CN108384811A

CN108384811A - 改善的细胞系以及在胶囊化细胞生物递送中的用途

Info

Publication number: CN108384811A
Application number: CN201711449477.8A
Authority: CN
Inventors: 菲利普·库斯克; 拉尔斯·U·沃尔伯格
Original assignee: Gloria AA Therapeutics LLC
Current assignee: Gloria AA Therapeutics LLC
Priority date: 2009-01-23
Filing date: 2010-01-21
Publication date: 2018-08-10
Also published as: CA2750027A1; US9121037B2; WO2010083841A2; JP2015199744A; AU2010206374B2; CA2750027C; WO2010083841A3; JP2012515729A; AU2010206374A1; JP5897335B2; US20180177736A1; US10888526B2; US20210128482A1; US20120027847A1; US8741340B2; US20140377341A1; EP2389435A2; EP2389435B1; US9884023B2; CN102361971A

Abstract

本发明涉及用于向受试者递送分泌性生物活性化合物的胶囊；表达重组蛋白的细胞系；以及所述细胞系的产生，所述细胞系用于分泌性治疗分子的裸细胞生物递送和胶囊化细胞生物递送。本发明还涉及利用所述细胞系产生重组蛋白的方法。在一个实施方案中，细胞系是人的细胞系。在本发明的另一方面中，转座子系统用于产生用于生物活性多肽分泌的细胞系。

Description

改善的细胞系以及在胶囊化细胞生物递送中的用途

本申请是申请日为2010年1月21日、申请人为Ns基因公司、发明名称为“改善的细胞系以及在胶囊化细胞生物递送中的用途”的中国专利申请201080013486.2的分案申请。

技术领域

本发明涉及表达重组蛋白的细胞系的产生，所述细胞系用于分泌性治疗分子的裸细胞生物递送和胶囊化细胞生物递送。在一个实施方案中细胞系是人的细胞系。

背景技术

向细胞中引入DNA的典型方法包括浓缩DNA的试剂、包含脂质的试剂以及病毒介导的策略。然而，这些方法具有局限性。例如，浓缩DNA试剂和病毒介导的策略存在大小限制。此外，在病毒策略中转染进入细胞的核酸的量受限制。此外，病毒介导的策略可以是细胞类型特异性的或组织类型特异性的，并且当体内使用病毒策略时会产生免疫问题。

克服这些问题的一个适宜的方法是转座子。转座子或转座元件是可在单个细胞基因组内移来移去并整合在不同部位的DNA序列，这是一个称作转座的过程。转座子包括在其上游和下游带有倒转重复序列的短核酸。活性转座子编码称作转座酶的促进切下核酸并插入到靶DNA序列内的酶。转座子向染色体内的整合提供了长期或可能永久在转基因细胞和生物体中表达转基因的基础。

转座子系统具有广的转基因应用范围。迄今为止，已经研究了转座子系统在昆虫幼体内的体内蛋白质生产，其中将转座子质粒直接注射入昆虫前胚盘胚中(WO 2001/29204)。然后从发育中的幼体或成体昆虫纯化目的蛋白质。

还已经利用转座子系统遗传修饰干细胞。WO 2009/050657涉及使用转座子-转座酶系统产生遗传修饰干细胞的方法。在干细胞中表达的转基因是处于在干细胞和分化细胞中均为组成型的启动子控制下的标志物基因，例如GFP。在WO 2009/071334中，描述了使用通过转座子系统修饰的精原干细胞产生敲除或者转基因动物模型的方法。

因此，在本领域当前技术水平众所周知，转座子可以用于产生转基因细胞系，或者产生敲除细胞系或者产生转基因细胞系，因此改变细胞的特性。由于转座子长期或者可能永久性整合入染色体中，所以在转基因细胞和生物体中实现转基因表达。

在基于细胞的治疗法中，其中产生稳定的人转基因细胞系用于随后作为或者胶囊化细胞或者裸细胞移植入受试者中，需要在植入后稳定高表达转基因，例如在其中不能使用选择标记的条件下。有代表性地，移植的细胞和植入的胶囊化细胞必须能够表达转基因达1年或更长，而没有任何下调，例如由基因沉默引起的下调。传统的增强表达的工具例如密码子优化、表达增强序列的使用或者强启动子的使用具有局限性并且可能产生变异的结果。

在本发明中，在用于植入的胶囊生产中采用了转座子系统的特性，其中所述胶囊包含使用转座子系统改变成分泌生物活性化合物或多肽或者促进所述生物活性肽产生的siRNA的细胞。胶囊的外膜是生物相容性的并且胶囊包含支持细胞的基质。

发明内容

因此，在第一个方面中，本发明涉及用于向受试者递送分泌性生物活性化合物的胶囊。胶囊包括

a.生物相容性外膜和内核，

b.所述内核包含细胞，

c.所述细胞包含含有下列结构基因的异源表达构建体

i.编码分泌性生物活性多肽的结构基因，或者

ii.编码促进细胞中产生分泌性生物活性化合物的多肽或siRNA的结构基因，

d.所述基因位于其为转座酶或者其它整合酶底物的两个反向重复序列之间。

该胶囊使得在植入后稳定高表达转基因成为可能，并且转座子系统的使用与传统的细胞转染相比使转基因表达增加数倍。

在另一个方面中，本发明涉及本发明的胶囊用于治疗的用途。由于本发明的胶囊稳定且高水平地并且在缺乏选择压力下产生生物活性化合物，它们特别适宜于在治疗中使用。由于表达水平更高，所以可降低胶囊的数量和/或大小。

在另一个方面中，本发明涉及细胞系，包含编码下列结构基因的异源表达构建体

i.编码分泌性生物活性多肽的结构基因，或者

ii.编码促进细胞中产生分泌性生物活性化合物的多肽或siRNA的结构基因；

所述基因位于其为转座酶底物的两个反向重复序列之间。

通过使用转座子系统产生细胞系，甚至在低拷贝数时观察到分泌多肽的增加。因此在缺乏选择压力下达到高效率和意外的稳定转基因表达。通过使用细胞系，保证了组合物中的所有细胞是相同的。

在另一个方面中，本发明涉及产生重组蛋白的方法，包括培养本发明的细胞和回收所述重组蛋白。

有代表性地，在重组表达中，至少在细胞扩大培养过程中维持选择压力以保证细胞没有丢失转基因。由于本发明的细胞系可以在没有选择压力下转基因稳定表达和高水平表达，所以可以避免在重组生产过程中使用选择压力，例如使用抗生素。由此，使随后的下游加工变得容易。

在进一步的方面中，本发明涉及产生能够分泌生物活性化合物的细胞系的方法，所述方法包括

a.以第一和第二表达构建体转染细胞；

b.所述第一表达构建体包含编码转座酶的阅读框；

c.所述第二表达构建体编码分泌性生物活性多肽或者编码促进细胞中产生分泌性生物活性化合物的多肽或siRNA；

d.所述第二表达构建体位于其为所述转座酶底物的两个反向重复序列之间；

e.使所述座酶瞬时表达，由此使所述第二构建体整合入所述人细胞的基因组中。

通过使用转座子系统产生分泌多肽的细胞系，达到分泌性多肽的更高产量。通过使用转座子系统，较少需要连续选择压力，因为转基因细胞倾向于不降低表达。

附图说明

图1A：2D，8周研究，甘丙肽克隆。体外稳定分泌甘丙肽的ARPE-19克隆基于pCA表达载体，使用标准转染技术和G418选择产生克隆，不传代培养克隆8周，通过ELISA测量甘丙肽的分泌；

图1B：2D，8周研究，SB IgSP-甘丙肽克隆。体外稳定分泌甘丙肽的ARPE-19克隆基于SB底物载体pT2，使用SB技术产生克隆，不传代培养克隆直到8周，通过ELISA测量甘丙肽的分泌；

图1C：对临床NGF克隆的2D测试。体外稳定分泌NGF的ARPE-19克隆基于pCA表达载体，使用标准转染技术和G418选择产生克隆，不传代培养克隆8周，通过ELISA测量NGF的分泌；

图1D：对临床SB-NGF克隆的2D测试。体外稳定分泌NGF的ARPE-19克隆基于SB底物载体pT2，使用SB技术产生克隆，不传代培养克隆8周，通过ELISA测量NGF分泌；

图2：在迷你猪中的甘丙肽4周体内研究。使用SB技术产生的胶囊化SB-甘丙肽克隆SB-IgSP-24对使用标准转染技术产生的克隆ppG-152的丙甘肽表达水平，植入前数值(蓝色柱)与外植体数值(红色柱)相比并且体外并行运行装置(黄色柱)，将装置植入迷你猪的海马内；

图3：在大鼠中的NGF 8周体内研究。使用SB技术产生的胶囊化SB-甘丙肽克隆SB-NGF-78对使用标准转染技术产生的克隆NGC-0295的NGF表达水平，植入前数值(蓝色柱)与外植体数值(红色柱)相比并且体外并行运行装置(黄色柱)，将装置植入大鼠的纹状体内。

具体实施方式

定义

生物学活性指分子对特定细胞的生物学上有益的作用。如本文所使用，“生物活性化合物”是从产生其的细胞释放或分泌并且对分开的靶细胞起作用的化合物。

如本文所使用，“生物相容性胶囊”意思是指这样的胶囊，即当植入到宿主哺乳动物内时没有引起足以导致排斥胶囊或者使其不适合，例如通过降解的有害宿主反应。

如本文所使用，术语“生物学试剂”指任何试剂，例如病毒、蛋白质、肽、氨基酸、脂质、碳水化合物、核酸、核苷酸、药物、前药或者由细胞产生的对细胞具有作用的其它物质，而不论此种作用是有害、有益的还是其它方式。

如本文所使用，“编码序列”是被转录和翻译成多肽的多核苷酸序列。

如本文所使用，术语“控制序列”指对于实现与其连接的编码序列和非编码序列的表达所必需的多核苷酸序列。控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。此外，“控制序列”指控制编码序列内所编码肽加工的序列；这些控制序列可以包括，但不限于控制肽的分泌、蛋白酶切割和糖基化的序列。术语“控制序列”旨在以最小限度包括其存在可以影响表达的成分，并且还可包括其存在是有利的额外成分，例如，前导序列和融合配偶体序列。

启动子“下调”意思是指在体内植入后减少转基因产物的表达至导致转基因产物的生物学活性明显缺乏的水平。如本文所使用，“不下调的启动子”意思是指在体内植入至哺乳动物宿主内后驱动或持续驱动转基因以具有生物学活性的水平表达的启动子。

如本文所使用，术语“表达载体”指能够指导与其有效连接的基因表达的载体。通常，表达载体在重组DNA技术中的应用性常常是质粒形式。

如本文所使用，术语“遗传修饰”和“遗传工程”指通过有意引入外源DNA而稳定或瞬时改变细胞的基因型。DNA可以是合成的或天然衍生的，并且可以包括基因、基因部分或其它有用的DNA序列。术语“遗传修饰”的含义不包括天然存在的改变，例如通过天然病毒活性、天然遗传重组等发生的改变。

如本文所使用，“免疫隔离性胶囊”意思是指这样的胶囊，即当植入至哺乳动物宿主内时，使宿主免疫系统对胶囊核心内的细胞的有害作用最小化。

如本文所使用，“生物活性化合物的长期稳定表达”意思是指以足以维持其有用的生物活性的水平持续产生生物活性化合物达到大于一个月、优选大于3个月并且最优选大于6个月的时间。

“哺乳动物启动子”指能够在哺乳动物细胞内起作用的启动子。

如本文所使用，术语“神经病学试剂”指对神经细胞有益的生物学试剂，术语包括经证明可能用于CNS或眼细胞的存活、增殖、分化或功能或者神经病学或眼科疾病或病症治疗的任何生物学或药学活性物质。

“神经肽”是在脑中产生的一类蛋白质样分子的成员。神经肽由短链氨基酸组成，一些神经肽作为神经递质起作用并且一些神经肽作为激素起作用。短链意思是指具有<5kD分子量的肽。

如本文所使用，术语“有效连接的”意思是指在重组表达载体内目的核苷酸序列与一个或多个调节序列以允许核苷酸序列表达(例如在体外转录/翻译系统中或者，当载体被引入至宿主细胞内时，在宿主细胞中)的方式连接。

如本文所使用，术语“调节性序列”旨在包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如多腺苷化信号)。

“序列同一性”：高水平的序列同一性指第一个序列衍生自第二个序列的可能性。氨基酸序列同一性要求两个比对的序列间具有相同的氨基酸序列。因此，与参考序列具有70％氨基酸同一性的候选序列要求在比对后候选序列中70％的氨基酸与参考序列中相应氨基酸相同。同一性可以借助于计算机分析例如但不限于ClustalW计算机比对程序(Higgins D.，Thompson J.，Gibson T.，Thompson J.D.，Higgins D.G.，Gibson T.J.，1994.CLUSTAL W：improving the sensitivity of progressive multiple sequencealignment through sequence weighting,position-specific gap penalties andweight matrix choice.Nucleic Acids Res.22:4673-4680)和其中推荐的默认参数确定。ClustalW软件可以从欧洲生物信息研究所的ClustalW WWW服务器http://www.ebi.ac.uk/ clustalw得到。使用该程序和其默认设置，查询多肽的成熟(生物活性)部分和参考多肽比对。计算完全保守残基的数量并且除以参考多肽的长度。

ClustalW算法可类似的用于比对核苷酸序列。可与对于氨基酸序列所标明的方式相似的方式计算序列同一性。

如本文所使用，术语“转化”指外源多核苷酸(即“转基因”)向宿主细胞中的插入。外源多核苷酸整合入宿主基因组内。

“治疗”可以数种不同方式开展，包括治疗性、缓解性和预防性方式。治疗性治疗通常是针对治疗已经存在于所治疗个体内的临床病症，例如疾病或感染。缓解性治疗通常意思是指为了改善个体中现存临床病症的治疗。预防性治疗通常针对预防临床病症。

如本文所使用，术语“siRNA”指称作“小干扰RNA”，有时称作短干扰RNA或沉默RNA的一类化合物。20-25个核苷酸长度的RNA在生物学上起着多种作用。最值得注意的是，siRNA参与RNA干扰(RNAi)途径，其中其干扰特定基因的表达。使产生的siRNA与待沉默基因转录物一部分互补。使用本文所述的方法使siRNA在靶细胞中表达。所表达的短siRNA与靶转录物中的互补RNA序列杂交并且所产生的双链RNA被细胞自身的机构降解。最终的结果是所靶向基因表达的下调。

如本文所使用，术语“载体”指能够转运已经与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其指向其中可以连接额外DNA片段的环状双链DNA环。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括诸如此类形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型反转录病毒，腺病毒和腺伴随病毒)，它们具有等效的功能。

如本文所使用，“反向重复序列”(或IR)是这样的核苷酸序列，其是更下游另一序列的反向互补物。反向重复序列限定了转座子中的边界。反向重复序列还可称作“反向末端重复”或者“末端反向重复序列”，因为它们以反向形式位于同一转座子的相反端。

转座子

当前，已知两类转座子，即I类和II类转座子。I类移动遗传元件或反转座子，通过首先转录成RNA，然后通过逆转录酶逆转录成DNA，并且然后插入在基因组中的另一位置而将自身备份。II类移动遗传元件也称作仅DNA转座子，通过切割和粘接机制移动，使用转座酶从一个位置直接移动到另一个位置。不同类型的转座酶可以以不同方式工作。一些转座酶可结合DNA分子的任何部分，并且靶向部位可以位于任何位置，而其他的转座酶结合特异的序列。然后，转座酶切割靶部位产生粘性末端，释放转座子并将其连接入靶部位内。DNA转座子的插入部位可以通过短的定向重复序列(DR)鉴定，短的定向重复在由DNA聚合酶填补的靶DNA内被交错切开，接着通过反向重复序列(IR)鉴定，反向重复序列对于转座子被转座酶的切除是重要的。

无脊椎动物和脊椎动物的转座子在模式生物中均具有的转基因和插入诱变的潜能。

在脊椎动物中，当前已知和使用三种有效转座子：Tol2元件(Kawakami，K.，(2007)，Genome Biology,8(Suppl 1):S7)和重构建的转座子睡美人(Sleeping Beauty)(SB)(Ivics，Z.等.(2004)，Curr.Issues Mol.Biol.，6：43-56)和青蛙王子(Frog Prince)(FP)(Miskey，C.等.(2003)，Nucleic Acid Research，31(24)：6873-6881)。脊椎动物中的另一感兴趣的转座子系统是PiggyBac转座子系统(Wilson，M.H.等.(2007)，MolecularTherapy，15(1)：139-145。

从青鳉鱼(青鳉(Oryzias latipes))分离的Tol2转座子是自主性转座子，其编码全功能的转座酶。可将相当大的DNA插入片段(大至11kb)克隆入Tol2转座子中，而不降低转座活性。已经证明，Tol2转座子系统在迄今为止所测试的所有脊椎动物细胞中是有效的，包括斑马鱼、爪蟾、鸡、小鼠和人。Tol2转座子的DNA序列与hAT家族转座子，包括来自果蝇的hobo，来自玉米的Ac和来自金鱼草的Tam3(Kawakami，K.(2007)，Genome Biology，8(suppl1)：S7)相似。

睡美人(SB)是从鱼基因组复活的Tc1/船员样家族转座子和转座酶成员并且表现出在多种脊椎动物的培养细胞系、胚胎干细胞和小鼠体内体细胞和种系细胞中具有高转座活性。已经证明睡美人是用于数种脊椎动物模式生物内功能基因组学的有价值的工具，并且显示有希望用于人基因治疗应用(Ivics，Z.和Izsvak，Z.(2006)，Curr.Gene Ther.，6：593-607)。

SB转座酶和转座子描述于US 7,148,203和US 6,489,458。SB转座酶的高活性变体描述于WO 2009/003671中，结果改善了已经有价值的SB系统作为将DNA引入细胞的方法。

青蛙王子也是Tc1/marine样家族成员并且最近已经从北方豹蛙(豹纹蛙，Ranapipiens)的基因组转座子拷贝中再活化。青蛙王子与睡美人仅具有约50％的序列相似性并且有效催化鱼、两栖动物和哺乳动物细胞系中转座的切割和粘连(Miskey，C.等，(2003)，Nucleic Acids Research，31(24)：6873-6881)。

PiggyBac转座子系统衍生自粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)并且能够递送大的转座元件(大至14kb)而不明显降低效率。PiggyBac转座子系统已经用于昆虫转基因和用于小鼠内的种系诱变(Wilson，M.H.等，(2007)，Molecular Therapy，15(1)：139-145)。

可结合使用的另外的转座子是Φc31(见例如Calos，Curr Gene Ther.2006Dec；6(6):633-45)、米诺斯(见例如Zagoraiou等，Proc Natl Acad Sci U S A.2001Sep 25；98(20):11474-8.Epub 2001Sep 18)、船员转座酶例如米诺斯(见例如Pavlopoulos等，GenomeBiol.2007；8Suppl 1:S2)和赫耳墨斯(例如Evertts等，Genetics.2007Dec；177(4):2519-23.Epub 2007Oct 18)。

上述转座子不会相互作用并且因此可以用作在其他转座子存在下的遗传工具，这极大地扩展了这些元件的实用性。可以以互补方式利用对于不同插入部位的任何偏爱。已经开发出作为在无脊椎动物和脊椎动物两种模式生物内的基因转移载体的DNA转座子。DNA转座子在人基因治疗中是逆转录系统的强有力的竞争者。对于遗传分析和治疗目的，II类转座元件是最有用的，因为它们具有容易的实验室操作和可控性质。

转座子系统具有广泛的遗传应用范围。迄今为止，已经研究了转座子系统用于在昆虫幼虫内的体内蛋白质生产，在其中将转座子质粒直接注射入昆虫的前胚盘胚胎中(WO2001/29204)。然后将目的蛋白质从发育中的幼虫或成体昆虫中纯化。

转座子系统还已经用于通过向干细胞引入转座而遗传修饰干细胞。WO 2009/050657涉及使用转座子-转座酶系统产生遗传修饰干细胞的方法。在干细胞中表达的转基因是标记基因，例如处于在干细胞和分化细胞内均为组成型的启动子控制下的GFP。在WO2009/071334中，描述了使用通过转座子系统修饰的精原干细胞产生敲除或者转基因动物模型的方法。

在本发明的优选实施方案中，编码促成细胞中产生生物活性分泌性化合物的多肽的核酸已经通过使用睡美人(SB)转座酶插入至染色体中。更优选地，SB转座酶是高活性转座酶，如在WO 2009/003671中所述。高活性转座酶包括选自包含与SEQ ID NO 7有1至20个氨基酸不同的SB10X变体的睡美人变体，包括选自下列的突变或突变组的至少一种：

-K14R；

-K13D；

-K13A；

-K30R；

-K33A；

-T83A；

-I100L；

-R115H；

-R143L；

-R147E；

-A205K/H207V/K208R/D210E；

-H207V/K208R/D210E；

-R214D/K215A/E216V/N217Q；

-M243H；

-M243Q；

-E267D；

-T314N；和

-G317E.

特别的，优选的SB变体包含至少下列的突变组合：

-变体1：K14R//R214D/K215A/E216V/N217Q；

-变体2：K33A/R1 15H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H；

-变体3:K14R/K30R//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H；

-变体4：K13D/K33A/T83A//H207V/K208R/D210E//M243Q；

-变体5：K13A/K33A//R214D/K215A/E216V/N217Q；

-变体6：K33A/T83A//R214D/K215A/E216V/N217Q//G317E；

-变体7：K14R/T83A/M243Q；

-变体8：K14R/T83A/I100L/M243Q；

-变体9：K14R/T83A/R143L/M243Q；

-变体10：K14R/T83A/R147E/M243Q；

-变体11：K14R/T83A/M243Q/E267D；

-变体12：K14R/T83A/M243Q/T314N；

-变体13：

K14R/K30R/I100I7/A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H；

-变体14:

K14R/K30R/R143L//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H；

-变体15:

K14R/K30R/R147E//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H；

-变体16：

K14R/K30R//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/E267D；

-变体17:

K14R/K30R/A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/T314N；

-变体18：

K14R/K30R//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/G317E；

-变体19：K14R/K33A/R115H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H；

-变体20:

K14R/K30R/R147E//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/T314N；

-变体21:

K14R/K30R/R143L//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/E267D；

-变体22:

K14R/K30R/R143I7/A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/T314N；

-变体23:

K14R/K30R/R143I7/A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/G317E；

-变体24：

K14R/K33A/R115H/R143L//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H；

-变体25：

K14R/K33A/R115H/R147E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H；

-变体26：

K14R/K33A/R115H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/E267D；

-变体27：

K14R/K33A/R1 15H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/T314N；

-变体28：

K14R/K33A/R115H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/G317E；

-变体29：K14R/T83A/M243Q/G317E；

-变体30：K13A/K33A/T83A//R214D/K215A/E216V/N217Q

优选地选自

-变体1：K14R/R214D//K215A/E216V/N217Q；

-变体2：K33A/R115H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H；

-变体3:

K14R/K30R//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H；

-变体4：K13D/K33A/T83A//H207V/K208R/D210E//M243Q；

-变体5：K13A/K33A//R214D/K215A/E216V/N217Q；

-变体6：K33A/T83A//R214D/K215A/E216V/N217Q//G317E；

-变体7：K14R/T83A/M243Q；

-变体8：K14R/T83A/l100L7M243Q；

-变体9：K14R/T83A/R143L/M243Q；

-变体10：Kl 4R/T83A/R147E/M243Q；

-变体11：K14R/T83A/M243Q/E267D；

-变体12：K14R/T83A/M243Q/T314N；

-变体14:

K14R/K30R/R143I7/A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216/N217Q//M243H；

-变体15:

K14R/K30R/R147E//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H；

-变体16:

K14R/K30R//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/E267D；

-变体17：

K14R/K30R//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/T314N；

-变体18:

K14R/K30R//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/G317E；

-变体19：K14R/K33A/R115H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H；

-变体20:

-变体21:

-变体23：

K14R/K30R/R14317/A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/G317E；

-变体24：

K14R/K33A/R1 15H/R143L//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H；

-变体25：

K14R/K33A/R115H/R147E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H；

-变体26：

K14R/K33A/R115H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/E267D；

-变体27：

K14R/K33A/R115H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/T314N；

-变体28：

K14R/K33A/R115H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/G317E；

更优选地选自

-变体2：K33A/R115H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H；

-变体3:

K14R/K30R//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H；

-变体14：

K14R/K30R/R143IJ/A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H；

-变体15:

K14R/K30R/R147E//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H；

-变体16:

K14R/K30R//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/E267D；

-变体19：K14R/K33A/R115H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H；

-变体20:

K14R/K30R/R147E//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243HAT314N；

-变体21:

K14R/K30R/R143L7/A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/E267D；

-变体23:

K14R/K30R/R143L//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/G317E；

-变体24：

K14R/K33A/R115H/R143L//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H；

-变体25：

K14R/K33A/R1 15H/R147E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H；

-变体26：K14R/K33A/R1 15H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/E267D；

-变体27：

K14R/K33A/R115H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/T314N；

-变体28：

K14R/K33A/R115H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/G317E。

在最优选的实施方案中，高活性SB是变体27，其具有如SEQ ID NO 8中所示氨基酸序列。

胶囊化细胞治疗

胶囊化细胞生物递送治疗基于这样的一种概念，即通过在植入到宿主内之前以半渗透性生物相容性材料包绕细胞将细胞与接受体宿主的免疫系统隔离开。本发明包括其中细胞被包于免疫隔离性胶囊中的装置。通过将细胞包装入由微孔膜形成的可植入聚合物胶囊中，将细胞与宿主免疫隔离。该方法防止了宿主与所植入组织间的细胞与细胞接触，消除通过直接提呈的抗原识别。

细胞胶囊，以下称作胶囊，具有特定的膜以控制分子例如生长因子激素、神经递质、肽、抗体和补体基于它们的分子量的扩散(Lysaght等，56J.Cell Biochem.196(1996)，Colton，14Trends Biotechnol.158(1996))。使用胶囊化技术，可将细胞移植入宿主内，而没有免疫排斥，或者使用或者不使用免疫抑制药物。有用的生物相容性聚合物胶囊通常包含含有细胞的核，细胞或者悬浮在液体介质中或者固定在基质内，和不包含所分离细胞的选择性渗透基质或膜的周围或外周区(“套”)，套是生物相容性的并且足以保护核内的细胞不受有害的免疫攻击。胶囊化阻止免疫系统成分进入胶囊，由此保护胶囊化细胞不被免疫破坏。胶囊膜的半渗透性性质还阻止目的生物活性分子容易地从胶囊中扩散到周围宿主组织中并允许营养物容易地扩散进入胶囊中并支持胶囊化细胞。胶囊可由生物相容性材料制成。“生物相容性材料”是这样的材料，即在植入宿主后不引起足以导致排斥胶囊或例如通过降解使其不起作用的有害宿主反应。生物相容性材料对大分子，例如宿主免疫系统成分相对不通透，但是对小分子例如胰岛素、生长因子和营养物是可渗透性的，同时允许去除代谢废物。多种生物相容性材料适宜通过本发明的组成递送生长因子。已知具有不同外表面形态和其它机械和结构特征的多种生物相容性材料。优选地，本发明的胶囊将与通过参考并入本文的WO 92/19195或WO 95/05452；或通过参考并入本文美国专利号5,639,275；5,653,975；4,892,538；5,156,844；5,283,187；或美国专利号5,550,050中描述的那些相似。此类胶囊允许代谢物、营养物和治疗物质通过，而使宿主免疫系统的不利作用最小化。生物相容性材料的构成可包括外周的半渗透性膜和内部的支持细胞的支架。优选地，重组细胞置于支架上，其被选择性渗透膜胶囊化。丝状的细胞支持支架可由选自丙烯酸、聚酯、聚乙烯、聚丙烯聚乙腈、聚对苯二甲酸乙二醇酯、尼龙、聚酰胺、聚氨基甲酸酯、聚丁烯酯、丝、棉、甲壳质、碳或生物相容性金属的任何生物相容性材料制成。并且，粘合的纤维结构可用于细胞植入(美国专利号5,512,600，通过参考并入本文)。生物可降解聚合物包括由聚(乳酸)PLA、聚(乳酸共羟乙酸)PLGA和聚(羟乙酸)PGA及其等效物组成的那些。泡沫支架已经用于提供所移植细胞可粘附其上的表面(WO 98/05304，通过参考并入本文)。编织网管已经用作人造血管(WO 99/52573，通过参考并入本文)。另外，核可以由从水凝胶形成的固定介质构成，核将细胞的位置稳定。水凝胶是大部分由水组成的、凝胶形式的交联亲水聚合物的三维网络。

套优选地具有如小于1000kD、更优选50-700kD之间、更优选70-300kD之间、更优选70-150kD之间，例如70和130kD之间的该分子量所限定的分子量截留值，其中膜(套)将排斥90％的溶质。分子量截留值应当可选择以保证生物活性分子逃离胶囊同时保护胶囊化细胞不被患者的免疫系统破坏。

套的厚度有代表性地在2至200微米，更优选从50至150微米范围内。套应该具有给予胶囊足够强度以保持细胞胶囊化的厚度，并且记住应当尽可能薄以占据尽可能小的空间。

多种聚合物和聚合物混合物可以用于制造周围的半渗透性膜，包括聚丙烯酸酯(包括丙烯酸共聚物)、聚偏二乙烯、聚氯乙烯共聚物、聚氨基甲酸酯、聚苯乙烯、聚酰胺、乙酸纤维素、硝酸纤维素、聚砜(包括聚醚砜)、聚磷腈、聚丙烯腈、聚(丙烯腈/共氯乙烯)以及它们的衍生物、共聚物和混合物。优选地，周围的半渗透性膜是生物相容性半渗透性中空纤维膜。此类膜以及制造它们的方法公开于美国专利号5,284,761和5,158,881中，该两篇文献通过参考并入本文。周围的半渗透性膜可以从聚醚砜中空纤维，例如美国专利号4,976,859或美国专利号4,968,733中描述的那些形成，该两篇文献通过参考并入本文。可替代的周围的半渗透性膜材料是聚(丙烯腈/共氯乙烯)(Pan-PVC)。

胶囊可以是适宜保持生物学活性和提供产品递送或功能通路的任何形状，包括例如圆柱形、矩形、圆盘形、片形、卵圆形、星形或球形。此外，胶囊可以卷曲或缠绕于网样或巢结构中。如果打算在胶囊植入后还取回胶囊，则倾向于导致胶囊从植入部位移走的形状，例如足够小以致于在受体宿主血管中移行的球形胶囊不是优选的。某些形状例如矩形、片形、圆盘形、圆柱形和扁片提供更大的结构完整性并且在希望取回的情况下是优选的。特别优选的形状是圆柱形，因为此形状容易地从中空纤维产生，这可以工业化生产。

在本发明中，大胶囊是体积具有至少1μL，例如从1至10μL的胶囊。

当使用大胶囊时，在每一装置中优选至少10³个细胞被胶囊化，例如10³和10⁸个之间的细胞被胶囊化，最优选10⁵至10⁷个细胞被胶囊化。当然，每一胶囊中的细胞数量取决于胶囊大小。根据经验，本发明人已经发现，在具有泡沫的胶囊中(下面描述)，每μL胶囊(体积计算为包括泡沫的内体积)加载10,000和100,000个之间的细胞，更优选每μL 25,000至50,000个细胞，更优选每μL30,000至40,000个细胞使胶囊填充良好。可加载的细胞数量还取决于细胞大小。

可通过改变胶囊的尺寸(长度，直径)和/或通过植入更少或更多数量的胶囊，优选每个患者1和10个之间的胶囊来控制剂量。

支架可用细胞外基质(ECM)分子包被。细胞外基质分子的适宜实例包括，例如胶原、层粘连蛋白和纤连蛋白。支架表面还可以如下修饰，即用等离子体辐射处理使其带有电荷以增强细胞粘附。

任何适宜的封闭胶囊的方法可以使用，包括使用聚合物粘合剂或褶形、结节或热封。此外，还可使用任何适宜的“干”封，如例如美国专利号5,653,687中所描述，该文献通过参考并入本文。

根据已知技术植入胶囊化细胞装置。许多植入部位考虑用于本发明的装置和方法。这些植入部位包括但不限于，中枢神经系统，包括脑、脊髓(见美国专利号5,106,627，5,156,844和5,554,148，通过参考并入本文)，和眼睛的水性体液和玻璃体液(见WO 97/34586，通过参考并入本文)。

所公开的胶囊可包括从胶囊延伸出来的完整拴绳，并且其足够长以致于至少从治疗部位到达接近插入部位，由此利于将胶囊固定在插入部位，例如固定在皮肤外表面。插入部位随后用皮肤覆盖。

为了便于从组织中移出胶囊，例如当治疗结束时，或者如果必须替换胶囊，胶囊和拴绳之间的过渡应当是平滑的并且没有任何类型的突出，或者尺寸从胶囊向着拴绳方向增加。明显的，这在两部分之间产生了边缘，但是由于相对小的胶囊形成治疗系统的远端，即朝向身体的末端，在移出胶囊的过程中防止辅助伤害。如果胶囊和拴绳是横截面为圆形的管，则胶囊的半径大小优选小于栓绳的半径大小，并且胶囊和栓绳可优选彼此同轴连接。优选地，本发明的胶囊在设计上将与WO 2006/122551中所述相似。

胶囊可通过使用注射器填充，或者备选地可使用如WO2007/048413(通过参考并入本文)中所述的自动或半自动填充。

泡沫支架

泡沫支架可从任何适宜的材料形成，所述材料形成带有开室或带有孔网络的大孔结构的生物相容性泡沫。开室泡沫是互联孔的网状结构。泡沫支架提供非生物降解性的稳定的支架材料，这使得贴壁细胞附着。在用于形成用于本发明装置的泡沫支架的聚合物当中有热塑性塑料和热塑性弹性体。

用于形成适宜泡沫支架的材料的一些实例列于表3。

表3

由聚砜和聚醚砜制造的热塑性塑料泡沫支架，和由聚氨基甲酸酯和聚乙烯醇制造的热塑性弹性体泡沫支架是优选的。

泡沫必须有一些(但不需全部)允许细胞粘附孔内的壁或表面的大小的孔。泡沫支架的孔大小、孔密度和外水体积可变。孔形状可以是圆形、椭圆形或不规则。由于孔形状可以相当大地变化，其尺寸可根据所测量的轴而改变。为了本发明的目的，泡沫中至少一些孔应该具有20-500μm之间，优选50-150μm之间的孔径。优选地，上述尺寸代表着泡沫的孔大小。如果是非圆形的，孔可以具有可变的尺寸，只要其大小足以允许粘附细胞贴附到孔内的壁或表面即可。在一个实施方案中，考虑了具有一些椭圆形孔的泡沫，椭圆形的孔沿着短轴具有20-500μm的直径并且沿着长轴具有最多达1500μm的直径。

除了上述的细胞许可的孔大小外，优选地泡沫中至少部分孔应该小于10μm以便不允许细胞透出，但是仍然提供营养物和生物活性分子在整个泡沫内运输的通道。

泡沫的孔密度(即，每体积中可以容纳细胞的孔数量，如上所述)可以在20-90％之间，优选50-70％之间变化。

类似地，泡沫的孔体积可以在20-90％之间，优选30-70％之间变化。

孔的壁或表面可以用一种或多种细胞外基质分子或其它适宜分子包被。该包衣可以用于促进细胞粘附至孔的壁，容纳特定表型的细胞和/或诱导细胞分化。

可以粘附至泡沫孔内表面的细胞外基质分子(ECM)的优选实例包括：胶原、层粘连蛋白、玻连蛋白、聚鸟氨酸和纤连蛋白。其它适宜的ECM分子包括葡糖氨基聚糖和蛋白聚糖；例如硫酸软骨素，硫酸肝素、透明质酸、硫酸皮肤素、硫酸角质素、类肝素硫酸蛋白聚糖(HSPG)和弹性蛋白。

ECM可以通过培养已知储存ECM的细胞得到，包括间质或星形胶质细胞来源的细胞。当用抗坏血酸盐和cAMP处理时，可诱导Schwann细胞合成ECM。见例如Baron-VanEvercooren等,"Schwann Cell Differentiation in vitro:Extracellular MatrixDeposition and Interaction,"Dev.Neurosci.,8,pp.182-96(1986)。

此外，已经发现粘附肽片段，例如包含RGD的序列(ArgGlyAsp)，包含YIGSR的序列(TyrIleGlySerArg)，以及包含IKVAV的序列(IleLysValAlaVal)，可用于促进细胞附着。一些包含RGD的分子是商业可得的—例如PepTite-2000.TM.(Telios)。

本发明的泡沫支架还可用增加装置内细胞分布的其它材料处理。例如，泡沫的孔可用抑制细胞增殖或迁移的非许可性水凝胶填充。此类修饰可改善粘附细胞对泡沫支架的附着。适宜的水凝胶包括因为带电荷而排斥细胞的阴离子水凝胶(例如藻酸盐或鹿角菜胶)。备选地，“固体”水凝胶(例如琼脂糖或聚环氧乙烷)也可以用于通过阻碍细胞所分泌细胞外基质分子的结合而抑制细胞增殖。

泡沫支架区域以非许可材料处理使得在装置内包封两种或更多种不同的细胞群，而不会一个群体比另一种过度生长。如此的非许可材料可用于泡沫支架中以分隔开不同的胶囊化细胞群。不同的细胞群可以是相同或不同的细胞类型，并且可以产生相同或不同的生物活性分子。在一个实施方案中，一个细胞群产生促进其它细胞群生长和/或存活的物质。在另一实施方案中，产生多个生物活性分子的多个细胞类型被胶囊化。这向受体提供了治疗物质的混合物或“cocktail”。

本发明的装置可以按照任何适宜方法形成。在一个实施方案中，泡沫支架可以作为单独的元件预先形成并且插入到预加工的套，例如中空纤维膜中。

任何适宜的热塑性塑料或热塑性弹性体泡沫支架材料可以预先形成用于插入到预加工的套内。在一个实施方案中，我们优选聚乙烯醇(PVA)海绵用作泡沫支架。数种PVA海绵是商业可得的。例如，PVA泡沫海绵#D-3，60μm孔大小是适宜的(Rippey Corp，Kanebo)。类似地，PVA海绵可以从Ivalon Inc.(San Diego，Cailf.)和Hydrofera(Cleveland，Ohio)商业性得到。PVA海绵是水不溶性泡沫，它是通过充气聚(乙烯醇)溶液与作为交联剂的气态甲醛反应形成。PVA上的羟基与醛基共价交联形成聚合物网络。当泡沫浸湿时是能弯曲的和弹性的并且当干燥时是半刚性的。

作为备选，如US 6,627,422中所述可以使用支持网或纱。

用于形成纱或网的内部支架的丝由任何适宜的生物相同的基本上不可降解的材料形成。用于形成纱或编网的材料包括能够形成纤维的任何生物相容性性聚合物，例如丙烯酸、聚酯、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯腈、聚对苯二甲酸乙二酯、尼龙、聚酰胺、聚氨基甲酸酯、聚丁烯酯、或者天然纤维例如棉、丝、甲壳质或碳。任何适宜的热塑性塑料聚合物、热塑性弹性体或具有形成纤维特性的其它合成或天然材料可插入到预加工中空纤维膜或由扁膜片形成的中空圆柱中。例如，用于缝合材料或者用于制造人造血管的丝、PET或尼龙丝对于该类型的应用是高度有益的。在另外的实施方案中，金属条或丝可用于编织。这些丝材料的每一种具有良好可控表面和几何学特性，可以大批量生产，并且具有悠久的植入使用历史。在某些实施方案中，可将丝“编织”成提供细胞突出物可附着的粗糙表面和“爪手”。丝可用细胞外基质分子包被或表面处理(例如等离子体辐射或者NaOH或KOH侵蚀)以增强细胞对丝的粘附。

在一个实施方案中，优选以非随机单向定位组织的丝拧成束以形成不同厚度和外水体积的纱。外水体积定义为丝与丝之间存在的空隙。纱内的外水体积应在20-95％之间变化，但优选50-95％之间变化。优选的丝与丝之间的空隙空间在20-200μm之间，这足以使细胞沿着纱的长度放置在支架上，并且允许细胞粘附至丝上。包含丝的纱的优选直径在5-100μm之间。这些丝应具有足够的机械强度以拧成束并形成纱。丝的横断面形状可变，优选为圆形、矩形、椭圆形、三角形和星形横截面。

在另一实施方案中，将丝或纱编织成网。可以在使用类似于线轴的包含单丝或复丝的运载器的缝辨机上生产网，在编织过程中运载器用于供给纱或丝成为网。运载器的数量是可调的并且可以缠绕相同的丝或者具有不同成分和结构的丝的组合。由经纬密度限定的编织角通过运载器的旋转速度和生产速度控制。在一个实施方案中，芯棒用于生产网的中空管。在某些实施方案中，编织成一层，在另外的实施方案中编织成多层结构。编织的拉伸强度是各个丝拉伸强度的线性总和。

用于本发明的适宜的单丝的实例在US 6,627,422中可找到。一个实例是编织成辫的PET纱。该PET辫由34股，44旦复丝纱用16运载器的缝辨机以每英寸20交叉数(ppi)的经纬密度在760μm O.D.芯棒上编织形成。PET纱还可用于非编织股。另一实例是尼龙单丝编织成辫。该尼龙辫由13股，40旦复丝纱用16运载器缝辨机以18ppi的经纬密度在760μm O.D.芯棒上编织而成。更多的实例包括不锈钢复丝编织成辫。该不锈钢辫由带子用16运载器缝辨机以90ppi的经纬密度在of 90ppi900μm O.D.芯棒上编织而成。这些PET、尼龙和不锈钢辫的拉伸强度分别为2.7、2.4和3.6kg拉断力。

在一个实施方案中，构建了管状辫。在另外的实施方案中，将辫插入到中空纤维膜中。在更多的实施方案中，细胞置于中空纤维膜上。在另外的实施方案中，允许细胞渗过网管的壁以将细胞附着可用的表面积最大化。在该实施方案中，辫起着细胞支架基质和装置的内部支持体两种作用。辫支持的装置的拉伸强度的增加显著高于备选方法。

细胞系

许多不同的细胞系可以被胶囊化于本发明的装置内。这些细胞包括众所周知的可公开得到的永生化细胞系、自发永生化细胞系以及分裂的原代细胞培养物。由于在一些实施方案中细胞系将要被转染或转导，不得不将克隆进行选择、扩大和储存于细胞库，所以优选能够经历明显次数分裂的细胞或细胞系。

具有长期增殖潜能的细胞系可以从很多种细胞产生，包括祖细胞和/或前体细胞。干细胞也是适宜的，包括多潜能和多能干细胞、胚胎干细胞、神经干细胞和造血干细胞。

细胞系实例包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO)；CHO-K1；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠成纤维细胞-3T3细胞；非洲绿猴细胞系(包括COS-1，COS-7，BSC-1，BSC-40，BMT-10和Vero)；大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12和PC12A)；AT3，大鼠神经胶质肿瘤(C6)；大鼠神经元细胞系RN33b；大鼠海马细胞系HiB5；生长因子扩增的干细胞；EGF-反应性神经球；衍生自哺乳动物CNS的bFGF-反应性神经前体干细胞[Richards等，PNAS 89：8591-8595(1992)；Ray等，PNAS90：3602-3606(1993)]；非人胎体细胞(foetal cells)；原代成纤维细胞；Schwann细胞；星形细胞；β-TC细胞；Hep-G2纹状体细胞；少突胶质细胞及其前体；小鼠成肌细胞-C2C12；人神经胶质来源的细胞-Hs683；人神经胶质来源的细胞-A172；HEI193T；猪成胶质细胞；神经元细胞；神经元；星形细胞；中间神经元；从人长骨分离的成软骨细胞；人胚肾细胞HEK293；HeLa；兔角膜来源的细胞(SIRC)；ARPE-19和CAC细胞。

对于哺乳动物重组生产优选的细胞系包括CHO、CHO-1、HEI193T、HEK293、COS、PC12、HiB5、RN33b和BHK细胞。

本发明还考虑了在同一装置中将两种或更多种单独转染的细胞或细胞系胶囊化，每一细胞系分泌至少一种想要的分子。此外，本发明考虑了将以一种以上表达构建体，例如本发明的两种或更多种表达构建体转染的一种细胞系胶囊化。备选地，可以植入单独产生每一分子的单独的装置。

可将许多不同细胞类型胶囊化于根据本发明的装置中。这些细胞包括众所周知的可公开得到的永生化细胞系、自发永生化细胞系以及分裂的原代细胞培养物。由于在一些实施方案中细胞系将要被转染或转导，不得不将克隆进行选择、扩大和储存于细胞库，所以优选能够经历明显次数分裂的细胞或细胞系。

细胞的选择依赖于预期应用。细胞可以天然产生想要的生物活性分子或者可以经遗传修饰而产生想要的活性分子。

在优选的实施方案中，细胞是人来源的以便降低在人受体中免疫反应的风险。即便细胞被胶囊化于半渗透性膜后面，非人细胞系固有地产生非人蛋白质和代谢物，其虽然以低水平分泌但是会在人宿主中触发免疫反应。在植入到非人哺乳动物中的情况下，优选细胞与待植入胶囊的哺乳动物同一物种。

在最广的方面中，这包括任何的人细胞培养物或细胞系，不管是多克隆的还是单克隆的。单克隆细胞系是更优选的，因为它们可以更好地表征。

人细胞系可以是已经通过插入异源性永生化基因而永生化的，它们可以是自发永生化的，或者它们可以是生长因子扩增的原代细胞或干细胞。

对于间接体内基因治疗，优选的细胞组包括神经元细胞、神经元前体细胞、神经元祖细胞、成纤维细胞、造血细胞、造血干细胞、干细胞、非人胎体细胞和胚胎干细胞。在一个实施方案中，细胞不是胚胎干细胞。

在本发明的优选实施方案中，人细胞系没有通过插入异源永生化基因而永生化。由于本发明涉及特别适用于细胞移植的细胞，不管是作为裸细胞或者优选作为胶囊化细胞，此类永生化细胞系的优选性差，因为如果它们携带已知癌基因的话，则存在它们以不受控方式在人体内开始增殖并潜在形成肿瘤的风险。

优选地，细胞系能够吞噬。通过吞噬作用细胞能够清除装置内由衰退或濒死细胞所脱落的碎片。

优选地，细胞系是接触抑制的细胞系或者可以在胶囊内分化的细胞系，例如干细胞。接触抑制细胞系旨在指当在2-D培养中生长至汇合然后基本停止分裂的细胞系。这不排除有限数量的细胞逃脱2D层的可能性。接触抑制细胞还可以在3D中生长，例如在胶囊内。同样，在胶囊内，细胞生长至汇合然后显著降低增殖率或者完全停止分裂。

特别优选类型的细胞包括在培养中因为它们的特性而接触抑制并形成稳定单层的上皮细胞。甚至更优选的是视网膜色素上皮细胞(RPE细胞)。RPE细胞的来源是通过从哺乳动物视网膜的原代细胞分离。收获RPE细胞的方法明确定义(Li和Turner，1988，Exp.EyeRes.47:911-917；Lopez等，1989，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.30:586-588)并且认为是常规方法学。在大多数的RPE细胞共移植的公布报导中，细胞来源于大鼠(Li和Turner，1988；Lopez等，1989)。根据本发明，RPE细胞来源于人。除了分离的原代RPE细胞之外，培养的人RPE细胞系可用于实施本发明。

所有正常的二倍体脊椎动物细胞具有有限的增殖能力，这是称作Hayflick极限或细胞复制性衰老的现象。在人成纤维细胞中，该限制在50-80次群体倍增数后出现，之后细胞维持有活力但不分裂的衰老状态许多月。这与大多数癌细胞的行为形成对比，其中癌细胞逃脱了限制其增殖能力的控制并且是有效的永生化。

优选细胞能够经历一定数量的细胞分裂，因为它们可以被遗传修饰和扩增以产生用于胶囊化细胞治疗或移植治疗的足够细胞。因此，优选的细胞系能够经历至少50次倍增，更优选至少60次倍增，更优选至少70次倍增，更优选至少80次倍增，更优选至少90次倍增，例如大约100次倍增。

对于胶囊化，细胞优选地能够在人体的低氧分压水平上，例如在CNS内存活并保持分泌治疗分子。优选地，本发明的细胞系能够在低于5％，更优选低于2％，更优选低于1％的氧分压下存活。1％氧分压对应于脑中的氧水平。

用于胶囊化细胞生物递送的细胞系应当具有尽可能多的下列特性：(1)在应急条件下细胞应当是强壮的(胶囊化细胞应当是在血管和无血管组织腔内，例如在脑实质内的中枢神经系统内或者心室内或鞘内流体间隙或者眼睛内，特别是眼内环境中是有功能的)。(2)细胞应该能够被遗传修饰以表达治疗分子。(3)细胞应该能够经历相对高数量的分裂并且具有相对长的寿命(细胞应当产生足够的后代以便存入细胞库、表征、工程改造、安全测试和临床批量制造)。(4)细胞必须是人来源的(这增加了胶囊化细胞和宿主之间的相容性)。(5)细胞应当表现出在装置内体内具有大于80％的生存力超过1个月(这保证了长期递送)。(6)胶囊化细胞应当递送有效量的治疗分子(这保证了治疗的有效性)。(7)当胶囊化时，细胞不应当引起明显的宿主免疫反应(这保证了移植物的寿命)。(8)细胞应当是非致瘤性的(在装置渗漏情况下为宿主提供额外的安全性)。

在筛选和表征数个细胞系过程中，已经发现ARPE-19细胞系(Dunn等，62Exp.EyeRes.155-69(1996)，Dunn等，39Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.2744-9(1998)，Finnemann等，94Proc.Natl.Acad.Sci.USA 12932-7(1997)，Handa等，66Exp.Eye.411-9(1998)，Holtkamp等，112Clin.Exp.Immunol.34-43(1998)，Maidji等，70J.Virol.8402-10(1996))具有用于基于胶囊化细胞的递送系统的成功的平台细胞的所有特征(US 6,361,771，Tao等)。ARPE-19细胞系优于所测试的其它细胞系。

ARPE-19细胞系从美国典型培养物保藏中心得到(ATCC号CRL-2302)。ARPE-19细胞系来源于正常视网膜色素上皮(RPE)细胞的培养物并且表达视网膜色素上皮细胞特异性标志物CRALBP和RPE-65。ARPE-19细胞形成稳定的单层，其表现出形态和功能极性。ARPE-19细胞可以在完全生长培养基中，即细胞保存机构推荐的包含血清的培养基中生长。完全生长培养基或者是含有90％的3mM L-谷氨酰胺、10％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基与Ham's F12培养基的1：1混合物或者是含有包含10％胎牛血清、56mM终浓度碳酸氢钠和2mML-谷氨酰胺的HEPES缓冲液的Dulbecco改良Eagle培养基与Ham's F12培养基的1：1混合物。细胞优选在37℃、5％CO₂下培养。细胞有代表性地铺于并生长于Falcon组织培养基处理的6孔或12孔板中或T25或T75瓶中。对于传代培养，去除培养基，并且优选用0.05％胰蛋白酶，0.02％EDTA溶液漂洗ARPE-19细胞，并且去除胰蛋白酶。加入1至2ml的另外的胰蛋白酶溶液。培养物在室温下(或者37℃下)孵育直到ARPE-19细胞脱落。推荐1：3至1：5的传代率。

可以使用下列的三步筛选法测试用于胶囊化细胞治疗的候选细胞的抵抗性。(a)细胞生存力筛选(可以在使用人造水性体液(aAH)培养基或者人造脑脊髓液(aCSF)培养基的应激条件下评价细胞)。(b)体外ECM筛选(可以在体外的细胞外基质(ECM)筛选中评价细胞)。(c)体内装置生存力筛选(可以在体内膜筛选中评价胶囊化细胞)。使用数种人和非人细胞系进行的筛选和结果的详细描述在US 6,361,771中找到(通过参考并入本文)。

在上述的三种类型筛选中，证明ARPE-19优于所测试的许多其它细胞系(见US 6,361,771)。特别地，应当注意到，在当前技术水平中已经用于分泌NGF的BHK细胞没有通过细胞生存力筛选。

在另一实施方案中，细胞系选自：人永生化成纤维细胞系、人永生化间质干细胞系、人永生化星形胶质细胞系、人永生化中脑细胞系和人永生化内皮细胞系，优选以SV40T、vmyc或端粒酶催化亚基(TERT)永生化。

根据本发明的另一类型的优选人细胞是永生化人星形胶质细胞系。用于产生永生化人星形胶质细胞系的方法先前已经描述(Price TN，Burke JF，Mayne LV.A novel humanastrocyte cell line(A735)with astrocyte-specific neurotransmitter function.InVitro Cell Dev Biol Anim.1999May；35(5):279-88.)。该方法可以用于产生星形胶质细胞系。

优选对该方法做如下三种修改以产生另外的人星形胶质细胞系。

可以使用永生化基因v-myc代替SV40T抗原。

可以使用逆转录病毒基因转移代替通过常规质粒转染技术(包括磷酸钙沉淀)转染质粒。

生长因子扩增的细胞系具有依赖于所加入的促分裂原而连续增殖的优势。因此在将细胞填充至装置内之前或同时撤掉促分裂原，则细胞停止增殖并且在植入至人体内后不再增殖。一些生长因子扩增的细胞系还可在撤掉促分裂原时分化。生长因子扩增的细胞系包括干细胞，例如神经干细胞和胚胎干细胞。

控制细胞在胶囊化装置内分布的方法也已经讨论过。见例如美国专利号5,795,790，其通过参考并入本文。将细胞接受抑制细胞增殖、促进细胞分化或者影响细胞附着至人工生物器官内生长表面的处理。此类处理包括步骤(1)遗传操作细胞，(2)将细胞暴露于抑制增殖的化合物或者诱导分化的化合物下或者使细胞不暴露于刺激增殖的化合物或抑制分化的化合物下；使细胞暴露于辐射下，和(3)以细胞外基质分子、影响细胞增殖或粘附的分子或者惰性支架或其组合修饰胶囊化装置的生长表面。这些处理可以组合使用。在优选的处理中，将细胞暴露于刺激增殖的和抑制分化的化合物下，然后在将细胞胶囊化于半渗透性生物相容性膜内之前消除这种接触。当胶囊化装置体内植入宿主内时，细胞增殖被抑制并且细胞分化被促进。

长期稳定性

优选地，本发明的细胞系当作为胶囊化细胞体内移植时能够存活达长时间(数月并最多达一年或更长)。细胞系优选还能够保持以足以保证治疗功效的水平分泌生物活性化合物达超过一个月、优选大于三个月、更优选大于六个月的时间。还优选细胞能够在胶囊化后保持生物活性化合物的适当分泌达至少一个月、更优选至少三个月、更优选至少六个月。

分泌水平优选每10⁶个细胞每24小时至少200ng生物活性生长因子，例如NGF，更优选至少225ng、更优选至少250ng、更优选至少275ng、更优选至少300ng、更优选至少325ng、更优选至少350ng、更优选至少375ng、更优选至少400ng、更优选至少425ng、更优选至少450ng、更优选至少500ng、更优选525ng、更优选550ng、更优选575ng、更优选600ng、更优选625ng、更优选650ng、更优选675ng、更优选700ng、更优选725ng、更优选750ng、更优选775ng、更优选800ng。

分泌水平优选每10⁶个细胞每24小时至少50ng生物活性神经肽，例如甘丙肽，更优选至少100ng、更优选至少150ng、更优选至少175ng、更优选至少200ng、更优选至少225ng、更优选至少250ng、更优选至少275ng、更优选至少300ng、更优选至少325ng、更优选至少350ng、更优选至少400ng、更优选425ng、更优选450ng、更优选475ng、更优选500ng、更优选525ng、更优选550ng、更优选575ng、更优选600ng、更优选625ng、更优选650ng、更优选675ng、更优选700ng、更优选725ng、更优选750ng、更优选775ng、更优选800ng、更优选825ng、更优选850ng、更优选875ng、更优选900ng、更优选925ng、更优选950ng。

当在胶囊水平测量时，胶囊(包含胶囊化细胞)优选能够每24小时分泌超过20ng生物活性化合物。更优选地，每个装置每24小时的生物活性化合物的量为至少25ng、更优选至少30ng、更优选至少40ng、更优选至少50ng、更优选至少60ng、更优选至少70ng、更优选至少80ng、更优选至少90ng、更优选至少100ng、更优选至少125ng、更优选至少150ng、更优选至少175ng、更优选至少200ng。这些数字指的是具有500-700μm内经的5-7mm长的圆柱形装置并且加载50000个细胞的情况。

用于胶囊化的细胞的遗传工程

可将细胞进行遗传改造以过表达治疗分子。术语“遗传修饰”和“遗传工程”指通过有意引入外源DNA而稳定或瞬时改变细胞基因型。DNA可以是合成的或天然来源的，并且可包含基因、基因部分或其它有用的DNA序列。术语“遗传修饰”意思不包括天然存在的改变，例如通过天然病毒活性、天然遗传重组等发生的那些。

细胞的任何有用的遗传修饰处于本发明的范围内。例如，细胞可以被修饰以产生生物活性物质或者提高生物活性物质的产量，例如神经递质或生长因子等。遗传修饰可以通过用病毒载体(反转录病毒、修饰的疱疹病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺伴随病毒等等)感染或者使用本领域已知方法的转染(lipofection、磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔等等)实现(见Maniatis等，in Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring HarborLaboratory，N.Y.，1982))。例如，嵌合基因构建体可包含病毒，例如逆转录病毒长末端重复序列(LTR)、猴病毒40(SV40)、巨细胞病毒(CMV)；或哺乳动物细胞特异性启动子。此外，载体可以包括药物选择标记，例如大肠杆菌氨基糖苷磷酸转移酶基因，当其与测试基因共感染时提供对遗传霉素(G418)，即蛋白质合成抑制剂的抵抗。

使用表达载体的转染可对细胞进行遗传修饰。如本文所使用，术语“载体”指能够转运已经与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其指向其中可以连接额外DNA片段的环状双链DNA环。另一类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA片段可以连接入病毒基因组中。某些载体能够在它们被引入到的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加体哺乳动物载体)。其它类型的载体(例如非附加体哺乳动物载体)当被引入到宿主细胞内时整合入宿主细胞的基因组中，并且因此随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其有效连接的基因表达。此类载体在本文中被称作“表达载体”。通常，表达载体在重组DNA技术中的使用常常以质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括诸如此类形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型反转录病毒，腺病毒和腺伴随病毒)，它们具有等效的功能。

在一个方案中，包含基因的载体DNA在0.1xTE(1mM Tris pH 8.0，0.1mM EDTA)中稀释成40μg/ml的浓度。将22μl的DNA加入到一次性无菌5ml塑料管内的250μl的2倍HBS(280mM NaCl，10mM KCl，1.5mM Na₂HPO₄，12mM右旋糖，50mM HEPES)中。缓慢加入31μl的2MCaCl₂并将混合物室温孵育30分钟(min)。在该30min的孵育过程中，于4℃、800g下离心细胞5min。将细胞重悬于20倍体积的冰冷PBS中并分成1x10⁷个细胞的等分试样，再次离心。每一等分试样细胞重悬于1ml的DNA-CaCl₂悬浮液中，并室温孵育20min。然后将细胞在生长培养基中稀释并于37℃、5％-7％CO₂下孵育6-24hr。再次离心细胞、在PBS中洗涤并且再溶于10ml的生长培养基中48hr。

用于直接DNA、质粒多核苷酸或重组载体施用的适宜媒介物包括但不限于盐或蔗糖、鱼精蛋白、聚凝胶、聚赖氨酸、聚阳离子、蛋白质、磷酸钙或精脒。见例如WO 94/01139。

还可使用磷酸钙转染技术遗传修饰细胞。对于标准的磷酸钙转染，将细胞机械性打散成单细胞悬液并以50％的汇合度(50,000-75,000个细胞/cm²)铺于组织培养物处理的培养皿中并使其粘附过夜。在一个方案中，如下开展改良的磷酸钙转染方法：将无菌TE缓冲液(10mM Tris，0.25mM EDTA，pH 7.5)中的DNA(15-25μg)用TE稀释至440μl，并且向DNA/TE缓冲液中加入60μl的2M CaCl₂(用1M HEPES缓冲液调节pH至5.8)。向该混合物中逐滴加入总共500μl的2xHeBS(HEPES-缓冲盐；275mM NaCl，10mM KCl，1.4mM Na₂HPO₄，mM右旋糖，40mMHEPES缓冲液粉末，pH 6.92)。使混合物室温静置20min。用1xHeBS短暂洗涤细胞并向每一板中加入1ml的磷酸钙沉淀的DNA的溶液，并于37℃孵育细胞20min。该孵育之后，向细胞中加入10ml的“完全培养基”，并将板置于孵育箱中(37℃，9.5％CO₂)孵育另外3-6小时。在孵育阶段结束时通过吸取去除DNA和培养基。洗涤细胞，加入新鲜培养基，然后将细胞放回到孵育箱中。

可以使用如WO 93/06222中所述的磷酸钙共沉淀技术。

此外，可将细胞遗传工程改造成产生想要的分泌性因子。想要的分泌性因子可以由合成的或者重组的表达载体编码。本发明的重组表达载体包含适宜在宿主细胞中表达核酸的形式的本发明核酸，这意味着重组表达载体包括基于待用于表达的宿主细胞而选择的、与待表达核酸序列有效连接的一种或更多种调节序列。术语“重组”指用于组合多核苷酸以产生有用的生物产品的分子生物学技术，并且指通过该技术产生的多核苷酸和肽。多核苷酸可以是包含与编码调节元件如启动子、终止信号等等的多核苷酸有效连接的编码想要的分泌性因子的多核苷酸的重组构建体(例如载体或质粒)。在重组表达载体中，“有效连接的”意思是指目的核苷酸序列以允许核苷酸序列表达(例如在体外转录/翻译系统中或者当载体被引入到宿主细胞中时在宿主细胞中)的方式与一种或多种调节序列连接。术语“调节序列”旨在包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如多腺苷化信号)。此类调节序列描述于例如Goeddel，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990)。调节序列包括指导核苷酸序列在许多种宿主细胞中组成型表达的那些和指导核苷酸序列仅在某些宿主细胞中表达的那些(例如组织特异性调节序列)。本领域技术人员应当意识到，表达载体的设计可依赖于诸如待转化宿主细胞的选择、预期的蛋白质表达水平等因素。与编码序列有效连接的控制序列如此连接，以致于在与控制序列一致的条件下实现编码序列的表达。“控制序列”指实现与其连接的编码和非编码序列表达必需的多核苷酸序列。控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。此外，“控制序列”指控制编码序列内所编码肽加工的序列；这些可以包括，但不限于控制肽分泌、蛋白酶水解和糖基化的序列。术语“控制序列”旨在以最小限度包括其存在可影响表达的元件，并且还可包括其存在是有利的额外元件，例如，前导序列和融合配偶体序列。“编码序列”是被转录和翻译成多肽的多核苷酸序列。如果连接导致产生可连续翻译的序列而没有改变或打断三联阅读框，则两个编码多核苷酸“有效连接”。如果连接导致基因表达元件具有正确的功能以使想要的分泌性因子表达，则多核苷酸与该基因表达元件有效连接。“转化”是向宿主细胞中插入外源多核苷酸(即“转基因”)。外源多核苷酸被整合入宿主基因组内。如果多核苷酸包含含有转录和翻译调节信息的核苷酸序列并且此类序列与编码想要的分泌性因子的多核苷酸“有效连接”，则多核苷酸“能够表达”想要的分泌性因子。然后可以通过例如根据常规方法，例如在标准教科书Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press 1989)中描述的方法制备细菌载体，来扩增编码肽编码区的多核苷酸。表达载体包括质粒或其他载体。

基因的表达在转录、翻译或翻译后水平上控制。转录起始是基因表达中的早期和关键的事件。这依赖于启动子和增强子序列并且受与这些序列相互作用的特异细胞因子的影响。许多基因的转录单位包含启动子并且在一些情况下包含增强子或调节元件(Banerji等，Cell 27：299(1981)；Corden等，Science 209：1406(1980)；以及Breathnach和Chambon，Ann.Rev.Biochem.50：349(1981))。对于反转录病毒，参与逆转录病毒基因组复制的控制元件存在于长末端重复序列(LTR)中(Weiss等编，The molecular biology of tumorviruses：RNA tumor viruses，Cold Spring Harbor Laboratory，(NY 1982))。莫洛尼鼠白血病病毒(MLV)和Rous肉瘤病毒(RSV)LTR包含启动子和增强子序列(Jolly等,NucleicAcids Res.11:1855(1983)；Capecchi等,在Enhancer and eukaryotic gene expression中,编者Gulzman和Shenk,第101-102页,Cold Spring Harbor Laboratories(NY1991)。其它有效的启动子包括来自巨细胞病毒(CMV)的那些和其它野生型病毒启动子和来自人遍在蛋白C的UbiC启动子(WO 98/32869)。

已经描述了许多非病毒启动子的启动子和增强子区(Schmidt等，Nature 314：285(1985)；Rossi和deCrombrugghe，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5590-5594(1987))。维持和增强转基因在静止细胞中表达的方法包括使用启动子，包括I型胶原(1和2)(Prockop和Kivirikko，N.Eng.J.Med.311：376(1984)；Smith和Niles，Biochem.19：1820(1980)；de Wet等，J.Biol.Chem.，258：14385(1983))、SV40和LTR启动子。

根据本发明的一个实施方案，启动子是选自下列的组成型启动子：鸡β肌动蛋白(CAG)、遍在蛋白启动子、CMV启动子、JeT启动子(US 6,555,674)、SV40启动子、Mt1启动子、人UbiC和延伸因子1α启动子(EF-1α)。特别优选的启动子是体内不接受下调的启动子。

可诱导/可抑制启动子的实例包括：Tet-On、Tet-Off、雷帕霉素可诱导启动子、Mx1、Mo-MLV-LTR、孕酮、RU486。

除了使用病毒和非病毒启动子驱动转基因表达外，可使用增强子序列提高转基因表达水平。增强子不但可以增强它们天然基因的转录活性，而且还可增强一些外源基因的转录活性(Armelor，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 70：2702(1973))。例如，在本发明中，胶原增强子序列可与胶原启动子2(I)一起使用以增强转基因表达。此外，在SV40病毒中发现的增强子元件可用于增强转基因表达。该增强子序列包含72个碱基对重复，如Gruss等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：943(1981)；Benoist和Chambon，Nature 290：304(1981)，以及Fromm和Berg，J.Mol.Appl.Genetics，1：457(1982)中所述，所有这些文献通过参考并入本文。当该重复序列串联存在于多种启动子中时可增强许多不同的病毒和细胞基因的转录(Moreau等，Nucleic Acids Res.9：6047(1981)。

更多的表达增强序列包括但不限于Kozak共有序列、旱獭肝炎病毒转录后调节元件、WPRE、SP163增强子、CMV增强子、来自tau、TH或APP基因的非翻译的5’或3’区和鸡[β]-珠蛋白绝缘子或其它绝缘子。优选的增强元件包括Kozak共有序列、WPRE和β珠蛋白绝缘子。

可通过化学合成方法或者通过重组技术制备编码想要的分泌性因子的多核苷酸。多肽可通过例如Merrifield，85J.Amer.Chem.Soc.2149-2154(1963)中所描述的化学合成技术常规制备(见Stemmer等，164Gene 49(1995))。其体外或体内转录或翻译会导致想要的分泌性因子产生的合成的基因，可以通过本领域众所周知的技术构建(见Brown等，68Methods in Enzymology 109-151(1979))。编码多核苷酸可以使用常规DNA合成仪器，例如Applied Biosystems Model 380A或380B DNA合成仪(可从Applied Biosystems，Inc.，850Lincoln Center Drive，Foster City，Calif.，USA商业性获得)产生。

简言之，重组表达载体的构建采用标准的连接技术。对于分析证实所构建载体中序列的正确性，将基因使用例如Messing等的方法(核酸Res.，9：309-，1981)、Maxam等的方法(Methods in Enzymology，65：499，1980)或者本领域技术人员已知的其它适宜方法测序。

对所切割片段大小的分离使用如Maniatis等所述的常规凝胶电泳(MolecularCloning，第133-134页，1982)开展。

术语“生物学试剂”指任何试剂，例如病毒、蛋白质、肽、氨基酸、脂类、碳水化合物、核酸、核苷酸、药物、前药或对神经细胞具有作用的其它物质，不管此类作用是有害的、有益的还是其它。对神经细胞有益的生物学试剂是“神经学试剂”，该术语包括可证明有效用于CNS或眼睛细胞增殖、分化或功能或者治疗神经学或眼科疾病或病症的任何生物学或药学活性物质。例如，术语可包括某些神经递质、神经递质受体、生长因子、生长因子受体等等以及用于合成这些试剂的酶。

当遗传修饰用于产生生物学试剂时，物质可以是用于治疗特定病症例如CNS病症的物质。可将细胞进行遗传修饰以表达生物活性试剂，例如生长因子、生长因子受体、神经递质、神经递质合成基因、神经肽和嗜铬颗粒胺转运体。例如，遗传修饰细胞以致于它们分泌诱导增殖的生长因子或诱导分化的生长因子是所渴望的。

生物学试剂可以是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、转化生长因子α、转化生长因子β、神经生长因子、胰岛素样生长因子、血小板衍生生长因子、神经胶质细胞系衍生神经营养因子、神经秩蛋白、泊色芬(persephin)、神经胚素(阿尔特明(Artemin))、脑源性神经营养因子、睫状神经营养因子、佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯、垂奥法丁(tryophotin)、激活蛋白、促甲状腺激素释放激素、白细胞介素、骨形态发生蛋白、巨噬细胞炎性蛋白、硫酸肝素、双调蛋白、视黄酸、肿瘤坏死因子α、成纤维细胞生长因子受体、表皮生长因子受体、或预期对潜在靶组织具有有用治疗作用的其它试剂。生物学试剂的实例包括营养因子例如神经胶质衍生神经营养因子(GDNF)、神经秩蛋白、阿尔特明和泊色芬；与生长因子活性有关的细胞内途径的调节物例如星状孢子素、CGP-4 1251等等；激素；多种蛋白质和多肽例如白细胞介素；肝素样分子；抗体如人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、抗体的抗原结合片段例如Fv、scFv、Fab、Fab'或F(ab)₂，以及多聚体形式，例如二聚体的IgA分子或五价的IgM、亲和体和双体、和对靶细胞例如神经细胞具有影响的多种其它分子。

在另一实施方案中，分泌性生物活性化合物是细胞合成的小分子。在这些实施方案中，结构基因编码参与小分子生物合成的多肽。一个实例涉及用于多巴胺合成的酶的表达，包括AADC(芳香族氨基酸脱羧酶)、TH(酪氨酸羟化酶)和GCH1(GTP-环水解酶1)。另一实例涉及用于GABA合成的酶的表达，包括GAD(谷氨酸脱羧酶)。

在另外的实施方案中，使用siRNA技术下调基因的表达。在某些情况下这将导致生物活性化合物分泌的增加。例如结构基因可以编码siRNA以便下调内源蛋白质，例如腺苷激酶，以促进腺苷合成和分泌。

可将哺乳动物细胞改造以产生多种神经递质或者它们的受体例如血清紧张素、L-多巴、多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素、速激肽、P物质、内啡肽、脑啡肽、组胺、N-甲基D-天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酸、GABA、ACh等等。有用的合成神经递质的基因包括TH、DDC、DBH、PNMT、GAD、色氨酸羟化酶、ChAT和组氨酸脱羧酶。编码证明可用于治疗CNS病症的多种神经肽的基因包括P物质、神经肽-Y、甘丙肽、脑啡肽、血管升压素、VIP、胰高血糖素、铃蟾肽、CCK、促生长素抑制素、降钙素基因相关肽等等。

生物学试剂对受体宿主内CNS或眼睛细胞的影响可体外鉴定，这基于中枢神经系统细胞(例如大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞、培养的原代中枢神经神经元等)；或眼睛细胞(例如IO/LD7/4细胞系、ARPE-19细胞、培养的视网膜色素上皮细胞等)模型细胞培养物相对于对照培养物之间，在条件例如所表达表型的比值(神经元、神经胶质细胞或神经递质或其它标志物)、细胞生存力和基因表达改变方面的显著差异。细胞的物理特征可通过使用显微镜观察细胞和神经突形态和生长来分析。诱导蛋白质例如酶、受体和其它细胞表面分子或者神经递质、氨基酸、神经肽和生物胺的新表达或者水平增加，可以使用本领域已知可鉴定此类分子水平改变的任何技术分析。这些技术包括使用抗此类分子的抗体的免疫组织化学或者生物化学分析。此类生物化学分析包括蛋白质测定、酶测定、受体结合测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、电泳分析、使用高效液相色谱(HPLC)的分析、Western印迹和放射免疫测定(RIA)。核酸分析例如Northern印迹和PCR可以用于检查编码这些分子或者编码合成这些分子的酶的mRNA水平。同样，可以通过免疫化学或者通过其他免疫学方法体内检测想要的分泌性因子的细胞内转录物。

用于产生生物活性化合物的细胞的支持基质

本发明的方法还包括在植入至哺乳动物脑内之前在支持基质上体外培养产生生物活性化合物的细胞。经设计在植入至脑内前将细胞预粘附在微载体上增强了移植细胞的长期生存力并提供长期的功能益处。在支持基质上培养细胞的方法和将所述细胞植入脑内的方法描述于US 5,750,103中(通过参考并入本文)。

为提高移植的细胞，即移植的分泌生物活性化合物的细胞的长期生存力，可以在移植前将待移植的细胞体外粘附至支持基质上。支持基质可以包含的材料包括这样的材料，即在体外孵育后细胞粘附，并且细胞可以在其上生长，并且可以移植入哺乳动物体内而没有产生有毒的反应或将破坏所植入细胞的炎症反应或者其它干扰它们的生物学或治疗活性的反应。此类材料可以是合成的或者天然的化学物质或者生物来源的物质。

基质材料包括，但不限于，玻璃和其它硅氧化物、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚偏二氟乙烯、聚氨基甲酸酯、聚海藻酸盐、聚砜、聚乙烯醇、丙烯腈聚合物、聚丙烯酰胺、聚碳酸酯、聚戊烯(polypentent)、尼龙、淀粉酶类、天然和改良明胶以及天然和改良胶原、天然和改良多糖类包括葡聚糖和纤维素(例如硝基纤维素)、琼脂和磁石。可使用可吸收性或者非吸收性材料。同样还预期使用本领域众所周知的细胞外基质材料。细胞外基质材料可以商业性获得，或者如下制备，即通过培养分泌此类基质的细胞、去除分泌性细胞并且使待移植的细胞与基质相互作用并粘附在基质上。待移植的细胞可以在其上生长，或者细胞可以与其混合的基质材料可以是RPE细胞的天然产物。因此，例如，基质材料可以是由待植入的RPE细胞产生并分泌的细胞外基质或者基膜材料。

为了改善细胞粘附、存活和功能，可任选用本领域已知的因子包被固体基质外表面以促进细胞粘附、生长或存活。此类因子包括细胞粘附分子、细胞外基质例如，诸如纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原、弹性蛋白、葡糖氨基聚糖或蛋白聚糖或生长因子。

备选地，如果所植入细胞粘附其上的固体基质由多孔材料构成，则促进生长或促进存活的一种或多种因子可以混合到基质材料中，在体内植入后所述因子可以从基质材料中缓慢释放。

当粘附至根据本发明的支持物时，用于移植的细胞通常在支持物的“外表面”。支持物可以是固体的或多孔的。然而，甚至在多孔支持物中，细胞与外部环境直接接触，而没有介入膜或其它屏障。因此，根据本发明，尽管细胞粘附其上的表面可以是不在颗粒或珠自身外表的多孔支持材料内折或转曲形式，但是还是认为细胞在支持物的“外表面”上。

支持物的形态优选是球形的，如在珠中，但是可以是圆柱形、椭圆形、扁片或条、针或钉形等等。优选的支持物基质形式是玻璃珠。另一优选的珠是聚苯乙烯珠。

珠大小可以从直径大约10μm至1mm，优选地从大约90μm至大约150μm。对于多种微载体珠的描述见例如，Fisher Biotech Source 87-88，Fisher Scientific Co.，1987，第72-75页；Sigma Cell Culture Catalog，Sigma Chemical Co.，St，Louis，1991，第162-163页；Ventrex Product Catalog，Ventrex Laboratories，1989；这些参考文献通过参考并入本文。珠大小的上限可以由珠对不良宿主反应的刺激限定，不良刺激会干扰所移植细胞的功能或者导致周围组织的损伤。珠大小的上限还可以由施用方法限定。此类限制可由本领域技术人员容易地确定。

生物活性化合物的聚合物胶囊化细胞递送的治疗有用性.

中枢神经系统是经历慢性退化的部位。已知生长因子具有用于治疗神经退行性病症的巨大治疗潜能。例如，已经被遗传工程改造分泌生长因子的聚合物-胶囊化异种细胞可保护大鼠(Winn等，91Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2324-8(1994))、灵长类(Emerich等，349J.Comp.Neurol.148-64(1994))和年老的灵长类(Kordower等，91Proc.Natl.Acad.Sci.USA 10898-902(1994))中枢神经系统不产生损害诱导的细胞损失。使用聚合物-胶囊化细胞装置直接递送多种生长因子至中枢神经系统内的广范围靶部位已经产生治疗效果，并且没有证据表明产生副作用(Emerich等，130Exp.Neurol.141-50(1994)，Emerich等，736Brain Res.99-110(1996)，Emerich等，349J.Comp.Neurol.148-64(1994)，Hoffman等，122Exp.Neurol.100-6(1993)，Kordower等，72Neuroscience 63-77(1996)，Kordower等，91Proc.Natl.Acad.Sci.USA 10898-902(1994)，Winn等，91Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2324-8(1994))。通过研究在接受递送生长因子至脑长达1年的动物中没有发现副作用(Lindner等，5Cell Transplant.205-23(1996)，Winn等，140Exp.Neurol.126-38(1996))，这支持聚合物-胶囊化细胞递送生长因子的安全性。这些研究甚至测试对神经毒性极其敏感的学习行为时也没有发现有副作用。

微胶囊

除了上述的大胶囊之外，本发明的神经肽分泌细胞可以胶囊化于微胶囊中或者微球体中。

本发明中的胶囊是具有小于1μL体积的胶囊。

如本文所定义的微胶囊或微球体是每个胶囊容纳小于10⁴个细胞的胶囊。每个微胶囊可包含基本上少于10⁴个细胞，例如每个胶囊少于1000个细胞，例如每个胶囊少于100个细胞，例如每个胶囊少于50个细胞，例如每个胶囊少于10个细胞，例如每个胶囊少于5个细胞。此种微胶囊结构上相对简单，因为它们包含在基质内或多或少均匀分散细胞。还可将微胶囊包被以提供两层以上的结构并保证没有细胞突出穿过微胶囊的表面。

由于微胶囊有代表性地是小的直径，有代表性地小于500μm、例如小于450μm、例如小于400μm、例如小于350μm、例如小于300μm、例如小于250μm、例如小于200μm、例如小于150μm、例如小于100μm、例如小于50μm、例如小于25μm、例如小于20μm、例如小于10μm、例如小于5μm，所以它们可以像液体悬浮液一样操作并在治疗部位注射。

自杀系统

当需要时，可将分泌生物活性化合物的细胞胶囊化的本发明的装置从患者中取回。作为进一步的安全措施，可将细胞装备自杀系统，这保证在向所述患者施用适宜药物时细胞可以被选择性地杀死。

自杀系统对于根据本发明的裸细胞移植是特别优选的，因为在移植后取出裸细胞的可能性非常有限。

一个此类的自杀系统基于胸腺嘧啶核苷激酶。通过具有其中胸腺嘧啶核苷激酶组成型或诱导表达的内置自杀系统，可通过向个体施用治疗有效量的核苷类似物，例如AZT杀死细胞。如果胶囊化细胞开始以不受控的方式增殖，则可以施用核苷类似物。人们可能仅仅因为不再需要分泌生物活性化合物的细胞，因为必须立即终止并且不能等待手术去除胶囊化细胞或者因为通过一些其它途径进一步治疗，而希望终止治疗。

在所移植或胶囊化细胞已经在移植前有条件地永生化的情况下，理论上存在在移植后癌基因起始转录和所移植细胞因此变成致瘤型的风险。当细胞通过转导处于可诱导启动子控制下的癌基因而永生化时(例如Tet on-off系统，Mx1启动子等)，胸腺嘧啶核苷激酶(TK)编码序列插入至处于同一启动子控制下的载体构建体中(例如通过使用IRES构建体)或者TK编码序列插入到具有相同启动子的另一载体中。这保证了当癌基因被转录时，TK也被转录并且通过施用前体药物选择性杀死转导的和致瘤的细胞。

在本领域描述了数个胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因实例。一个优选的TK是HSV-胸腺嘧啶核苷激酶。其它优选的激酶包括Munch-Petersen等2000，J.Biol.Chem.275:6673-6679中描述的黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)胸腺嘧啶核苷激酶。该特殊激酶的突变体甚至更优选，因为对于数种核苷类似物它们具有降低的LD₅₀(WO 01/88106)。另一组的优选胸腺嘧啶核苷激酶包括WO 03/100045中描述的植物激酶。

免疫刺激性细胞表面蛋白

在一个实施方案中，提供除了表达生物活性化合物外还能够表达免疫刺激性细胞表面多肽的胶囊化人细胞。当用于植入人患者内而胶囊化时，表达这些免疫刺激性细胞表面多肽的细胞特别有用，因为从破裂的胶囊逃出的细胞会通过患者的免疫系统破坏。宿主免疫反应不会被完整装置内的表达免疫刺激性细胞表面多肽的重组细胞触发。然而，在装置损害的情况下，所释放的细胞被吞噬细胞有效去除，没有补体活化或免疫记忆产生。

在特定的实施方案中，包含人转铁蛋白受体膜结构域的嵌合多肽将人IgG₁Fc以“反向方向”锚定至细胞质膜的表面，因此模拟调理素作用过程中的IgG构型。人IgG₁嵌合多肽结合Fc受体以活化吞噬细胞，例如巨噬细胞，但是避免了还活化补体级联反应的(“补体结合”)的不良特性。长期活化的补体系统会杀死宿主细胞，并且积累的证据表明该机制可以引起许多退化性疾病，包括炎症和神经变性疾病。本发明的该实施方案的更多细节描述于US 6,197,294中(Neurotech)。

根据该实施方案，细胞系还包含含有与编码融合蛋白的多核苷酸序列有效连接的启动子的构建体，所述融合蛋白包含连接在第二个细胞表面多肽氨基末端的免疫刺激性细胞表面蛋白，其中第二个细胞表面多肽包含跨膜区，其中当表达时融合蛋白表达在细胞表面上。

优选地免疫刺激性细胞表面多肽活化吞噬细胞，但是不锚定补体。在一个实施方案中，免疫刺激性细胞表面多肽是IgG的一个区，优选Fc。第二个细胞表面多肽可以是转铁蛋白受体铰链区。

实施例

实施例1:

甘丙肽和NGF表达质粒的构建以及将表达盒亚克隆入睡美人转座酶的底物载体中，以通过哺乳动物细胞产生野生型甘丙肽和野生型NGF

1)如下产生甘丙肽构建体：通过重叠PCR产生IgSP-deltaprepro-甘丙肽。在第一个扩增步骤中，编码成熟甘丙肽和具有10bp IgSP FLAP(IgSP＝小鼠Ig重链基因V-区信号肽序列)的C末端肽的甘丙肽序列，使用引物FLAP-IgSP-mature gala(SEQ ID NO 10)，5'(5’-GGTGAATTCGGGCTGGACCCTGAACAGCGCG-3’)和Deltaprepro-甘丙肽-XhoI(SEQ ID NO11)3'(5’-TATACTCGAGCAGGAATGGCTGACTCTGCATAAATTGGCC-3’)从pCMV-SPORT6-h甘丙肽质粒(从德国柏林的RZPD得到，克隆ID：IRATp970F0849D6)PCR扩增。在第二个PCR反应中，包含带有来自成熟甘丙肽5’的10bp甘丙肽FLAP的全长IgSP序列的片段，使用引物IgSPkozak1s+BamHI(SEQ ID NO 12)(5’-TATAGGATCCGCCACCATGAAATGCAGCTGGGTTATC-3’)和IgSP-甘丙肽FLAP as(SEQ ID NO 13)(5’-GGGTCCAGCCCGAATTCACCCCTGTAGAAAG-3’)从pNUT-IgSP-hCNTF(US 6，361，771)扩增。在第三步中，步骤1和2的产物在最后的PCR反应中混合，通过使用等摩尔量的前两次PCR反应的产物和引物IgSPkozak1s+BamHI和Deltaprepro-甘丙肽-XhoI3'产生IgSP-deltaprepro-甘丙肽片段。

为了产生基于质粒的表达载体，所得到的PCR片段克隆入用BamHI/XhoI消化的pCAn中。pCAn载体来源于pcDNA3.1(Invitrogen)。将pcDNA3.1中的CMV启动子去除并且替换成人CMV增强子/鸡β肌动蛋白(CAG)启动子和第一个内含子。此外，当在哺乳动物细胞中表达时，载体包含提供G418抗性的Neo基因。然后将IgSP-deltaprepro-甘丙肽片段表达盒(即包括CAG启动子以及新霉素抗性表达盒)从pCAn载体亚克隆入质粒pT2BH中。pT2BH是用于转座酶睡美人的底物载体(Ivics等，Cell，91：501-10(1997))。通过用BglII和EcoRV第一次消化pT2BH进行亚克隆。然后将pCAn-IgSP-deltaprepro-甘丙肽载体用BsmBI消化，然后用Klenow大片段聚合酶进行填补反应。然后将平端的开口的载体用BglII消化以产生半平端的IgSP-deltaprepro-甘丙肽+新霉素抗性表达盒片段，将其克隆入BglII-EcoRV-消化的pT2BH载体中。

2)如下产生人NGF构建体：使用下列引物从分离自HEK293细胞的基因组DNA中PCR扩增人preproNGF：hNGFs+BamHI(SEQ ID NO 14)：5’-TATAGGATCCCTCTGAGGGACCCAGAAACT-3’和hNGFas+XhoI(SEQ ID NO 15)：5’-TATACTCGAGCAGGTCAGGCTCTTCTCAC-3’。所得到的PCR片段用BamHI和XhoI酶切并插入至表达载体pCAn(上述)的BamHI和XhoI位点产生构建体pCAn.hNGF。使用BglII和SsPI将来自pCAn.hNGF(还包含新霉素抗性表达盒)的表达盒切下作为半平端片段。睡美人转座酶底物载体pT2BH用BglII和EcoRV消化。将CAn.hNGF片段连接入BglII和EcoRV消化的载体主链中产生构建体pT2.CAn.hNGF。

来自构建体的序列示于实施例2中。

实施例2.实施例1中所述构建体的序列

存在于构建体pCAn.IgSP-deltaprepro-甘丙肽和pT2.CAn.IgSP-deltaprepro-甘丙肽中的IgSP-deltaprepro-甘丙肽核苷酸序列(SEQ ID NO 1)

ATGAAGTGCAGCTGGGTGATCTTCTTCCTGATGGCAGTGGTTACAGGTAAGGGGCTCCCAAGTCCCAAACTTGAGGGTCCATAAACTCTGTGACAGTGGCAATCACTTTGCCTTTCTTTCTACAGGGGTGAATTCGGGCTGGACCCTGAACAGCGCGGGCTACCTGCTGGGCCCTCACGCCGTGGGCAACCACAGAAGCTTCAGCGACAAGAACGGCCTGACCAGCAAGCGGGAGCTGCGGCCCGAGGACGACATGAAGCCCGGCAGCTTCGACAGAAGCATCCCCGAGAACAACATCATGCGGACCATCATCGAGTTTCTGAGCTTTCTGCACCTGAAAGAGGCCGGAGCCCTGGACCGGCTGCTGGATCTGCCTGCCGCTGCCTCCTCAGAAGACATCGAGCGGTCCTGA

IgSP-deltaprepro-甘丙肽是与没有prepro序列但包括C末端尾的人甘丙肽融合的小鼠Ig重链基因V区信号肽(GenBank ID：M18950)。注意IgSP-deltaprepro-甘丙肽序列包含内含子。

IgSP-甘丙肽转录物的翻译(SEQ ID NO 2)

MKCSWVIFFLMAVVTGVNSGWTLNSAGYLLGPHAVGNHRSFSDKNGLTSKRELRPEDDMKPGSFDRSIPENNIMRTIIEFLSFLHLKEAGALDRLLDLPAAASSEDIERS

成熟甘丙肽序列用粗体强调。

存在于构建体pCAn.hNGF和pT2.CAn.hNGF中的人preproNGF核苷酸序列(SEQ ID NO 3)

ATGTCCATGTTGTTCTACACTCTGATCACAGCTTTTCTGATCGGCATACAGGCGGAACCACACTCAGAGAGCAATGTCCCTGCAGGACACACCATCCCCCAAGTCCACTGGACTAAACTTCAGCATTCCCTTGACACTGCCCTTCGCAGAGCCCGCAGCGCCCCGGCAGCGGCGATAGCTGCACGCGTGGCGGGGCAGACCCGCAACATTACTGTGGACCCCAGGCTGTTTAAAAAGCGGCGACTCCGTTCACCCCGTGTGCTGTTTAGCACCCAGCCTCCCCGTGAAGCTGCAGACACTCAGGATCTGGACTTCGAGGTCGGTGGTGCTGCCCCCTTCAACAGGACTCACAGGAGCAAGCGGTCATCATCCCATCCCATCTTCCACAGGGGCGAATTCTCGGTGTGTGACAGTGTCAGCGTGTGGGTTGGGGATAAGACCACCGCCACAGACATCAAGGGCAAGGAGGTGATGGTGTTGGGAGAGGTGAACATTAACAACAGTGTATTCAAACAGTACTTTTTTGAGACCAAGTGCCGGGACCCAAATCCCGTTGACAGCGGGTGCCGGGGCATTGACTCAAAGCACTGGAACTCATATTGTACCACGACTCACACCTTTGTCAAGGCGCTGACCATGGATGGCAAGCAGGCTGCCTGGCGGTTTATCCGGATAGATACGGCCTGTGTGTGTGTGCTCAGCAGGAAGGCTGTGAGAAGAGCCTGA

人preproNGF转录物的翻译(SEQ ID NO 4)

MSMLFYTLITAFLIGIQAEPHSESNVPAGHTIPQVHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRTHRSKRSSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRA

成熟NGF序列用粗体强调。

存在于pT2-来源的构建体中的IR/DR(L)左手(互补链)睡美人(SB)底物序列(SEQ ID NO 5)

CAGTTGAAGTCGGAAGTTTACATACACTTAAGTTGGAGTCATTAAAACTCGTTTTTCAACTACTCCACAAATTTCTTGTTAACAAACAATAGTTTTGGCAAGTCAGTTAGGACATCTACTTTGTGCATGACACAAGTCATTTTTCCAACAATTGTTTACAGACAGATTATTTCACTTATAATTCACTGTATCACAATTCCAGTGGGTCAGAAGTTTACATACACTAA

存在于pT2-来源的构建体中的IR/DR(R)右手SB底物序列(SEQ ID NO 6)TTGAGTGTATGTAAACTTCTGACCCACTGGGAATGTGATGAAAGAAATAAAAGCTGAAATGAATCATTCTCTCTACTATTATTCTGATATTTCACATTCTTAAAATAAAGTGGTGATCCTAACTGACCTAAGACAGGGAATTTTTACTAGGATTAAATGTCAGGAATTGTGAAAAAGTGAGTTTAAATGTATTTGGCTAAGGTGTATGTAAACTTCCGACTTCAACTG

SB转座酶SB10的蛋白质序列(野生型睡美人转座酶)(SEQ ID NO 7)

高活性SB转座酶SB100x的蛋白质序列(SEQ ID NO 8)

突变用粗体和下划线强调。

高活性SB转座酶SB80x的蛋白质序列(SEQ ID NO 9)

突变用粗体和下划线强调。

实施例3.稳定的分泌甘丙肽和NGF的哺乳动物细胞的产生活和所分泌神经肽水平的比较

使用实施例1中所述构建体在ARPE-19细胞中产生稳定细胞系

ARPE-19是人视网膜色素上皮细胞系(Dunn等，1996)，其于37℃和5％CO₂下生长于补充有10％胎牛血清(Sigma-Aldrich，丹麦)的含Glutamax的DMEM/Nutrient Mix F-12中(Invitrogen，丹麦)。通过胰蛋白酶消化和再接种(1:5接种率)，将细胞每周大约传代2次。将细胞以2.4x10⁶个细胞/瓶的密度接种于T150培养瓶中(Corning Costar，Biotech Line，丹麦)用于转染研究。次日，每一培养瓶中的细胞使用Fugene6(Roche，德国)根据生产商的说明书，以包含甘丙肽或NGF表达盒的pT2SB底物载体和SB-100x高活性转座酶表达载体以或者3:1的比例(7.5μg pT2载体和2.5μg SB-100x)或者10:1的比例(9μg pT2载体和0.9μgSB-100x)共转染。为选择稳定转染子，转染后48小时，向培养基中加入800μg/ml G418。当克隆表现出界限清晰并彼此分开时，每一构建体调取大约200个克隆并转移至48孔板中。当在这些板中汇合时，使用商业性甘丙肽ELISA试剂盒(目录号S-1210，Bachem)测试甘丙肽克隆中是否存在甘丙肽，并且使用商业性NGF ELISA试剂盒(NGF Duoset，R&D Systems)测试NGF克隆中是否存在NGF。将最高产量的克隆在T150培养瓶中进一步扩大培养并将等分试样冻存于液氮中。

结果

从基于pCAn和基于pT2的克隆体外分泌甘丙肽和NGF

最佳的甘丙肽和NGF克隆在培养高达8周中接受表达稳定性研究(2D研究)。从图1中明显看出，与通过标准转染产生的克隆相比，使用SB转座酶系统产生的克隆分泌令人惊奇的大量因子。

从基于pCAn和基于pT2的克隆体内分泌甘丙肽

在Goettingen迷你猪模型中测试来自2D-研究的最稳定的甘丙肽高(SB-IgSP-24)和低(ppG-152)生产者克隆的体内表达稳定性能。使用NsGene的专利胶囊化细胞(EC)生物递送技术将克隆胶囊化。简言之，具有280kD的分子量截留值(MWCO)的14mm聚醚-砜(PES)膜以250,000个细胞/装置填充。在植入至猪海马内之前，使细胞沉降并在装置上繁殖2周。4周后将装置外植。图2显示与外植的装置和体外平行运行的装置相比，来自植入前装置的所分泌的甘丙肽水平。明显地，与使用标准转染技术产生的克隆ppG-152相比，来自使用SB技术产生的克隆SB-IgSP-24的甘丙肽分泌水平出乎意料的大(外植体水平：大约150ng/装置/24小时对5ng/装置/24小时)。

来自基于pCAn和基于pT2的克隆的体内NGF分泌

在大鼠中测试来自2D研究的最稳定NGF高生产者克隆(SB-NGF-78)和早期产生的最低生产者克隆(NGC-0295)的体内表达稳定性。通过使用NsGene的专利胶囊化细胞(EC)生物递送技术以100,000个细胞/装置体充280kD MWCO，7mm PES膜，将克隆胶囊化。将装置植入到大鼠纹状体内并且在外植之前保留8周。图3显示与外植的装置和体外平行运行的装置相比，来自植入前装置的所分泌的NGF水平。与使用标准转染技术产生的克隆NGC-0295相比，来自使用SB技术产生的克隆SB-NGF-78的NGF分泌水平出乎意料的大(外植体水平：大约80ng/装置/24小时对8ng/装置/24小时)。

比较实施例4：所测试其他增强转基因表达的方法

表1：所测试的其它增强转基因表达方法的示意。

实施例5.使用转座酶系统产生的细胞系中转基因拷贝数的确定

用于该测定的技术称作转座子展示(Wicks等，Dev.Biol.221：295-307(2000))，其衍生于小载体方法(Hui等，Cell.Mol.Life Sci.54：1403-11(1998))。

该方法简言之：1)从细胞系制备基因组DNA。2)用限制酶消化基因组DNA成染色体片段。3)大约500bp的所谓小载体连接体/表达盒-带有与通过限制酶产生的基因组DNA的悬突匹配的悬突-与消化的基因组DNA连接。小载体连接体包含中心大约50bp的错配区。4)使用与小载体的一个链复性的引物和与转座子中的序列复性的另一引物开展两步小载体PCR。由于小载体连接体中存在错配区，仅包含连接至含有一个拷贝转基因(周围是转座酶底物序列)的所消化基因组DNA片段的小载体连接体被扩增(见Hui等，Cell.Mol.LifeSci.54：1403-11(1998)的图1。

对使用睡美人转座子系统产生的分泌甘丙肽和NGF的细胞系使用该方法，发现在转基因因子拷贝数和分泌水平之间存在良好相关(见表2)。高生产者SB克隆有代表性地具有1-6个NGF转基因拷贝或者1-18个甘丙肽转基因拷贝。因此，在SB-克隆的转基因拷贝数与所观察到的因子分泌水平改善之间存在某些程度关联。然而，当比较具有一个转基因拷贝的SB-克隆与使用标准转染技术产生的同样包含一个拷贝转基因的克隆的因子分泌水平时，很明显，转基因拷贝不是确定分泌水平的唯一因素，并且SB-克隆的确具有比正常预期更高和更稳定的因子分泌水平。

结论

从上述对SB来源的克隆对使用标准转染技术来源的克隆进行测试明显看出，SB系统能够比基于宿主细胞中转基因拷贝数的3-5倍增加所预期的更高地加强转基因的分泌。在本文中，重要的是提到已经测试了数种其它潜在增强表达的方法(见下面的表1)。

表2：来自使用睡美人转座子系统产生的分泌甘丙肽或NGF的克隆的因子分泌水平对于广范围拷贝数的比较。

序列

序列表

<110> 格罗丽亚娜疗法有限责任公司

菲利普·库斯克

拉尔斯·U·沃尔伯格

<120> 改善的细胞系以及在胶囊化细胞生物递送中的用途

<130> P2177PC00

<150> US61/146,754

<151> 2009-01-23

<160> 15

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 412

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

atgaagtgca gctgggtgat cttcttcctg atggcagtgg ttacaggtaa ggggctccca 60

agtcccaaac ttgagggtcc ataaactctg tgacagtggc aatcactttg cctttctttc 120

tacaggggtg aattcgggct ggaccctgaa cagcgcgggc tacctgctgg gccctcacgc 180

cgtgggcaac cacagaagct tcagcgacaa gaacggcctg accagcaagc gggagctgcg 240

gcccgaggac gacatgaagc ccggcagctt cgacagaagc atccccgaga acaacatcat 300

gcggaccatc atcgagtttc tgagctttct gcacctgaaa gaggccggag ccctggaccg 360

gctgctggat ctgcctgccg ctgcctcctc agaagacatc gagcggtcct ga 412

<210> 2

<211> 110

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly

1 5 10 15

Val Asn Ser Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Pro

20 25 30

His Ala Val Gly Asn His Arg Ser Phe Ser Asp Lys Asn Gly Leu Thr

35 40 45

Ser Lys Arg Glu Leu Arg Pro Glu Asp Asp Met Lys Pro Gly Ser Phe

50 55 60

Asp Arg Ser Ile Pro Glu Asn Asn Ile Met Arg Thr Ile Ile Glu Phe

65 70 75 80

Leu Ser Phe Leu His Leu Lys Glu Ala Gly Ala Leu Asp Arg Leu Leu

85 90 95

Asp Leu Pro Ala Ala Ala Ser Ser Glu Asp Ile Glu Arg Ser

100 105 110

<210> 3

<211> 726

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(726)

<400> 3

atg tcc atg ttg ttc tac act ctg atc aca gct ttt ctg atc ggc ata 48

Met Ser Met Leu Phe Tyr Thr Leu Ile Thr Ala Phe Leu Ile Gly Ile

1 5 10 15

cag gcg gaa cca cac tca gag agc aat gtc cct gca gga cac acc atc 96

Gln Ala Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile

20 25 30

ccc caa gtc cac tgg act aaa ctt cag cat tcc ctt gac act gcc ctt 144

Pro Gln Val His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu

35 40 45

cgc aga gcc cgc agc gcc ccg gca gcg gcg ata gct gca cgc gtg gcg 192

Arg Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala

50 55 60

ggg cag acc cgc aac att act gtg gac ccc agg ctg ttt aaa aag cgg 240

Gly Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg

65 70 75 80

cga ctc cgt tca ccc cgt gtg ctg ttt agc acc cag cct ccc cgt gaa 288

Arg Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu

85 90 95

gct gca gac act cag gat ctg gac ttc gag gtc ggt ggt gct gcc ccc 336

Ala Ala Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro

100 105 110

ttc aac agg act cac agg agc aag cgg tca tca tcc cat ccc atc ttc 384

Phe Asn Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Ser Ser Ser His Pro Ile Phe

115 120 125

cac agg ggc gaa ttc tcg gtg tgt gac agt gtc agc gtg tgg gtt ggg 432

His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly

130 135 140

gat aag acc acc gcc aca gac atc aag ggc aag gag gtg atg gtg ttg 480

Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu

145 150 155 160

gga gag gtg aac att aac aac agt gta ttc aaa cag tac ttt ttt gag 528

Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu

165 170 175

acc aag tgc cgg gac cca aat ccc gtt gac agc ggg tgc cgg ggc att 576

Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile

180 185 190

gac tca aag cac tgg aac tca tat tgt acc acg act cac acc ttt gtc 624

Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val

195 200 205

aag gcg ctg acc atg gat ggc aag cag gct gcc tgg cgg ttt atc cgg 672

Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg

210 215 220

ata gat acg gcc tgt gtg tgt gtg ctc agc agg aag gct gtg aga aga 720

Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg

225 230 235 240

gcc tga 726

Ala

<210> 4

<211> 241

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 4

Met Ser Met Leu Phe Tyr Thr Leu Ile Thr Ala Phe Leu Ile Gly Ile

1 5 10 15

Gln Ala Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile

20 25 30

Pro Gln Val His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu

35 40 45

Arg Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala

50 55 60

Gly Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg

65 70 75 80

Arg Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu

85 90 95

Ala Ala Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro

100 105 110

Phe Asn Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Ser Ser Ser His Pro Ile Phe

115 120 125

His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly

130 135 140

Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu

145 150 155 160

Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu

165 170 175

Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile

180 185 190

Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val

195 200 205

Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg

210 215 220

Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg

225 230 235 240

Ala

<210> 5

<211> 227

<212> DNA

<213> 大西洋鲑(Salmo salar)

<400> 5

cagttgaagt cggaagttta catacactta agttggagtc attaaaactc gtttttcaac 60

tactccacaa atttcttgtt aacaaacaat agttttggca agtcagttag gacatctact 120

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<210> 6

<211> 228

<212> DNA

<213> 大西洋鲑(Salmo salar)

<400> 6

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<210> 7

<211> 340

<212> PRT

<213> 大西洋鲑(Salmo salar)

<400> 7

Met Gly Lys Ser Lys Glu Ile Ser Gln Asp Leu Arg Lys Lys Ile Val

1 5 10 15

Asp Leu His Lys Ser Gly Ser Ser Leu Gly Ala Ile Ser Lys Arg Leu

20 25 30

Lys Val Pro Arg Ser Ser Val Gln Thr Ile Val Arg Lys Tyr Lys His

35 40 45

His Gly Thr Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Ser Gly Arg Arg Arg Val Leu

50 55 60

Ser Pro Arg Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Lys Val Gln Ile Asn Pro

65 70 75 80

Arg Thr Thr Ala Lys Asp Leu Val Lys Met Leu Glu Glu Thr Gly Thr

85 90 95

Lys Val Ser Ile Ser Thr Val Lys Arg Val Leu Tyr Arg His Asn Leu

100 105 110

Lys Gly Arg Ser Ala Arg Lys Lys Pro Leu Leu Gln Asn Arg His Lys

115 120 125

Lys Ala Arg Leu Arg Phe Ala Thr Ala His Gly Asp Lys Asp Arg Thr

130 135 140

Phe Trp Arg Asn Val Leu Trp Ser Asp Glu Thr Lys Ile Glu Leu Phe

145 150 155 160

Gly His Asn Asp His Arg Tyr Val Trp Arg Lys Lys Gly Glu Ala Cys

165 170 175

Lys Pro Lys Asn Thr Ile Pro Thr Val Lys His Gly Gly Gly Ser Ile

180 185 190

Met Leu Trp Gly Cys Phe Ala Ala Gly Gly Thr Gly Ala Leu His Lys

195 200 205

Ile Asp Gly Ile Met Arg Lys Glu Asn Tyr Val Asp Ile Leu Lys Gln

210 215 220

His Leu Lys Thr Ser Val Arg Lys Leu Lys Leu Gly Arg Lys Trp Val

225 230 235 240

Phe Gln Met Asp Asn Asp Pro Lys His Thr Ser Lys Val Val Ala Lys

245 250 255

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260 265 270

Pro Asp Leu Asn Pro Ile Glu Asn Leu Trp Ala Glu Leu Lys Lys Arg

275 280 285

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290 295 300

Gln Glu Glu Trp Ala Lys Ile His Pro Thr Tyr Cys Gly Lys Leu Val

305 310 315 320

Glu Gly Tyr Pro Lys Arg Leu Thr Gln Val Lys Gln Phe Lys Gly Asn

325 330 335

Ala Thr Lys Tyr

340

<210> 8

<211> 340

<212> PRT

<213> 大西洋鲑(Salmo salar)

<400> 8

Met Gly Lys Ser Lys Glu Ile Ser Gln Asp Leu Arg Lys Arg Ile Val

1 5 10 15

Asp Leu His Lys Ser Gly Ser Ser Leu Gly Ala Ile Ser Lys Arg Leu

20 25 30

Ala Val Pro Arg Ser Ser Val Gln Thr Ile Val Arg Lys Tyr Lys His

35 40 45

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50 55 60

Ser Pro Arg Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Lys Val Gln Ile Asn Pro

65 70 75 80

Arg Thr Thr Ala Lys Asp Leu Val Lys Met Leu Glu Glu Thr Gly Thr

85 90 95

Lys Val Ser Ile Ser Thr Val Lys Arg Val Leu Tyr Arg His Asn Leu

100 105 110

Lys Gly His Ser Ala Arg Lys Lys Pro Leu Leu Gln Asn Arg His Lys

115 120 125

Lys Ala Arg Leu Arg Phe Ala Thr Ala His Gly Asp Lys Asp Arg Thr

130 135 140

Phe Trp Arg Asn Val Leu Trp Ser Asp Glu Thr Lys Ile Glu Leu Phe

145 150 155 160

Gly His Asn Asp His Arg Tyr Val Trp Arg Lys Lys Gly Glu Ala Cys

165 170 175

Lys Pro Lys Asn Thr Ile Pro Thr Val Lys His Gly Gly Gly Ser Ile

180 185 190

Met Leu Trp Gly Cys Phe Ala Ala Gly Gly Thr Gly Ala Leu His Lys

195 200 205

Ile Asp Gly Ile Met Asp Ala Val Gln Tyr Val Asp Ile Leu Lys Gln

210 215 220

His Leu Lys Thr Ser Val Arg Lys Leu Lys Leu Gly Arg Lys Trp Val

225 230 235 240

Phe Gln His Asp Asn Asp Pro Lys His Thr Ser Lys Val Val Ala Lys

245 250 255

Trp Leu Lys Asp Asn Lys Val Lys Val Leu Glu Trp Pro Ser Gln Ser

260 265 270

Pro Asp Leu Asn Pro Ile Glu Asn Leu Trp Ala Glu Leu Lys Lys Arg

275 280 285

Val Arg Ala Arg Arg Pro Thr Asn Leu Thr Gln Leu His Gln Leu Cys

290 295 300

Gln Glu Glu Trp Ala Lys Ile His Pro Asn Tyr Cys Gly Lys Leu Val

305 310 315 320

Glu Gly Tyr Pro Lys Arg Leu Thr Gln Val Lys Gln Phe Lys Gly Asn

325 330 335

Ala Thr Lys Tyr

340

<210> 9

<211> 340

<212> PRT

<213> 大西洋鲑(Salmo salar)

<400> 9

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Asp Leu His Lys Ser Gly Ser Ser Leu Gly Ala Ile Ser Lys Arg Leu

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Ala Val Pro Arg Ser Ser Val Gln Thr Ile Val Arg Lys Tyr Lys His

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

Arg Thr Thr Ala Lys Asp Leu Val Lys Met Leu Glu Glu Thr Gly Thr

85 90 95

Lys Val Ser Ile Ser Thr Val Lys Arg Val Leu Tyr Arg His Asn Leu

100 105 110

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115 120 125

Lys Ala Arg Leu Arg Phe Ala Thr Ala His Gly Asp Lys Asp Arg Thr

130 135 140

Phe Trp Arg Asn Val Leu Trp Ser Asp Glu Thr Lys Ile Glu Leu Phe

145 150 155 160

Gly His Asn Asp His Arg Tyr Val Trp Arg Lys Lys Gly Glu Ala Cys

165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

Ile Asp Gly Ile Met Asp Ala Val Gln Tyr Val Asp Ile Leu Lys Gln

210 215 220

His Leu Lys Thr Ser Val Arg Lys Leu Lys Leu Gly Arg Lys Trp Val

225 230 235 240

Phe Gln His Asp Asn Asp Pro Lys His Thr Ser Lys Val Val Ala Lys

245 250 255

Trp Leu Lys Asp Asn Lys Val Lys Val Leu Glu Trp Pro Ser Gln Ser

260 265 270

Pro Asp Leu Asn Pro Ile Glu Asn Leu Trp Ala Glu Leu Lys Lys Arg

275 280 285

Val Arg Ala Arg Arg Pro Thr Asn Leu Thr Gln Leu His Gln Leu Cys

290 295 300

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305 310 315 320

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340

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 10

ggtgaattcg ggctggaccc tgaacagcgc g 31

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 11

tatactcgag caggaatggc tgactctgca taaattggcc 40

<210> 12

<211> 37

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 12

tataggatcc gccaccatga aatgcagctg ggttatc 37

<210> 13

<211> 31

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 13

gggtccagcc cgaattcacc cctgtagaaa g 31

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 14

tataggatcc ctctgaggga cccagaaact 30

<210> 15

<211> 29

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 15

tatactcgag caggtcaggc tcttctcac 29

Claims

1.用于向受试者递送分泌性生物活性化合物的胶囊，胶囊包括

a.生物相容性外膜和内核，

b.所述内核包含细胞，

c.所述细胞包含含有下列任一结构基因的异源表达构建体

i.编码分泌性生物活性多肽的结构基因，或，

d.所述基因位于作为转座酶或者其它整合酶底物的两个反向重复序列之间。

2.根据权利要求1的胶囊，其中所述生物相容性膜允许所述化合物通过的半渗透性外膜。

3.根据前述权利要求任一项的胶囊，其中装置中的所有细胞源于单一细胞系。

4.根据权利要求3的胶囊，其中细胞系是人单克隆细胞系。

5.根据前述权利要求任一项的胶囊，其中结构基因选自甘丙肽、神经肽Y、食欲素A、食欲素B、脑啡肽、促生长素抑制素14、促生长素抑制素28、血管活性肠肽、肠肽PHV-42、肠肽PHV-27、P物质、神经降压肽、缩胆囊素58、缩胆囊素39、缩胆囊素33、缩胆囊素25、缩胆囊素18、缩胆囊素12、缩胆囊素8、缩胆囊素7、缩胆囊素5、P物质、神经肽K、神经肽γ、神经激肽A、TRH、NGF。

6.包含下列任一结构基因的异源表达构建体的细胞系

i.编码分泌性生物活性多肽的结构基因，或

所述基因位于作为转座酶底物的两个反向重复序列之间。

7.产生重组蛋白的方法，包括培养根据权利要求6的细胞和回收所述重组蛋白。

8.产生能够分泌生物活性化合物的细胞系的方法，所述方法包括

a.以第一和第二表达构建体转染细胞；

b.所述第一表达构建体包含编码转座酶的阅读框；

d.所述第二表达构建体位于作为所述转座酶底物的两个反向重复序列之间；

9.权利要求8的方法，其中所述转座酶选自Sleeping Beauty、Frog Prince、Tol2、ΦC31、piggyback、Minos、mariner、Hermes和这些转座酶的任何变体。

10.权利要求9的方法，其中所述Sleeping Beauty变体选自包含与SEQ ID NO 7有1至20个氨基酸不同的氨基酸序列的SB10X变体，包括选自下列的突变或突变组的至少一种：

-K14R；

-K13D；

-K13A；

-K30R；

-K33A；

-T83A；

-I100L；

-R115H；

-R143L；

-R147E；

-A205K/H207V/K208R/D210E；

-H207V/K208R/D210E；

-R214D/K215A/E216V/N217Q；

-M243H；

-M243Q；

-E267D；

-T314N；和

-G317E。