CN113827566A - 一种绿原酸-脂质复合物脂质体及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种绿原酸‑脂质复合物脂质体及其制备方法与用途。本发明的绿原酸‑脂质复合物脂质体，以磷脂、胆固醇和PEG化磷脂的脂质材料为膜材，以绿原酸‑脂质复合物作为中间载体包载绿原酸活性成分，制备平均粒径在120‑750nm的脂质体。本发明的绿原酸‑脂质复合物脂质体，可以增强对巨噬细胞向M2型分化的抑制作用，且可以增加外周血和肿瘤细胞中的白细胞总量、T细胞总量以及CD4+和CD8+比例，增加中央记忆性T细胞和效应记忆性T细胞。有利于提高绿原酸的体内抗肿瘤免疫效果。

Description

一种绿原酸-脂质复合物脂质体及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种绿原酸-脂质复合物脂质体技术，属于医药制备的技术领域。
背景技术
绿原酸又名咖啡鞣酸(Chlorogenic acid，简称CHA)，是广泛存在于金银花和杜仲科植物杜仲的叶、葵花籽、茵陈和蓝盆花等植物中的一种有机酸，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、降糖、降脂、降血压和免疫调节等多种药理作用。绿原酸分子结构中含有最适合酚酶催化的反应底物邻二酚羟基，使得其化学性质极不稳定，受热及见光易氧化。
在绿原酸的多种生理活性中，绿原酸所具有的免疫调节作用使得其在肿瘤免疫治疗方面成为近年来研究热门的天然产物之一。Xue等人[1]研究发现，绿原酸一方面可以通过激活体内STAT1信号通路来抑制肿瘤相关巨噬细胞M2型的极化，另一方面还可以通过抑制体内STAT6信号通路进一步促进M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞的分化，进而增强抗肿瘤免疫效应。但是，受理化性质及药代特征的影响，绿原酸制剂发展受到限制。绿原酸在肠液中易发生降解，且亲水性强不易透过胃肠粘膜，口服生物利用度较低，目前尚无口服给药剂型，临床研究系采用注射用冻干粉针。但由于绿原酸在生理pH 7.4的条件下化学性质不稳定，现有的普通注射剂药物在血液中易发生降解且快速消除，体内循环时间较短，不利于免疫靶向递送，影响绿原酸抗肿瘤免疫效应的发挥。此外，注射用冻干粉针需要每日一次肌肉注射，而治疗周期又长达数月或更长，使得患者的顺应性较低。
采用纳米载体包裹和递送技术对绿原酸进行免疫递送或免疫靶向递送的研究对于提高绿原酸的抗肿瘤免疫效果具有重大的临床意义和重要的学术价值。目前文献多以磷脂和胆固醇为膜材对绿原酸进行包载以制备绿原酸普通脂质体，这些文献仅仅是进行了绿原酸普通脂质体的制备及体外表征，很少有涉及到对绿原酸脂质体的体内相关研究尤其是体内抗肿瘤免疫机制的研究。也有文献[2]以磷脂和胆固醇为膜材，对包载绿原酸的普通脂质体进行了体内药代动力学研究，结果也仅显示，与绿原酸溶液相比，这种普通脂质体提高了绿原酸储存的化学稳定性，动物口服给药后的血药浓度有所升高，但无进一步的体内尤其是体内抗肿瘤免疫机制的深入研究。
对于脂溶性药物而言，由于其亲酯基团易嵌入脂质双分子层，从而易于获得较高的包封率。而水溶性药物很难嵌入脂质双分子层，故包封率普遍较低。由于绿原酸亲水性太强，用脂质体直接对其进行包载很难获得较高的包封率。尽管有文献报道[3,4]，采用磷脂和胆固醇为膜材可以制备得到高包封率(大于70％)的包载绿原酸的普通脂质体。但是，这些文献中所报道的绿原酸脂质体的测定方法采用的均是直接离心法，且所制备的绿原酸脂质体的粒径均在110-230nm。我们的研究发现，处于该粒径范围的脂质体很难采用普通的离心法将脂质体与水相分开，即使离心速率达到了15000rpm。所以采用这种方法均会使离心液中检测到的绿原酸偏小甚至几乎没有，进而使得所测定的包封率远远高于其实际值(不足30％)。也有报道[2]采用微柱离心法进行绿原酸脂质体的包封率的测定，测定的脂质体的包封率为53.08％，我们采用该微柱离心法进行绿原酸脂质体的包封率测定时发现，由于绿原酸的亲水性太强，导致在洗脱过程中，除了脂质体外，大量的游离绿原酸也会被洗脱下来，导致所得的绿原酸包封率远远高于其实际值(不足20％)。还有文献报道[5]采用透析法对其所制备的绿原酸普通脂质体进行包封率测定，测定结果大于70％，我们同样采用该方法进行了绿原酸包封率的测定，研究过程中发现，绿原酸只有在pH小于6.5更甚于小于5.5的环境中才可以稳定存在，而文献中透析介质所用的去离子水中，绿原酸很快就降解，导致透析介质中的绿原酸含量测定值偏小，进而使得所测定的脂质体中的绿原酸的包封率也远远高于其实际值(不足40％)。
综上，现有绿原酸脂质体的制备研究中均未能实现对绿原酸的有效包载。且文献关于绿原酸纳米递送载体的研究报道也较少，关于绿原酸脂质体的报道也仅仅限于体外的相关表征。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供一种以绿原酸-脂质复合超分子复合物为中间载体的绿原酸-脂质复合物系列脂质体(普通、长循环和靶向的)。具体而言，本发明提供了一种绿原酸-脂质复合物脂质体以及这种脂质体的制备方法和用途。
为解决本发明的技术问题，本发明提供如下技术方案：
本发明技术方案的一方面是提供了一种绿原酸-脂质复合物脂质体，其特征在于，所述绿原酸-脂质复合物脂质体含有绿原酸-脂质复合物和脂质体膜材，其中所述脂质体膜材中含有磷脂、胆固醇和PEG化磷脂，脂质体平均粒径在50-1000nm，优选地，平均粒径在120-750nm。
本发明公开的绿原酸-脂质复合物脂质体，其特征在于，膜材中除磷脂和胆固醇外，还含有PEG化磷脂。任选地，膜材中还可加入离子型或非离子型的表面活性剂。
具体而言，本发明公开的绿原酸-脂质复合物脂质体使用含有磷脂、胆固醇和聚乙二醇(PEG)化磷脂(简称PEG化磷脂)的脂质材料为膜材，包载绿原酸活性成分，其中，绿原酸活性成分以绿原酸-脂质复合物作为中间载体，制备得到平均粒径为50-1000nm的脂质体，优选120-750nm。
优选地，所述绿原酸-脂质复合物与脂质体膜材的质量比为1:1-1:100，优选1:3-1:50，更优选1:5-1:20。
所述脂质体膜材中的磷脂为大豆磷脂、蛋黄磷脂、磷脂酰甘油酯、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二肉蔻酰磷脂酰胆碱、神经酰胺中的至少一种；优选地，为大豆磷脂和蛋黄磷脂中的一种或一种以上的混合。
所述脂质体膜材中的磷脂选自天然磷脂和合成磷脂中的一种或它们的混合物，优选天然磷脂。
本发明中，所述PEG化磷脂，由磷脂、PEG和活性基团组成，所述PEG化磷脂中的磷脂选自二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆寇酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆寇酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)中的一种，优选地为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，更优选为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)；PEG分子量选自1000－10000Da,优选地为2000－8000Da，更优选为2000－5000Da；活性基团选自－羟基(OH)、-马来酰亚胺基团(MAL)、-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、-氨基(NH2)、-羧基(COOH)、-巯基(SH)、-醛基(CHO)、-叶酸(Folate)、－甘露糖(Man)、-(天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸，NGR)短肽-(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，RGD)短肽、－单克隆抗体和－多肽，优选地为－羟基(OH)、-叶酸(Folate)、－甘露糖(man)、－半乳糖凝集素(Gal)、-(天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸，NGR)短肽-(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，RGD)短肽、－单克隆抗体和－多肽，更优选地为－羟基(OH)、－甘露糖(Man)和－半乳糖凝集素(Gal)。
本发明中，以脂质体膜材的总重量为100计，磷脂所占重量百分比为30％～93％，优选地为50％～70％；胆固醇所占重量百分比为4％～30％，优选地为10％～30％；PEG化磷脂所占重量百分比为0％～50％,优选地为5％～20％。
优选地，所述绿原酸-脂质复合物中，绿原酸与脂质材料的摩尔比为1:0.25～1:8，优选1:0.25～1:4；绿原酸与脂质材料的复合率为80％以上，优选地，为99％以上。
优选地，所述绿原酸-脂质复合物中的脂质材料选自磷脂、胆固醇和胆酸盐类，优选地为磷脂类。
本发明技术方案的第二方面是提供了一种绿原酸-脂质复合物脂质体的制备方法，所述方法选自薄膜分散法、二次乳化法、乙醇注入法或逆向蒸发法。
所述薄膜分散法的操作步骤如下：
1)脂材溶液配制：称取磷脂、胆固醇和PEG化磷脂，分别加入有机溶剂溶解制成5-40mg/ml脂材溶液，备用；
其中的有机溶剂，选自二氯甲烷、氯仿、乙醚、四氢呋喃、丙酮、甲醇和无水乙醇中的一种或它们的混合物；
2)药物溶液配制：精密称取绿原酸-脂质复合物，加入氯仿，溶解制成绿原酸浓度为2-30mg/ml的药物溶液，其中优选16mg/ml，备用；
3)脂质薄膜：按规定的质量比，量取各种脂材和药物溶液，置圆底烧瓶中，混合，35℃－60℃条件下减压旋蒸除去有机溶剂，成膜；所述的质量比如本发明第一方面所述；
4)水化：取预热至35℃－60℃的PBS缓冲液，加入至脂质薄膜中，水化30-60min，必要时水化液经超声探头或高压均质机处理，获得符合粒径要求的绿原酸-脂质复合物脂质体悬液。
所述二次乳化法的操作步骤如下：
1)脂材溶液配制：称取磷脂、胆固醇和PEG化磷脂，加入有机溶剂溶解制成脂材浓度在5-40mg/ml的溶液，有机溶剂选自二氯甲烷、氯仿、乙醚、四氢呋喃、丙酮、甲醇和无水乙醇中的一种或它们的混合物；
2)药物溶液配制：精密称取绿原酸-脂质复合物，加入氯仿，溶解制成绿原酸浓度为2-30mg/ml的药物溶液，其中优选16mg/ml，备用；
3)乳化和挥除溶剂：在高速搅拌下，将水或PBS缓冲液缓慢滴加到脂质材料和药物溶液中，高速搅拌1h后，将等体积的PBS缓冲液缓慢滴加到上述液体中，高速搅拌1h后，再将所得到的乳液于通风橱中搅拌挥发除去有机溶剂，即得绿原酸-脂质复合物脂质体的混悬液。
所述乙醇注入法的操作步骤如下：
称取磷脂、胆固醇、PEG化磷脂和绿原酸-脂质复合物，分别加入无水乙醇溶解制成5-40mg/ml的溶液，绿原酸-脂质复合物溶于无水乙醇形成绿原酸浓度为2-30mg/ml的药物溶液，其中优选16mg/ml，按规定的质量比量取各种溶液，置圆底烧瓶中搅拌混合后缓慢均匀注入到PBS缓冲液中(pH5.5)，PBS缓冲液温度控制在35-55℃，保温并磁力搅拌1h使其充分水化，于35-55℃旋转蒸发除去溶剂，随后冰浴超声或经高压均质机处理，获得粒径符合要求的绿原酸-脂质复合物脂质体悬液。所述的按规定的质量比如本发明第一方面所述。
所述逆向蒸发法的操作步骤如下：
称取磷脂、胆固醇和PEG化磷脂分别加入氯仿溶解制成5-40mg/ml浓度的溶液，绿原酸-脂质复合物溶于丙酮形成绿原酸浓度为2-30mg/ml的药物溶液，其中优选16mg/ml。按规定的质量比量取各种溶液，置圆底烧瓶中搅拌混合，35-55℃旋转蒸发除去有机溶剂，形成均匀薄膜；再加入氯仿-丙酮混合溶剂和PBS缓冲液(pH5.5)，搅拌均匀后超声形成稳定的W/O相，35-55℃旋转蒸发至胶凝状，再加入一定体积的PBS缓冲液(pH 5.5)，35℃水化1h，得到绿原酸-脂质复合物脂质体悬液。所述的按规定的质量比如本发明第一方面所述。
进一步地，本发明的制备方法还包括向制得的绿原酸-脂质复合物脂质体悬液加入冻干支撑剂，通过冷冻干燥工艺制成冻干粉针。
所述冻干支撑剂为甘露醇、海藻糖、萄萄糖、蔗糖、乳糖、壳聚糖中的一种或它们的混合物。
本发明技术方案的第三方面是提供了所述绿原酸-脂质复合物脂质体在制备治疗免疫系统疾病或肿瘤免疫疾病的药物中的用途。
有益技术效果
本发明采用激光散射粒度仪测定绿原酸-脂质复合物脂质体的粒径：移液枪精密量取绿原酸-脂质复合物脂质体悬液或者冻干脂质体的复溶液0.5ml加入到5mL纯净水中轻微振荡混匀后，采用激光散射粒度仪测定其粒径。
超滤法利用离心产生的压力，小于截留分子量的药物透过膜，而大于膜孔的脂质体由于筛分作用被截留，从而使脂质体与药物达到有效分离,该方法耗时短、简单易行且可以极大提高脂质体药物包封率测定的准确性,因此选用此法作为测定绿原酸-脂质复合物脂质体的包封率：采用截留分子量为100K的超滤离心管，经超速离心后，绿原酸-脂质复合物脂质体被截留于超滤膜上，未包封的游离绿原酸被分离至超滤液中，分别测定脂质体中的药物总量和超滤液中的游离药物总量，两者之差即为被包封药物的量，由此计算本发明的绿原酸-脂质复合物脂质体中绿原酸的药物包封率大于50％。
本发明采用皮下种植小鼠神经胶质瘤细胞株G422的ICR小鼠进行绿原酸-脂质复合物脂质体的体内抗肿瘤免疫机理探讨研究。以替莫唑胺(Temozolomide，TMZ)为阳性对照药，分别考察绿原酸-脂质复合物脂质体每日给药及隔日给药的体内抗肿瘤免疫机理，通过对脾指数和胸腺指数考察以及分别对血液和肿瘤组织的T细胞变化和巨噬细胞总量及M1和M2表达水平等检测，探讨绿原酸-脂质复合物脂质体用于肿瘤免疫治疗的作用及其免疫机理。结果表明，与绿原酸溶液组相比，绿原酸-脂质复合物脂质体可以增强对巨噬细胞向M2型分化的抑制作用。且可以增加外周血和肿瘤细胞中的白细胞总量、T细胞总量以及CD4+和CD8+比例，增加中央记忆性T细胞和效应记忆性T细胞。
综上所述，本发明所制备的绿原酸-脂质复合物脂质体中绿原酸的包封率均大于50％，可实现对绿原酸的有效包载，并且体内抗肿瘤免疫实验结果显示：本发明的绿原酸-脂质复合物脂质体能够增强对巨噬细胞向M2型分化的抑制作用，增加外周血和肿瘤细胞中的白细胞总量、T细胞总量以及CD4+和CD8+比例，同时增加中央记忆性T细胞和效应记忆性T细胞的比例。
附图说明
图1绿原酸-脂质复合物脂质体处理荷瘤小鼠的脾脏指数变化图，其中替莫唑胺为阳性对照药组。
图2绿原酸-脂质复合物脂质体处理荷瘤小鼠的胸腺指数变化图，其中替莫唑胺为阳性对照药组。
图3绿原酸-脂质复合物脂质体处理荷瘤小鼠的外周血中的T细胞，其中替莫唑胺为阳性对照药组。
图4绿原酸-脂质复合物脂质体处理荷瘤小鼠的外周血中的巨噬细胞，其中替莫唑胺为阳性对照药组。
图5绿原酸-脂质复合物脂质体处理荷瘤小鼠的肿瘤组织中的T细胞，其中替莫唑胺为阳性对照药组。
图6绿原酸-脂质复合物脂质体处理荷瘤小鼠的肿瘤组织中的巨噬细胞，其中替莫唑胺为阳性对照药组。
具体实施方式
为了便于理解，以下将通过具体的实施例、试验例及附图，对本发明的绿原酸-脂质复合物脂质体进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。
实施例1：绿原酸-脂质复合物CHAPC的制备与检测
制备方法：
以大豆卵磷脂为脂质材料，将绿原酸和大豆卵磷脂按照下表的药脂比进行投料，一同加入至1L的圆底烧瓶中，以无水乙醇为溶剂，使药物浓度控制在60mg/ml,待绿原酸和大豆卵磷脂全部溶解后,室温放置15min，随后于旋转蒸发仪100rpm、40℃旋蒸减压干燥除去无水乙醇，待乙醇蒸干后，于室温继续100rpm减压干燥1h将乙醇除干净。
取制备的系列复合物粉末，照如下方法测定复合率，结果见表1。
(1)对照品溶液：称取绿原酸标准品25mg至25ml容量瓶中，用乙醇溶液定容，精密量取1ml至50ml容量瓶中，用30％乙醇水定容，作为对照品溶液；
(2)W总：称取80mg绿原酸复合物至25ml容量瓶中，用无水乙醇定容摇匀，精密量取1ml至50ml容量瓶中，用30％乙醇水溶液定容摇匀，作为供试品W总溶液；
(3)W复合：称取80mg绿原酸复合物至25ml容量瓶中，用氯仿溶解后定容，用0.22um滤膜过滤，精密量取续滤液1ml，氮吹挥干溶剂(氯仿)后，用30％乙醇水准确稀释至50mL，作为供试品W复合溶液。
在制得以上样品的基础上，采用以下HPLC条件进行测定。
流动相：0.4％磷酸：乙腈＝82:18
检测波长：328nm
流速：1.0mL/min
柱温：25℃
进样量：10uL
Stop Time：8min
表1无水乙醇为溶剂，不同药脂比复合物(CHAPC)及复合率
Figure BDA0002554758450000101
结果表明，药脂比(摩尔比)为1:0.25至1:4，制得的复合物均复合完全，复合率在99％以上。
实施例2：薄膜分散法制备不同脂材比的绿原酸-脂质复合物脂质体
固定绿原酸-脂质复合物(CHA-PC)与膜材的质量比为1:10，按下表方法制备不同脂材比的脂质体，并采用激光粒度仪和超滤法分别测定平均粒径和包封率。
表2不同脂材比的绿原酸-脂质复合物脂质体处方组成及其粒径结果
Figure BDA0002554758450000102
Figure BDA0002554758450000111
制备方法：
(1)脂材溶液配制：称取天然磷脂-大豆磷脂、胆固醇和PEG化磷脂DSPE-PEG2000-OH，分别加入氯仿溶解制成浓度20mg/ml、10mg/ml和34mg/mL的溶液。
(2)药物溶液配制：精密称取绿原酸-脂质复合物(CHA-PC)，加入氯仿溶解制成绿原酸浓度为16mg/ml的溶液。
(3)脂质铺膜：按规定的质量比例，按照表2的比例量取各种脂材溶液，并加入药物溶液，使CHA-PC与膜材的质量比为1:10，置圆底烧瓶中，混合，在35℃条件下减压旋蒸发除去有机溶剂，成膜。
(4)水化：取12ml预热至35℃的PBS缓冲液(pH 5.5)，加入至上述的脂质薄膜中，水化60min，水化液经超声探头或高压均质机处理，获得粒径和包封率符合要求的绿原酸-脂质复合物脂质体悬液。
实施例3:薄膜分散法制备不同药脂比的绿原酸-脂质复合物脂质体
固定脂材比为大豆磷脂：胆固醇：DSPE-PEG2000-OH＝65:30:5，制备不同CHA-PC与膜材的质量比的脂质体，并采用激光粒度仪和超滤法分别测定平均粒径和包封率。
制备方法：
(1)脂材溶液配制：称取大豆磷脂、胆固醇和DSPE-PEG2000-OH，分别加入氯仿溶解制成浓度20mg/ml、10mg/ml和34mg/mL的溶液。
(2)药物溶液配制：精密称取CHA-PC，加入氯仿溶解制成绿原酸浓度为16mg/ml的溶液。
(3)脂质铺膜：按规定的质量比例，量取各种脂材溶液使磷脂重量百分比为65％、胆固醇重量百分比为30％、DSPE-PEG2000-OH重量比为5％，绿原酸与膜材的质量比按表3进行量取，置圆底烧瓶中，混合，在35℃条件下减压旋蒸除去有机溶剂，成膜。
(4)水化：取12ml预热至35℃的PBS缓冲液(pH5.5)，加入至上述的脂质薄膜中，水化60min，水化液经超声探头或高压均质机处理，获得粒径和包封率均符合要求的绿原酸-脂质复合物脂质体悬液。
表3不同CHA-PC与膜材的质量比的绿原酸-脂质复合物脂质体处方组成及粒径结果
Figure BDA0002554758450000121
实施例4:改变大豆磷脂材料为天然磷脂-蛋黄卵磷脂，薄膜分散法制备不同脂材比的绿原酸-脂质复合物脂质体
以薄膜分散法制备，固定CHA-PC与膜材的质量比为1：10，改变天然磷脂-大豆磷脂材料为天然磷脂-蛋黄卵磷脂，按下表方法制备不同脂材比的脂质体，并采用激光粒度仪和超滤法分别测定平均粒径和包封率。
(1)脂材溶液配制：称取蛋黄卵磷脂、胆固醇和DSPE-PEG2000-OH，分别加入氯仿溶解制成浓度20mg/ml、10mg/ml和34mg/mL的溶液。
(2)药物溶液配制：精密称取CHA-PC，加入氯仿溶解制成绿原酸浓度为16mg/ml的溶液。
(3)脂质铺膜：按规定的质量比例，按照表4的比例量取各种脂材溶液，并加入药物溶液，使CHA-PC与膜材的质量比为1:10，置圆底烧瓶中，混合，在35℃条件下减压旋蒸除去有机溶剂，成膜。
(4)水化：取12ml预热至35℃的PBS缓冲液，加入至上述的脂质薄膜中，水化60min，水化液经超声探头或高压均质机处理，获得粒径和包封率符合要求的绿原酸-脂质复合物脂质体悬液。
表4不同磷脂比例绿原酸长循环脂质体处方组成及粒径结果
Figure BDA0002554758450000131
实施例5:薄膜分散法制备不同PEG化磷脂的绿原酸-脂质复合物脂质体
以薄膜分散法制备，固定脂材比为大豆磷脂：胆固醇：PEG化磷脂＝65:30:5，CHA-PC与膜材的质量比＝1：10，制备不同PEG化磷脂的绿原酸-脂质复合物脂质体，并采用激光粒度仪和超滤法分别测定平均粒径和包封率。
(1)脂材溶液配制：称取大豆磷脂、胆固醇和PEG化磷脂，分别加入氯仿溶解制成浓度20mg/ml、10mg/ml和34mg/mL的溶液。
(2)药物溶液配制：精密称取CHA-PC，加入氯仿溶解制成绿原酸浓度为16mg/ml的溶液。
(3)脂质铺膜：按规定的质量比例，量取各种脂材溶液使磷脂重量百分比为60％、胆固醇重量百分比为30％、各种PEG化磷脂(表5)重量比为5％，按照CHA-PC与膜材的质量比为1:10进行量取，置圆底烧瓶中，混合，在35℃条件下减压旋蒸除去有机溶剂，成膜。
(4)水化：取12ml预热至35℃的PBS缓冲液(pH 5.5)，加入至上述的脂质薄膜中，水化60min，水化液经超声探头或高压均质机处理，获得粒径和包封率符合要求的绿原酸-脂质复合物脂质体悬液。
表5不同PEG化磷脂的绿原酸-脂质复合物脂质体处方组成、粒径及包封率结果
Figure BDA0002554758450000141
实施例6:二次乳化法制备绿原酸-脂质复合物脂质体
按照实施例2中样品2-4的脂质体处方组成，固定脂材比为大豆磷脂：胆固醇：DSPE-PEG2000-OH＝65:30:5，CHA-PC与膜材的质量比为1:10，二次乳化法制备脂质体，并采用激光粒度仪和超滤法分别测定平均粒径和包封率。
(1)脂材溶液配制：取大豆磷脂、胆固醇和DSPE-PEG2000-OH，分别加入氯仿溶解制成浓度为20mg/ml、10mg/ml和34mg/mL的溶液。
(2)药物溶液：精密称取一定质量的CHA-PC溶于氯仿溶液中，制得绿原酸浓度为16mg/ml。
(3)乳化和挥除溶剂：量取3种溶液，使磷脂重量百分比为60％、胆固醇重量百分比为30％、DSPE-PEG2000-OH重量比为5％，混合均匀，加入药物溶液，使得CHA-PC与膜材的质量比1:10。量取适量水溶液，在高速搅拌下缓慢滴加到溶解磷脂材料和CHA-PC的氯仿溶液中，高速搅拌1h后，将等体积的PBS缓冲液缓慢滴加到上述液体中，高速搅拌1h后，再将所得到的乳液于通风橱中搅拌挥发除去有机溶剂，即得绿原酸-脂质复合物脂质体的混悬液。按照发明内容中脂质体粒径和包封率测定方法，所得脂质体的粒径和包封率分别为220nm和53％。
实施例7:乙醇注入法制备绿原酸-脂质复合物脂质体
按照实施例2中样品2-4的脂质体处方组成，固定脂材比为大豆磷脂：胆固醇：DSPE-PEG2000-OH＝65:30:5，绿原酸-脂质复合物与膜材的质量比为1:10，乙醇注入法制备脂质体，并采用激光粒度仪和超滤法分别测定平均粒径和包封率。
称取大豆磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000-OH和CHA-PC，分别加入无水乙醇溶解制成浓度20mg/ml、10mg/ml、34mg/mL和16mg/ml的溶液。按规定的质量比例，量取各种脂材溶液和药物溶液，使磷脂重量百分比为60％、胆固醇重量百分比为30％、DSPE-PEG2000-OH重量比为5％，CHA-PC与膜材的质量比为1:10，置圆底烧瓶中搅拌混合后缓慢均匀注入到PBS缓冲液中(pH5.5)，PBS缓冲液温度控制在55℃，保温并磁力搅拌1h使其充分水化，于55℃旋转蒸发除去除溶剂，随后冰浴超声或经过高压均质机处理，获得粒径符合要求的绿原酸-脂质复合物脂质体悬液。按照发明内容中脂质体粒径和包封率测定方法，所得脂质体的粒径和包封率分别为155nm和59％。
实施例8:逆向蒸发法制备脂质体
按照实施例2中样品2-4的脂质体处方组成，固定脂材比为大豆磷脂：胆固醇：DSPE-PEG2000-OH＝60:30:5，CHA-PC与膜材的质量比为1:10，逆向蒸发法制备脂质体，并采用激光粒度仪和超滤法分别测定平均粒径和包封率。
取大豆磷脂、胆固醇和DSPE-PEG2000-OH，分别加入氯仿溶解制成浓度为20mg/ml、10mg/ml和34mg/mL的溶液。最取3种溶液，使磷脂重量百分比为60％、胆固醇重量百分比为30％、DSPE-PEG2000-OH重量比为5％，混合均匀。另配制CHA-PC的丙酮溶液，使得绿原酸浓度为16mg/ml，按照CHA-PC与膜材的质量比为1:10，量取适量CHA-PC溶液，与磷脂溶液混合后，35℃旋转蒸发除去有机溶剂，形成均匀薄膜。再加入氯仿-丙酮混合溶剂和PBS缓冲液(pH5.5)，搅拌均匀后超声形成稳定的W/O相，35℃旋转蒸发至胶凝状，再加入一定体积的PBS缓冲液(pH 5.5)，35℃水化1h，得到绿原酸-脂质复合物脂质体。按照发明内容中脂质体粒径和包封率测定方法，所得脂质体的粒径和包封率分别为158nm和57％。
实施例9:
取实施例2中的样品2-4和实施例6-实施例8制备的绿原酸-脂质复合物脂质体悬液，按照下表6加入冻干支撑剂、按冻干程序“预冻(-25℃,0.5h)——(-25℃,1.5h)——(-35℃,2h)；主干燥(-35℃,0.3h)——(-30℃,2.8h)——(-20℃,13h)——(-10℃,2h)；再干燥(0℃,3h)——(25℃,3h)——(25℃,5h)”进行冷冻干燥，得绿原酸-脂质复合物脂质体的冻干粉，并按照发明内容中脂质体粒径和包封率测定方法，分别采用激光粒度仪和超滤法进行粒径和包封率的测定。
表6冻干剂的种类和用量
Figure BDA0002554758450000171
试验例1：绿原酸-脂质复合物脂质体的体内抗肿瘤免疫机理研究
G422皮下移植瘤小鼠模型构建：无菌条件下从ICR荷瘤小鼠中获取肿瘤组织，匀浆，用生理盐水稀释后计数制成浓度为1×107cells/mL肿瘤细胞悬液，于小鼠右侧腋下接种0.2mL/只。接种后次日动物随机分组，每组7只，称重后分别给予绿原酸普通注射剂溶液、样品2-1、2-4和5-3，给药剂量为20mg/kg。其中以替莫唑胺(TMZ)作为阳性对照药。给药方式按照每天给药及隔日给药两种方式进行，按优化剂量，通过对血液及肿瘤组织的T细胞变化、血液及肿瘤组织中的巨噬细胞总量及M1和M2表达水平等的检测，探讨构建与修饰的绿原酸-脂质复合物脂质体用于肿瘤免疫治疗的作用及其机理。以接种肿瘤当天记为day 0，给药第一天记为day 1，整个给药过程持续约14天。
脾指数和胸腺指数：给药结束后，处死各给药组动物后剥离小鼠脾和胸腺，称重，计算脾和胸腺指数，结果分别如附图1和附图2所示。图中结果表明，与阳性对照药TMZ相比，绿原酸普通注射剂及不同绿原酸-脂质复合物脂质体(样品2-1、2-4和5-3)的脾指数均有增大趋势。与绿原酸普通注射剂相比，样品2-1、2-4和5-3处理组的胸腺指数均有增大趋势，但三者之间无明显差异。
外周血中的T细胞和巨噬细胞测定：给药结束后，取外周血，按如下方法处理：取300μL外周血，加入3倍体积红细胞裂解液，冰上放置15min，其间轻轻涡旋混匀2次，4℃，1700rpm离心10min收集细胞。向细胞沉淀中加入2倍体积红细胞裂解液重悬，4℃，1700rpm离心5min收集细胞。向细胞沉淀中加入100μL PBS重悬。选择T细胞及巨噬细胞对应的流式抗体，孵育45min，离心水洗，加0.2％多聚甲醛固定，流式细胞仪测定，外周血中的T细胞变化和巨噬细胞变化的结果分别如附图3和附图4所示。
1)T细胞抗体标记分型
CD45+代表总白细胞；
CD45+CD3+代表T细胞；
CD45+CD3+CD4+代表辅助性T细胞；
CD45+CD3+CD8+代表杀伤性T细胞；
CD45+CD3+CD44+CD62L+代表中央记忆T细胞；
CD45+CD3+CD44+CD62L-代表效应记忆T细胞。
2)巨噬细胞抗体标记分型
CD45+F4/80+代表总巨噬细胞；
CD45+F4/80+CD11c+代表M1型巨噬细胞；
CD45+F4/80+CD206+代表M2型巨噬细胞。
外周血T细胞测定结果表明：1)关于白细胞总量，与绿原酸普通注射剂相比，样品2-1与其大致相当，但样品2-4和5-3均有增加作用，且高于TMZ组；2)关于T细胞总量，与模型组相比，阳性药TMZ明显降低，而绿原酸普通注射剂以及样品2-1与模型组相当，而2-4和5-3有增加作用，以样品2-4最为明显；3)关于T细胞中的CD4+和CD8+比例，与模型组相比，阳性药TMZ明显降低，绿原酸普通注射剂及样品2-1与模型组相当，而样品2-4和5-3均有增加作用，以样品2-4最为明显；4)关于T细胞中的中央记忆型T细胞，与模型组相比，阳性药TMZ及绿原酸普通注射剂组均有升高作用，但样品2-1的每日一次给药有降低趋势，而样品2-4的每日给药组及5-3的隔日给药组升高幅度最大，且优于TMZ及绿原酸普通注射剂；5)关于T细胞中的效应记忆型T细胞，与模型组相比，阳性药TMZ明显降低，绿原酸普通注射剂组也明显降低，但三个样品组有升高趋势，其中以样品2-4最优。
外周血巨噬细胞测定结果表明，与模型组相比，阳性药TMZ及绿原酸普通注射剂均无明显影响。但与绿原酸普通注射剂相比，三个绿原酸-脂质复合物脂质体样品均有使外周血中巨噬细胞总量降低的趋势，同时使M1和M2均略有升高，但两者比例无明显变化。总体而言，绿原酸普通注射剂及三个脂质体样品对外周血巨噬细胞无明显影响。
肿瘤组织中的T细胞和巨噬细胞测定：给药结束后，取肿瘤组织，按如下方法处理：肿瘤采用网搓法处理，将肿瘤置于干净的网筛内，剪碎，架于六孔板板孔上，用注射器柄尾碾碎组织，再用1mL的PBS清洗筛网，收集滤液于EP管中(冰上操作)。对收集到的单细胞悬液进行裂解红细胞处理，1倍体积单细胞悬液加入3倍体积红细胞裂解液，冰上放置15min，其间轻轻涡旋混匀2次，4℃，1700rpm离心10min收集细胞。向细胞沉淀中加入100μL的PBS重悬。按上述的抗体标记分型，加流式抗体孵育45min，离心水洗，加0.2％多聚甲醛固定，流式细胞仪测定。肿瘤组织中的T细胞变化和巨噬细胞变化的结果分别如附图5和附图6所示。
肿瘤组织中的T细胞测定结果表明：1)关于白细胞总量，与模型组相比，阳性药TMZ、绿原酸普通注射剂及三个脂质体样品均无明显影响；2)关于T细胞总量，与模型组相比，阳性药TMZ有增加趋势，但绿原酸普通注射剂有降低趋势，三个脂质体样品总体上高于绿原酸普通注射剂；3)关于T细胞中的CD4+比例，与模型组和阳性药TMZ相比，绿原酸普通注射剂有降低趋势，而三个脂质体组均高于绿原酸普通注射剂；T细胞中的CD8+比例，模型组、阳性药TMZ及绿原酸普通注射剂大致相当，而三个绿原酸-脂质复合物脂质体组则表现出增加CD8+比例的作用；4)关于T细胞中的中央记忆型T细胞，与绿原酸普通注射剂组相比，三个脂质体有升高趋势，其中以样品2-1和5-3的隔日给药相对更高；5)关于T细胞中的效应记忆型T细胞，与模型组相比，阳性药TMZ明显降低，绿原酸普通注射剂及三个脂质体样品均有升高趋势。其中样品2-1及5-3优于绿原酸普通注射剂，而样品2-4与绿原酸普通注射剂相当。
肿瘤组织中巨噬细胞测定结果表明，与阳性药TMZ相比，绿原酸普通注射剂和三个绿原酸-脂质复合物脂质体样品均有抑制M2型巨噬细胞表达的作用，其中以样品2-4隔日给药和样品5-3每日给药更为明显。
综上，与绿原酸普通注射剂相比，绿原酸-脂质复合物脂质体可以增强对巨噬细胞向M2型分化的抑制作用。此外，样品2-4和5-3增加了外周血的白细胞总量、T细胞总量以及CD4+比例和CD8+比例，使中央记忆T细胞有所升高，以2-4表现更优。而样品2-1和样品5-3则表现出更好的上调肿瘤组织中的CD4+比例和CD8+比例、增加中央记忆T细胞和效应记忆T细胞的作用。
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Claims (20)

1.一种绿原酸-脂质复合物脂质体，其特征在于，所述绿原酸-脂质复合物脂质体含有绿原酸-脂质复合物和脂质体膜材，其中所述脂质体膜材中含有磷脂、胆固醇和PEG化磷脂，脂质体平均粒径在50-1000nm，优选地，平均粒径在120-750nm。
2.根据权利要求1所述的绿原酸-脂质复合物脂质体，其特征在于，所述绿原酸-脂质复合物与脂质体膜材的质量比为1:1-1:100，优选1:3-1:50，更优选1:5-1:20。
3.根据权利要求1或2任一项所述的绿原酸-脂质复合物脂质体，其特征在于，所述脂质体膜材中的磷脂为大豆磷脂、蛋黄磷脂、磷脂酰甘油酯、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二肉蔻酰磷脂酰胆碱、神经酰胺中的至少一种；优选地，为大豆磷脂和蛋黄磷脂中的一种或一种以上的混合。
4.根据权利要求1－2任一项所述的绿原酸-脂质复合物脂质体，其特征在于，所述脂质体膜材中的磷脂选自天然磷脂和合成磷脂中的一种或它们的混合物，优选天然磷脂。
5.根据权利要求1－2任一项所述的绿原酸-脂质复合物脂质体，其特征在于，所述脂质体膜材中的PEG化磷脂由磷脂、PEG和活性基团组成，所述PEG化磷脂中的磷脂选自二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆寇酰磷脂酰胆碱、二肉豆寇酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰胆碱和二油酰磷脂酰乙醇胺中的一种；PEG的分子量为1000－10000Da；活性基团选自－羟基、-马来酰亚胺基团、-N-羟基琥珀酰亚胺、-氨基、-羧基、-巯基、-醛基、-叶酸、－甘露糖、－半乳糖凝集素、-(天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸)短肽、-(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)短肽、－单克隆抗体或－多肽。
6.根据权利要求5所述的绿原酸-脂质复合物脂质体，其特征在于，所述PEG化磷脂中的磷脂选自二硬脂酰磷脂酰乙醇胺；PEG的分子量为2000－8000Da；活性基团选自－羟基、-叶酸、－甘露糖、－半乳糖凝集素、-(天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸)短肽或-(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)短肽。
7.根据权利要求6所述的绿原酸-脂质复合物脂质体，其特征在于，所述PEG化磷脂中的磷脂选自二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，PEG的分子量为2000－5000Da,活性基团选自－羟基、－甘露糖或－半乳糖凝集素。
8.根据权利要求1所述的绿原酸-脂质复合物脂质体，其特征在于，在所述脂质体膜材中，磷脂所占重量百分比为30％～93％，胆固醇所占重量百分比为4％～30％，PEG化磷脂所占重量百分比为
Figure FDA0002554758440000021
9.根据权利要求8所述的绿原酸-脂质复合物脂质体，其特征在于，所述脂质体膜材中，磷脂所占重量百分比为50％～70％，胆固醇所占重量百分比为10％～30％，PEG化磷脂所占重量百分比为
Figure FDA0002554758440000022
10.根据权利要求1－2任一项所述的绿原酸-脂质复合物脂质体，其特征在于，所述绿原酸-脂质复合物中，绿原酸与脂质材料的摩尔比为1:0.25～1:8，优选1:0.25～1:4。
11.根据权利要求1－2任一项所述的绿原酸-脂质复合物脂质体，其特征在于，所述的绿原酸-脂质复合物中，绿原酸与脂质材料的复合率为80％以上，优选地，为99％以上。
12.根据权利要求1-2或10-11任一项所述的绿原酸-脂质复合物脂质体，其特征在于，所述绿原酸-脂质复合物中的脂质材料选自磷脂、胆固醇和胆酸盐类，优选地为磷脂类。
13.权利要求1-12任一项所述的绿原酸-脂质复合物脂质体的制备方法，其特征在于，所述制备方法选自薄膜分散法、二次乳化法、乙醇注入法或逆向蒸发法。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其中薄膜分散法的操作方法如下：
1)脂材溶液配制：称取磷脂、胆固醇和PEG化磷脂，分别加入有机溶剂溶解制成5-40mg/ml脂材溶液，备用；
其中的有机溶剂，选自二氯甲烷、氯仿、乙醚、四氢呋喃、丙酮、甲醇和无水乙醇中的一种或它们的混合物；
2)药物溶液配制：精密称取绿原酸-脂质复合物，加入氯仿，溶解制成绿原酸浓度为2-30mg/ml的药物溶液，其中优选16mg/ml，备用；
3)脂质薄膜：按规定的质量比，量取各种脂材和药物溶液，置圆底烧瓶中，混合，35℃－60℃条件下减压旋蒸除去有机溶剂，成膜；
4)水化：取预热至35℃－60℃的PBS缓冲液，加入至脂质薄膜中，水化30-60min，必要时水化液经超声探头或高压均质机处理，获得符合粒径要求的绿原酸-脂质复合物脂质体悬液。
15.根据权利要求13所述的制备方法，其中二次乳化法的操作方法如下：
1)脂材溶液配制：称取磷脂、胆固醇和PEG化磷脂，加入有机溶剂溶解制成脂材浓度在5-40mg/ml的溶液，有机溶剂选自二氯甲烷、氯仿、乙醚、四氢呋喃、丙酮、甲醇和无水乙醇中的一种或它们的混合物；
2)药物溶液配制：精密称取绿原酸-脂质复合物，加入氯仿，溶解制成绿原酸浓度为2-30mg/ml的药物溶液，其中优选16mg/ml，备用；
3)乳化和挥除溶剂：在高速搅拌下，将水或PBS缓冲液缓慢滴加到脂质材料和药物溶液中，高速搅拌1h后，将等体积的PBS缓冲液缓慢滴加到上述液体中，高速搅拌1h后，再将所得到的乳液于通风橱中搅拌挥发除去有机溶剂，即得绿原酸-脂质复合物脂质体的混悬液。
16.根据权利要求13所述的制备方法，其中乙醇注入法的操作方法如下：称取磷脂、胆固醇和PEG化磷脂，分别加入无水乙醇溶解制成5-40mg/ml的溶液，绿原酸-脂质复合物溶于无水乙醇形成绿原酸浓度为2-30mg/ml的药物溶液，其中优选16mg/ml(，按规定的质量比量取各种溶液，置圆底烧瓶中搅拌混合后缓慢均匀注入到pH5.5的PBS缓冲液中，PBS缓冲液温度控制在35-55℃，保温并磁力搅拌1h使其充分水化，于35-55℃旋转蒸发除去溶剂，随后冰浴超声或经高压均质机处理，获得粒径符合要求的绿原酸-脂质复合物脂质体悬液。
17.根据权利要求13所述的绿原酸-脂质复合物脂质体的制备方法为逆向蒸发法，操作方法如下：称取磷脂、胆固醇和PEG化磷脂分别加入氯仿溶解制成5-40mg/ml浓度的溶液，绿原酸-脂质复合物溶于丙酮形成绿原酸浓度为2-30mg/ml的药物溶液，其中优选16mg/ml；按规定的质量比量取各种溶液，置圆底烧瓶中搅拌混合，35-55℃旋转蒸发除去有机溶剂，形成均匀薄膜；再加入氯仿-丙酮混合溶剂和pH5.5的PBS缓冲液，搅拌均匀后超声形成稳定的W/O相，35-55℃旋转蒸发至胶凝状，再加入一定体积的pH 5.5的PBS缓冲液，35℃水化1h，得到绿原酸-脂质复合物脂质体悬液。
18.根据权利要求13-17任一项所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括向制得的绿原酸-脂质复合物脂质体悬液加入冻干支撑剂，通过冷冻干燥工艺制成冻干粉针。
19.根据权利要求18所述的制备方法，其特征在于，所述冻干支撑剂为甘露醇、海藻糖、萄萄糖、蔗糖、乳糖、壳聚糖中的一种或它们的混合物。
20.权利要求1－12任一项所述的绿原酸-脂质复合物脂质体在制备治疗免疫系统疾病或肿瘤免疫疾病的药物中的用途。
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