CN114306591B - 一种脂质体佐剂、一种温敏凝胶及一种温敏凝胶制剂 - Google Patents
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Abstract
本申请具体公开了一种脂质体佐剂、一种温敏凝胶及一种温敏凝胶制剂。脂质体佐剂，按重量份计，包括DOTAP 1‑4份，大豆卵磷脂280‑320份、胆固醇40～60份。其制备方法为：S1将DOTAP、大豆卵磷脂、胆固醇溶解在溶剂中；旋转，蒸干溶剂，得到薄膜；S2向S1所得薄膜中加入PBS，45‑55℃下搅拌0.5‑1.5h，溶解薄膜，得到脂质体原液；S3所述脂质体原液通过聚碳酸酯膜，挤压20‑80次，得到脂质体佐剂。温敏凝胶包括泊洛沙姆凝胶和脂质体佐剂；温敏凝胶可以用于制备温敏凝胶佐剂。本申请的脂质体佐剂具有调节温敏凝胶相变温度和粘度，并且提高温敏凝胶制剂给药效率的优点。
Description
技术领域
本申请涉及生物技术领域，更具体地说，它涉及一种脂质体佐剂、一种温敏凝胶及一种温敏凝胶制剂。
背景技术
目前批准的疫苗(例如手足口疫苗)多为注射剂，其主要诱导强烈的全身免疫应答。然而，大多数病原体优先通过胃肠道，呼吸道、泌尿生殖道或眼睛的粘膜表面感染人体，常规使用注射方式对传染病的全身疫苗递送，不能诱导强烈的粘膜免疫应答。
鼻腔具有高密度的树突细胞，其可介导针对通过上呼吸道侵入身体的抗原和病原体的强烈的全身和粘膜免疫应答，并且通过鼻腔施用疫苗时可以避免胃肠道破坏；其中鼻粘膜递送因安全、有效、施用便利是解决现有产品缺点的技术路线之一。
但鼻粘膜对药物的吸收量是有限的，如何提高鼻粘膜给药的生物利用度是在研究鼻粘膜疫苗时必须面对的问题。
发明内容
为了增加药物在鼻腔粘膜粘滞性，提高鼻粘膜给药的生物利用度，本申请提供一种脂质体佐剂、一种温敏凝胶及一种温敏凝胶制剂
第一方面本申请提供一种脂质体佐剂，采用如下的技术方案：
一种脂质体佐剂，按重量份计，包括DOTAP 1-4份，大豆卵磷脂280-320份、胆固醇40～60份。
优选的，按重量份计，脂质体佐剂包括DOTAP 3份，大豆卵磷脂297份、胆固醇50份。
通过选择大豆卵磷脂、DOTAP、胆固醇，并对这三种组分进行用量的配比，从而制备出的脂质体佐剂可以用于调节温敏凝胶的相变温度以及相变后的粘度。从而使得温敏凝胶可以作用在人体鼻腔内，并且温敏凝胶在鼻腔内吸热后凝固，从而附着在鼻粘膜上。当温敏凝胶内部携带药剂或是疫苗时，药剂或是疫苗可以直接作用在鼻粘膜上。由于脂质体佐剂改变了温敏凝胶的相变温度以及粘度，从而改善了药剂或疫苗的在鼻粘膜上的作用效果。
第二方面，本申请提供一种脂质体佐剂的制备方法，
脂质体佐剂的制备方法，包括如下步骤：
S1将DOTAP、大豆卵磷脂、胆固醇溶解在溶剂中；旋转，蒸干溶剂，得到薄膜；
S2向S1所得薄膜中加入PBS，45-55℃下搅拌0.5-1.5h，溶解薄膜，得到脂质体原液；
S3所述脂质体原液通过聚碳酸酯膜，挤压20-80次，得到脂质体佐剂。优选的，挤压40次。
所述溶剂可以选自甲醇、乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷中的至少一种，优选的，溶剂选择为乙醇。
选择不同的溶剂对成膜以及薄膜在PBS中水化程度有影响：
当选择二氯甲烷或二氯乙烷作为溶剂时，所得薄膜不均匀，瓶底处产生沉淀，而当选择甲醇作为溶剂时，所得薄膜有褶皱；当选择乙醇为溶剂时，薄膜面积大并且薄膜均匀的分布在瓶底。
对于水化程度来说，当溶剂选择为乙醇时，水化后的液体呈乳白色，说明薄膜水化效果好，分布均匀，而选择其他溶剂，水化后的液体更加浑浊。
综上所述，当溶剂选择为乙醇时，旋转蒸发后所得的薄膜以及薄膜的水化效果均优于其它溶剂。
优选的，所述聚碳酸酯膜孔径为200nm。
脂质体佐剂经过挤压通过聚碳酸酯膜后，脂质体的平均粒径被均化为200-300nm之间，优选的，脂质体的平均粒径为240-270nm。
通过对聚碳酸酯膜规格的选择以及挤压次数的控制，从而使得脂质体的平均粒径被控制在240-270nm，从而提高了脂质体佐剂的稳定性，减少了脂质体佐剂经过存放后发生聚沉从而影响性能的情况。
第三方面，本申请提供一种温敏凝胶，采用如下的技术方案，
一种温敏凝胶，按重量份计，包括泊洛沙姆凝胶50-70份、脂质体佐剂35-105份；
所述脂质体佐剂使用的是上述的脂质体佐剂；
所述温敏凝胶的相变温度为31-35℃。
当温敏凝胶作为经鼻递送的温敏凝胶制剂时，其相变温度优选为31-35℃。这是因为受环境因素的影响，人体鼻腔温度会略低于体温，当温敏凝胶的相变温度选择在31-35℃，温敏凝胶可以快速在鼻腔内凝固。而如果温敏凝胶的相变温度过低，则不易给药以及对温敏凝胶进行储存了运输。而当温敏凝胶的相变温度过高时，温敏凝胶注入鼻腔后不易相变，从而难以附着在鼻腔内。
优选的，所述泊洛沙姆凝胶由泊洛沙姆407凝胶和泊洛沙姆118凝胶组成，泊洛沙姆407凝胶与泊洛沙姆118凝胶的重量比为1.5-2.5:1。
优选的，包括泊洛沙姆407凝胶40份、泊洛沙姆188凝胶20份、脂质体佐剂87.5份。
第四方面，本申请请求保护一种温敏凝胶制剂，采用如下技术方案。
一种温敏凝胶制剂，包括上述的温敏凝胶。
温敏凝胶中可以加入药物或抗原，从而制备出温敏凝胶制剂，进而可以用于向鼻腔黏膜处给药。从而提高了给药的便捷性。
优选的，所述温敏凝胶制剂还包括抗原、蔗糖；蔗糖和温敏凝胶重量比10:80-180。
第五方面，本申请请求保护一种温敏凝胶制剂在制备经鼻粘膜递送的疫苗中的应用。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、由于本申请选用大豆卵磷脂、DOTAP、胆固醇，并对三者用量进行选择，从而获得了脂质体佐剂，进而脂质体佐剂可以用于调节凝胶的相变温度，从而使得温敏凝胶的相变温度与人体温度相适应，从而温敏凝胶作用与人体鼻粘膜后，可以稳定的向鼻粘膜给药，从而提高了药效。
2、本申请中通过调整脂质体佐剂在温敏凝胶中的用量关系，进一步优化了温敏凝胶的相变温度，和相变后的粘度，从而改善了温敏凝胶的附着性。
具体实施方式
脂质体佐剂的制备
制备例1-4、对比制备例1-3的不同之处在于各组分用量不同，制备例1-4和对比制备例1-3的各组分用量如表1。
表1脂质体佐剂制备例1-4组分配比
| 大豆卵磷脂/mg | DOTAP/mg | 胆固醇/mg | |
| 制备例1 | 299 | 1 | 50 |
| 制备例2 | 298 | 2 | 50 |
| 制备例3 | 297 | 3 | 50 |
| 制备例4 | 296 | 4 | 50 |
| 对比制备例1 | 300 | 0 | 50 |
| 对比制备例2 | 295 | 5 | 50 |
| 对比制备例3 | 297 | 3 | 0 |
制备例1-4、对比制备例1-3的脂质体佐剂均采用如下的方法制备
一种脂质体佐剂的制备方法
S1将大豆卵磷脂、DPTAP、胆固醇按配方量加入茄形瓶中，加入无水乙醇溶解，60℃下旋转蒸发；当茄形瓶内无水乙醇蒸干后，茄形瓶内形成薄膜。
S2对向瓶壁附有薄膜的茄形瓶内加入10ml的PBS，50℃下搅拌1h，使薄膜溶解在PBS中，得到脂质体原液。
S3将脂质体原液转移至气密注射器中通过挤压使脂质体原液通过聚碳酸酯膜，挤压40次，得到脂质体佐剂，聚碳酸酯膜的孔径为200nm。
对比制备例4
与制备例3的不同之处在于，本对比制备例中聚碳酸酯膜的孔径为300nm。
对制备例1-4、对比制备例1-3所得的脂质体佐剂中脂质体的粒径以及Zeta电位进行检测。
脂质体粒径的测定：使用激光粒度测定仪(厂家型号:布鲁克海文90Plus PALS)，取1mL脂质体佐剂，加入到测定器皿中，每个样品自动测定三次。
Zeta电位的测定：采用带有表面电位分析功能的动态光散射粒度仪测定，取1mL稀释的纳米粒悬液加入到电位测定样品池中，平行测定三次，取平均值作为最终结果。
粒径和Zeta电位的测定结果如表2
表2脂质体的粒径以及zeta电位检测
| 粒径(nm) | Zeta电位/mV | |
| 制备例1 | 241.2 | 35.23 |
| 制备例2 | 253.3 | 37.76 |
| 制备例3 | 264.3 | 42.34 |
| 制备例4 | 251.5 | 46.24 |
| 对比制备例1 | 223.1 | 28.66 |
| 对比制备例2 | 245.4 | 56.67 |
| 对比制备例3 | 110.5 | 35.37 |
| 对比制备例4 | 372.3 | 23.78 |
结合表2，可以看出的通过选择大豆卵磷脂、DOTAP、胆固醇组合后配置的脂质体佐剂中，脂质体的平均粒径可以达到240-270mm，zeta电位为30-50mV。脂质体的平均粒径维持在200-300mm尤其是240-270mm时可以提高脂质体佐剂的稳定性，而当脂质体佐剂的粒径过大时，脂质体佐剂容易发生分层现象，脂质体佐剂粒径过小，会影响对DOTAP的包覆能力，从而降低脂质体佐剂的活性。
Zeta电位的增大有利于提高脂质体佐剂的稳定性，而如果zeta电位过大，则容易对细胞产生刺激。
因此本申请制备例1-4得到的脂质体佐剂具有稳定性高，对细胞刺激性小的优点。
温敏凝胶的制备
实施例1-3和对比例1、2的温敏凝胶采用如下方法制备
一种温敏凝胶的制备方法
将泊洛沙姆407凝胶40mg、泊洛沙姆118凝胶20mg溶解在10ml的PBS中，得到温敏凝胶前体溶液，向温敏凝胶前体溶液中加入脂质体佐剂，混合均匀得到温敏凝胶。
温敏凝胶前体溶液与脂质体佐剂的体积比为100:10。
实施例1-3和对比例1、2的不同之处在于温敏凝胶中使用的脂质体佐剂不同温敏凝胶与脂质体佐剂的对应关系如表3
表3，实施例1-3，对比例1、2中温敏凝胶与脂质体佐剂的对应关系
| 温敏凝胶 | 脂质体佐剂 |
| 实施例1 | 制备例2 |
| 实施例2 | 制备例3 |
| 实施例3 | 制备例4 |
| 对比例1 | 对比制备例1 |
| 对比例2 | 对比制备例2 |
在实施例4-7和对比例3、4中，温敏凝胶前体溶液与脂质体佐剂的体积比与实施例2不同，其余配比及制备方法均相同
表4实施例2、4-7，对比例3、4温敏凝胶前体溶液与脂质体佐剂的体积比
| 组别 | 温敏凝胶前体溶液与脂质体佐剂的体积比 |
| 实施例2 | 100:10 |
| 实施例4 | 100:15 |
| 实施例5 | 100:20 |
| 实施例6 | 100:25 |
| 实施例7 | 100:30 |
| 对比例3 | 不添加脂质体佐剂 |
| 对比例4 | 100:35 |
温敏凝胶性质检测
对实施例1-7以及对比例1-4所制备的温敏凝胶的相转变温度(℃)、粘度(mPa·S)进行检测
温敏凝胶相转变温度，采用如下方法进行检测：
将温敏凝胶于4℃冷藏2h，检测时，取出温敏凝胶，加入0.5cm×1.0cm的搅拌子，调节搅拌转速为150r/min。水浴环境下加热，加热速度为2℃/min。观察搅拌子停止转动时的温度,定义此时的温度为胶凝温度，每组平行测定3次，结果取平均值。
温敏凝胶的粘度采用粘度计进行检测：
将20ml配制好的温敏凝胶置于直径不小于70mm的烧杯中，于25℃恒温水浴0.5h。采用NDJ－1粘度计测定样品粘度。测定时指针在刻度表盘上指示的读数乘以系数表上特定系数即为该溶液的绝对粘度。每组平行测定3次，结果取平均值。
检测结果如表4所示。
表5温敏凝胶的相转变温度、粘度。
| 组别 | 相转变温度(℃) | 粘度(mPa·s) |
| 实施例1 | 32.5 | 210 |
| 实施例2 | 32.1 | 235 |
| 实施例3 | 33.4 | 202 |
| 实施例4 | 33.7 | 254 |
| 实施例5 | 34.1 | 278 |
| 实施例6 | 34.3 | 293 |
| 实施例7 | 34.5 | 252 |
| 对比例1 | 29.9 | 192 |
| 对比例2 | 30.6 | 187 |
| 对比例3 | 28.6 | 180 |
| 对比例4 | 35.3 | 202 |
结合表5，对于粘度而言，温敏凝胶相变后的粘度应在200-300mPa·s，当温敏凝胶的粘度过低，则容易造成温敏凝胶在鼻腔内的附着能力降低，影响温敏凝胶制剂对鼻腔的给药给药，而如果粘度过高，则容易刺激鼻腔，促使鼻腔分泌物增多，从而影响给药效果。
结合实施例2和对比例3，加入脂质体佐剂可以明显提高温敏凝胶的相变温度以及温敏凝胶相变后的粘度。
结合实施例1、2、3对比例1、2可以看出，当DOTAP与卵磷脂的重量比为3:297时，脂质体佐剂可以明显改变温敏凝胶的相变温度并且得到的温敏凝胶具有较高的粘度。
结合实施例2、4、5、6、7以及对比例4可以看出，通过改变脂质体佐剂的用量，可以调节温敏凝胶的相变温度以及粘度，随着脂质体佐剂的用量增大，温敏凝胶的相变温度逐渐增大，粘度先增大后减小。当脂质体佐剂添加量在25％时，温敏凝胶的粘度最高。
温敏凝胶制剂的制备
将抗原、蔗糖加入到温敏凝胶中，得到温敏凝胶制剂。
具体的，抗原和蔗糖的加入时机为温敏凝胶前体溶液和脂质体佐剂混合之前：将抗原和蔗糖按照配方量加入温敏凝胶前体溶液内，混合均匀后加入脂质体佐剂，得到携带了温敏凝胶抗原的温敏凝胶制剂。
当抗原选择为手足口抗原时，手足口疫苗温敏凝胶制剂采用如下制备方法：
将40mg的泊洛沙姆407凝胶和20mg的泊洛沙姆188凝胶溶解在10ml PBS内，得到温敏凝胶前体溶液，以目标产物中含有50U手足口疫苗抗原的要求，加入抗原到温敏凝胶前体溶液中，接着加入10mg的蔗糖，混合均匀后；加入脂质体佐剂，充分混合得到手足口疫苗温敏凝胶制剂。
应用例1-7的不同之处在于，分别选择了实施例1-7的温敏凝胶；
对比应用例1-4的不同之处在于，分别选择了对比例1-4的温敏凝胶；
手足口疫苗温敏凝胶制剂与温敏凝胶的对应关系如表5。
表6，手足口疫苗温敏凝胶制剂与温敏凝胶的对应关系
| 手足口疫苗温敏凝胶制剂 | 温敏凝胶 |
| 应用例1 | 实施例1 |
| 应用例2 | 实施例2 |
| 应用例3 | 实施例3 |
| 应用例4 | 实施例4 |
| 应用例5 | 实施例5 |
| 应用例6 | 实施例6 |
| 应用例7 | 实施例7 |
| 对比应用例1 | 对比例1 |
| 对比应用例2 | 对比例2 |
| 对比应用例3 | 对比例3 |
| 对比应用例4 | 对比例4 |
手足口疫苗温敏凝胶制剂效用的检测小鼠免疫：10ul手足口疫苗温敏凝胶制剂经鼻粘膜免疫2次，间隔2周，于免疫后14日取眼眶血液，制备血清；并用200ul生理盐水冲洗并收集鼻腔粘液，用0.2um针头过滤器去除杂质，-20℃储存储存备用；用经典细胞病变法测定血清抗体及粘液内抗体水平。
检测结果见表6
表7血清抗体IgG浓度(μg/ml)及粘液IgA浓度(μg/ml)。
| 组别 | 血清IgG | 粘液IgA |
| 应用例1 | 160 | 32 |
| 应用例2 | 192 | 32 |
| 应用例3 | 160 | 32 |
| 应用例4 | 192 | 64 |
| 应用例5 | 192 | 64 |
| 应用例6 | 276 | 148 |
| 应用例7 | 256 | 128 |
| 对比应用例1 | 128 | 16 |
| 对比应用例2 | 64 | 8 |
| 对比应用例3 | 128 | ＜8 |
| 对比应用例4 | 65 | ＜8 |
结合表7可以看出应用例1-7制备的经鼻递送的手足口疫苗温敏凝胶制剂作用在小鼠后，可以显著提高小鼠体内血清抗体IgG以及粘液抗体IgA的水平。应用例1-7中血清抗体IgG浓度可以达到160μg/ml以上，最优可以达到276μg/ml。相比于对比应用例，有明显的提高。
产生这种变化，可能是由于应用例6中的温敏凝胶可以更稳定的附着在鼻粘膜上，从而使得手足口疫苗的作用效果更佳稳定，还有可能是，脂质体佐剂对于手足口抗原具有包裹缓释的租用，从而使得手足口抗原可以更加长效的作用在鼻粘膜上，进而提高了经鼻递送的手足口疫苗温敏凝胶制剂对于小鼠的免疫效果。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (4)
1.一种温敏凝胶，其特征在于，按重量份计，所述温敏凝胶的组分为泊洛沙姆凝胶50-70份和脂质体佐剂35-105份；
所述脂质体佐剂包括DOTAP 1-4份，大豆卵磷脂280-320份和胆固醇40～60份；
所述泊洛沙姆凝胶由泊洛沙姆407凝胶和泊洛沙姆188凝胶组成，泊洛沙姆407凝胶与泊洛沙姆188凝胶的重量比为1.5-2.5:1；
所述温敏凝胶的相变温度为31-35℃；
所述脂质体佐剂的制备方法，包括如下步骤：
S1将DOTAP、大豆卵磷脂、胆固醇溶解在乙醇中；旋转，蒸干溶剂，得到薄膜；
S2向S1所得薄膜中加入PBS，45-55℃下搅拌0.5-1.5h，溶解薄膜，得到脂质体原液；
S3所述脂质体原液通过孔径为200nm的聚碳酸酯膜，挤压20-80次，得到脂质体佐剂。
2.根据权利要求1所述的一种温敏凝胶，其特征在于：按重量份计，所述温敏凝胶的组分为泊洛沙姆407凝胶40份、泊洛沙姆188凝胶20份和脂质体佐剂87.5份。
3.一种温敏凝胶制剂，其特征在于，包括权利要求1-2任一所述的温敏凝胶、手足口抗原和蔗糖；蔗糖和温敏凝胶重量比10:80-180。
4.如权利要求3所述的温敏凝胶制剂在制备经鼻粘膜递送的手足口疫苗中的应用。
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