CN101501058A - 制备蛋白质材料的颗粒的方法 - Google Patents

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Abstract

通过引起或允许以8mg.mL－1或更高的浓度分散在液体介质中的蛋白质分子在零长度交联剂存在下反应，来产生包含共价结合在一起的蛋白质分子的蛋白质颗粒，由此来制备蛋白质颗粒。可以产生大小在亚微米范围且精确限定大小和大小分布的蛋白质颗粒。所述颗粒可用于多个领域，可用于(但不限于)向机体递送治疗剂和其它作用剂，例如成像造影剂。

Description

制备蛋白质材料的颗粒的方法
发明领域
本发明涉及制备蛋白质材料的颗粒(particles of proteinaceous material)的方法，和具有限定的大小范围的蛋白质材料的颗粒。本发明还涉及蛋白质材料的颗粒用于递送作用剂(agent)(例如递送至机体(body))的用途。这些作用剂可以是治疗剂或用于医学成像技术中的成像造影剂(imaging contrastagent)。例如，可以用放射性同位素标记所述颗粒用于医学成像，例如，骨髓和淋巴扫描。蛋白质材料本身可以具有治疗益处，在这种情况下按照本发明形成颗粒可导致所述蛋白质材料在体内的递送增强或停留时间延长。
发明背景
胶体材料用于研究淋巴系统功能性的用途是公知的。在原子核医学中使用放射性毫微胶体(radioactive nanocolloid)来进行骨髓扫描、炎症成像和研究淋巴流注(lymphatic drainage)，包括在一些癌症转移扩散的研究中对“前哨淋巴结(sentinel node)”的鉴定。目前只有有限数量的商业产品是可用的，包括锝-99m(99mTc)胶体白蛋白配制物(例如以商品名NANOCOLL(其中95％的颗粒具有≤80nm的直径)和ALBURES(其中据称平均粒度为500nm)出售的那些)和用99mTc标记的多种硫胶体。
认为目前的配制物之间粒度和粒度分布上的差异是在体内(例如摄取(uptake)、生物分布(biodistribution)和清除)呈现出的差异的根本。例如，粒度将影响颗粒被淋巴结吞入(engulf)的效率。
因此，理想的是以精密限定的大小和大小分布产生大小在亚微米(sub-micron)范围的颗粒(毫微颗粒)。
所以本发明的目的是提供改进的用于制备具有精确限定的平均粒度和大小分布的毫微颗粒的方法。这样的颗粒可用于(但不限于(inter alia))向机体递送治疗剂或其它作用剂，例如当与放射性药物(radiopharmaceutical)结合用于核成像应用时；或者用于延长蛋白质材料在体内的停留时间。
已知可以使用所谓的零长度交联剂(zero-length crosslinkers)将蛋白颗粒偶联在一起。这种化学性质公开在，例如，US-A-2005/0036946中，其描述了经化学修饰的白蛋白交联形成类固体凝胶(solid-like gel)。WO-A-00/67774描述了蛋白质的非特异性混合物的交联。在交联之前，通过酸化、添加非水溶剂和加热至高温，使蛋白质成为不溶性的并且变性。产物可以通过低速离心回收，并且需要均质化方能注射，这说明该产物是不溶性的，且具有相当大的粒度。同样，WO-A-97/36614公开了蛋白A以4mg.mL-1的浓度的交联。类似地，Winkelhake等，Physiol Chem & Phys 10(1978)，305-322描述了牛血清白蛋白以5mg.mL-1的浓度的交联。白蛋白的交联同样在WO-A-01/45761中描述，将产物用作密封剂(sealant)，这显示该产物必须具有宏观的(macroscopic)固态结构形式。
发明简述
发明人首次发现了使用零长度交联剂在比现有技术公开的那些更高的蛋白浓度导致蛋白质毫微颗粒的形成，并且通过对反应条件的适当控制，能够精确控制所得颗粒的平均粒度和大小分布。
根据本发明的第一方面，提供了用于制备蛋白质颗粒的方法，所述方法包括引起或允许以8mg.mL-1或更高的浓度分散在液体介质中的蛋白质分子在零长度交联剂存在下反应，由此产生包含共价结合在一起的蛋白质分子的蛋白质颗粒。
“颗粒”的意思是包含多个彼此共价结合的蛋白质分子的结合物(conjugate)或附聚物(agglomerate)。当分散在合适的介质中时颗粒可以作为可辨别的离散相存在，或者它们在介质中的存在是肉眼(naked eye)不可见的，在这样的情况下可以将颗粒认为是可溶性颗粒。因此术语颗粒意欲包括类固体(solid-like)颗粒和以类似于经典溶液的形式存在的颗粒。
“零长度交联剂”的意思是促进蛋白质分子上基团的反应，而不在这些基团之间插入任何化学基团(chemical moiety)或“间隔物(spacer)”的化合物。
在本发明的方法中共价结合在一起的蛋白质分子最优选是单一蛋白质的分子。或者，蛋白质颗粒可以由两种或更多种不同蛋白质的混合物形成。
本发明的方法在合适的介质中进行，所述介质最通常为水性介质。优选介质将是缓冲溶液，由此所述方法包括将蛋白质分子和零长度交联剂分散在缓冲溶液中。
在蛋白质分子和零长度交联剂的反应之后通常将产物纯化。纯化通常包括去除过量反应物(reagent)，这可以使用任何已知方法进行，例如柱层析。还可以包括热处理步骤以水解任何结合的交联剂，其后可以通过已知方法(例如柱层析)将释放的物质(species)去除。
因为能够以某种方式控制反应条件从而可以控制蛋白质颗粒的平均大小，所以根据本发明的方法是有利的。另外，粒度分布的广度(width)可以相对较窄，使得在颗粒性质中的均匀性的程度相对较高。
一种测定粒度的合适方法是光散射(light scattering)，并且应该将本申请涉及的粒度理解为指通过这种方法测量的粒度。例如，可以使用MalvernZetasizer Nano S(由Malvern Instruments Ltd，Enigma Business Park，Grovewood Road，Malvern，Worcestershire WR14 1XZ，United Kingdom提供)测定粒度。由这种设备生成的数据最方便地表示为作为粒度的函数的散射光强度。可以使用制造商提供的专用软件自动计算平均粒度和标准差。
在粒度分布的测量中，峰可以定义为{X(i)，Y(i)；i＝i1..i2}，其中Y(i)是i类大小的％强度，X(i)是大小分类。曲线之下的总面积、平均粒度(μ)和标准差(σ)如下：-
Figure A200780030024D00061
因此，根据本发明的第二方面，提供了包含蛋白质分子的蛋白质颗粒，所述蛋白质分子通过蛋白质分子上官能团之间的共价连接直接偶联在一起，并且其中所述蛋白质颗粒具有小于200nm，更优选小于150nm，或小于100nm，80nm，50nm，40nm，30nm或20nm的平均粒度。优选地，粒度分布的标准差小于平均粒度的100％，或小于80％或小于60％。粒度的标准差可以小于平均粒度的50％，或小于40％。
根据本发明的颗粒可以具有大于5μm，或大于10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、70μm或大于100μm的平均粒度。
可以提到的具体的平均粒度范围是(a)对于较小的颗粒，5nm-50nm，或10nm-40nm，10nm-30nm，或10nm-20nm；(b)对于中等大小的颗粒，10nm-100nm，或20nm-80nm，或20nm-50nm；和(c)对于较大的颗粒，50nm-200nm，或50nm-150nm，或50nm-130nm。
粒度小于200nm的毫微颗粒，尤其是平均粒度小于130μm的那些，是尤其有用的，因为它们可以通过0.2μm过滤来灭菌。这在制造和加工方面具有重要的益处，因为它使简单的灭菌而不显著损失物料成为可能。
尤其优选的是根据本发明的颗粒应该不含，或基本上不含除形成该颗粒的蛋白质分子和与该颗粒以物理或化学方式结合的任何治疗剂或其它作用剂以外的材料。具体而言，因为颗粒包含通过蛋白质分子本身的官能团之间的共价连接而直接偶联在一起的蛋白质分子的残基，所以颗粒不包含源自交联剂等的中间连接基团或间隔基团。
另外，根据本发明的方法是简单的，包括不需要溶剂或表面活性剂的单相反应。颗粒的平均大小可以简单地通过调节少数变量来改变，平均大小和大小分布在设定的反应条件下可以再现。此外，方法的简单性使放大(scale-up)变得容易。本发明的方法额外的有利之处在于交联剂的零长度特性意味着颗粒不含合成的间隔物。因此避免了无治疗益处或功能益处并且可能是有害的其它成分或其它成分残余物的存在。
在其它的应用中，本发明的蛋白质颗粒在医学成像应用中当与成像造影剂结合时尤其有用。
因此，根据本发明另外的方面，提供了用于医学成像的结合物，所述结合物包含与成像造影剂或其前体结合的通过本发明第一方面的方法形成的蛋白质颗粒，或根据本发明第二方面的蛋白质颗粒。
“医学成像”意指为了诊断、研究或治疗处理，用于显现人体或动物体内部区域的任何技术。这些技术理论上包括X射线成像、磁共振成像(MRI)、核成像(nuclear imaging)和正电子发射断层成像(positron emission tomography)(PET)，以及超声技术，尽管最后提到的超声技术与本发明的关系较不显著。在增强这些技术中有用的作用剂是使体内的特定部位、器官或疾病位点能够显现的那些材料，和/或使成像技术生成的图像的质量有些改进的那些材料，其提供改进的或更简单的对那些图像的解读。这些作用剂在本申请中称为成像造影剂，使用它们通过增加图像不同区域之间的“对比度”来帮助区别图像的不同部分。因此术语“成像造影剂”包括用于增强图像质量的作用剂，但是图像可以在不存在这样的作用剂的条件下生成(例如在MRI中即是这样的情况)，以及作为图像生成的先决条件的作用剂(例如，在核成像中即是这样的情况)。
成像造影剂的“前体”意指本身不作为有效的成像造影剂，但是能够通过在使用前与某些其它物质反应或混合而变得非常有效的部分(moiety)。这样的前体的实例是金属螯合模块，其能够与金属离子形成物理键从而形成发挥成像造影剂功能的金属螯合物。
本发明中可以使用的MRI造影剂包括金属离子，特别是钆。这些离子可以通过与蛋白质颗粒共价结合的螯合部分与蛋白质颗粒偶联。
类似地，可用于核成像中的金属，例如99mTc、201T1和111In也可以与载体材料直接或间接地偶联，例如通过螯合部分偶联。用高锝酸钠(99mTc)标记对于骨髓扫描和炎症扫描应用，尤其是对于淋巴系统的扫描尤其有用。
以相似的方式，可以将本发明的蛋白质颗粒用于向机体递送其它作用剂，如治疗剂。
因此，根据本发明的又一方面提供了结合物，其包含与治疗剂结合的通过本发明第一方面方法形成的蛋白质颗粒，或根据本发明第二方面的蛋白质颗粒。
根据本发明的颗粒或结合物将通常作为包含可药用(pharmaceuticallyacceptable)液体介质的配制物施用于机体。该介质将通常是水性介质，最常见的是含有适当赋形剂的水性介质。这些赋形剂可以包括一种或多种张力调节剂、防腐剂、表面活性剂和其它常规药用赋形剂。
因此，根据本发明的另一个方面提供了配制物，其包含与可药用液体介质混合的如上限定的蛋白质结合物。
发明详述
蛋白质的性质
可用于本发明的方法的蛋白质包括球状蛋白质和纤维状或结构蛋白质。
蛋白质最优选是单一的、完整或基本上完整的蛋白质分子。
或者，蛋白质分子可以是完整蛋白质分子的片段，其意味着包含与天然存在的蛋白质分子中存在的氨基酸序列对应的氨基酸序列、但是长度较短的分子。然而，这样的片段优选包含长度大于天然存在的蛋白质分子的20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％并且最优选大于天然存在的蛋白质分子的95％的氨基酸序列，并且其与所述天然存在的蛋白质分子的相应部分具有大于80％、90％或最优选大于95％的同源性程度。
蛋白质分子也可以是天然存在的蛋白质的衍生物或突变体。
球状蛋白质包括合成或天然血清蛋白，以及它们的盐和天然或合成的衍生物(例如以酶的、化学的或其它的方式修饰的、切割的、缩短或交联的，经氧化或水解的它们的衍生物或亚单位)。纤维状或结构蛋白质的实例包括合成或天然的胶原、弹性蛋白、角蛋白、丝心蛋白、血纤蛋白和纤连蛋白，和它们的天然或合成的衍生物。血清蛋白的实例是白蛋白、运甲状腺素蛋白、血纤蛋白原、凝血酶和运铁蛋白。可提到的其它蛋白质包括载脂蛋白A-1(apolipoprotein A-1)、乳铁蛋白(lactoferrin)和抗体。蛋白质也可以是融合蛋白，即包含第一蛋白(或其片段或变体)例如人血清白蛋白与另一蛋白或多肽(或其片段或变体)融合的重组产物。融合蛋白通常通过重组方法制备，其使用编码第一蛋白和其它蛋白或多肽的连续DNA。白蛋白融合蛋白的实例在WO-A-90/13653、WO-A-01/79271和WO-A-060071中公开，将它们每一篇的教导均通过题述并入本文。转铁蛋白融合蛋白的实例在WO-A-2004/020454、WO-A-2004/020405和WO-A-2006/096515中公开，将它们每一篇的教导通过题述并入本文。
用于本发明方法的尤其优选的蛋白质是白蛋白，理由在下面详述。
在意欲将结合物施用于人体的情况下，蛋白质优选是人来源的，即确实源自人，或在结构上与人来源的蛋白质相同(或基本上相同)。因此尤其优选的蛋白质是人血清白蛋白。对于某些应用，可以使用非人白蛋白，特别是哺乳动物白蛋白，例如牛血清白蛋白、马血清白蛋白和犬血清白蛋白。
人血清白蛋白可以是血清衍生的，例如从捐献的血液获得。然而，为了消除或降低潜在污染物传播的风险(例如可能存在于血液衍生的产品中的病毒或其它有害剂)，以及与分离自捐献血液的材料相关的供应上的潜在局限性，优选的是所述蛋白质例如人血清白蛋白应该是重组产物。这种重组蛋白可以源自微生物(包括细胞系)，或源自已被转化或转染而表达所述蛋白质的转基因植物或动物。
因此目前用于本发明的最优选的蛋白质是重组人血清白蛋白(rHA)。rHA的合适形式在商业上可以从Novozymes Delta Ltd，Nottingham，UnitedKingdom获得。
用于制备rHA的方法将通常是本领域技术人员熟悉的，并且在例如WO96/37515和WO 00/44772中描述。
在用于制备rHA的优选方法中，rHA溶液源自真菌培养基，其通过在发酵培养基中培养用编码rHA的核苷酸序列转化的真菌而获得。真菌表达rHA并且将其分泌至培养基中。适当纯化培养物上清，于是可以产生用于本发明方法的合适溶液。真菌可以是丝状真菌，如曲霉属菌种(Aspergillusspecies)。优选地，真菌是酵母。更优选地，真菌是酵母属(genus Saccharomyces)(例如酿酒酵母(S.cerevisiae))，克鲁维酵母属(genus Kluyveromyces)(例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis))或毕赤酵母属(genus Pichia)(例如巴斯德毕赤酵母(P.pastoris))的。
优选rHA含有的大部分分子带有游离SH(硫氢基(sulphydryl)或巯基(thiol))基团。这提供了尤其有用的将rHA分子与治疗剂或成像造影剂结合的手段(means)，如下所述。
目前白蛋白是用来制备根据本发明方法的蛋白质颗粒的优选蛋白质，理由如下：
a)白蛋白在水性介质中是高度可溶的；
b)白蛋白分子中存在的游离硫氢基提供了与治疗剂或成像造影剂选择性偶联的手段；
c)白蛋白分子中存在的具有氨基侧基的多种氨基酸残基(特别是赖氨酸残基)，还有大量羧基，提供了白蛋白分子之间通过形成酰胺键的有效共价结合；和
d)带有氨基侧基和相对大量的羧基的多种氨基酸残基还可用于为递送至机体的作用剂提供偶联位点。
可以有效用于本发明的其它蛋白质是那些归因于经由肾脏的排泄而通常迅速地从血流中清除的蛋白质。本发明的蛋白质颗粒的形成可以增加这些蛋白质的体内半衰期。
例如，天然存在的载脂蛋白A-1(Apo A-1)就是这样的蛋白质，其是高密度脂蛋白(HDL)(所谓的“优良胆固醇”)的主要蛋白组分。
在患有动脉粥样硬化的患者中Apo A-1脂蛋白的血浆水平降低。当用二聚体Apo A-1(为了延长它的血池停留(blood pool residence))治疗动脉粥样硬化患者时，他们的斑块(plaque)水平显著降低，及相应的心脏病发作率下降。
先前已经尝试过静脉内施用Apo A-1，但是由于该蛋白质相对较小所以迅速地从血池中清除并且经由肾小球滤过从肾脏排出，在注射之后不久便出现在尿中。
通过本发明的方法学，能够制备较高分子量毫微颗粒，其很大而不会通过肾脏从血液排出，由此延长这种重要的血浆蛋白质的半衰期。出于与白蛋白相似的理由，本发明中使用的载脂蛋白A-1优选是重组产物。
可以用于本发明的另一种蛋白质是运铁蛋白。运铁蛋白的使用可能对一些应用有益，因为它具有多个潜在的偶联位点，它可以促进穿过血脑屏障的转运，并且可以将它制备成重组产物(参见，例如，MacGillivray等2002，于 Molecular and Cellular Iron Transport，Templeton(编)，Marcel Dekker，Inc，p 41和Mason等1993，Biochemistry 32：5472)。与白蛋白一样，运铁蛋白优选地是重组运铁蛋白(rTF)。
如上所述，可以用于本发明的其它蛋白质包括乳铁蛋白和抗体。这些也可以是重组产物。
下文给出的对多种参数和反应条件的描述可应用于白蛋白，但是也可应用于其它蛋白质，包括在上文具体提到的那些(即Apo A-1、运铁蛋白、乳铁蛋白、抗体)及其他蛋白质。
在交联之前，将蛋白质分子在液体介质中分散，优选为至少10mg.mL-1，或至少20mg.mL-1，或至少50mg.mL-1的浓度。蛋白质浓度的上限可以通过所用具体蛋白质的溶解度来确定，但是蛋白质浓度可以是500mg.mL-1或更高，或其可为多至400mg.mL-1、300mg.mL-1或200mg.mL-1。蛋白质的浓度最通常为8mg.mL-1至500mg.mL-1，更通常为10mg.mL-1至200mg.mL-1，或20mg.ml-1至200mg.mL-1，例如50mg.mL-1至150mg.mL-1。
反应介质的性质
本发明的方法在合适的介质中进行，所述合适的介质最通常是水性介质，优选是缓冲溶液。一种合适的缓冲液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。其它常规的介质也可以使用。
介质的pH优选低于10.0，或低于9.0或8.0。pH可以低到3.0(或更低)，但是更通常在4.0或5.0以上。通常，pH将为3.0-10.0，或3.0-9.0，或3.0-8.0。在许多情况下，pH为3.0-8.5，更优选为4.5-8.5，或5.5-8.5，并且尤其是5.5-7.5。
零长度交联剂的性质
使用零长度交联剂来促进蛋白质分子之间的交联而不向交联产物中添加其它成分，即颗粒不含合成间隔物，而是包含直接偶联在一起的蛋白质分子。多种零长度交联化学剂(chemistries)或试剂可以使用，以下作为实例提供而并非意在穷举。
根据Bioconjugate Techniques(生物技术)(Hermanson，G.T.(1996)， Academic Press)，可应用于蛋白质的两种类型的零长度交联化学剂是：
a)通过用醛基还原性胺化伯胺或仲胺制成的仲胺或叔胺连接；和
b)通过伯胺与羧酸的缩合制得的酰胺连接。
它们中的第一种可适用于具有含顺式二元醇的碳水化合物链的糖蛋白，其能被氧化而形成醛基，尽管这不包括白蛋白。第二种类型的交联化学剂—酰胺连接—应该可适用于所有蛋白质，并因此在本发明中是优选的。
能够用于形成酰胺连接的三种类型的交联试剂是：
a)碳二亚胺；
b)Woodward试剂K(N-乙基-3-苯基异噁唑-3′-磺酸盐(N-ethyl-3-phenylisoxazolium-3′-sulphonate))；和
c)N，N-羰二咪唑(N，N-carbonyldiimidazole)。
使用碳二亚胺在本发明中是优选的。存在多种可能的碳二亚胺，例如EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺)，CMC(1-环己基-3-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺)，DCC(二环己基碳二亚胺)和DIC(二异丙基碳二亚胺)。然而，由于在水中的可溶性差，DCC和DIC通常不可适用于交联蛋白质。用于本发明中最优选的零长度交联剂是EDC。
零长度交联剂的浓度优选低于500mM，更优选低于200mM，并且可以低于100mM。零长度交联剂的浓度优选在5mM以上，更优选在10mM以上，并且可以在20mM以上。因此零长度交联剂的浓度优选在5mM、10mM或20mM至100mM、200mM或500mM的范围内，例如5mM-500mM或更优选地20mM-200mM。
在零长度交联剂是碳二亚胺的优选实施方案中，可以向碳二亚胺反应添加NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)或磺基NHS(N-羟基磺基琥珀酰亚胺)以生成更稳定的活化羧基中间物，并由此改进反应的产率。反应更加有效，所以需要的零长度交联剂浓度更低。
在使用NHS或磺基NHS的本发明的实施方案中，则零长度交联剂的浓度优选低于100mM，更优选低于50mM。零长度交联剂的浓度优选在2mM以上，更优选地在5mM以上。因此零长度交联剂的浓度优选在2mM或5mM至50mM或100mM的范围内，例如2mM-100mM，更优选5mM-50mM。NHS或磺基NHS的浓度优选高于1mM或2mM，并且低于50mM或20mM。因此NHS或磺基NHS的浓度优选在1mM或2mM至20mM或50mM的范围内，例如1mM-50mM，更优选2mM-20mM。
EDC目前是优选的零长度交联剂，并且最优选地，将EDC与NHS一起使用。
反应条件
反应温度和反应时间均是对产生的蛋白质颗粒的大小有影响的变量。
在实践中，进行反应的温度的最低值根据需要反应介质为液体来限定，即根据介质的凝固点限定，进行反应的温度的最高值根据蛋白质的变性温度限定。当(按照通常的情况)反应介质是水性的情况下，反应温度方便地为10℃-40℃。在大多数情况下，反应可以在室温或接近环境温度进行，即通常为15℃-30℃，例如20℃+/-5℃。
反应时间可以在相当宽的范围内变化，但通常是从1小时至4、6、8、10或12小时，例如约2小时。
在蛋白质分子和零长度交联剂反应之后可以将产物纯化。纯化通常包括去除过量试剂，其可以使用已知方法，例如柱层析进行。合适的层析介质是Sephadex G50。
已经发现了在零长度交联剂与蛋白质分子中的羧基反应过之后，活化的羧基可以与游离的巯基(如存在于例如白蛋白分子中)反应以形成硫代酸酯(thioester)。因为巯基可以用作蛋白质分子与例如治疗剂或成像造影剂进行反应的手段，所以将这种硫代酸酯水解是理想的。这可以通过热处理来完成。
热处理优选在20℃-50℃的温度进行，持续时间从1、2、4或8个小时，直到10、20、30或40个小时。
通常，可以使用上文提供的任何反应条件和参数的组合，对最适合或最佳条件的选择是由所用材料的确切性质和待生成的毫微颗粒的期望特性来确定的。然而，在许多实施方案中，反应在水性介质中进行，pH范围是3.0-8.5，例如5.5-8.5或5.5-7.5，蛋白质浓度为8mg.mL-1至500mg.mL-1，例如10mg.mL-1至200mg.mL-1，使用碳二亚胺交联剂，例如EDC，其浓度为5至500mM，例如20至200mM。在使用NHS或磺基-NHS的情况下，交联剂的浓度可以更低，例如2mM-100mM，或5mM-50mM。
蛋白质颗粒与造影剂或治疗剂的偶联
将用于向机体递送的作用剂与蛋白质颗粒偶联可以通过许多方法进行，尤其依赖于所述作用剂的性质和所述蛋白质颗粒的性质。然而，偶联将通常涉及在蛋白质颗粒和作用剂之间形成共价键，或在蛋白质颗粒和能够与作用剂本身形成化学键或物理键的偶联部分之间形成共价键。
一种优选的偶联方法，其尤其适合于偶联金属(例如用于MRI或核成像的金属)或偶联用于放射疗法的放射性金属，该方法包括将蛋白质颗粒与能够结合所述金属的螯合剂结合。
在一个尤其优选的实施方案中，螯合剂包含羧基或其衍生物，其与蛋白质颗粒中存在的氨基反应以形成将螯合剂与蛋白质颗粒相连的酰胺键。然后可以添加所述金属的合适的盐的溶液，致使金属通过结合的螯合剂螯合。
可以使用的螯合剂包括含有多个氨基的化合物的乙酸衍生物。实例包括乙二胺四乙酸，二亚乙基三胺五乙酸，和它们的衍生物，例如二亚乙基三胺五乙酸酐。可用的其它类别的螯合剂包括大环螯合剂。大环螯合剂的实例是：
1，4，7-三氮杂环壬烷-N，N′，N″-三乙酸(NOTA)
1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N″，N″′-四乙酸(DOTA)
1，4，8，11-四氮杂环十四烷-N，N′，N″，N″′-四乙酸(TETA)
用于将螯合剂与蛋白质颗粒偶联的其它方法对于本领域那些技术人员将是显而易见的。合适的化学方法(chemistries)最通常包括通过蛋白质颗粒和/或螯合剂中存在的氨基、巯基、羰基、羧基或羟基形成连接。
在作用剂与蛋白质颗粒以金属螯合物的形式偶联的情况下，可以作为制备过程中的一部分形成螯合物，或者可以稍后添加金属，例如恰在使用之前添加。尤其在金属是放射性金属的情况下，在即将使用之前再向配制物中添加金属离子可能是理想的。
同样，有机作用剂，如用作X线造影剂的含碘化合物，其可以通过在该有机作用剂和蛋白质颗粒之间形成共价键而直接与蛋白质颗粒偶联。用于将有机作用剂与蛋白质颗粒偶联的方法对于本领域那些技术人员同样是显而易见的，并且可以包括通过蛋白质颗粒和/或有机作用剂中存在的氨基、巯基、羰基、羧基或羟基形成连接。
供给和施用
根据本发明的颗粒或结合物将通常作为包含可药用介质的配制物施用于机体。介质最通常为液体介质。这些配制物可以作为无菌的即用型溶液(ready-to-use solution)提供给开业医师(practitioner)，或者还可以将所述颗粒或结合物冻干，其后在使用之前再用合适的溶液还原。例如，在使用之前可以将冻干的蛋白质颗粒与放射性标记的溶液混合以在液体介质中产生需要的结合物配制物。
根据本发明的颗粒和配制物可以通过多种途径施用。例如，可以静脉内施用或通过皮下施用来施用配制物。也可以通过口服或鼻吸入(例如作为雾化溶液)来施用配制物。在适当的情况下，可以经由导管将配制物直接递送至疾病部位。对于其它应用，可以局部(topically)递送配制物，例如通过施用于皮肤来递送。在这些情况下，配制物可以作为霜剂(cream)或软膏(ointment)施用，或者可以掺入施用于皮肤的贴片。
根据本发明的毫微颗粒的应用实例包括下列内容。
所述颗粒可能在增强药物的跨膜递送(例如肺、鼻、口等)中有价值。具体而言，毫微颗粒，例如rHA的毫微颗粒，能够通过胞转作用(transcytosis)跨膜转运。已知蛋白质的颗粒形式比单一分子更容易被膜吸收和/或跨膜转运。同样，可以将毫微颗粒制备成带有与之(化学)附接的荷电基团或亲水基团以增强摄取。
所述颗粒还可以用于基因递送。例如，可以将DNA通过化学方法与所述颗粒连接，以使DNA能够运行穿过细胞膜和核被膜。
也可以将所述颗粒用于增强对疫苗的应答，其凭借由疫苗分子制成的颗粒，或者通过将抗原与由例如rHA制成的颗粒连接。
颗粒的使用也可以增加进入肿瘤中的药物摄取。例如，已知肿瘤细胞过表达gp60/SPARK，并且可显示增强的rHA毫微颗粒摄取。这也可以为克服多药抗性提供一种机制(其通过阻止药物被直接泵送出肿瘤细胞)。
根据本发明的颗粒也可以用于向创伤递送药物或其它有用的作用剂。
根据本发明的颗粒的体表递送可具有将药物或其它活性物留在皮肤表面(特别是毛孔(pore)等中)的有益效果。同样，带有表面电荷的颗粒的制备物可以增强皮肤附着力(skin adhesion)。
所述颗粒也可用于口服药物递送，如它们可以用于递送分子穿过消化道壁(gut wall)或穿过派伊氏结(Payers patch)。
根据本发明的颗粒也可以应用于非药用背景(non-pharmaceutical settings)中，例如用于个人护理产品中。另外，还想到了工业应用，例如用于在工业过程中酶的递送。
发明的示例性实施方案
现将参考以下实施例和附图，仅以说明的方式，更详细地描述本发明目前优选的实施方案，其中
图1显示由实施例1的产物获得的凝胶渗透(gel permeation)HPLC结果。
图2显示由实施例2的产物获得的凝胶渗透HPLC结果。
图3显示实施例3的产物的非变性(native)PAGE结果。
图4显示实施例5中详述的在交联产物的热处理过程中游离巯基的增加。
图5显示实施例6(a)的产物的非变性PAGE结果。
图6显示实施例6(b)的产物的非变性PAGE结果。
图7显示实施例6(c)的产物的非变性PAGE结果。
图8显示实施例7的脱盐产物的非变性PAGE结果。
图9显示通过光散射测定的实施例7的脱盐产物的粒度分布。
图10显示实施例8的产物的脱盐层析图(desalting chromatograms)。
图11显示实施例8的产物的非变性PAGE结果。
图12显示实施例8的产物的凝胶渗透HPLC结果。
图13显示通过光散射测定的实施例8的产物的粒度分布。
常规方法
交联rHA以形成蛋白质颗粒
将配制的rHA(约20％(w/v)rHA，32mM辛酸根(octanoate)，145mM Na+，15mg.L-1聚山梨酯80(Polysorbate 80)，pH7.0)用所示缓冲液稀释至指定的rHA浓度。以指定的浓度添加EDC或EDC+NHS，将样品混合并在室温(约20℃)温育指定的时间。
脱盐
为了去除过量反应物，通过Sephadex层析将交联的rHA脱盐。除非另有说明，脱盐在含有0.9％(w/v)NaCl、15mM Na2HPO4、5mM NaH2PO4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中进行。
热处理
如所示，通过在约45℃温育指定的时间来热处理交联的rHA，接下来，如所示，重复脱盐步骤。
凝胶渗透HPLC(GPHPLC)
GPHPLC使用TSKgel G3000SWXL 0.78×30cm分析柱，并且在PBS中以1mL.min-1进行保护运行，在280nm监控流出液。将样品在PBS中适当地稀释并注入10-25μL。
非变性PAGE
使用Novex 4-12％ Tris Glycine凝胶(Tris甘氨酸凝胶)(Invitrogen Ltd，3Fountain Drive，Inchinnan Business Park，Paisley PA4 9RF，United Kingdom)根据制造商的说明进行非变性PAGE，样品在PBS中适当稀释。用GelCode Blue(Pierce Biotechnology，Inc，3747 N Meridian Rd，PO Box 117，Rockford，IL61105，USA)根据制造商的说明将凝胶染色。
游离巯基测定法
用0.1M TrisHCl、0.01M EDTA pH8将空白和样品制成1mL并测量A412。添加50μL 0.05M磷酸钠pH7中的0.01M 5，5’-二硫双-(2-硝基苯甲酸)(5，5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid))，并在10分钟后在室温再次测量A412。使用ε412＝13600M-1cm-1计算巯基含量。
粒度测定
将样品用PBS稀释至1-5mg.mL-1rHA并且进行0.2μm过滤，之后使用Malvern Zetasizer Nano S用低容量一次性比色杯进行一式三份的分析。使用Malvern Dispersion Technology Software(Malvern分散技术软件)v4.10测定基于散射光强度的平均粒度和大小分布的标准差。
结合氨甲喋呤测定法
在将样品脱盐并在PBS中适当稀释之后，通过A373测量法在与已知浓度的MTX(蛋白结合氨甲喋呤)溶液比较下测定蛋白结合氨甲喋呤(protein-bound methotrexate；MTX)浓度。
实施例1
交联rHA并通过GPHPLC分析：交联剂浓度的影响
以稀释在PBS中的100mg.mL-1rHA与0、15、30和45mM EDC，15mMEDC+5mM NHS进行交联，反应时间2小时。通过GPHPLC分析产物，如图1所示。
层析图显示单体rHA起始物料的洗脱(图1a)，和随着EDC浓度增加和NHS的添加而量逐渐增加的较大种类(蛋白质颗粒)。
注意(NB)在层析图c起始处洗脱的宽峰产生在柱的空隙容积(voidvolume)之前，因此是基线伪迹(baseline artefact)，与样品无关。
实施例2
交联rHA并通过GPHPLC分析：交联后处理的影响
以稀释在PBS中的100mg.mL-1rHA与15mM EDC+5mM NHS进行交联，反应时间2小时。将交联的产物(含有蛋白质颗粒)在水中脱盐，通过添加SnCl2、Na2HPO4、葡萄糖和Pluronic(普卢兰尼克)F68进行配制，并且冻干。通过GPHPLC分析各个阶段的产物，结果示于图2，其表明脱盐、配制和冻干对蛋白质颗粒没有显著影响。
实施例3
交联rHA并通过非变性PAGE分析
以稀释在PBS中的100mg.mL-1rHA与0、15、30、45、75、105和150mMEDC，15mM EDC+5mM NHS进行交联，反应时间2小时。通过非变性PAGE分析产物，结果示于图3。
该结果与上文讨论的GPHPLC结果一致，因为它们显示随着EDC浓度的增加和NHS的掺入，形成的流动性较差种类(蛋白质颗粒)的量的增加。
实施例4
交联rHA并测定产物的游离巯基含量
以稀释在PBS中的100mg.mL-1rHA与15mM EDC+5mM NHS进行交联，反应时间2小时。与起始rHA的0.64mol.mol-1相比，在水中脱盐的交联产物显示0.04mol.mol-1的游离巯基水平。
实施例5
rHA的交联：产物的游离巯基含量对热处理持续时间的依赖
以稀释在PBS中的100mg.mL-1rHA与15mM EDC+5mM NHS进行交联，反应时间2小时。将交联产物脱盐并且热处理指定的时间，取等分试样用于游离巯基测定。结果示于图4。可以看出，对于16个小时和更长的热处理时间，游离巯基含量基本上回到了rHA起始物料的游离巯基含量。
实施例6
反应条件中的变化的影响
a)[EDC]、[NHS]和时间
以稀释在PBS中的100mg.mL-1rHA与浓度为15、30、75、150和300mM的EDC，每种EDC浓度再分别加0、1、5和20mM NHS，由此进行交联。在2小时和22小时的反应时间之后通过非变性PAGE分析尚未形成凝胶的全部样品—参见图5，其表明在较长的反应时间之后形成了稍微较大量的蛋白质颗粒。
b)[EDC]、[rHA]和时间
以稀释在PBS中的10、20、50和100mg.mL-1rHA，每种与浓度为15、30、75、150和300mM的EDC交联。在2小时和22小时的反应时间之后通过非变性PAGE分析尚未形成凝胶的全部样品—参见图6。
c)pH
通过在0.9％(w/v)NaCl、20mM MES，或在0.9％(w/v)NaCl、20mM EPPS或PBS中稀释来制备100mg.mL-1rHA。将MES样品的等分试样调节至约pH5.5和pH6.5。将EPPS样品的等分试样调节至约pH7.5和pH8.5。在每个样品与75mM EDC和15mM EDC+5mM NHS以2小时反应时间进行交联之前，测量实际的起始pH。通过非变性PAGE分析尚未形成凝胶的全部样品—参见图7。结果说明在pH值在7以下时交联更有效。
实施例7
使用NHS+EDC和单独的EDC所得结果的比较
以稀释在PBS中的100mg.mL-1rHA与15mM EDC+5mM NHS和75mMEDC进行交联，反应时间2小时。脱盐之后，通过非变性PAGE和光散射分析交联产物，与rHA起始物料比较。非变性PAGE结果示于图8，通过光散射分析测定的粒度分布示于图9。所述结果表明使用5mM NHS与仅仅15mMEDC产生了与单独使用75mM EDC相当的结果。
实施例8
使用NHS+EDC和单独的EDC所得结果的进一步比较
以稀释在PBS中的100mg.mL-1rHA与15mM EDC+5mM NHS和75mMEDC进行交联，反应时间2小时。将交联产物脱盐，热处理，并再次脱盐。对于EDC+NHS产物，在热处理时游离巯基水平从0.03增加至0.54mol.mol-1，对于EDC产物是从0.02增加至0.50mol.mol-1。通过非变性PAGE、GPHPLC和光散射分析热处理之前和之后的脱盐产物，与rHA起始物料比较。
图10显示了脱盐层析图。在260nm监测脱盐。图10中上方的层析图获得于热处理之前。左手边的峰对应于收集的并且随后进行了热处理的产物；右手边的峰对应于游离的NHS。下方的层析图表明在热处理之后，产生了更多的游离NHS。这些结果显示通过热处理方法使NHS从收集的产物中释放。相同的效果也在仅用EDC的反应中显示(数据未显示)。
图11显示非变性PAGE结果，图12显示通过GPHPLC获得的结果，图13显示通过光散射获得的粒度数据。所述数据显示热处理步骤对蛋白质颗粒没有显著影响，除了可能有非常微小的平均粒度降低(图13)和迁移率增加(图11)。
实施例9
在恒定[NHS]改变[rHA]和[EDC]的影响
以稀释在PBS中的20、50和100mg.mL-1rHA各自与10mM EDC+5mMNHS、15mM EDC+5mM NHS、25mM EDC+5mM NHS和50mM EDC+5mMNHS进行交联，反应时间2小时。将尚未形成凝胶的全部样品脱盐，热处理，并且再次脱盐。通过光散射分析产物的粒度分布。结果在表1中给出。
表1
相比之下，rHA起始物料具有8.38nm的平均直径和2.99nm的标准差。
实施例10
在恒定[rHA]改变[EDC]和[NHS]的影响
以稀释在PBS中的100mg.mL-1rHA与15、25和35mM EDC，且每种EDC浓度加2、5、10和20mM NHS，由此进行交联，反应时间2小时。将尚未形成凝胶的全部样品脱盐，热处理，并且再次脱盐。通过光散射分析产物的粒度分布。结果示于表2。
表2
Figure A200780030024D00212
相比之下，rHA起始物料具有8.39nm的平均直径和2.96nm的标准差。
实施例11
重组运铁蛋白的交联
使用与所述用于rHA相同的方法交联重组运铁蛋白(rTF)。以稀释在PBS中的100mg.mL-1rTF与15、25和35mM EDC，每种EDC浓度加5mM NHS，由此进行交联，反应时间为1、2和4小时。将尚未形成凝胶的全部样品脱盐，并且通过光散射分析。结果示于表3。
表3
Figure A200780030024D00221
相比之下，rTF起始物料具有7.78nm的平均直径和1.80nm的标准差。
实施例12
载脂蛋白A-1的交联
载脂蛋白A-1(Apo A-1)的交联使用含有25mM EDC和5mM NHS的PBS中的50mg.mL-1Apo A-1，进行1、2和4小时的反应时间。将全部样品脱盐并且通过光散射分析，与起始Apo A-1比较。结果示于表4：
表4
 
反应时间/h 平均直径/nm 标准差/nm
1 21.8 10.8
2 44.9 33.7
4 57.6 33.4
相比之下，Apo A-1起始物料具有12.5nm的平均直径和5.72nm的标准差。
实施例13
制备含有治疗剂(氨甲喋呤)的交联rHA颗粒
以稀释在PBS中的100mg.mL-1rHA，及25mM EDC+5mM NHS、9.8mMMTX(6.5mol.mol-1rHA)进行在氨甲喋呤(MTX)存在下的rHA交联，反应时间2小时。将交联产物脱盐，测定蛋白结合MTX并通过光散射分析，与起始rHA比较。所述产物含有浓度为2.3mol.mol-1rHA的结合MTX，并具有37.9nm的平均直径和22.6nm的标准差。相比之下，rHA起始物料具有8.24nm的平均直径和2.44nm的标准差。
实施例14
治疗剂(氨甲喋呤)与交联rHA颗粒的偶联
以稀释在PBS中的100mg.mL-1rHA，及25mM EDC+5mM NHS进行rHA的交联，反应时间2小时。将交联的产物脱盐，热处理22小时，再次脱盐，并且通过超滤浓缩至20mg.mL-1rHA。
通过在PBS中使10mM MTX与20mM NHS和100mM EDC在室温反应1小时制备NHS-活化的MTX，通过适当添加NaOH和HCl来保持大约pH7。NHS-活化的MTX的终浓度为9.8mM。
通过混合等体积的20mg.mL-1交联rHA和9.8mM NHS-活化的MTX(33mol.mol-1rHA)来进行MTX与交联rHA的偶联。在室温反应1.5小时和3小时之后取样，将样品脱盐并测定蛋白结合MTX。同样通过光散射分析全部交联rHA样品，与起始rHA比较。结果示于表5：
表5
 
样品 反应时间/h 蛋白结合MTX/mol.mol-1rHA 平均直径/nm 标准差/nm
交联rHA - - 48.7 23.4
MTX标记的交联rHA 1.5 12.6 54.2 26.0
3 14.4 58.4 29.5
相比之下，rHA起始物料具有8.09nm的平均直径和2.47nm的标准差。
实施例15
造影剂(钆螯合物)与交联rHA颗粒的偶联
二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)与交联rHA的偶联如下进行，在30分钟的时间，伴随恒定搅拌，向6mL 20mg.mL-1交联rHA添加0.4g DTPA酸酐(如实施例14)，通过添加5M NaOH保持约pH8。在最后的添加之后再继续搅拌30分钟，用3M HCl将样品调节至pH7并且在0.9％(w/v)NaCl中脱盐。
用0.1M GdCl3在二甲酚橙指示剂存在下滴定蛋白结合DTPA基团，通过添加1M NaOH保持pH5.5-6.0。结合DTPA水平是43mol.mol-1rHA。同样通过光散射分析全部交联的rHA样品，与起始rHA比较。结果示于表6：
表6
 
样品 平均直径/nm 标准差/nm
交联rHA 48.1 23.8
DTPA标记的交联rHA 67.6 36.9
DTPA-Gd标记的交联rHA 62.4 31.8
相比之下，rHA起始物料具有7.77nm的平均直径和2.15nm的标准差。
实施例16
使用Woodward’s试剂K的rHA交联
以稀释在PBS中的100mg.mL-1rHA与0.1M Woodward’s试剂K(WRK)来进行使用WRK的交联，反应时间30分钟。将交联产物在PBS中稀释，并且通过光散射分析，与起始rHA比较。所述产物具有13.5nm的平均直径和5.76nm的标准差。相比之下，rHA起始物料具有8.42nm的平均直径和2.87nm的标准差。
实施例17
使用N，N-羰二咪唑的rHA交联
使用N，N-羰二咪唑(CDI)的交联以稀释在PBS中的100mg.mL-1rHA与0.5MCDI进行。使反应进行至完成。将交联产物在PBS中稀释并且通过光散射分析，与起始rHA比较。所述产物具有50.7nm的平均直径和26.0nm的标准差。相比之下，rHA起始物料具有8.42nm的平均直径和2.87nm的标准差。

Claims (32)

1.一种用于制备蛋白质颗粒的方法，所述方法包括引起或允许以8mg.mL-1或更高的浓度分散在液体介质中的蛋白质分子在零长度交联剂存在下反应，从而产生包含共价结合在一起的蛋白质分子的蛋白质颗粒。
2.权利要求1中的方法，其中所述蛋白质分子是白蛋白分子。
3.权利要求1中的方法，其中所述蛋白质分子选自下组：胶原、弹性蛋白、角蛋白、丝心蛋白、血纤蛋白、纤连蛋白、运甲状腺素蛋白、血纤蛋白原、凝血酶、运铁蛋白、载脂蛋白A-1、乳铁蛋白、抗体和融合蛋白。
4.权利要求3中的方法，其中所述蛋白质分子是运铁蛋白分子。
5.权利要求3中的方法，其中所述蛋白质分子是载脂蛋白A-1分子。
6.权利要求3中的方法，其中所述蛋白质分子是乳铁蛋白分子。
7.权利要求3中的方法，其中所述蛋白质分子是抗体。
8.权利要求3中的方法，其中所述蛋白质分子是融合蛋白。
9.权利要求8中的方法，其中所述融合蛋白是人血清白蛋白和另一种蛋白质或多肽的融合蛋白。
10.任一前述权利要求中的方法，其中所述蛋白质分子是重组产物。
11.权利要求10中的方法，其中所述蛋白质分子是重组人血清白蛋白分子。
12.任一前述权利要求中的方法，其中所述蛋白质的浓度是8mg.mL-1-500mg.mL-1，更优选10mg.mL-1-200mg.mL-1，或20mg.ml-1-200mg.mL-1，最优选50mg.mL-1-150mg.mL-1。
13.任一前述权利要求中的方法，其中所述交联剂选自下组：碳二亚胺、Woodward′s试剂K和N，N-羰二咪唑。
14.权利要求13中的方法，其中所述零长度交联剂是碳二亚胺。
15.权利要求14中的方法，其中所述碳二亚胺是1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺。
16.权利要求13-15中任一项的方法，其中所述交联剂的浓度是5mM-500mM，更优选20mM-200mM。
17.权利要求14或权利要求15中的方法，其中所述反应在N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基磺基琥珀酰亚胺存在下进行。
18.权利要求17中的方法，其中所述交联剂的浓度是2mM-100mM，更优选5mM-50mM。
19.权利要求17或权利要求18中的方法，其中所述N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基磺基琥珀酰亚胺的浓度是1mM-50mM，更优选2mM-20mM。
20.任一前述权利要求中的方法，其中所述液体介质是水性的。
21.权利要求20中的方法，其中所述水性液体介质是缓冲溶液。
22.权利要求20或权利要求21中的方法，其中所述介质的pH为3.0-8.5，更优选4.5-8.5，或5.5-8.5，并且尤其是5.5-7.5。
23.通过任一前述权利要求的方法制备的蛋白质颗粒。
24.可以通过任一前述权利要求的方法获得的蛋白质颗粒。
25.蛋白质颗粒，其包含通过蛋白质分子上官能团之间的共价连接直接偶联在一起的蛋白质分子残余物，并且其中所述蛋白质颗粒的平均粒度小于200nm，更优选小于150nm，或小于130nm、100nm、80nm、50nm、40nm、30nm或20nm。
26.权利要求25中的蛋白质颗粒，其中所述粒度分布的标准差小于平均粒度的100％，或小于80％或小于60％，或小于50％，或小于40％。
27.权利要求25或权利要求26中的蛋白质颗粒，其中所述颗粒的平均粒度是5nm-50nm。
28.权利要求25或权利要求26中的蛋白质颗粒，其中所述颗粒的平均粒度是10nm-100nm。
29.权利要求25或权利要求26中的蛋白质颗粒，其中所述颗粒的平均粒度是50nm-200nm。
30.一种用于医学成像的结合物，所述结合物包含与成像造影剂或其前体结合的通过权利要求1-22中任一项的方法形成的蛋白质颗粒或根据权利要求23-29中任一项的蛋白质颗粒。
31.一种结合物，其包含与治疗剂结合的通过权利要求1-22中任一项的方法形成的蛋白质颗粒或根据权利要求23-29中任一项的蛋白质颗粒。
32.一种配制物，其包含与可药用介质混合的通过权利要求1-22中任一项的方法形成的蛋白质颗粒或根据权利要求23-29中任一项的蛋白质颗粒或根据权利要求30或权利要求31的结合物。
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