CN113117056A - 一种脂质体结合微针给药的乙脑疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种脂质体结合微针给药的乙脑疫苗，包括针体和背衬，针体由乙脑疫苗脂质体和基质材料组成，其中，基质材料为GantrezS‑97与HA的混合，脂质体材料为HEPC、胆固醇和DOTAP的混合；乙脑疫苗脂质体与基质材料的含量比为1:2。本发明通过选择特定组分及含量的基质材料(GantrezS‑97+HA)，特定组分及含量的脂质体材料(HEPC+胆固醇+DOTAP)，及适当的乙脑疫苗脂质体与基质材料的含量比，制得乙脑疫苗脂质体可溶性微针，该微针既能稳定、有效地负载乙脑疫苗，又具有良好的机械性能，还能显著增强乙脑疫苗的免疫效果。

Description

一种脂质体结合微针给药的乙脑疫苗
技术领域
本发明涉及乙脑疫苗的给药技术领域，具体涉及一种脂质体结合微针给药的乙脑疫苗。
背景技术
流行性乙型脑炎是由乙脑病毒引起、由蚊虫传播的一种急性传染病。乙脑的病死率和致残率高,是威胁人群特别是儿童健康的主要传染病之一。我国是乙脑高流行区，在20世纪60年代和70年代初期全国曾发生大流行，70年代以后随着大范围接种乙脑疫苗,乙脑发病率明显下降,近年来维持在较低的发病水平。由此可见乙脑疫苗在预防乙脑流行上起着重要作用。而乙脑病毒抗原作为乙脑疫苗的最主要成分,其含量对疫苗质量起到至关重要的作用。
目前，灭活全病毒疫苗制品通常采用皮下或肌内给药途径,利用这些部位丰富的免疫细胞特别是抗原递呈细胞(Antigen Presenting cells,APCs)以及将其他部位的免疫细胞和免疫相关细胞因子募及到这些部位的能力,诱导机体快速产生保护性免疫应答。因此,这种类型的疫苗制品通常都是采用注射针剂的制剂方式,包括水针和冻干粉针。但对于一些重症过敏患者，虽皮下或皮肤注射给药治疗周期短，疗效更快，但需要专业的医务人员进行操作，技术要求高。同时，由于乙脑疫苗免疫周期短，一般初次免疫后，7至10天就得进行二次免疫，注射时会有疼痛感，这对于乙脑疫苗主要服务人群如儿童、婴幼儿群体而言，依从性差，免疫周期短，易引起不良反应，如一般发烧，红肿，更甚者会出现过敏反应等。因此，需开发一种增强机体对疫苗免疫应答能力，增强疫苗疗效，从而延长给药周期，并具有好的患者依从性的新型给药技术。
微针作为一种新型的经皮免疫方法，其特点就是实用方便，不需要专业医务人员，普通人群就可以操作。同时，微针不触及真皮层地神经末梢，能无痛微创给药、特殊人群顺应性良好，在能充分穿透皮肤角质层条件下，载药的针尖恰好到达免疫细胞最多的皮层部位，所以临床效果更好。根据不同的结构和功能特点，目前已有的微针可以分为四个类型，即固体实心微针、中空微针、涂层微针以及可溶性微针。固体实心微针与中空微针虽然制备较为简单但是如果不小心断在皮内会造成有害残留；涂层微针载药量小且难以控制给药量；相比之下，可溶性微针具有良好生物相容性，刺入皮内可以自行溶解且不造成有害残留等优点而被广泛研究。目前虽有乙脑疫苗可溶性微针的相关文献报道，能解决患者依从性问题，但对乙脑疫苗的免疫应答能力并没有提高。
脂质体由天然或合成的磷脂特别是磷脂酰胆碱组成，是具有至少一个脂双分子层的球形囊泡。据文献《脂质体作为药物载体的研究进展》报道其具有显著的免疫刺激作用，是提高抗原呈递效应和半抗原载体效应的新型递送系统，且能提供增加疫苗的稳定性(Guevara Maria L,Persano Stefano,Persano Francesca.Lipid-Based Vectors forTherapeutic mRNA-Based Anti-Cancer Vaccines.[J].Current pharmaceutica ldesign,2019,25(13))。脂质体按电荷可分为中性脂质体、负电荷脂质体以及正电荷脂质体(阳离子脂质体)，且阳离子脂质体本身具有免疫刺激作用，可增加免疫刺激。
目前，查阅相关文献可知，与乙脑疫苗相关的脂质体制备，有文献(Wu S C,Yu CH,Lin C W,et al.The domain III fragment of Japanese encephalitis virusenvelope protein:mouse immunogenicity and liposome adjuvanticity[J].Vaccine,2003,21(19-20):0-2522.)报道携带乙脑疫苗活性蛋白基因片段的pET32a表达载体，以硫氧化还原重组蛋白形式加载至PC、PA、SA与胆固醇四者结合的脂质体中，但乙脑疫苗除主要活性成分外，还有杂蛋白成分存在，理化性质更复杂，简单以乙脑疫苗替换pET32a重组蛋白加载到上述脂质体，是否能达到乙脑疫苗的有效负载仍具有不确定性。
同时，查阅国内外文献，虽有疫苗脂质体可溶性微针的文献以及乙脑疫苗由中空聚乳酸纳米粒负载与可溶性微针结合的专利报道，但并未有乙脑疫苗脂质体可溶性微针的相关文献报道。
公开号为CN 104027324A的中国发明专利公开了一种可溶性微针疫苗贴片及其制备方法，采用不同种类的纳米粒负载特定的疫苗与特定的Th1佐剂GpG OND，从而达到有效递送和免疫效果，优选的纳米粒为阳离子脂质体纳米粒。但，文中并未用阳离子脂质体纳米粒(DPPC+DDA+胆固醇)负载乙脑减毒疫苗，是否因为由DPPC、DDA、胆固醇三者构成的阳离子脂质体对乙脑疫苗的负载效果不佳，进而影响其递送与免疫效果，故选择中空聚乳酸纳米粒，尚不可知。可见，选择何种材料构建的脂质体，能对乙脑疫苗达到有效负载和递送，仍存在不确定性。
文献(Ji hui Zhao，et al.Enhanced immunization via dissolvingmicroneedle array-bastaned delivery system incorporating subunit vaccine andsaponin adjuvant[J].International Journal of Nanomedicine,2017:12 4763-4772)涉及了由HEPC(13.0mg)、胆固醇(7.0mg)和十八胺(SA)(1.1mg)制备而成的脂质体负载OVA与PVP K30微针基质材料共混形成可溶性微针。该技术方案的不足之处在于：①脂质体为一种流动型微囊，在溶液中能较稳定存在，但与可溶性微针基质材料溶液共混后，随着水分挥发，干燥成型，对脂质体的稳定性是否会有影响，从该文献中无法知悉。②乙脑疫苗与OVA的理化性质不同，乙脑疫苗是否能简单替换OVA加载至其脂质体中，达到良好包封率，且与PVPK30有效结合组成微针，并脂质体又能稳定存在于微针中，目前尚不可知。
因此，如何构建脂质体，使之稳定、有效地负载乙脑疫苗，存在不确定性。
此外，由文献(章捷,马凤森,占浩慧,et al.用于构建可溶性微针的基质材料及其复合材料[J].材料导报,2017(19):132-137+164)可知，不同的基质材料混合制备可溶性微针，可溶性微针机械强度也不同。
因此，选用何种基质材料与乙脑疫苗结合形成具有良好机械性能的可溶性微针，也存在不确定性。
综上所述，如何开发一种脂质体结合微针给药的乙脑疫苗可溶性微针，既能稳定、有效地负载乙脑疫苗，又具有良好的机械性能，增强乙脑疫苗的免疫效果，是本领域技术人员急需解决的技术难题。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，提供了一种脂质体结合微针给药的乙脑疫苗，通过选择适合的脂质体和基质材料，解决了上述现有技术存在的不足之处。
为此，本发明采取了以下技术方案：
一种脂质体结合微针给药的乙脑疫苗，包括针体和背衬，针体由乙脑疫苗脂质体和基质材料组成，其中，基质材料为GantrezS-97与HA的混合，脂质体材料为HEPC、胆固醇和DOTAP的混合；乙脑疫苗脂质体与基质材料的含量比为1:2。
优选的，基质材料中，GantrezS-97与HA的含量比为(1:1)～(2:1)。
更优选的，基质材料中，GantrezS-97与HA的含量比为2:1。
优选的，脂质体材料中，各组分及其质量占比为：HEPC占比为50％，胆固醇占比为30％，DOTAP占比为20％。
优选的，乙脑疫苗可溶性微针的针体中，各组分及其质量占比为：乙脑疫苗脂质体占比为33.3％，GantrezS-97占比为44.5％，HA占比为22.2％。
综上，与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明通过选择特定组分及含量的基质材料(GantrezS-97+HA)，特定组分及含量的脂质体材料(HEPC+胆固醇+DOTAP)，及适当的乙脑疫苗脂质体与基质材料的含量比，制得乙脑疫苗脂质体可溶性微针，该微针既能稳定、有效地负载乙脑疫苗，又具有良好的机械性能，还能显著增强乙脑疫苗的免疫效果。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步的描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
实施例1乙脑疫苗脂质体可溶性微针的制备
本发明拟制备的乙脑疫苗脂质体可溶性微针，包括针体和背衬，针体由乙脑疫苗脂质体和适宜的基质材料组成，其中负载乙脑疫苗的脂质体材料由中性磷脂、胆固醇和正电荷脂质组成。
本发明制备乙脑疫苗脂质体的方法如下：
通过聚碳酸酯膜过滤控制脂质纳米囊的粒径，将乙脑疫苗溶液作为水相待用，将脂质体材料溶于氯仿中，作为有机相待用。取40ml有机相，用旋转蒸发法除去其中氯仿后，在烧瓶中有一层薄薄的脂膜。取10ml体积疫苗溶液水合0.5h，随后放入高压均质器中，在300±100bar压力下混匀三次后，利用小型挤出机通过100nm膜孔的聚碳酸酯膜过滤，控制脂质体粒径统一，即得乙脑疫苗脂质体。
本发明制备乙脑疫苗脂质体可溶性微针的方法如下：
将乙脑疫苗脂质体混悬液、微针基质材料按照处方配比进行混合，形成均一的针体液。取适量针体液倒入聚二甲基硅氧烷阴模具中，使针体液完全浸没阴模具孔洞，然后放入高速离心机中，设定转速为4000r/min，离心5min，使针体液充分进入阴模具的孔洞。最后，放入37℃的烘箱中干燥12小时后，脱模，即得乙脑疫苗脂质体可溶性微针。
实施例2乙脑疫苗脂质体可溶性微针的相关测试
1.乙脑疫苗脂质体的包封率的测定方法
乙脑疫苗脂质体的评价指标为包封率，包封率的测定方法如下：用BCA测定试剂盒测10ml疫苗溶液的蛋白含量，记为W1。随后将制备好的乙脑疫苗脂质溶液通过超速离心法，离心条件为18000rpm，离心30min。取其上清液，通过BCA测定试剂盒测其蛋白含量，记为W2。即包封率为EE＝(W1-W2)/W1。
中国药典(2015版)规定，脂质体的包封率不得低于80％(通则9014)。
2.乙脑疫苗脂质体稳定性考察方法
将脂质体悬液用去离子水稀释5倍后，取2微升滴于200目铜网上，干燥后染色10min，双蒸水漂洗干燥后，用透射电镜观察脂质体的形态结构，并测定其粒径大小，记为R1。随后将乙脑疫苗脂质体微针复溶于去离子水中，后续按上述操作进行测定其粒径，记为R2。若脂质体破碎，记为100％。计算粒径差异率为K＝(R1-R2)/R2。
当粒径差异率不高于10％时，即可达到脂质体稳定目的，视为符合要求。
3.微针机械性能的表征方法
方法1)：采用物性分析仪进行微针的压变性能考察
将可溶性微针针面朝上放置，使针的方向与探头的轴向平行，进行压变测定，记录微针的断裂力。
方法2)：微针的皮肤穿刺性能考察
运用给药装置在小鼠背部施加所制备的可溶性微针，1min后揭开，用亚甲基蓝染色后，除去多余染液，记录孔洞数，计算皮肤穿刺率，值越高，机械性能越好。穿刺率的计算公式如下：穿刺率＝(孔洞数/可溶性微针针体数)*100％。
当微针的断裂力大于3N时，穿刺率达到80％以上，即可实现有效经皮递送，视为符合要求。
4.乙脑疫苗免疫效果测定方法：
采用免疫小鼠中和抗体测定法，以蚀斑减少中和试验测定中和抗体。参考疫苗(RA和RB)以及中和试验阳性血清由国家药品检定机构提供。
将参考疫苗(R)均分别稀释1:32，分别腹腔免疫体重12～14g小鼠10只。再将联合疫苗可溶性微针(T)通过给药器免疫体重12～14g小鼠10只，免疫后采血，分离血清，同组小鼠血清等量混合，于56℃灭活30分钟，稀释阳性血清、T血清和R血清，分别与稀释好的病毒(约200PFU/0.4ml)等量混合。同时将稀释好的病毒再1:2稀释，作为病毒对照，置37℃水浴作用90分钟，接种6孔板BHK2细胞，每孔0.4m1，37C培养90分钟，加入甲基纤维素的培养基覆盖物，于CO2孵箱中培养5天，染色，蚀斑计数，计算T和R组对病毒对照组的蚀斑减少率，病毒对照组的蚀斑平均数应在50～150之间，评价微针组乙脑疫苗的效价(T值)。
中国药典规定：乙脑疫苗的效价T≥(RA+RB)/2-0.33时，为合格(RA和RB是参考疫苗的效价)，经本实验测定，当乙脑疫苗效价T值≥1.35时，视为符合要求。
实施例3脂质体材料的组成对乙脑疫苗负载效果的影响
由实施例1可知，负载乙脑疫苗的脂质体材料由中性磷脂、胆固醇、正电荷脂质组成。设定胆固醇在脂质体材料中的质量占比为一定值(如占比30％)，仅改变中性磷脂与正电荷脂质的成分，来探究其对乙脑疫苗脂质体包封率的影响。
本实施例中，筛选中性磷脂的成分如下：氢化蛋黄卵磷脂(HEPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)。
本实施例中，筛选正电荷脂质的成分如下：硬脂酰胺(SA)、己二酸二癸酯(DDA)、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺(DOTAP)。
本实施例中，乙脑疫苗脂质体的制备工艺，见实施例1。乙脑疫苗脂质体的包封率和释放量的测试方法，见实施例2，测试结果见表1。
表1.脂质体材料的组成对乙脑疫苗负载效果的影响(mean％±SD％，n＝6)
Figure BDA0002346356330000061
由表1可知：
1)当中性磷脂为HEPC，正电荷脂质为DOTAP时，构建的乙脑疫苗脂质体的包封率大于80％，符合测试要求。
2)故，选择HEPC、胆固醇与DOTAP组合构建负载乙脑疫苗的脂质体。
实施例4脂质体材料的质量占比对乙脑疫苗脂质体包封率的影响
在实施例3的基础上，设定乙脑疫苗脂质体在针体中的质量占比为一定值，仅改变HEPC与DOTAP各自在脂质体材料中的质量占比，探究其对乙脑疫苗脂质体包封率的影响。
本实施例中乙脑疫苗脂质体的制备工艺，见实施例1。乙脑疫苗脂质体包封率的测试方法，见实施例2，测试结果见表2。
表2.脂质体材料的质量占比对乙脑疫苗脂质体包封率的影响(mean％±SD％，n＝6)
Figure BDA0002346356330000062
由表2可知：
1)当HEPC占比为50％，胆固醇为30％，DOTAP为20％时，乙脑疫苗脂质体的包封率为89.7±0.8％，符合测试要求。
2)故，确定脂质体材料由HEPC、胆固醇、DOTAP组成，三者的质量占比分别为：HEPC占比为50％，胆固醇占比为30％，DOTAP占比为20％。
实施例5不同的基质材料对乙脑疫苗脂质体稳定性的影响
由于不同的可溶性微针基质材料，其理化性质不同，共混形成微针基质溶液后，其粘度等特性也不同，故对乙脑疫苗脂质体的稳定性影响存在差异。
在实施例3和4的基础上，设定乙脑疫苗脂质体在针体中的质量占比为一定值，仅改变微针基质材料的种类，来探究不同的基质材料对乙脑疫苗脂质体稳定性的影响。
本实施例中，筛选基质材料的成分为：聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、透明质酸(HA)、聚乙烯醇(PVA)、硫酸软骨素(CS)、甲基乙烯基醚-顺丁烯酸酐共聚物(GantrezS-97)中的一种或多种的组合，对应实验组为1～12。
本实施例中，乙脑疫苗脂质体可溶性微针的制备工艺，见实施例1。乙脑疫苗脂质体稳定性的测试方法，见实施例2，测试结果见表3。
表3.不同的基质材料对乙脑疫苗脂质体稳定性的影响(mean％±SD％，n＝6)
NO. 基质材料 粒径差异率(％)
1 PVP 37.5±0.3
2 PVA 100
3 GantrezS-97 28.5±0.1
4 CS 9.2±0.4
5 HA 14.2±0.2
6 PVP+HA 13.8±0.6
7 HA+PVA 100
8 GantrezS-97+CS 6.7±0.3
9 GantrezS-97+PVA 17.9±0.5
10 GantrezS-97+HA 1.5±0.1
11 PVP+CS 13.9±0.3
12 CS+HA 29.7±0.2
由表3可知：
1)不同的基质材料的组成，对乙脑疫苗脂质体的粒径改变极大，甚至出现实验组2和7这样脂质体破碎的现象，影响了乙脑疫苗脂质体的稳定性。
2)实验组4、8、10中粒径差异率少于10％，符合测试要求。
实施例6不同的基质材料对微针机械性能的影响
在实施例5的基础上，对实验组4、8、10进行断裂力和皮肤穿刺率的测定，来探究不同的不同的基质材料对乙脑疫苗可溶性微针机械性能的影响。
本实施例中，乙脑疫苗脂质体可溶性微针的制备工艺，见实施例1。乙脑疫苗脂质体可溶性微针机械性能的测试方法，见实施例2，测试结果见表4。
表4.不同的基质材料对微针机械性能的影响(mean±SD，n＝6)
NO. 基质处方 断裂力(N) 皮肤穿刺率(％)
4 CS 2.53±0.23 65.2±1.3
8 GantrezS-97+CS 4.13±0.15 72.4±2.1
10 GantrezS-97+HA 4.92±0.32 87.4±1.6
由表4可知：
仅实验组10的机械性能符合测试要求，故，选择GantrezS-97与HA的组合作为基质材料。
实施例7基质材料中各组分的比例对微针机械性能的影响
在实施例6的基础上，设定基质材料在针体中的质量占比为一定值，仅改变基质材料中GantrezS-97与HA的含量比，来探究GantrezS-97与HA的含量比变化对微针机械性能的影响。
本实施例中，乙脑疫苗脂质体可溶性微针的制备工艺，见实施例1。乙脑疫苗脂质体可溶性微针机械性能的测试方法，见实施例2，测试结果见表5。
表5.微针基质材料比例对可溶性微针机械性能的影响(mean％±SD％，n＝6)
NO. GantrezS-97与HA的含量比 断裂力(N) 皮肤穿刺率(％)
1 3:1 2.62±0.13 68.3±1.1
2 2:1 5.92±0.15 97.5±1.7
3 1:1 4.92±0.32 87.4±1.6
4 1:2 2.81±0.11 57.2±2.1
5 1:3 2.13±0.16 45.2±1.8
从表5可知：
1)当GantrezS-97与HA的含量比为(1:1)～(2:1)时，断裂力和皮肤穿刺率均符合测试要求。
2)当GantrezS-97与HA的含量比为2:1时，微针的机械性能最佳，故作为最优处方。
实施例8乙脑疫苗脂质体与基质材料的含量比对微针机械性能、乙脑疫苗脂质体稳定性的影响
在实施例3～7的基础上，设定基质材料在针体中的质量占比为一定值，仅改变乙脑疫苗脂质体与基质材料的含量比，来探究乙脑疫苗脂质体与基质材料的含量比对微针机械性能、乙脑疫苗脂质体稳定性的影响。
本实施例中，乙脑疫苗脂质体可溶性微针的制备工艺，见实施例1。乙脑疫苗脂质体可溶性微针机械性能和乙脑疫苗脂质体稳定性的测试方法，见实施例2，测试结果见表6。
表6.乙脑疫苗脂质体与基质材料的含量比对微针机械性能、乙脑疫苗脂质体稳定性的影响(mean％±SD％，n＝6)
Figure BDA0002346356330000091
由表6可知：
1)从断裂力和皮肤穿刺率来看，当乙脑疫苗脂质体与基质材料的含量比为(1:2)～(1:3)时，微针的机械性能符合测试要求。
2)从粒径差异率来看，当乙脑疫苗脂质体与基质材料的含量比1:2时，粒径差异率为8.2±0.1％，小于10％，乙脑疫苗脂质体的稳定性符合测试要求。
3)综合考虑微针的机械性能和乙脑疫苗脂质体的稳定性，仅当乙脑疫苗脂质体与基质材料的含量比为1:2时符合要求，达到稳定、有效地递送乙脑疫苗的效果。
综上所述，乙脑疫苗可溶性微针的针体中，各组分及其质量占比的最优处方为：乙脑疫苗脂质体占比为33.3％，GantrezS-97占比为44.5％，HA占比为22.2％。其中，负载乙脑疫苗的脂质体材料由HEPC、胆固醇和DOTAP组成，三者在脂质体材料中的质量占比分别为：HEPC占比为50％，胆固醇占比为30％，DOTAP占比为20％。
实施例9乙脑疫苗脂质体可溶性微针的免疫效果测定
本实施例选择空白可溶性微针(实验组1)、普通的乙脑疫苗(非脂质体形式)可溶性微针(实验组2)和脂质体负载乙脑疫苗的可溶性微针(实验组3，最优处方)这三个实验组，按实施例2的方法测定乙脑疫苗的效价(T值)，判断免疫效果的差异，测试结果见表7。
表7.乙脑疫苗的效价测定(mean±SD，n＝6)
NO. 可溶性微针的种类 效价(T值)
1 乙脑疫苗脂质体+可溶性微针 1.94±0.12
2 乙脑疫苗+可溶性微针 1.49±0.16
3 空白可溶性微针 0
由表7可知：脂质体负载乙脑疫苗的可溶性微针，其效价要高于普通的乙脑疫苗(非脂质体形式)可溶性微针，表明本发明提供的乙脑疫苗脂质体可溶性微针，能够显著增强乙脑疫苗的免疫效果。

Claims (5)

1.一种脂质体结合微针给药的乙脑疫苗，包括针体和背衬，其特征在于，所述的针体由乙脑疫苗脂质体和基质材料组成，其中，所述的基质材料为GantrezS-97与HA的混合，所述的脂质体材料为HEPC、胆固醇和DOTAP的混合；所述的乙脑疫苗脂质体与基质材料的含量比为1:2。
2.根据权利要求1所述的脂质体结合微针给药的乙脑疫苗，其特征在于，所述的基质材料中，GantrezS-97与HA的含量比为(1:1)～(2:1)。
3.根据权利要求2所述的脂质体结合微针给药的乙脑疫苗，其特征在于，所述的基质材料中，GantrezS-97与HA的含量比为2:1。
4.根据权利要求1所述的脂质体结合微针给药的乙脑疫苗，其特征在于，所述的脂质体材料中，各组分及其质量占比为：HEPC占比为50％，胆固醇占比为30％，DOTAP占比为20％。
5.根据权利要求1所述的脂质体结合微针给药的乙脑疫苗，其特征在于，所述的乙脑疫苗可溶性微针的针体中，各组分及其质量占比为：乙脑疫苗脂质体占比为33.3％，GantrezS-97占比为44.5％，HA占比为22.2％。
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