CN115252556A - 糖基修饰的共负载蛋白和免疫激动剂的糖聚肽纳米囊泡及其应用 - Google Patents

糖基修饰的共负载蛋白和免疫激动剂的糖聚肽纳米囊泡及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及糖基修饰的共负载蛋白和免疫激动剂的糖聚肽纳米囊泡及其应用。本发明提供了多种糖基修饰的线性聚肽‑含糖树枝化共聚物构筑的糖聚肽纳米囊泡的制备及其在蛋白抗原和免疫激动剂共递送载体中的应用。通过透析法制备共负载卵清蛋白(OVA)和小分子免疫激动剂咪喹莫特(R837)的糖聚肽(PNLys‑4Man、PNLys‑4Gal、PNLys‑4Glu)纳米囊泡。本发明中构筑的糖聚肽纳米囊泡显示出糖基依赖性的促进树突状细胞(DC)熟化的免疫佐剂效应，且甘露糖修饰的纳米囊泡具有免疫细胞靶向能力和最强的免疫佐剂效应；施加紫外光刺激后共负载OVA和R837的糖聚肽纳米囊泡促进了DC细胞熟化和免疫相关共刺激因子的分泌，展示出OVA抗原、R837激动剂和糖聚肽纳米载体在细胞免疫中的协同效应。

Description

糖基修饰的共负载蛋白和免疫激动剂的糖聚肽纳米囊泡及其 应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及糖基修饰的共负载蛋白和免疫激动剂的糖聚肽纳米囊泡，及其制备方法，以及所述糖聚肽纳米囊泡作为免疫细胞靶向性、免疫佐剂及其免疫协同效应方面的应用。
背景技术
增加纳米载体对抗原提呈细胞(APC)的靶向性是提高抗原细胞内转运进而增强免疫应答的有效途径。APC细胞表面表达多种凝集素，如树突状细胞(DC)特异的细胞间黏附分子3结合的非整合素分子、甘露糖受体、巨噬细胞半乳糖型凝集素等，可以与相应的糖基修饰的抗原载体进行特异性识别，提高抗原的细胞内摄效率。同时，将小分子免疫激动剂(例如咪喹莫特,R837)负载在纳米载体中并实现胞内的高效递送是提高细胞免疫应答的另一有效策略。可以推测将小分子免疫激动剂和蛋白抗原(例如卵清蛋白，OVA)共负载至纳米载体中，发挥二者的协同效应，有利于大幅度激活细胞的免疫应答。
聚合物囊泡具有亲水的空腔和疏水的壳层、良好的热力学稳定性，能有效防止蛋白抗原和小分子激动剂的泄露而降低非特异性免疫副作用。但是，常规的聚合物囊泡缺乏生物可降解性、免疫细胞的靶向能力、特别是免疫佐剂效应。因此，设计构筑兼具免疫细胞靶向性、生物可降解性且具有免疫佐剂功能的聚合物囊泡在免疫治疗领域具有重要的科学意义和临床应用前景。
文献检索发现，Wenjing Qi等在题目<Deprotection-induced morphologytransition and immunoactivation of glycovesicles:a strategy of smart deliverypolymersomes>(脱保护诱导的形貌转化和糖修饰囊泡的免疫激活：一种智能递送聚合物囊泡的策略)论文中(Wenjing Qi,Yufei Zhang,Jue Wang,Guoqing Tao,Libin Wu,ZdravkoKochovski,Hongjian Gao,Guosong Chen,and Ming Jiang.J.Am.Chem.Soc.2018,140(28),8851-8857)报道了半乳糖修饰的聚苯乙烯聚合物囊泡及其免疫性能，但未发现糖修饰聚合物囊泡中糖依赖性的细胞靶向性、免疫佐剂效应及其细胞免疫的协同效应，且不能生物降解。
发明内容
为了改善现有技术中纳米载体缺乏生物可降解性和细胞靶向性、特别是缺乏免疫佐剂作用和细胞免疫的协同效应等关键问题，本发明提供了糖基修饰的共负载蛋白和免疫激动剂的糖聚肽纳米囊泡及其应用。
本发明提供的糖聚肽纳米囊泡兼具生物可降解性、抗原提呈细胞靶向性、糖基依赖性的免疫佐剂功能、以及细胞免疫的协同效应，实现了蛋白抗原和小分子激动剂的胞内高效递送，不仅解决了纳米载体的生物可降解性、免疫细胞靶向性的问题，而且构筑的共负载纳米囊泡展现出促进树突状细胞熟化和共刺激因子分泌的免疫佐剂功能和细胞免疫的协同效应，为设计高活性纳米疫苗及其免疫治疗提供了解决方案。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明提供糖基修饰的共负载蛋白和免疫激动剂的糖聚肽纳米囊泡，分子结构中包括线型聚肽和含糖树状聚合物，其中，
线型聚肽为聚ε-(1-邻硝基苯基)乙氧羰-L-赖氨酸(PNLys)，其聚合度为10～20，优选为15；含糖树状聚合物为多种糖基修饰的1代至3代的聚酰胺-胺树状聚合物，优选为含4个糖单元的2代聚酰胺-胺树状聚合物，所述糖基选自甘露糖、半乳糖或葡萄糖。
在本发明的一个实施方式中，糖基修饰的共负载蛋白和免疫激动剂的糖聚肽纳米囊泡，具体为糖基修饰的共负载蛋白OVA和免疫激动剂R837的糖聚肽纳米囊泡。
在本发明的一个实施方式中，糖基修饰的共负载蛋白OVA和免疫激动剂R837的糖聚肽纳米囊泡，其分子结构式如下：
Figure BDA0003777859260000031
其中，R选自以下三个结构中的一种：
Figure BDA0003777859260000032
本发明进一步提供糖基修饰的共负载蛋白OVA和免疫激动剂R837的糖聚肽纳米囊泡的制备方法，包括以下步骤：
(1)将PNLys和含糖树状聚合物溶于DMSO中，氮气下加入溴化亚铜和N,N,N′,N″,N″-五甲基二亚乙基三胺，反应，再加入乙二胺四乙酸二钠搅拌、透析、冷冻干燥，得到糖基修饰的糖聚肽；
(2)步骤(1)中所得的产物溶解于DMSO中，加入OVA和R837后混合均匀，再向上述溶液中逐滴加入磷酸盐缓冲液(PBS)，充分搅拌后透析，得到糖基修饰的共负载蛋白OVA和免疫激动剂R837的糖聚肽纳米囊泡。
在本发明的一个实施方式中，所述步骤(1)中，PNLys和含糖树状聚合物的点击反应效率接近100％，铜离子经络合透析去除。
在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，反应条件为：35℃下反应48h。
在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，步骤(1)中所得的产物、OVA、R837的质量比为1：0.3：0.1。
在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，加入PBS与DMSO的体积比为0.3～0.5:1，优选为0.4:1。
在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，所述磷酸盐缓冲液(PBS)pH为7.4。
在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，先后经截留分子量为3500Da和100kDa的透析袋透析，时间36～48h，每次的透析体积1000mL，透析次数6～8。优选为透析48h，每次的透析体积1000mL，透析次数8。
步骤(2)中，透析的目的在于除去DMSO和R837(MWCO＝3500Da)，以及除去OVA(MWCO＝100k Da)。
在本发明中，糖基修饰的共负载蛋白OVA和免疫激动剂R837的糖聚肽纳米囊泡的流体力学直径为70～80nm，干态粒径为40～50nm，R837负载率为1～3％，OVA负载率为5～10％。
本发明还提供所述糖聚肽纳米囊泡在蛋白抗原和免疫激动剂共递送载体中的应用，具体的，还提供了其作为免疫细胞靶向性、免疫佐剂及其免疫协同效应方面的应用。
在本发明中，糖基修饰的共负载蛋白OVA和免疫激动剂R837的糖聚肽纳米囊泡和DC细胞共培养后，甘露糖聚肽纳米囊泡展示出靶向DC细胞的能力，其携带OVA入胞的细胞内摄效率大约是半乳糖和葡萄糖聚肽纳米囊泡的2倍。
在本发明中，糖基修饰的共负载蛋白OVA和免疫激动剂R837的糖聚肽纳米囊泡，与甘露糖聚肽纳米囊泡共培养的DC细胞的熟化程度达34.6％，其依次高于半乳糖聚肽囊泡的29.4％和葡萄糖聚肽囊泡的27.7％，表明糖聚肽纳米囊泡具有糖基依赖性的免疫佐剂效应，且甘露糖聚肽纳米囊泡展示出最强的促进DC细胞熟化的免疫佐剂效应。
在本发明中，糖基修饰的共负载蛋白OVA和免疫激动剂R837的糖聚肽纳米囊泡，经紫外光刺激，单独负载OVA的甘露糖聚肽囊泡使DC细胞的熟化程度提升至58.5％，而共负载OVA和R837的甘露糖聚肽囊泡使DC细胞的熟化程度则提高至74.6％，表明OVA抗原、R837激动剂和甘露糖聚肽纳米载体对促进DC细胞熟化具有协同效应。
在本发明中，糖基修饰的共负载蛋白OVA和免疫激动剂R837的糖聚肽纳米囊泡，和DC细胞共培养，其促进了DC细胞熟化和肿瘤坏死因子(TNF-α)及白细胞介素6(IL-6)的分泌，不仅展示出糖基依赖性的细胞免疫佐剂效应，而且OVA抗原、R837激动剂和甘露糖聚肽纳米载体具有细胞免疫的协同效应。糖基修饰的共负载OVA和R837的糖聚肽纳米囊泡，经甘露糖聚肽囊泡共培养的DC细胞的共刺激因子IL-6和TNF-α的分泌水平比半乳糖聚肽囊泡分别提高20.3％和19.5％，而比葡萄糖聚肽囊泡则分别提高37.4％和17.7％，展示出糖基依赖性的免疫佐剂效应。
在本发明中，糖基修饰的共负载OVA和R837的糖聚肽纳米囊泡，经紫外光刺激后，单独负载OVA的甘露糖聚肽囊泡使DC细胞的TNF-α和IL-6的分泌水平比空白甘露糖聚肽囊泡组显著增加1.74倍和2.28倍；而共负载OVA和R837的甘露糖聚肽囊泡使TNF-α和IL-6的分泌提升了2.97倍和3.04倍，展示出细胞免疫的协同效应。
本发明提供了多种糖基(甘露糖、半乳糖、葡萄糖)修饰的线性聚肽-含糖树枝化共聚物构筑的糖聚肽纳米囊泡的制备及其在蛋白抗原和免疫激动剂共递送载体中的应用。通过透析法制备共负载卵清蛋白(OVA)和小分子免疫激动剂咪喹莫特(R837)的糖聚肽(PNLys-4Man、PNLys-4Gal、PNLys-4Glu)纳米囊泡。本发明中构筑的糖聚肽纳米囊泡显示出糖基依赖性的促进树突状细胞(DC)熟化的免疫佐剂效应，且甘露糖修饰的纳米囊泡具有免疫细胞靶向能力和最强的免疫佐剂效应；施加紫外光刺激后共负载OVA和R837的糖聚肽纳米囊泡促进了DC细胞熟化和免疫相关共刺激因子的分泌，展示出OVA抗原、R837激动剂和糖聚肽纳米载体在细胞免疫中的协同效应。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
(1)通过设计尺寸和糖基表面密度均相近的糖聚肽纳米囊泡，筛选出具有DC细胞靶向性的甘露糖修饰的糖聚肽纳米囊泡，揭示出糖基依赖性的细胞免疫佐剂效应；
(2)制备的糖聚肽纳米囊泡同时负载蛋白抗原OVA和小分子激动剂R837，协同促进DC细胞熟化和免疫共刺激因子的分泌，增强细胞免疫应答，揭示出细胞免疫的协同效应。
附图说明
图1为多种糖修饰的共负载OVA和R837的糖聚肽纳米囊泡的动态光散射图谱和透射电镜图；
图2为负载OVA和R837的多种糖修饰的糖聚肽纳米囊泡经DC细胞内摄的平均荧光强度柱状图；
图3为多种糖修饰的糖聚肽纳米囊泡及负载OVA或OVA/R837的甘露糖修饰的糖聚肽纳米囊泡促进DC细胞熟化的流式结果图；
图4为与多种糖修饰的糖聚肽纳米囊泡及负载OVA或OVA/R837的甘露糖修饰的糖聚肽纳米囊泡共培养后细胞因子TNF-α和IL-6分泌结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
多种糖基修饰的糖聚肽纳米囊泡的制备：
(1)将PNLys15(80.0mg)和Alkynyl-D2-4Man(33.0mg)加入圆底烧瓶中，用5mL DMSO充分溶解，在氮气氛围下加入CuBr(2.4mg)和PMDETA(3.4μL)，35℃下避光反应48h。反应结束后，向溶液中加入EDTA二钠盐(43.0mg)搅拌络合体系中的铜离子。将反应液转移至透析袋(MWCO＝3500Da)中，在去离子水中透析48h，冷冻干燥得到甘露糖修饰的糖肽PNLys-4Man，收率为89％，同样的方法制备半乳糖和葡萄糖修饰的糖肽PNLys-4Gal和PNLys-4Glu。
(2)5mg上述制备的糖聚肽溶解在5mL DMSO中，加入0.5mg R837和1.5mg OVA(溶解在250μL PBS中)，混合体系在4℃下充分搅拌混合后，将2mL PBS以3mL/h的速度滴加到糖聚肽的DMSO溶液中。待组装体溶液稳定，将其转移至透析袋(MWCO＝3500Da)中，在4℃下透析到10mM pH 7.4的PBS中，待DMSO和R837除尽后换用MWCO＝100k Da的透析袋透析，除去游离OVA，得到OVA/R837共负载糖聚肽纳米囊泡。同样方法，未加入OVA和R837，制备得到空白糖聚肽纳米囊泡。
其中，多种糖基修饰的共负载蛋白OVA和免疫激动剂R837的糖聚肽纳米囊泡，其分子结构式如下：
Figure BDA0003777859260000071
其中，R选自以下三个结构中的一种：
Figure BDA0003777859260000072
本实施例制得的不同糖修饰的负载OVA/R837糖聚肽纳米囊泡如图1所示，其流体力学直径为70～80nm，干态粒径在40～50nm的囊泡。
实施例2
实施例1制得的多种糖修饰的负载OVA和R837的糖聚肽纳米囊泡对DC细胞的内摄实验。
将小鼠骨髓源树突状细胞(BMDCs)以每孔2mL、5.0×105的初始密度铺入6孔板中，培养过夜后，向特异性抑制组加入100mM的甘露糖(甘露糖和葡萄糖修饰的纳米囊泡组)或半乳糖(半乳糖修饰的纳米囊泡组)共培养1h后，然后再加入含有游离FITC-OVA、实施例1中制得的负载FITC-OVA和R837的糖肽纳米囊泡的新鲜培养基(各样品FITC-OVA浓度均为10μg/mL)。共培养4h后，离心收集BMDCs，用PBS清洗2次，然后重悬于少量体积的PBS中，用流式细胞仪进行测试，分析门内1×104个细胞的荧光强度，结果如图2所示。
实施例3
实施例1制得的多种糖修饰的糖聚肽纳米囊泡及负载OVA和R837的甘露糖聚肽纳米囊泡促进DC细胞熟化和细胞因子分泌实验。
将BMDCs细胞以5×105的密度铺入24孔板中，培养过夜后，分别加入游离OVA、实施例1中制得的多种糖修饰的空白糖聚肽纳米囊泡(Man-NP、Glu-NP和Gal-NP)、实施例1中制得的负载OVA和R837的甘露糖修饰的糖聚肽纳米囊泡(OVA/R837-Man-NP)的溶液(OVA的终浓度为10μg/mL,空白糖聚肽纳米囊泡的浓度为150μg/mL)。共培养4h后，将OVA/R837-Man-NP组用紫外灯照射5min(365nm、10mW)，继续培养20h。离心收集细胞，并用冰PBS洗2次，然后加入APC anti-mouse CD11c、FITC anti-mouse CD80和PE anti-mouse CD86抗体，在4℃下进行避光标记30分钟。然后用PBS洗两次，重新分散在500μL PBS中，通过流式细胞仪分析细胞的熟化情况。同时使用ELISA试剂盒，测试细胞培养液中细胞因子TNF-α和IL-6的浓度。促进DC细胞熟化和共刺激因子分泌水平的结果如图3和图4所示。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种糖基修饰的共负载蛋白和免疫激动剂的糖聚肽纳米囊泡，其特征在于，分子结构中包括线型聚肽和含糖树状聚合物，其中，
线型聚肽为聚ε-(1-邻硝基苯基)乙氧羰-L-赖氨酸，其聚合度为10～20，优选为15；含糖树状聚合物为多种糖基修饰的1代至3代的聚酰胺-胺树状聚合物，优选为含4个糖单元的2代聚酰胺-胺树状聚合物，所述糖基选自甘露糖、半乳糖或葡萄糖。
2.根据权利要求1所述的一种糖基修饰的共负载蛋白和免疫激动剂的糖聚肽纳米囊泡，其特征在于，具体为糖基修饰的共负载蛋白OVA和免疫激动剂R837的糖聚肽纳米囊泡。
3.根据权利要求2所述的一种糖基修饰的共负载蛋白和免疫激动剂的糖聚肽纳米囊泡，其特征在于，糖基修饰的共负载蛋白OVA和免疫激动剂R837的糖聚肽纳米囊泡，其分子结构式如下：
Figure FDA0003777859250000011
其中，R选自以下三个结构中的一种：
Figure FDA0003777859250000021
4.根据权利要求3所述的一种糖基修饰的共负载蛋白和免疫激动剂的糖聚肽纳米囊泡，其特征在于，糖基修饰的共负载蛋白OVA和免疫激动剂R837的糖聚肽纳米囊泡的流体力学直径为70～80nm，干态粒径为40～50nm，R837负载率为1～3％，OVA负载率为5～10％。
5.权利要求3所述糖基修饰的共负载蛋白OVA和免疫激动剂R837的糖聚肽纳米囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将聚ε-(1-邻硝基苯基)乙氧羰-L-赖氨酸和含糖树状聚合物溶于DMSO中，氮气下加入溴化亚铜和N,N,N′,N″,N″-五甲基二亚乙基三胺，反应，再加入乙二胺四乙酸二钠搅拌、透析、冷冻干燥，得到糖基修饰的糖聚肽；
(2)步骤(1)中所得的产物溶解于DMSO中，加入OVA和R837后混合均匀，再向所得溶液中逐滴加入磷酸盐缓冲液，充分搅拌后透析，得到糖基修饰的共负载蛋白OVA和免疫激动剂R837的糖聚肽纳米囊泡。
6.根据权利要求5所述糖基修饰的共负载蛋白OVA和免疫激动剂R837的糖聚肽纳米囊泡的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，聚ε-(1-邻硝基苯基)乙氧羰-L-赖氨酸和含糖树状聚合物的点击反应效率接近100％，铜离子经络合透析去除；
步骤(1)中，反应条件为：35℃下反应48h。
7.根据权利要求5所述糖基修饰的共负载蛋白OVA和免疫激动剂R837的糖聚肽纳米囊泡的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，步骤(1)中所得的产物、OVA、R837的质量比为1：0.3：0.1。
8.根据权利要求5所述糖基修饰的共负载蛋白OVA和免疫激动剂R837的糖聚肽纳米囊泡的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，加入PBS与DMSO的体积比为0.3～0.5:1，优选为0.4:1。
9.根据权利要求5所述糖基修饰的共负载蛋白OVA和免疫激动剂R837的糖聚肽纳米囊泡的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，先后经截留分子量为3500Da和100kDa的透析袋透析，时间36～48h，每次的透析体积1000mL，透析次数6～8；优选为透析48h，每次的透析体积1000mL，透析次数8。
10.权利要求1-4中任一项所述糖基修饰的共负载蛋白和免疫激动剂的糖聚肽纳米囊泡的应用，其特征在于，所述糖基修饰的共负载蛋白和免疫激动剂的糖聚肽纳米囊泡在蛋白抗原和免疫激动剂共递送载体中的应用。
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