243：220(1989)，Wilson等，科学244：1344(1989))。结果Zwiebel和Wilson提出，为了进行基因治疗，向患者施用附着在塑料或者胶原支持体上的转导的内皮细胞。Nathan等对此项建议进行了实验(PNAS美国92：8130(1995)。

作为这一建议的延伸，Nabel等第一次证明向血液中施用转导的内皮细胞的细胞悬液作为一种基因治疗途径的可能性(科学：244：1342，1989))。这些作者设法证明了通过刮活体哺乳动物的血管而获得的并在体外进行转导以便表达报告基因的内皮细胞，在局部施用到，例如有内皮细胞损坏的血管上后，可以在此生长并表达报告基因。在这些结果基础上，这些作者描述了施用遗传修饰的内皮细胞用于基因治疗的可能性，通过这些内皮细胞直接运输到血液循环中的活性化合物可以对全身或者遗传疾病进行治疗。Bernstein等进一步发展了这一观点(FASEB杂志4：2665(1990))。使用质粒体外转染肺内皮细胞以便表达活性化合物，接下来经腹膜内、静脉内、皮下或者肾小囊下注射到裸鼠中。在以这种方式处理的动物中检测局部(肾囊)或血液(在i．p．、i．v．或者s．c．施用后)中的由所说的内皮细胞移植物产生的活性化合物，这样就证明了体内施用于体外转导的内皮细胞进行基因治疗是有用的。

此后，Zwiebel等，1992(国际专利申请，公开号为WO93／13807)和Ojeifb等(癌症研究55：2240(1995))以大量的例子证明将体外转导的内皮细胞施用到血液循环中用于基因治疗的可行性。

Zwiebel等(1992)使用逆转录病毒载体对人脐带内皮细胞和大鼠脂肪组织的内皮细胞进行体外转导以便表达活性化合物，并将这些内皮细胞静脉内注射到通过注射照射的FGF分泌细胞先已发生局部血管损坏和血管形成的动物体内。他们证明注入的内皮细胞定位在血管损伤和血管生成的位点，并在此表达活性化合物。这此基础上，这些作者在他们的专利申请中要求体外转导的内皮细胞在表达腺苷胺化酶、血液凝固因子、遗血生长因子、细胞因子、抗凝剂、酶抑制物和激素方面的用途。

同时，其它的研究者改进了内皮细胞的分离技术，并更详细地研究了体外转导的内皮细胞的迁移行为。

因此，Messina等(PNAS美国89：12018(1992))证明体外转染的内皮细胞在注入循环后能够附着在完整的内皮细胞层上，并整合到其中。这样就可能排除了经血管内施用的内皮细胞只定位在血管损伤和血管生成区域的可能性。另一方面可能表明与肿瘤细胞混合注射并体外转染的内皮细胞与肿瘤血管床的血管生成有关(Lal等，PNAS美国91：9695(1994)，Nam等，脑研究731：161(1996))。因此，与内皮细胞混合移植的肿瘤细胞在体内具有明显的生长优势(Stopeck等，美国癌症研究协会学报38：265(1997))。

另一方面，转导的内皮细胞通过表达由转基因编码的活性化合物具有药物活性或者具有局部(例如施用到脑或者施用到脑肿瘤)的抗肿瘤活性(Nam等，脑研究731：161(1996)；Quinonero等，基因治疗4：111(1997))。例如，Robertson等(美国癌症研究协会学报38：382(1997))将人内皮细胞(HUVEc)(这种内皮细胞是使用AV载体进行转导的以便表达HSV-TK)与人卵巢癌细胞混合施用。施用更昔洛韦后，在肿瘤中经HSV-TK活化产生细胞抑制物，这些作者观察到裸鼠肿瘤发生明显的消退。

然而，内皮细胞在基因治疗中作为转基因细胞载体的用途由于两个主要的问题而大大受到限制：

-目前，获得足量的合适的内皮细胞仍然是十分困难的。

事实上，可以比较简单地由脐带或者细胞培养物获得异源内皮细胞，但是由于它们的免疫原性只能以有限的方式用于受体中，另一方面它们在细胞培养物中的增殖只能达到有限的的程度。

事实上，可以获得自体内皮细胞，例如，经机械方法通过“刮擦”曲张静脉或者由脂肪组织获得。然而，这种获得内皮细胞的方式不可能用于所有的患者中，并且其对患者带来较大的损伤。因此，也可以从外周血液获得成血管细胞或者内皮细胞的前体细胞(Asahara等，科学275：964(1997))。事实上，收集用于此目的所必需的血液对患者的损害不大；然而从单核血液细胞分离假设的成血管细胞和由上皮细胞分化这些成血管细胞是十分复杂的。因此，在与载体结合的单克隆抗体(对CD34或者Flk-l是特异性的)上通过免疫吸附从血液白细胞(通过密度梯度离心分离的)中分离在血液中仅以很低浓度(≤0．1％)存在的单核血细胞。接下来，在组织培养皿中用1型胶原或者纤连蛋白将这些细胞在含有牛脑的培养基上夹层培养大约4周，目的是使它们分化成内皮细胞并增殖。然而，这些细胞的增殖只可能达到有限的程度。此外，将内皮细胞与脑部物质(如牛脑)一起培养产生了很大的安全性问题。

-内皮细胞的迁移和转基因在所需要的靶区的的选择性表达还不能够得到有效地控制。

所说的内皮细胞经血管内施用之后，定位在(上文已经描述)血管生成区以及静止的内皮细胞层上或内部。此外，在细胞培养物中由前体细胞形成的内皮细胞在注射并分散到整个身体内后是否会在体内再分化成前体细胞还不清楚。

本发明解决了这两个主要的问题。2)本发明的一般性描述

A)本发明包括：

1)一种改进的(即简单而安全的)从血液和其它含有细胞的体液中分离和培养单核细胞(特别是内皮前体细胞)的方法，以及这些细胞在预防或者治疗疾病中的用途；

2)另外，以细胞特异性特别是内皮细胞特异性方式任选药理可控制地转化这些细胞，以便借助于细胞培养获得稍大量的所说的细胞；

3)产生作为效应基因载体的细胞(特别是内皮细胞)，以便将至少一种效应基因插入到按照1)或1)和2)制备的细胞中，所说的效应基因经选择合适的启动子系统可以以细胞特异性(特别是内皮细胞特异性)、任选低氧诱导地、细胞周期特异性和／或病毒特异性的方式表达；

4)施用以此方式获得的遗传修饰的细胞(特别是内皮细胞)，以便预防或者治疗疾病。

B)因此，本发明涉及用于基因治疗的细胞，所说的细胞是通过下列步骤获得的：

a)从血液或者含有细胞的体液中分离单核细胞；

b)在含有神经节苷脂、磷脂、糖脂和／或内皮细胞生长因子(包括影响分化、存活、迁移和／或血管形成的生长因子)的细胞培养基中培养步骤a)获得的细胞；

c)或者通过转化癌基因、活化癌基因或者灭活抑制基因使a)或b)中获得的细胞无限增殖化；

d)或者使用用于基因治疗的核酸构建体转染步骤a)和b)或c)中获得的细胞，所说的核酸构建体包含可以由合适的启动子系统靶细胞特异性、细胞周期特异性、病毒特异性地和／或通过低氧被活化的效应基因；

此外，下文描述了本发明的其他目的、实施方案和相应的实施例。

3)内皮细胞的制备

3．1．)内皮细胞之前体细胞的分离和培养

按照本发明的由内皮细胞分离前体细胞的方法可以分成下列步骤：

使用本领域技术人员熟知的侵入方法从各个器官中分离含有细胞的体液。这些含有细胞的体液例如包括：

-从静脉、毛细血管、动脉、脐带或胎盘中获得的血液

-骨髓细胞悬浮液

-脾细胞悬浮液

-淋巴节细胞悬浮液

-腹膜细胞悬浮液

-胸膜细胞悬浮液

-淋巴

-结缔组织液(例如由浅表损坏(如机械损坏)的表皮的表面流出的液体)。

从这些体液中通过密度梯度离心分离红细胞、粒性白细胞以及其它细胞组分，按照为本领域技术人员公知的方法通过差式离心分离沉淀。

将以此方法分离的单核(含有细胞核)细胞悬浮在含有血清的细胞培养基中。所用的细胞培养基含有神经节苷脂、磷脂和／或下文提及的生长因子。

在本发明的特定实施方案中，分离的单核(含有细胞核)细胞培养在这种细胞培养基中，并分化成类似内皮细胞的细胞。

在本发明的另一个特定的实施方案中，分离的含有细胞核的单核细胞与抗单核细胞／巨噬细胞典型的表面标记物(CD11、CD11b、CD13、CD14、CD34、CD64、CD68，所说的表面标记物与包被多糖的铁或者氧化铁微粒结合)的抗体一起培养，洗涤并通过磁体回收以此方式包被的细胞。将这些细胞加入到含有神经节苷脂、磷脂和／或下文提到的生长因子的细胞培养基中，使之在体外进一步增殖并分化成内皮细胞。在所说的细胞增殖和／或分化后，使之进行无限增殖化和／或转染。

在本发明的另一个实施方案中，将分离的含有细胞核的细胞预培养在上文提到的细胞培养基中一小时以上，以便使之进一步分化和增殖。在这种条件下，被认为是内皮前体细胞的细胞产生了越来越典型的单核细胞／巨噬细胞表面标记物(CD11、CD11b、CD13、CD14、CD34、CD64、CD68)。然后分离这些细胞，例如通过磁体使用抗体回收这些细胞，所说的抗体抗这些单核细胞的标记物(例如CD11和CD14)，并与包被葡聚糖的铁颗粒结合。这些细胞在体外进一步增殖，并分化成内皮细胞。

此外，也可以由非附着单核细胞分离CD34-阳性细胞(造血干细胞)，例如通过Asahara等(科学275、964(1997))描述的方法，并在体外进一步增殖，分化成内皮细胞。

在本发明特定的实施方案中，将分离的含有细胞核的细胞悬浮在细胞培养基中，余下的吞噬细胞(例如单核细胞、巨噬细胞、粒性白细胞)通过吸附到表面或通过载有蛋白并包被有葡聚糖的铁颗粒的吞噬作用借助于磁体和／或者按照本领域技术人员公知的方法通过逆流离心除去，将余下的包含CD34-阳性细胞的单核细胞培养在按照本发明的细胞培养基中并分化成类内皮细胞的细胞。

用细胞外基质组分(例如参见Sigma的结合和基质因子)(如纤连蛋白)包被所说的细胞培养器。将神经节苷脂、磷脂和／或糖脂加入到细胞培养基中，和／或然而，按照本发明优选的是加入内皮细胞生长因子，例如：

-血管内皮生长因子(VEGF)和／或其它的KDR或Fit配体

-成纤维细胞生长因子(FGFα、FGFβ)和／或

-表皮生长因子(EGF)和／或

-类胰岛素生长因子(IGF-1、IGF-2)和／或

-β-内皮细胞生长因子(ECGF)和／或

-内皮细胞附着因子(ECAF)和／或

-白介素3(IL-3)和／或

-GM-CSF和／或

-G-CSF和／或

-白介素-4(IL-4)和／或

-白介素-1(IL-1)和／或

-集落刺激因子(CSF-1)和／或

-白介素-8(IL-8)和／或

-血小板衍生生长因子(PDGF)和／或

-干扰素γ(IFNγ)和／或

-制癌素M和／或

-LIF和／或

-B61和／或

-血小板衍生内皮细胞生长因子(PDEGF)和／或

-干细胞因子(SCF)和／或

-转化生长因子β(TGF-β)和／或

-血管生成素和／或

-多效因子(pleiotrophin)和／或

-Fit-3配体(FL)

-Fie-2-配体(如angiopoietin-1)和／或

-基质衍生因子-1(SDF-1)和／或

-midkines。

在培养一段时间(6小时-8周)后，按照本发明进一步处理生长的细胞。

以此方式分离的内皮细胞也可以直接用于改进受损伤血管的内皮化和促进血管生成。

3．2．)内皮细胞的分离

然而，除了如3．1．)部分所示的本发明的方法外，也可以使用本领域技术人员公知的方法获得内皮细胞，例如由脂肪组织、通过刮擦静脉或移出脐带内皮来获得。内皮细胞的培养如3．1．)部分所述。

4)内皮细胞的无限增殖化

按照本发明，可以将蛋白质的核苷酸序列(组分a)插入到一个或多个非附着单核细胞或按照本发明的内皮细胞中，这样可以使这些细胞连续地通过细胞分裂周期，而变成不会改变的“永久”分裂细胞系。已经知道这种无限增殖化核苷酸序列或者基因。例如这些核苷酸序列包括致癌基因。按照本发明，所说的癌基因可以是细胞或者病毒来源的。Wynford-Thomas(病理学杂志165：187(1991))、Harrington等(Curr．Opin．Genet．Developm．4：120(1994))、Gones等(抗癌研究13：1117(1993))、Baserga等(癌症调查16：201(1993))已经综合描述了细胞致癌基因的例子。

可以使用本领域技术人员公知的方法将这一类型的致癌基因引入到所说的细胞中。然而在它们的基因组中，细胞也携带原癌基因，按照本发明，可以利用本领域技术人员公知的方法在细胞中活化这些原癌基因，即将它们转化成为致癌基因。

在本发明特定的实施方案中，组分a)代表一种核苷酸序列，所说的核苷酸序列编码灭活抑制基因之蛋白质的蛋白质。

Karp和Broder(自然医学4：309(1995))、Skuse和Ludlow等(Lancet345：902(1995))、Duan等(科学269：1402(1995))、Hugh等(癌症研究55：2225(1995))和Knudson(PNAS美国90：10914(1993))已经综合描述了抑制基因的例子。

编码灭活抑制基因表达产物的蛋白质的基因(组分a))的例子如下。

表1抑制基因的蛋白质    按照本发明的基因(组分a))编码：成视网膜细胞瘤蛋    -腺病毒E1A蛋白质(Whyte等，自然334：白(Rb蛋白)和        124(1988))相关的蛋白，例如    -SV40病毒的大T抗原(De Caprio等，细胞54：p107和              275(1988))p130

                -乳头瘤病毒的E7蛋白质(例如HPV-16，HPV-

                18)(Dyson等，科学243：934(1989))

                -包含下列氨基酸序列的蛋白质：LXDXLXXL-

                II-LXCXEXXXXXSDDE(SEQ NO：1)，其中

                的X是可变的氨基酸，-II-是7-80个氨基酸(选自

                翻译产物中存在的20种天然的氨基酸)的任何所

                需的氨基酸链(Münger等，癌症调查12：

                197(1992))p53                 -腺病毒的E1B蛋白质(Sarnow等，细胞28：

                287(1982))

                -SV40病毒的大T抗原(Lane等，自然278：

                261(1979))

                -乳头瘤病毒的E6蛋白质(如HPV-16、HPV-

                18)(Verness等，科学248：76(1990)；Scheffner

                等，细胞63：1129(1990))

                -MDM-2蛋白质(Momand等，细胞69：

                1237(1992)；Oliner等，自然362：857(1993)；

                Kussie等，科学274：948(1996))

本发明的另一个特定的实施方案中，组分a)是编码细胞周期调节蛋白质的突变核苷酸序列，这种序列通过突变进行改良，结果使之仍可以充分活化细胞周期，但其功能不再被细胞抑制物抑制。在本发明中，这些核苷酸序列包括编码细胞周期蛋白依赖性激酶的突变核苷酸序列，尽管这种突变使之仍保持它们的激酶活性，但失去了与细胞cdk抑制物结合的能力。

组分a)的例子是：

-突变的cdk-4，因此p16、p15和／或p21对它不再有抑制作用

-突变的cdk-6，因此p15和／或p18对它不再有抑制作用

-突变的cdk-2，因此p21和／或p27和／或WAF-1对它不再有抑制作用。

例如，cdk4的突变可以是半胱氨酸在24位置上取代精氨酸，这样这种突变的cdk4具有激酶活性，但是p15和p16对其不再有抑制作用用(Wolfel等，科学269：1281(1995))。

在本发明的另一个实施方案中，组分a)是一种转化基因，其表达由自我扩增启动子元件调节，如果合适，所说的启动子元件调节可以与药理可控制的启动子结合使用(参见6．4部分)。

在本发明另一个优选的实施方案中，将含有内皮细胞特异性启动子或者增强子序列(组分b)和组分a)，内皮细胞转录因子与组分b)的结合活化组分a)的转录)的核苷酸序列插入到内皮细胞，特别是内皮细胞的前体细胞或者细胞混合物中的细胞，所说的细胞混合物包含一定比例的内皮细胞、或者内皮细胞的前体细胞或者一定比例的CD34-、CD11-、CD11b-、CD14-、CD13-、CD64-和CD68-阳性细胞(它们的浓度和血液中的浓度相比有所增加)。

为了使组分a)的表达产物更好地保留在细胞核中，将组分a)与核定位信号(组分c)结合到一起是可能的。图1以举例的方式表示了如此形成的各种组分排列。

通过引入包含如图1所示的各组分的核酸构建体，只能转变内皮细胞和存在于无限增殖阶段(即永久的分裂细胞)的异源细胞混合物中的内皮细胞前体，这样几天后这些内皮细胞就成为细胞培养物中的主要部分，再过一段时间(取决于培养条件，但是确定的)成为细胞培养物中的唯一的细胞。

使用这些核酸构建体和按照本发明的方法，在相对较短的时间内，以较低费用由少数几个内皮细胞或少数几个内皮细胞的前体细胞制备大量的用于预防或者治疗目的的同质内皮细胞是可能的，尽管所说的内皮细胞或它们的前体存在于异质的细胞混合物中。

5)制备用于预防和／或治疗目的的遗传修饰的内皮细胞

按照本发明，核酸构建体将被引入到由按照一种本发明的方法获得的内皮细胞中，所说的核酸构建体含有至少下列组分：

-启动子(组分d)

-编码活性化合物或者酶的结构基因(组分e)

6)启动子序列的选择

在本发明的范围内，将要用作为启动子序列的核苷酸序列在与转录因子结合后能够活化位于其3’末端的转基因的转录，例如结构基因的转录。在本发明中，将至少一种内皮细胞特异性启动子序列(组分b)和／或组分d))插入到内皮细胞中。这种内皮细胞特异性启动子序列可以与至少一种另外的启动子序列结合使用。与所说的内皮细胞特异性启动子结合使用的启动子序列(一个或多个)的选择取决于将要治疗的疾病。因此，可能以非限制的方式、内皮细胞特异性地、在一定的代谢条件下(如低氧)诱导该另外的启动子序列；或者通过药物诱导或者关闭之；或通过病毒特异性和／或细胞周期特异性地活化之。专利申请EP95931204．2、EP95930524．4、EP95931205．9、EP95931933．6、EP96110962．2、DE19704301．1、EP97101507．8、EP97102547．3、DE19710643．9和EP97110995．8已经描述了这一类型的启动子。这些专利申请引入本文作为参考。例如，可选择的启动子序列包括：

6．1．)可非限制性活化的启动子和活化序列，

例如：

-RNA聚合酶Ⅲ的启动子

-RNA聚合酶Ⅱ的启动子

-CMV启动子和增强子

-SV40启动子。

6．2．)可通过代谢活化的启动子和增强子序列

例如，可由低氧诱导的增强子(Semenza等，PNAS88：5680(1991)，McBurney等，核酸研究19：5755(1991))。

6．3．)可被细胞周期特异性活化的启动子

例如，它们是cdc25B基因的启动子、cdc25C基因的启动子、细胞周期蛋白A基因的启动子、cdc2基因的启动子、B-myb基因的启动子、DHFR基因的启动子、E2F-1基因的启动子或者在细胞增殖期间其它与转录因子结合或活化的序列。这些结合的序列包括，例如c-myc蛋白质的结合序列。在这些结合的序列中包括命名为Mye E盒(5′-GGAAGCAGACCACGTGGTCTGCTTCC-3′(SEQ ID NO．：2)；Blackwood和Eisenmann，科学251：1211(1991))的核苷酸序列的单体或者多体。

6．4．)自我增强和／或药理可控制的启动子

在最简单的情况下，相同或者不同启动子结合使用中，一个启动子可以是可诱导型的，例如可以是由四环素以四环素操纵子结合合适的阻抑物形式活化或关闭的启动子形式。

然而，按照本发明，所说的启动子也可以是自我增强型的，带有或者也可以不带有药理可控制的启动子单元。

专利申请DE19651443．6已经描述了这种类型的自我增强型和／或药理可控制的启动子，此参考文献本文明确引用。

6．5．)可内皮细胞特异性活化的启动子

这些启动子包括那些编码在内皮细胞中优先形成的蛋白质编码基因的启动子、或者启动子活化序列、或者增强子。

在本发明中，例如将使用下列蛋白质编码基因的启动子：

-脑特异性内皮葡萄糖-1-转运蛋白

-endoglin

-VEGF受体1(fit-1)

-VEGF受体2(fit-1，KDR)

-tie-1或者tie-2

-B61受体(Eck受体)

-B61

-内皮肽，尤其是内皮肽B或者内皮肽-1

-内皮肽受体，特别内皮肽B受体

-甘露糖-6-磷酸受体

-维勒布兰德因子

-IL-1α，IL-1β

-IL-1受体

-血管细胞附着分子(VCAM-1)

-间质细胞附着分子(ICAM-3)

-合成的活化序列

其它可以使用的天然内皮细胞特异性启动子的替代物也是合成的活化序列，所说的活化序列包括在内皮细胞中具有优先或选择性活性的转录因子的寡聚结合位点。转录因子的一个例子是转录因子GATA-2，其在内皮肽-1基因中的结合位点是5′-TTATCT-3′(Lee等，生物化学16188(1991)，Dormann等，生物化学杂志1279(1992)和Wilson等，分子细胞生物学4854(1990)。

7)相同或者不同的启动子的结合使用

例如，可以通过几个启动子在读码方向上由核苷酸序列的5’→3’的连续的连接而使相同的启动子组合到一起。

然而，对于相同或者不同的启动子的结合使用，专利申请GB9417366．3、EP97101507．8、EP97102547．3、DE19710643．9、DE19617851．7、DE19639103．2和DE19651443．6已经详尽地描述了优选使用的技术。本发明中明确地引用这些专利申请。这一类型的技术的例子是：

7．1．)嵌合的启动子

嵌合的启动子是指位于上游的细胞特异性、代谢或者病毒特异性活化的活化序列及位于下游的启动子组件的组合，所说的嵌合启动子含有核苷酸序列CDE-CHR或者E2FBS-CHR，它们与阻遏蛋白结合，这样可以在细胞周期的G₀和G₁期抑制位于上游的活化序列的活化(GB9417366．3；Lucibello等，EMBO杂志，12(1994))。

有关作用方式，特别是启动子元件CDE-CHR的作用方式的连续研究表明，位于上游的活化序列的CDE-CHR元件对依赖于细胞周期的调节作用在很大程度上依赖于由富含谷酰胺的活化域活化的转录因子序列的活化(Zwicker等，核酸研究，3822(1995))。

这一类型的转录因子，例如，包括Spl和NF-Y。

因而，这就限制了嵌合启动子中启动子元件CDE-CHR的使用。推测B-myb基因的启动子元件E2F-BS-CHB由将如此(Zwicker等，核酸研究23，3822(1995))。

7．2．)杂合启动子

在专利申请DE19639103．2中已经描述了杂合启动子。为了将至少另一个启动子和内皮细胞特异性启动子组合在一起，例如，选择了共含有下列组分的基因构建体：

内皮细胞特异性启动子的核苷酸序列，其中至少有一个转录因子的结合位点发生突变。通过突变阻止了效应基因转录的起始。

作为效应基因的转基因，其编码活性化合物。

至少另一个启动子或者增强子序列，其可被非特异性活化、细胞特异性活化、病毒特异性活化、可被四环素和／或细胞周期特异性活化，所说的活化物活化了至少一个转录因子的至少一个基因的转录，所说的基因发生突变以便它能够结合到在内皮细胞特异性启动子中突变的结合位点上，因此能够使之活化。

在本发明例举性的实施方案中，在启动子序列中显示突变是可能的，例如cdc25B启动子的TATA盒的突变。

例如，TATA的突变可以是TGTATAA。通过这一突变，正常的结合TATA盒的蛋白质(TBP)的DNA-结合位点不能被识别，并且不再能有效地转录效应基因。因此，编码TBP的核酸序列必须有协突变(comutation)。通过这一协突变，TBP结合到突变的TATA盒(例如TGTATAA)上，因此导致效应基因的有效转录。例如，Strubin和Struhl(细胞，721(1992))和Heard等(EMBO J．，3519(1993))已经描述了这一类型的TBP基因的协突变。

7．3．)与核保持信号和核输出因子结合的多启动子

在专利申请DE19617851．7中已经详尽地描述了这一技术。此专利申请引入本文作为参考。

按照本发明，这一类型的启动子含有下列组分：

-第一内皮细胞特异性、可活化的启动子或者增强子序列，其活化转基因的基础转录

-作为效应基因并编码活性化合物的转基因，

-核保持信号(NRS)，它的cDNA的5’末端间接或直接连接到结构基因(b)的3’末端，

-优选地，核保持信号的转录产物具有核输出因子的结合结构，

-另一种非特异性、细胞特异性、病毒特异性、代谢和／或细胞周期特异性可活化的启动子或者增强子序列，其能活化核输出因子的基础转录，

-编码核输出因子(NEF)的核酸，它能结合到核保持信号的转录产物上，并调节转基因的转录产物从细胞核的转运。

优选地，编码核保持信号的基因选自HIV-1或者HIV-2的Rev-应答元件(RRE)、逆转录病毒的RRE-等同物保持信号和HBV的RRE-等同物保持信号。

优选的核输出因子基因选自病毒HIV-1和HIV-2、呼吸困难病毒(maedi-visna)、羊风湿性关节炎脑炎病毒、马传染性贫血病毒、猫免疫缺损病毒、反转录病毒、HTLV的Rev基因或者hnRNP-A1蛋白质的基因或者TFⅢ-A转录因子的基因。

7．4．)活化物应答性启动子单元

在专利申请DE19617851．7中已经详尽描述了活化物应答性启动子单元。此专利申请引入本文作为参考。

活化物应答性启动子单元是由下列组分组成的：

-一种或多种相同或不同的启动子或者增强子序列，例如所说的序列可以被细胞周期特异性、细胞增殖依赖性、代谢特异性、内皮细胞特异性、或病毒特异性或者同时具有细胞周期特异性和代谢特异性、内皮细胞特异性或者病毒特异性地(所谓的嵌合启动子)活化，

-一种或多种相同或不同的亚单位，该亚单位位于启动子或者增强子序列的下游，并且在它们的基础转录中由所说的启动子或增强子活化。

-由一种或多种活化物亚单位表达产物活化的活化物应答性启动子。

在优选的实施方案中，按照本发明的活化物应答性启动子单元可以是DNA结合区域、蛋白-蛋白相互作用区域和反式活化域中的嵌合转录因子的结合序列。在本申请中提到的所有转录因子结合位点可以是以单独形式存在(单体)或者以多拷贝形式存在(多聚体，例如，多达10个拷贝)。

由两个活化物亚单位活化的活化物应答性启动子的例子是与SV40启动子结合的LexA操纵子。

-第一个活化物亚单位包含编码LexA-DNA结合蛋白的1-81或者1-202氨基酸的cDNA，它的3’末端连接到Gal80蛋白质(1-435个氨基酸)的cDNA的5’末端上，

-第二个活化物亚单位包含编码Gal4蛋白质的Gal80结合区域的851-881氨基酸的cDNA，它的3’末端连接到编码SV40的大T抗原的126-132氨基酸cDNA的5’末端上；所说的SV40的cDNA的3’末端连接到编码HSV-1之VP16的反式活化域的406-488氨基酸cDNA的5’末端上。

由两个活化物亚单位活化的活化物应答性启动子的另一个例子是与SV40启动子结合的Gal4蛋白质的结合序列。

-第一个活化物亚单位包含编码Gal4蛋白质DNA结合区域(1-147氨基酸)的cDNA，它的3’末端连接到Gal80蛋白质(1-435个氨基酸)的cDNA的5’末端上。

-第二个活化物亚单位包含Gal4的Gal80结合区域(851-881氨基酸)的cDNA，它的3’末端连接到SV40(SV40大T抗原，126-132氨基酸)的核定位信号的cDNA的5’末端上；所说的SV40的cDNA的3’末端连接到编码HSV-1之VP16的反式活化域的406-488氨基酸cDNA的5’末端上。

活化活化物应答性启动子的两个活化物亚单位的另一个例子由Gal4蛋白的结合序列和SV40启动子构成，其组成如下：

-第一个活化单元，其包含CD4 T-细胞抗原的胞质区域(氨基酸397-435)的cDNA，它的5’末端连接到HSV-1之VP16的反式活化域(406-488氨基酸)的cDNA的3’末端上，所说的HSV-1的cDNA的5’末端连接到SV40(SV40大T抗原，16-132氨基酸)核定位信号的cDNA的3’末端上，和

-第二个活化单元包含SV40(SV40大T抗原，16-132氨基酸)核定位信号的cDNA、Gal4蛋白的DNA结合区域(1-147氨基酸)的cDNA，它的3’末端连接到p56 1ck蛋白质的CD4结合序列(1-71氨基酸)的cDNA的5’末端上。

8)效应基因的选择

在本发明中，按照本发明的核苷酸序列含有至少一个效应基因(组分e)，此基因编码用于预防和／或治疗疾病的药理活性化合物。这种活性化合物选自下列物质：细胞因子；生长因子；抗体；抗体片段；细胞因子或生长因子的受体；具有抗增殖性、编程性细胞死亡或细胞抑制活性的蛋白质；血管生成抑制物；凝血抑制物；具有纤维蛋白溶解活性的物质；血浆蛋白；补体活化蛋白；肽激素；病毒外被蛋白；细菌抗原；寄生虫抗原；对血液循环起作用的蛋白；和核酶。

优选地，所说的转基因是编码核酶的结构基因，所说的核酶灭活编码下列蛋白质的mRNA：细胞周期调节蛋白，特别是细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白E、E2F1-5、cdc2、cdc25C或者DP1；或者病毒蛋白质；或者细胞因子；或者生长因子或者它们的受体。在另一个实施方案中，所说的效应基因可以编码切割药物的前体使之成为药物的酶。

在另一个实施方案中，所说的效应基因可以编码配体-效应物融合蛋白质，所说的配体可以是抗体、抗体片段、细胞因子、生长因子、附着分子或者肽激素；所说的效应物是上文描述的具有药理活性的化合物或是一种酶。例如，所说的结构基因可以编码配体-酶融合蛋白质，所说的酶是可以切割药物前体的酶，配体是能够与细胞表面结合(优选的是与内皮细胞或者肿瘤细胞结合)的配体。

在本发明中，对效应基因及启动子元件(可以与内皮细胞特异性启动子相结合，也可以不与其结合)的选择取决于特定疾病的预防和／或治疗的方式。

例如，在下列疾病的情况下将选择下列启动子序列和效应基因的组合(专利申请EP97101507．8、EP97102547．3、DE19710643．9、DE197704301．1、DE19617851．7、E19639103．2、DE19651443．6、EP95931204．2、EP95930524．4、EP95931205．9、EP95931933．6和DE19701141．1对此进行了详细地描述，其全部内容引入本文参考)。

8．1．)肿瘤的治疗

8．1．1．)附加的启动子：

-非特异性的和／或

-细胞周期特异性的和／或

-可通过代谢活化的

8．1．2．)细胞增殖抑制剂效应基因，所说的抑制剂如：

-成视网膜细胞瘤蛋白(pRb=p110)或者相关的p107和p130蛋白

-成视网膜细胞瘤蛋白(pRb／p110)和相关的p107和p130蛋白经磷酸化灭活。优选地，这些待用的细胞周期抑制剂的基因是那些所表达蛋白质的灭活位点已经发生突变的基因，而它们的功能没有被破坏。这些突变的例子如p110所示。p107蛋白或p130蛋白的DNA序列也发生了类似的突变。

-p53蛋白

-蛋白质p53在细胞中的灭活是通过其与特异蛋白质(如MDM2)的结合或者经去磷酸化的C-端丝氨酸将p53寡聚化而完成的。这样，优选使用的是在C-端截短至丝氨酸392的p53蛋白的DNA序列。

-p21(WAF-1)

-p16蛋白

-其它cdk抑制物

-GADD45蛋白

-bak蛋白

8．1．3．)凝集诱导因子和血管生成抑制物的效应基因，例如：

-纤溶酶原活化物抑制剂-1(PAI-1)

-PAI-2

-PAI-3

-血管抑制素(angiostatin)

-干扰素(IFNα、IFNβ或者IFNγ)

-血小板因子-4

-TIMP-1

-TIMP-2

-TIMP3

-白血病抑制因子(LIF)

-组织因子(TF)和它的具有凝固活性的片段

-因子X或者因子X的突变体，对应于专利申请D19701141．1，本文明确引用该文献。

8．1．4．)细胞抑制物和细胞毒性蛋白质的效应基因，例如

-穿孔素

-粒酶

-IL-2

-IL-4

-IL-12

-干扰素，例如IFN-α、IFNβ或者IFNγ

-TNF，如TNFα或者TNFβ

-制瘤素M

-鞘髓磷脂酶

-爪蟾抗菌肽和爪蟾抗菌肽衍生物

8．1．5．)细胞抑制性或者细胞毒性抗体的效应基因以及抗体的抗原结合片段与细胞抑制性、细胞毒性或者炎性蛋白或者酶形成的融合蛋白的效应基因

-细胞抑制性或者细胞毒性抗体包括针对内皮细胞膜结构的那些抗体，所说的抗体例如已经由Burrows等(药物治疗64，155(1994))、Hughes等(癌症研究49，6214(1989))和Maruyama等(PNAS USA87，5744(1990))描述过。尤其是，这些抗体包括抗VEGF受体的抗体。

-此外，这些抗体包括直接针对于肿瘤细胞膜结构的细胞抑制性或者细胞毒性抗体。例如，Sedlacek等(Contrib．to Oncol．32，Karger Verlag，Munich(1988)和Contrib．to Oncol．43，Karger Verlag，Munich(1992))已经综合描述了这一类型的抗体。另外的例子是抗sialyl Lewis的抗体、抗肿瘤肽的抗体(所说的肿瘤肽由T细胞识别)、抗致癌基因表达的蛋白质的抗体、抗神经节苷脂(如GD3、GD2、GM2、9-O-乙酰GD3、岩藻糖GM1)的抗体、抗血型抗原和它们前体的抗体、抗多形上皮粘蛋白抗原的抗体、抗热激蛋白抗原的抗体。

-此外，这些抗体包括针对白血病细胞膜结构的抗体。大量用于诊断和治疗过程的这一类型单克隆抗体已经有所描述(Kristensen，丹麦医学公报41，52(1994)；Schranz，Therapia Hungarica 38，3(1990)；Drexler等，白血病研究10，279(1986)；Naeim，疾病标志物7，1(1989)；Stickney等，肿瘤学的最新观点4，847(1992)；Drexler等，Blut57，327(1988)；Freedman等，癌症研究9，69(1991))。根据白血病的类型，例如合适的配体是直接针对于下列膜抗原的单克隆抗体或者与它们的抗原结合性抗体片段。

表2细胞               膜抗原AML                CD13

               CD15

               CD33

               CAMAL

               Sialosyl-LeB-CLL              CD5

               CD1c

               CD23

               膜免疫球蛋白的独特型和同种型T-CLL              CD33

               M38

               IL-2受体

               T-细胞受体ALL                CALLA

               CD19

               非何杰金氏病淋巴瘤

按照本领域技术人员公知的技术将鼠抗体人源化、制备和优化Fab和rec．Fv片段的基因(Winter等，自然349，293(1991)；Hoogenbooms等，Rev．Tr．Transfus．Hemobiol．36，19(1993)；Girol．Mol．Immunol．28，1379(1991)或Huston等，国际免疫学综述lO，195(1993))。同样按照本领域技术人员公知的现有技术将rec．Fv片段与细胞抑制性、细胞毒性或者炎性蛋白或者酶的基因融合。

8．1．6．)与另外的内皮细胞或肿瘤细胞结合的配体与细胞抑制性、细胞毒性蛋白质或者酶之间的融合蛋白的效应基因。所说的配体包括，例如所有与膜结构或内皮细胞膜受体结合的物质。例如，这些物质包括：

-抗体或者抗体片段

-细胞因子，例如IL-1或生长因子或者它们的片段、或者它们与内皮细胞表达的受体相结合的部分序列(如PDGF、bFGF、VEGF、TGF)。

-此外，这些物质包括与活化的和／或增殖性内皮细胞结合的附着分子。例如，这些物质包括SLex、LFA-1、MAC-1、LECAM-1、VLA-4或者玻连蛋白。

-这些物质还包括与肿瘤或者白血病细胞的膜结构或者膜受体结合的物质。例如，这些物质包括生长因子或者它的片段、或者它们与白血病细胞或者肿瘤细胞表达的受体相结合的部分序列。

这一类型的生长因子已有所描述(Cross等的综述，细胞64，27l(1991)，Aulitzky等，药物48，667(1994)，Moore，临床癌症研究l，3(1995)，VanKooten等，Leuk．Lymph．12，27(1993))。

-根据现有技术使用本领域技术人员公知的方法将这些靶细胞结合性配体的基因与细胞抑制性、细胞毒性或者炎性蛋白或者酶的基因融合在一起。

8．1．7．)炎症诱导物的效应基因，所说的诱导物例如

-IL-1

-Ⅱ-2

-RANTES(MCP-2)

-单核细胞趋化和活化因子(MCAF)

-Ⅱ-8

-巨噬细胞炎症蛋白-1(MIP-lα，β)

-嗜中性活化蛋白-2(NAP-2)

-IL-3

-IL-5

-人白血病抑制性因子(LIF)

-IL-7

-IL-5

-eotaxin

-IL-13

-GM-CSF

-G-CSF

-M-CSF

-眼镜蛇毒液因子(CVF)或者在功能上相当于人补体因子C3b的CVF的部分序列，即所说的部分序列与因子补体B结合，在由因子D切割后，产生C3转化酶，

-人补体因子C3或它的部分序列

-人补体因子C3的切割产物，其在功能上和结构上与CVF相似

-能够激活补体或产生炎症的细菌蛋白质，如鼠伤寒沙门氏菌的孔蛋白(porines)、金黄色葡萄球菌的“聚集”因子、modulins、特别是革兰氏阴性细菌的modulins、军团菌属或者B型流感嗜血菌或者克雷白氏杆菌属的“主要外膜蛋白”、或者G组链球菌的M分子。

8．1．8．)能够活化细胞抑制物前体的酶的效应基因，例如，能够将无活性的原物质(前药)切割成活性细胞抑制物(药物)的酶的效应基因。

Deonarain等(英国癌症杂志70，786(1994))，Mullen，药物治疗63，199(1994))和Harris等(基因治疗1，170(1994))已经综合描述每一种情况下的这一类型的物质和相关的前药及药物。例如，将使用下列酶之一的DNA序列：

-单纯性疱疹病毒胸苷激酶

-水痘带状疱疹病毒胸苷激酶

-细菌硝基还原酶

-细菌β-葡糖醛酸糖苷酶

-黑麦的β-葡糖醛酸糖苷酶

-人β-葡糖醛酸糖苷酶

-人羧肽酶(CB)，例如肥大细胞的CB-A、胰腺的CB-B或者细菌羧肽酶

-细菌β-内酰胺酶

-细菌胞嘧啶脱氨酶

-人过氧化氢酶或者过氧化物酶

-磷酸酶，特别是人碱性磷酸酶、人酸性前列腺磷酸酶或者5型酸性磷酸酶

-氧化酶，特别是人赖氨酰氧化酶或者人酸性D-氨基-氧化酶

-过氧化物酶，特别是人谷胱甘肽过氧化物酶、人嗜伊红性粒细胞过氧化物酶或者人甲状腺过氧化物酶

-半乳糖苷酶。

8．2．)自身免疫疾病和炎症的治疗

8．2．1．)附加的启动子：

-非特异性的和／或

-细胞周期特异性和／或

-可通过代谢活化的

8．2．2．)用于变态反应治疗的效应基因，例如

-IFNβ

-IFNγ

-IL-10

-抗IL-4的抗体或者抗体片段

-可溶性IL-4受体

-IL-12

-TGFβ

8．2．3．)用于防止移植器官排斥的效应基因，例如

-IL-10

-TGFβ

-可溶的IL-1受体

-可溶的IL-2受体

-IL-1受体拮抗剂

-可溶的IL-6受体

-免疫抑制剂抗体或者它们含有VH-和VL-的片段、或者它们的经接头结合的VH和VL片段。例如免疫抑制剂抗体是T-细胞受体或者它的CD3复合物的抗体；抗CD4或者CD8的抗体，另外抗IL-2受体、IL-1受体或者IL-4受体的抗体；或者抗附着分子CD2、LFA-1、CD28或者CD40的抗体。

8．2．4．)治疗抗体介导的自身免疫疾病的效应基因，例如

-TGFβ

-IFNα

-IFNβ

-IFNγ

-IL-12

-可溶的IL-4受体

-可溶的IL-6受体

-免疫抑制剂抗体或者它们的含有VH-和VL-的片段

8．2．5．)治疗细胞介导的自身免疫疾病的效应基因，例如

-IL-6

-IL-9

-IL-10

-IL-13

-TNFα或者TNFβ

-免疫抑制剂抗体或者它的含有VH-和VL-的片段

8．2．6．)细胞增殖抑制物、细胞抑制性或者细胞毒性蛋白质、炎症诱导物和活化细胞抑制物前体的酶的效应基因

编码这一类型蛋白质的基因的例子已经列于“治疗肿瘤的结构基因”部分。

以已描述的相同形式，在本发明中，可以使用编码融合蛋白的结构基因，所说的融合蛋白是抗体或这些抗体的Fab或rec．Fv片段或所说的靶细胞的其它配体与上文提到的细胞因子、生长因子、受体、细胞抑制性或者细胞毒性蛋白质及酶的融合蛋白。

8．2．7．)治疗关节炎的结构基因

在本发明中，选择这样的结构基因，其表达的蛋白质直接或间接抑制炎症(例如关节处的炎症)，和／或促进关节胞外基质(软骨，结缔组织)的重建。

这包括，例如：

-IL-1受体拮抗剂(IL-1-Ra)；

IL-1-RA阻止对IL-1α、β的结合

-可溶的IL-1受体；

可溶的IL-1受体与IL-1结合并使之灭活

-IL-6

IL-6经滑液细胞和软骨细胞增加TIMP和过氧化物的分泌，减少IL-1和TNFα的分泌。

-可溶的TNF受体

可溶性TNF受体与TNF结合，并使之灭活。

-IL-4

IL-4抑制IL-1、TNFα和MMP的形成和分泌

-IL-10

IL-10抑制IL-1、TNF∝和MMP的形成和分泌，并且增加TIMP的分泌。

-类胰岛素生长因子(IGF-1)

IGF-1刺激胞外基质的合成。

-TGFβ，尤其是TGFβ1和TGFβ2

TGFβ刺激胞外基质的合成。

-过氧化物岐化酶

-TIMP，尤其是TIMP-1、TIMP-2或者TIMP-3

8．3．)血细胞形成缺陷的治疗

8．3．1．)附加的启动子

-细胞非特异性和／或

-细胞周期特异性和／或

-可通过代谢活化的

8．3．2．)治疗贫血的效应基因，例如

-红细胞生成素

8．3．3．)治疗白细胞减少的效应基因，例如

-G-CSF

-GM-CSF

-M-CSF

8．3．4．)治疗血小板减少的效应基因，例如

-IL-3

-白血病抑制性因子(LIF)

-IL-11

-血小板生成素

8．4．)神经系统损害的治疗

8．4．1．)附加的启动子

-非特异性和／或

-细胞周期特异性和／或

-可通过代谢活化的

8．4．2．)神经元生长因子的效应基因，所说的神经元生长因子例如

-FGF

-神经生长因子(NGF)

脑衍生的神经营养因子(BDNF)

-神经营养蛋白-3(NT-3)

-神经营养蛋白-4(NT-4)

-睫状神经营养因子(CNTF)

8．4．3．)酶的效应基因，例如

-酪氨酸羟化酶

-多巴脱羧酶

8．4．4．)细胞因子和它们抑制物的效应基因，所说的细胞因子和它们的抑制物能够抑制或中和TNFα的神经毒性作用，例如：

-TGFβ

-可溶的TNF受体

TNF受体中和TNFα

-IL-10

IL-10抑制IFNγ、TNFα、IL-2和IL-4的形成

-可溶的IL-1受体

-IL-1受体Ⅰ

-IL-1受体Ⅱ

可溶性IL-1受体中和IL-1的活性

-IL-1受体拮抗剂

-可溶的IL-6受体

8．5．)血液凝固和血液循环系统疾病的治疗

8．5．1．)附加的启动子

-细胞周期特异性和／或

-细胞非特异性和／或

-可通过代谢活化的

8．5．2．)抑制凝血或促进纤溶的效应基因，例如

-组织纤溶酶原活化物(tPA)

-尿激酶型纤溶酶原活化物(uPA)

-tPA和uPA的杂合体

-蛋白C

-水蛭素

-丝氨酸蛋白酶抑制物(serpines)，例如：

C-1S抑制物、α1-抗胰蛋白酶或者抗凝血酶III

-组织因子途径抑制物(TFPI)

8．5．3．)促进凝血的效应基因，例如

-F Ⅷ

-FIX

-维勒布兰德氏因子

-F XⅢ

-PAI-1

-PAI-2

-组织因子和它的片段

8．5．4．)血管生成因子的效应基因，例如

-VEGF

-FGF

8．5．5．)降血压的效应基因，例如

-血管舒缓素

-内皮细胞＂氧化氮合成酶＂

8．5．6．)在内皮层损伤之后，抑制平滑肌细胞增殖的效应基因，例如：

-抗增殖蛋白质、细胞抑制性或者细胞毒性蛋白质或者

-如上文所述在肿瘤中切割细胞抑制物前体的酶，或者

-这些活性化合物之一与配体(例如肌细胞的特异抗体或抗体片段)的融合蛋白

8．5．7．)其他血浆蛋白的效应基因，所说的蛋白质例如

-白蛋白

-C1灭活物

-血清胆碱酯酶

-转铁蛋白

-l-antritrypsin

8．6．)免疫接种

8．6．1．)附加的启动子

-非特异性和／或

-细胞周期特异性

8．6．2．)预防传染病的效应基因

以常规方法制备有效的疫苗有一定的局限性。

因此，研制了DNA疫苗技术。然而，这些DNA疫苗引起效能问题(Fynan等，国际免疫药物杂志17，79(1995)；Donnelly等，免疫学2，20(1994))。

按照本发明，期望得到效能更大的DNA疫苗。

选择的活性物质是由感染病原体形成的蛋白质的DNA，这种蛋白通过触发免疫反应，即通过抗体结合和／或细胞毒性T淋巴细胞导致中和作用和／或病因物的破坏。这一类型的所谓中和抗原已经用作疫苗抗原(参见Ellis的综述，实验医学生物学进展327，263(1992))。

在本发明中优选使用编码下列病因物中和抗原的DNA：

-感冒病毒

-HIV

-狂犬病病毒

-HSV(单纯疱疹病毒)

-RSV(呼吸道合胞病毒)

-副流感病毒

-轮状病毒属

-VZV(水痘带状疱疹病毒)

-CMV(巨细胞病毒)

-麻疹病毒

-HPV(人乳头瘤病毒)

-HBV(乙型肝炎病毒)

-HCV(丙型肝炎病毒)

-HDV(丁型肝炎病毒)

-HEV(戊型肝炎病毒)

-HAV(甲型肝炎病毒)

-霍乱弧菌抗原

-布氏疏螺旋体

-幽门螺杆菌

-疟疾抗原

-然而，在本发明中，这一类型的物质也包括抗独特型抗体或者它的抗原结合片段的DNA，所说抗体的抗原结合结构(“互补决定区”)能够产生感染病原体中和抗原的多拷贝蛋白质或碳水化合物结构。

这一类型的抗独特型抗体尤其可以代替细菌感染病原体的碳水化合物抗原。

Hawkins等(免疫治疗杂志14，273(1993))和Westerink和Apicella(Springer免疫病理研讨会15，227(1993))已经综合描述了这一类型的抗独特型抗体和它们的酶切产物。

8．6．3．)“肿瘤疫苗”的效应基因

这包括肿瘤细胞的抗原。例如，Sedlacek等(Contrib．to Oncol．32，Karger Verlag，Munich(1988)；Contrib．to Oncol．43，Karger Verlag，Munich(1992))已经综合描述了这一类型的抗原。

其它的例子是下列抗原或者下列抗独特型抗体的基因：

-sialyl Lewis

-肿瘤中的肽，其可以由T细胞识别

-致癌基因表达的蛋白质

-血型抗原和它们的前体

-多形上皮粘蛋白上的抗原

-热激蛋白的抗原

8．7．)慢性传染病的治疗

8．7．1．)附加的启动子

-病毒特异性和／或

-细胞周期特异性和／或

-非特异性

8．7．2．)效应基因，例如

-具有细胞抑制性、编程性细胞死亡或者细胞毒性作用的蛋白质

-将抗病毒或者细胞毒性物质的前体切割成活性物质的酶

8．7．3．)抗病毒蛋白的效应基因

-具有抗病毒活性的细胞因子和生长因子。例如，这些包括

IFNα、IFNβ、IFNγ、TNFβ、TNFα、IL-1患者TGFβ

-一种特异性抗体，所说的抗体能够灭活某一病毒或它的含有VH-及VL-的片段，或者能够产生它的经上述的接头结合的VH-及VL-片段。

例如，抗病毒抗原的抗体为：

抗-HBV

抗-HCV

抗-HSV

抗-HPV

抗-HIV

抗-EBV

抗-HTLV

抗-柯萨奇病毒病毒

抗-汉坦病毒

-Rev-结合蛋白。这些蛋白质与Vev-RNA结合，并抑制依赖于Rev的逆转录病毒基因表达的转录后阶段。Rev-结合蛋白的例子是：

RBP9-27

RBP1-8U

RBP1-8D

RBP1-8的假基因

-消化细胞周期控制蛋白基因的mRNA和病毒mRNA的核酶。例如，Christoffersen等(药物化学杂志．38，2033(1995))已经综合描述了催化HIV的核酶。

8．7．4．)抗细菌蛋白质的效应基因

抗细菌蛋白质包括，例如，中和细菌毒素或者通过调理素调理细菌的抗体。例如，所说的蛋白质包括抗下列抗原的抗体：

脑膜炎球菌C或者B

大肠杆菌

疏螺旋体

假单胞菌

幽门螺杆菌

金黄色葡萄球菌

9)相同或者不同的结构基因的组合

本发明也涉及这样的核酸构建体，其中存在两种相同或不同结构基因的DNA序列的组合。为了表达这两种DNA序列，在这两个结构基因间连接有另外的启动子序列或优选的“内部核糖体进入位点”(IRES)的cDNA。

IRES使得经IRES与另一个DNA序列连接的两个DNA序列的表达成为可能。

已经有人描述了这一类型的IRES，例如，Montford和Smith(TIG 11，179(1995))；Kaufman等(核酸研究19，4485(1991))；Morgan等(核酸研究20，1293(1992))；Dirks等(基因128，247(1993))；Pelletier和Sonenberg(自然334，320(1988))和Sugitomo等(生物技术12，694(1994))。

因此，例如可以使用脊髓灰质炎病毒的IRES序列的cDNA(5’UTR的≤140位至≥630位)。

在本发明中，优选地，具有加合作用的结构基因要通过附加启动子序列或IRES序列连接。

在本发明中，结构基因的组合是优选的，例如，用于：

9．1．)治疗肿瘤

-相同或不同的细胞抑制性、编程性细胞死亡、细胞毒性或者炎性蛋白，或者

-相同或不同的用于切割细胞抑制物前体的酶

9．2．)自身免疫疾病的治疗

对抑制细胞和／或肿瘤免疫反应具有协同作用的不同细胞因子或者受体，或

-不同的或者相同的TIMP

9．3．)血细胞形成缺陷的治疗

-等级连续的不同细胞因子，如IL-1、IL-3、IL-6或者GM-CSF和促红细胞生成素、G-CSF或者血小板生成素。

9．4．)神经细胞损伤的治疗

神经元生长因子和细胞因子或者细胞因子的抑制物。

9．5．)血液凝固和血液循环系统疾病的治疗

-抗血栓形成和溶纤维蛋白的因子(例如tPA或者uPa)或者

-细胞抑制性、编程性细胞死亡或者细胞毒性蛋白质和抗血栓形成或者溶纤维蛋白的因子。

-具有协同作用的许多不同的血液凝固因子，例如FⅧ和vWF或者FⅧ和FⅨ。

9．6．)免疫接种

-抗原和免疫刺激性细胞因子，例如IL-1α、IL-1β、IL-2、GM-CSF、IL-3或者IL-4受体

-一种感染病原体或不同的感染病原体的不同抗原或者

-肿瘤型或者不同肿瘤型的不同抗原

9．7．)病毒性传染病治疗

-抗病毒蛋白质和细胞抑制性、编程性细胞死亡或者细胞毒性蛋白质

-抗一种病毒的或许多不同病毒的不同表面抗原的抗体。

9．8．)对细菌感染性疾病的治疗

抗微生物不同表面抗原和／或毒素的抗体。

10)信号序列和跨膜区域的插入

在专利申请DE19639103．2和DE19651443．6中详细描述了这一技术，此专利申请明确引入本文参考。

10．1)为了促进翻译，可以在启动子序列的3’末端和直接在信号序列或跨膜序列的起始位点(ATG)的5’末端插入核苷酸序列GCCACC或者GCCGCC(Kozak，细胞生物学杂志108，299(1989))。

10．2．)为了有利于结构基因的表达产物的分泌，可以用能够改进胞内分泌的异源信号序列代替存在于或不存在于结构基因DNA序列中的同源信号序列。

因此，例如可以插入免疫球蛋白的信号序列(DNA位置：≤63至≥107；Riechmann等，自然332，323(1988))或CEA的信号序列(DNA位置≤33至≥134；Schrewe等，分子细胞生物学10，2738(1990)；Berling等，癌症研究50，6534(1990))；或人呼吸合胞病毒糖蛋白的信号序列(氨基酸的<38至>50或者48至65的cDNA；Lichtenstein等，普通病毒学杂志77，109(1996))。

10．3．)为了锚定形成活性化合物的转导细胞的细胞膜中的活性化合物，还可以用跨膜区的序列引入替代或增加到信号序列。

因此，例如，可以在启动子序列和结构基因序列之间插入人巨噬细胞集落刺激因子的跨膜序列(DNA位置：≤1485至≥1554；Cosman等，Behring Inst．Mitt．83，15(1988))或人呼吸合胞病毒(RSV)糖蛋白G的信号DNA序列和跨膜区域(1-63氨基酸或它们的部分序列，38-63氨基酸；Vijaya等，分子细胞生物学8，1709(1988)；Lichtenstein等，普通病毒学杂志．77，109(1996))或流感病毒的神经氨酸苷酶的信号DNA序列和跨膜区域(7-35氨基酸或7-27氨基酸序列；Brown等，病毒学杂志62，3824(1988))。

10．4)然而，为了锚定能形成活性化合物的转导细胞的细胞膜中的活性化合物，也可以插入糖磷脂锚的核苷酸序列。

在结构基因的核苷酸的3’末端插入糖磷脂锚，另外也可以插入信号序列。

例如，有人已经描述了CEA、N-CAM和其他膜蛋白(例如Thy-1)(参见Ferguson等，生物化学年度综述57，285(1988))的糖磷脂锚。

10．5．)按照本发明，将活性化合物锚定到细胞膜上的另一种可能性是使用配体-活性化合物融合蛋白的DNA序列。这种融合蛋白的配体的特异性是直接针对于靶细胞膜的膜结构。

10．5．1．)例如，结合到细胞表面的配体包括直接针对于下列细胞表面结构的抗体或抗体片段，例如

-内皮细胞。尤其是包括那些针对VEGF受体的抗体或抗激肽受体的抗体。

-肌肉细胞，例如抗肌动蛋白抗体、或抗血管紧张肽II受体的抗体，或抗生长因子受体的抗体，例如抗EGF受体、或者抗PDGF受体、或抗FGF受体的抗体，或者抗内皮素A受体的抗体。

-所说的配体也包括在肿瘤细胞膜上直接抗肿瘤特异性抗原或与肿瘤相关抗原的抗体或它们的片段。这一类型的抗体已有描述。

优选地以人源化形式使用鼠单克隆抗体。例如，如已述的，使用本领域技术人员公知的技术制备Fab和rec．Fv片段以及它们的融合产物。

10．5．2．)另外，配体也包括所有与相应细胞上膜结构或膜受体结合的活性化合物，例如细胞因子或者附着分子、生长因子或者它们的片段或者它们的部分序列、递质或肽激素。例如，这包括：

-内皮细胞的配体，例如IL-1、PDGF、bFGF、VEGF、TGGβ(Pusztain等，病理学杂志169，191(1993))或激肽和激肽衍生物或类似物。

-另外，这些配体也包括附着分子。这一类型的附着分子如SLex、LFA-1、MAC-1、LeCAM-1、VLA-4或者玻连蛋白和它的衍生物或类似物已就内皮细胞被描述过(参见Augustin-Voss等，细胞生物学杂志119，483(1992)；Pauli等，癌转移综述9，175(1990)；Honn等，癌转移综述11，353(1992)；Varner等，Cell Adh．Commun．3，367(1995))。

下列的非限制性的实施例更详细地说明了本发明。

11)核酸构建体的制备和应用

核酸构建体优选地是由DNA组成的。术语核酸构建体可以理解为可以在靶细胞中转录的核酸的人工结构。优选地将它们插入到载体中，质粒载体或者与非病毒载体复合的质粒(Fritz等，人类基因治疗7：1395(1996)；Solodin等，生物化学34：13537(1995)；Abdallak等，人类基因治疗7：1947(1996)；Ledley，人类基因治疗6：1129(1995)；Schofield等，英国医学公报51：56(1995)；Behr，Bioconj．Chem．5：382(1994)；Cotten等，生物技术最新发展趋势4：705(1993)；Hodgson等，自然生物技术14：339(1996))是特别优选的。使用本领域技术人员公知的技术(Cotten等，生物技术最新发展趋势4：705(1993)；Scheffield等，英国医学公报51：56(1995)，Ledley，人类基因治疗6：1129(1995))将载体引入到内皮细胞的前体细胞或引入到内皮细胞中。在另一个实施方案中，将本发明的核酸构建体插入到病毒载体中(Weir等，人类基因治疗7：1331(1996)；Flotte等，基因治疗2：357(1995)；Efsathion等，英国医学公报51：45(1995)；Kremer等，英国医学公报51．31(1995)；Vile等，英国医学公报51：12(1995)；Randrianarison等，生物制品23：145(1995)；Jolly，癌症基因治疗1：51(1994))，并且用这些内皮细胞转染。将通过上述方式转导的细胞施用到患者中，可以外部施用或内部施用、局部施用、体腔施用，可以施用到器官中、血液循环中、呼吸道中、胃肠道中、泌尿生殖道中、伤口或肌肉内或皮下施用。

利用本发明的核酸构建体，可以在内皮细胞或内皮细胞的前体细胞中细胞特异性地、也可以病毒特异性性、在一定的代谢条件下和／或细胞周期特异性地和／或由药物诱导来表达结构基因，所说的结构基因优选的是编码药理活性化合物或将药物的无活性前体切割为活性药物的酶的基因。可以选择结构基因，以便药理活性化合物或酶作为与配体的融合蛋白得以表达，这种配体与细胞(如增殖性内皮细胞或肿瘤细胞)的表面结合。

以下利用附图和非限制性的实施例，更详细地描述本发明。

图例：

图1：用于细胞转化的核酸构建体

12)用于说明本发明概念的实施例

12．1．)不使用纤连蛋白和牛脑，从CD34-阳性血细胞中培养内皮细胞

通过Asahara等(科学275：964(1997))描述的方法分离的CD34-阳性血细胞：

-要么是Asahara公开的a)批，将其培养在塑料瓶中，该瓶包被有一层纤连蛋白并加入牛脑抽提物(100μg／ml)，

-要么(b批)是按照本发明在塑料瓶中培养的，该瓶没有包被纤连蛋白，也没有加入牛脑抽提物，但是加入了VEGF和bFGF(Sigma，各为1％(v／v))，

对每种情况，在培养基(培养基199)中加入胎牛血清(FCS，20％)，在37℃和用5％CO2通气的条件下培养。6天后，显微镜下测定形成纺锤形和毛细管状结构的附着生长细胞的比例，并通过使用内皮细胞的特异性抗体(抗CD31、抗vWF、抗Flik1)标记，借助于FAGS分析来测定内皮细胞的比例。发现在a)批和b)批之间的细胞数量和形态上没有差异。在这两批的系列实验中，内皮细胞的比例的差异在1-10％之间，这证明加入生长因子VEGF和bFGF可以代替使用包被纤连蛋白的培养瓶和加入脑抽提物。

12．2．)从单核血细胞培养内皮细胞

通过Ficoll梯度离心从120ml的血液中分离单核血细胞。通过在细胞培养瓶中培养1小时，然后倾析分离出未附着的单核血细胞。

将这些细胞接种在b)批培养瓶中，并在37℃进行5％CO2通气培养6天。6天后，按照12．1)中的描述测定内皮细胞的比例。在不同的系列实验中，内皮细胞的比例在2％和20％之间变化。

12．3)由CD14-阳性血细胞培养内皮细胞

通过Ficoll梯度离心(Ficoll-Paque，Pharmacia，Uppsala)从健康供体的120ml血液中分离单核血细胞。通过在细胞培养瓶中培养60分钟，然后倾析分离出非附着的单核血细胞。通过这一方式分离的非附着的单核血细胞(NMC)含有0．3-0．05％的CD34-阳性血细胞和5-10％的CD14-阳性细胞(单核细胞和类单核细胞)。

将1×10⁶NMC调整到每毫升培养基199(含有20％胎牛血清，二者均来自Gibco)和100μg的ECGS(Harbor Bioproducts，Norwood，MA)或VEGF(Pepro Techn．，伦敦，英国)中有1×106个细胞，37℃下在纤连蛋白(Harbor Bioproducts，Norwood，MA)包被的塑料容器中培养1-3小时。结果，CD14-阳性细胞的含量由5-10％增加到25-30％。

通过小心洗涤分离出NMC，并使用磁珠(按照厂商的说明包被抗-CD14或抗CD11(CD14／CD11微型小珠，Miltenyi Biotec，Bergisch-Gladbach，德国))分离出CD14阳性细胞或CD11阳性细胞。

将含有大约≥80％CD14-阳性细胞的NMZ接种在上述的培养基199(添加了FCS和ECGS或VEGF)中，并37℃下在5％CO2的湿润空气中培养在纤连蛋白包被的塑料容器中。

使用单克隆抗体通过RT-PCR在6小时、3天和5天后检查培养物中的细胞。

在6小时后，已经观察到少量的单核CD14-阳性细胞，所说的细胞对内皮细胞特异性标记物乙酰基LDL受体、CD34、Flk-l和维勒布兰德因子为阳性。在第3天，这些细胞表现出较强的增殖迹象。

在第5天，观察到附着的大颗粒状的椭圆细胞和纺锤体细胞，所说的细胞都携带上述的内皮细胞标记，但不再有CD14标记。

一旦这些内皮细胞汇合后，它们就表达VE-钙粘着蛋白。在1至2周后，在培养的细胞中有80％以上是内皮细胞。

12．4．)内皮细胞特异性转化和由单核血细胞培养内皮细胞

通过Ficoll梯度离心从120ml的血液中分离单核血细胞，通过在细胞培养瓶中培养1小时，然后倾析分离出非附着的单核血细胞。将这些血细胞调整到浓度为1×10⁷／ml培养基，并接种到60mm培养皿中，在37℃下与本发明的质粒和Superfect(Quiagen)的复合物培养60分钟。

按照Superfect(Quiagen)的厂商说明进行复合物的制备。

本发明的质粒在读框中含有下列的DNA序列(从5’→3’)：

-人endoglin基因的启动子(NS1-2415；专利申请D19704301．1)

-在第24个密码子上发生突变(精氨酸(CGT)由半胱氨酸(TGT)取代，Wofel等，科学269：1281(1997))的人细胞周期蛋白依赖性激酶4(cdk-4)的cDNA。

-SV40的核定位信号(NLS)[SV40大T；126-132氨基酸；PKKKRKV(SEQ ID NO．：3)；Dingwall等，TIBS 16：478(1991)]。

通过合适的限制性位点对构建体的各个组分进行连接，所述位点通过PCR扩增到各种元件的末端。通过本领域技术人员公知的技术使用对限制酶切位点具有特异性的酶和DNA连接酶进行连接。可以从市场上买到这些酶。使用这些酶克隆由以上方式制备的核酸。

单核血细胞与Superfect／质粒复合物培养后，洗涤血细胞并在12．2)部分描述的细胞培养基中进行培养。

在6天后，按照在12．1．)部分所述测定内皮细胞的比例，在不同的系列实验中，内皮细胞的比例在10-60％之间变化。

12．5．)作为载体的转导内皮细胞的制备和用途

将在12．4．)部分所述分离、转导、增殖的内皮细胞接种在60mm培养皿中，并在37℃下将其和本发明的质粒与Superfect(Quiagen)的复合物培养10分钟。

按照Superfect厂商的说明进行复合物的制备。

本发明的质粒在读框中含有下列DNA序列(从5’→3’)：

活化亚单位A)

-cdc25C基因的启动子(核酸290至+121；Zwicker等，EMBO杂志14，4514(1995)；Zwicker等，核酸研究23，3822(1995))

-SV40的核定位信号(NLS)(SV40的大T，氨基酸126-132；PKKKRKV(SEQ ID NO：3)，Dingwall等，TIBS16，478(1991))

-HSV-1VP16的酸性反式活化域(TAD)(氨基酸406-488；Triezenberg等，基因进展，2，718(1988)；Triezenberg，目前遗传学最新进展，5，190(1995))

-CD4糖蛋白胞质部分的cDNA(氨基酸397-435；Simpson等，癌基因4，1141(1989)；Madden等，Cell42，93(1985))

活化亚单位B

-人endoglin基因的启动子(核酸1-2415；专利申请D19704301．1)

-SV40的核定位信号(NLS)(SV40大T；氨基酸126-132

PKKKRKV(SEQ ID NO．：3)；Dingwall等，Ties16，478(1991))

-Gal4蛋白的DNA结合区域的cDNA(氨基酸1-147，Chasman和Kornberg，分子细胞生物学10，2916(1990))

-p56lck蛋白的CD4结合序列的cDNA(氨基酸1-71；Shaw等，细胞59，627(1989)；Turner等，细胞60，755(1990)；Perlmutter等，细胞生物化学杂志38，117(1988))

活化物应答性启动子：

-Gal4结合蛋白的具有下述核苷酸序列的10x结合序列：5′-CGGACAATGTTGACCG-3′(SEQ ID NO．：4，Chasman和Kornberg，分子细胞生物学10，2916(1989))

-SV40的基础启动子(核酸48-5191；Tooze(编)，DNA肿瘤病毒(纽约冷泉港，纽约，冷泉港实验室)。

效应基因：

-人β葡糖醛酸糖苷酶的cDNA(核苷酸序列93-1982；Oshima等，PNAS美国84，65(1987))

上述的活化序列功能如下：

-启动子cdc25B细胞周期特异性地调节结合的VP16的活化结构域和CD4的胞质部分(活化亚单位A)cDNA的转录。

-人endoglin基因的启动子细胞周期特异性地调节结合的cDNA的转录，所说的cDNA编码Ga14的DNA结合蛋白和p56lck蛋白的CD4结合部分(活化亚单位B)。

-通过将CD4区域结合到p56lck区域使活化亚单位A和B的表达产物形成二聚体。

-二聚的蛋白质是用于活化物应答性启动子的嵌合转录因子(Gal4结合区域的DNA序列／SV40启动子)，所说的活化物应答性启动子用于效应基因(=萤光素酶基因)的转录。

通过合适的限制性位点对构建体的各个组分进行连接(所述位点通过PCR扩增到各种元件的末端)。通过本领域技术人员公知的技术，使用对限制酶切位点具有特异性的酶和DNA连接酶进行连接。可以从市场上买到这些酶。

使用这些酶，把通过这种方式制备的核苷酸构建体克隆到pXP2质粒载体中(Nordeen，生物技术6，454(1988))。把Superfect／质体复合物与单核血细胞一起培养后，洗涤血细胞并如12．2．)部分所述培养在细胞培养基中。

在6天后，使用4-甲基伞形酰β-葡糖醛酸糖苷作为底物测定内皮细胞产生的β-葡糖醛酸糖苷酶的量。

为了检验细胞周期特异性，通过除去甲硫氨酸，在G0／G1中将内皮细胞同步化48小时以上。使用Hoechst 33258(Lucibello等，EMBO杂志14，132(1995))染色后，在荧光活化细胞分选仪中测定细胞的DNA含量。

得到下列结果：

在转染的内皮细胞中，与未转染的成纤维细胞相比，可以测得β-葡糖醛酸糖苷酶的量没有增加。

转染的内皮细胞表达的β-葡糖醛酸糖苷酶显著地多于未转染的内皮细胞。

增殖性内皮细胞(DNA＞2S；S=单染色体组)分泌的β-葡糖醛酸糖苷酶显著地多于在G0／G1同步化的内皮细胞(DNA=2S)。

因此，所述的活化物应答性启动子单元使结构基因β-葡糖醛酸糖苷酶以细胞特异性、依赖于细胞周期的方式表达。

在局部施用(例如肿瘤位点)后，或颅内或蛛网膜下施用或者全身施用(优选的是静脉内或动脉内施用)后，按照本发明的内皮细胞有可能使这些内皮细胞优先聚集在细胞损坏的区域，并且由于活化物应答性启动子单元的细胞周期和内皮细胞特异性(这是主要的但不是唯一的原因)，只有增殖性内皮细胞分泌β-葡糖醛酸糖苷酶。这种β-葡糖醛酸糖苷酶能够切割刚刚注射的具有高度耐受性的阿霉素。这抑制内皮细胞增殖，并且对这些细胞和邻近的肿瘤细胞具有细胞抑制作用。结果，肿瘤生长受到了抑制。

                                      序列表

(1)一般信息：

  (ⅰ)申请人：

    (A)名称：Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH

    (B)街道：-

    (C)城市：法兰克福

    (D)州：-

    (E)国家：德国

    (F)邮区代码：65926

    (G)电话：069-305-3005

    (H)传真：069-35-7175

    (I)电传：-

(ⅱ)申请名称：遗传修饰的细胞和它们在预防或治疗疾病方面的用途

(ⅲ)序列数：4

(ⅳ)计算机可读形式：

    (A)介质类型：软盘

    (B)计算机：IBM PC兼容机

    (C)操作系统：PC-DOS／MS-DOS

    (D)软件：PatentIn Release#1．0，版本#1．25(EPO)

(2)SEQ ID NO：1的信息：

  (ⅰ)序列特征：

    (A)长度：23个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线型

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅸ)特性：

    (A)关键词：肽

    (B)位置：1．．23

    (D)其它信息：／注释=＂Xaa=20个遗传编码的氨基酸中的一个，

Xaa^*=由7-80个氨基酸Xaa组成的链

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：1：

Leu Xaa Asp Xaa Leu Xaa Xaa Leu Xaa* Leu Xaa Cys Xaa Glu Xaa Xaa

1               5                    10                  15

Xaa Xaa Xaa Ser Asp Asp Glu

        20

(2)SEQ ID NO：2的信息：

  (ⅰ)序列特征：

    (a)长度：26个碱基对

    (b)类型：核酸

    (c)链型：双链

    (D)拓扑结构：线型

(ⅱ)分子类型：DNA

(ⅸ)特性：

    (a)关键词：Myc E-Box

    (b)位置：1．．26

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：2：

GGAAGCAGAC CACGTGGTCT GCTTCC           26

(2)SEQ ID NO：3的信息：

  (ⅰ)序列特征：

    (a)长度：7个氨基酸

    (b)类型：氨基酸

    (c)链型：单链

    (D)拓扑结构：线型

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅸ)特性：

    (a)关键词：SV40的NLS

    (b)位置：1．．7

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：3：

Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

1               5

(2)SEQ ID NO：4的信息：

  (ⅰ)序列特征：

    (a)长度：16个碱基对

    (b)类型：核酸

    (c)链型：单链

    (D)拓扑结构：线型

(ⅱ)分子类型：DNA

(ⅸ)特性：

    (a)关键词：Gal4的结合序列

    (b)位置：1．．16

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：4：

CGGACAATGT TGACCG         16

Claims (26)

1．一种用于基因治疗的细胞，所说的细胞可通过下列步骤获得：

a)从血液或者含有细胞的体液中分离单核细胞；

b)在含有神经节苷脂、磷脂、糖脂和／或内皮细胞生长因子-包括影响分化、存活、迁移和／或血管形成的生长因子-的培养基中培养步骤a)获得的细胞；

c)或者通过转化癌基因、活化癌基因或者灭活抑制基因使a)或b)中获得的细胞无限增殖化；

d)或者使用用于基因治疗的核酸构建体转染步骤a)和b)或步骤c)中获得的细胞，所说的核酸构建体包含可以由合适的启动子系统靶细胞特异性、细胞周期特异性、病毒特异性地和／或通过低氧被活化的效应基因。

2．如权利要求1所要求的细胞，所说的细胞为CD34-、CD14-、CD11-、CD11b-、CD13-、CD64-或CD68阳性细胞或者内皮细胞。

3．如权利要求1和2之任一所要求的细胞，其中所说的细胞来源于静脉、毛细血管、动脉、脐带或者胎盘的血液；或者来源于骨髓、脾、淋巴结、腹膜腔、胸膜腔、淋巴、静脉、动脉、毛细血管和／或结缔组织液。

4．如权利要求3所要求的细胞，其中权利要求1步骤b)中的生长因子选自ECGF、FGFα、FGFβ、VEGF、ECAF、IGF-1；IGF-2；SC-3；EGF；SCF、TGFβ、血管生成素、多效因子和Fit-3配体。

5．如权利要求3和4之任一所要求的的细胞，其中权利要求1步骤c)中的癌基因发生突变，使得所说的癌基因基因产物仍然可以完全活化细胞周期，但是细胞周期的这种活化不再受细胞抑制物抑制。

6．如权利要求5所要求的的细胞，其中所说的癌基因选自突变的cdk-4、cdk-6和cdk-2。

7．如权利要求6所要求的细胞，其中所说的cdk-4第24位上的核苷酸序列发生突变，使得实际上编码的精氨酸由半胱氨酸代替。

8．如权利要求3和4之任一所要求的细胞，其中如权利要求1步骤c)中所说的灭活抑制基因是通过使用编码一种蛋白质-这种蛋白质灭活至少一种抑制基因的基因产物-的核酸序列转化所说的细胞来完成的。

9．如权利要求8所要求的细胞，其中所说的灭活抑制基因基因产物的蛋白质选自腺病毒的E1A蛋白质，腺病毒的E1B蛋白质、SV40病毒的大T抗原、乳头瘤病毒的E6蛋白质、乳头瘤病毒的E7蛋白质、MDM-2蛋白质以及包含至少一种氨基酸序列LXDXLXXL-Ⅱ-LXCXEXXXXXSDDE的蛋白质，其中X是一种可变的氨基酸，-Ⅱ-是任何所需的7-80个氨基酸的氨基酸链。

10．如权利要求5-9之任一所要求的细胞，其中所说的细胞是内皮细胞；其中所说的用于转化的癌基因或用于灭活所说的抑制基因的核酸序列与控制癌基因或所提到的核苷酸序列的转录的内皮特异性活化序列相连接。

11．如权利要求1-10之任一所要求的细胞，其中权利要求1步骤d)中的核酸构建体包含：

·至少一种可非限制性活化的活化序列、一种内皮细胞特异性的活化序列、一种病毒特异性的活化序列、一种可通过代谢活化的活化序列和／或一种可细胞周期特异地活化的活化序列；

·至少一种其表达由活化序列控制的效应基因。

12．如权利要求11所要求的细胞，其中所说的效应基因的表达由至少两种相同或者不同的活化序列控制。

13．如权利要求11和12之任一所要求的细胞，其中所说的活化序列的活化是自增强性的和／或可药理控制的。

14．如权利要求12和13之任一所要求的细胞，其中所说的第二种活化序列选自下组：病毒如HBV、HCV、HSV、HPV、EBV、HTLV、CMV或者HIV的启动子序列；通过低氧活化的启动子或增强子序列或者cdc25C、cdc25B、细胞周期蛋白A，cdc2、E2F-1、B-myb和DHFR的基因的细胞周期特异性活化序列；以细胞增殖依赖性方式产生的转录因子或活化的转录因子的结合序列，如Myc E盒的单体或者多体。

15．如权利要求13和14之任一所要求的细胞，其中所说的效应基因是编码活化化合物的基因，所说的化合物选自细胞因子；趋化因子；生长因子；细胞因子、趋化因子或者生长因子的受体；具有抗增殖或者抑制细胞作用或编程性细胞死亡作用的蛋白质；抗体；抗体片段；血管生成抑制物；肽激素；凝血因子；凝血抑制物；纤维蛋白溶解蛋白；作用于血液循环的肽或者蛋白质；血浆蛋白质；和感染病原体、细胞或肿瘤的抗原；激发免疫反应的选择的抗原。

16．如权利要求13和14之任一所要求的细胞，其中所说的效应基因是编码一种酶的基因，这种酶能够将药物前体切割成药物。

17．如权利要求13和14之任一所要求的细胞，其中所说的效应基因是编码配体-活性化合物融合蛋白或者配体-酶融合蛋白的基因，所说的配体选自细胞因子、生长因子、抗体、抗体片段、肽激素、递质、细胞附着蛋白和LDL受体结合蛋白。

18．如前面权利要求之任一所要求的细胞，其中所说的引入到内皮细胞中的核酸构建体是DNA。

19．如权利要求18所要求的细胞，其中所说的核酸构建体是插入到载体中的。

20．如权利要求19所要求的细胞，其中载体是质粒载体。

21．如权利要求19所要求的细胞，其中载体是病毒载体。

22．如权利要求1-21之任一所要求的细胞，这种细胞是通过体外、口头、膀胱内、鼻内、支气管内或者胃肠道内施用的，或者注射到器官、体腔、肌肉系统、皮下或者血液循环中，以便预防或治疗疾病。

23．如权利要求1-22之任一所要求的细胞在制备用于治疗下列疾病的治疗剂中的用途，所说的疾病选自肿瘤，白血病、自身免疫疾病、变态反应、关节炎、炎症、器官排斥、移植物对宿主的反应、凝血疾病、循环疾病、贫血、感染、激素疾病和CNS损坏。

24．产生如权利要求1-22所要求的细胞的方法，这种方法包括实施下列步骤：

a)从血液或者含有细胞的体液中分离细胞；

b)在含有神经节苷脂、磷脂、糖脂和／或生长因子的细胞培养基中培养步骤a)获得的细胞；

c)或者通过转化癌基因、活化癌基因或者灭活抑制基因使a)或b)中获得的细胞无限增殖化；

d)或者使用用于基因治疗的核酸构建体转染步骤a)和b)或c)中获得的细胞，所说的核酸构建体包含可以由合适的启动子系统靶细胞特异性、细胞周期特异性、病毒特异性地和／或通过低氧被活化的效应基因。

25．一种药物，其包含如权利要求1-22之任一所要求的细胞。

26．一种用于损伤血管的内皮化的根据权利要求1可获得的细胞。

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