CN102481360B - 包含聚γ谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒的佐剂组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒的佐剂组合物和包含该佐剂组合物的疫苗组合物，更具体地，本发明涉及包含通过在壳聚糖和安全性有保证的聚γ-谷氨酸之间进行离子键合而制备的纳米颗粒的佐剂组合物，以及包含该聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒和抗原的疫苗组合物。包含该聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒的佐剂的毒性和副作用很小或没有，并且被添加到预防和治疗病毒及细菌感染以及癌症的人类或动物疫苗中，增加抗体的产生。

Description

包含聚γ谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒的佐剂组合物
技术领域
本发明涉及包含聚γ谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒的佐剂组合物以及包含所述佐剂组合物的疫苗组合物，更具体地，本发明涉及包含借助壳聚糖和有安全保证的聚γ谷氨酸之间的离子键合制备的纳米颗粒的佐剂组合物，以及包含所述聚γ谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒和抗原的疫苗组合物。
背景技术
佐剂是可以用于产生抗原性增加的疫苗或者用于通过增加对抗原的非特异性免疫反应而达到治疗和预防目的的材料。由于抗原水平低时，佐剂用来在较长时间内维持针对抗原的强烈且快速的免疫反应，这些佐剂可以用于疫苗制备。此外，佐剂使得能够使用特殊抗原或者能够改变抗原水平，从而调节针对抗原的免疫反应或者控制针对抗原的抗体类型和亚类。此外，佐剂可以用以增强免疫反应，特别是对免疫不成熟或衰老的人，提高粘膜免疫性的诱导。
大部分佐剂是通过反复实验而在许多天然材料中发现的。在1925年，世界范围内第一次对佐剂的报道中，Ramon(法国)报道，在食品中使用的木薯淀粉(Casaba)与白喉和破伤风类毒素混合，将有效地增加抗原特异性抗体的产生。从那时起，报道了铝佐剂的免疫增强作用，并开发了作为免疫调节剂的包含失活的灭活分枝杆菌的有效的乳液型佐剂。弗氏完全佐剂(FCA)被公认为非常有效的免疫调节剂，但是由于它的高反应原性，不适合人类使用。出于这个原因，英国开发并批准了不含分枝杆菌的弗氏不完全佐剂(FIA)。据报道，革兰氏阴性细菌内毒素具有免疫增强作用，1974年Ellouz等人证实了胞壁酰二肽(MDP)的作用(Ellouz F.et al.，Biochem.Biophys.Res.Coomun.59：1317-25，1974)。此后，有报道称卵磷脂、皂素及其类似物也可作为佐剂来增强免疫性。
理想的佐剂应具有免疫增强作用并且应该是无毒、高度生物可降解、易于使用、易于获得且廉价的。迄今为止，已经报道了许多类型的佐剂，但只有几种类型的佐剂可以实际用于临床实践。这是因为，在开发用于疫苗的佐剂时，安全性是最重要的，应该有可靠的研究数据予以支持。
疫苗有治疗和预防作用，可以使99％的疾病的发生率得以降低。因此，疫苗是具有较高性价比的药物。目前，疫苗的使用不仅仅局限于传染病，也正在扩展到各种难治的疾病，包括癌症和自身免疫疾病。此外，由于治疗性疫苗的出现，人们意识到发展疫苗是非常重要的。因此，佐剂作为疫苗相关产品的发展正与疫苗的发展一起得以促进。随着免疫相关疾病范围的扩展，人们意识到开发新型佐剂是很有前景的领域。
同时，本发明的发明人取得了有关高分子量聚γ-谷氨酸及其应用的专利(韩国专利登记号：399091)、关于使用枯草杆菌chungkookjang变种(Bacillussubtilis var.chungkookjang)—一种生产高分子量聚γ谷氨酸的耐盐性的菌株—生产聚γ-谷氨酸的方法专利(韩国专利登记号：500796)以及有关抗癌组合物、佐剂、免疫增强剂和病毒感染抑制的专利(韩国专利登记号：496606、517114、475406和0873179)。此外，本发明人报道了含有聚γ-谷氨酸的透明质酸酶抑制剂(韩国专利注册号582120)，并发现基于聚γ-谷氨酸的免疫增强作用的抗癌作用[Poo，H.R.et al.，Journal of Immunology，178：775，2007，Poo，H.R.et al.，CancerImmunol Immunother(2009年3月18日在线出版)]。也就是说，本发明人进行了广泛的研究以开发聚γ-谷氨酸的应用，包括聚γ-谷氨酸的医药用途，从而找到了聚γ-谷氨酸的各种效果。
同时，聚合物纳米颗粒，尤其是由可生物降解的聚合物，例如聚己内酯，制成的纳米颗粒，正由于其高度的生物相容性而受到极大的关注。然而，这些纳米颗粒的缺点在于它们在本质上是疏水的，因此不适合递送亲水性药物或抗原。
已经报道了聚γ-谷氨酸在体内递送蛋白质或增强体液免疫的应用中的实例(Akagi，T.et al.，J.controlled release，108：226，2005；Uto，T.et al.，，the J，Imunol.，178：2979，2007)。然而，当聚γ-谷氨酸单独用作佐剂时，它不具有足够的产生抗体的能力。因此，需要进一步加强聚γ-谷氨酸诱导抗原特异性免疫的能力。
壳聚糖是阳离子多糖，是脱乙酰形式的甲壳素，它无毒且具有高度生物相容性。此外，已知壳聚糖是可以打开细胞间紧密连接的材料，因而在黏膜药物递送体系中是非常有效的。大多数壳聚糖具有50-2000kDa的分子量，且溶解于乙酸溶液(pH 4)。然而，为了使壳聚糖作为药用材料使用，壳聚糖应保持在中性pH的水溶液中。为了在生理pH值的阳离子水溶液中保持壳聚糖，有必要用纤维素酶处理壳聚糖，以降低分子量。
聚γ-谷氨酸和壳聚糖纳米颗粒的复合物是离子键合的聚γ-谷氨酸和壳聚糖复合物，并用作口服递送的胰岛素的载体或DNA递送的载体，但是尚未有其应用于诱导免疫应答的报道(Lin，Y.et al.，Biomacromolecules，6：1104，2005；Lin，Y.et al.，Nanotechnology，16：105102，2007)。
因此，本发明人进行了广泛的努力以克服现有技术中存在的上述问题，结果发现，与聚γ-谷氨酸单独作为佐剂使用相比，当将包含有通过聚-γ谷氨酸和壳聚糖之间的离子键合而制备的纳米颗粒的佐剂与各种抗原一起给予小鼠时，产生的抗体显著增加，从而完成了本发明。
发明内容
本发明的目的是提供具有优异的诱导抗原特异性免疫反应能力的含有聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒的佐剂组合物。
本发明的另一个目的是提供含有聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒和抗原的疫苗组合物。
本发明的再另一目的是提供制备包含聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒和抗原的疫苗的方法。
为了实现上述目标，本发明提供了含有聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒的佐剂组合物。
本发明还提供了通过将佐剂组合物与抗原一起给予不包括人类的动物而提高针对所述抗原的抗体产量的方法。
本发明还提供了包含聚γ-谷氨酸壳聚糖纳米颗粒和抗原的疫苗组合物。
本发明还提供了制备疫苗的方法，所述疫苗包含通过离子键结合到表面带负电荷的抗原上的聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒，所述方法包括步骤：(a)将壳聚糖通过离子键结合到表面带负电荷的抗原上；以及(b)向键合到壳聚糖上的抗原中加入聚γ-谷氨酸，以在壳聚糖和聚γ-谷氨酸之间形成离子键，从而制备包括聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒和所述抗原的疫苗。
本发明还提供了制备疫苗的方法，所述疫苗包含通过离子键结合到表面带正电荷的抗原上的聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒，所述方法包括步骤：(a)将聚γ-谷氨酸通过离子键结合到表面带正电荷的抗原上；以及(b)向键合到聚γ-谷氨酸上的抗原中加入壳聚糖，以在聚γ-谷氨酸和壳聚糖之间形成离子键，从而制备包括聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒和所述抗原的疫苗。
本发明还提供了通过向除人类之外的动物给予疫苗组合物，提高针对抗原的抗体产量的方法。
通过下面的详细描述和随附的权利要求书，本发明的其他特征和实施方式将更加显而易见。
附图说明
图1是聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒的显微照片。
图2是一组聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒的激光共聚焦荧光显微照片，其引入FITC标记的OVA以考察依据蛋白质的添加顺序，抗原蛋白质的引入比率。
图3示出为了观察OVA抗原对体液免疫的作用，将含有多种分子量的谷氨酸的聚γ-谷氨酸(PGA)-壳聚糖纳米颗粒与OVA混合后，通过测量OVA特异性血清IgG，测定的OVA-特异抗体的产生结果。
图4示出向小鼠注射OVA与具有不同电荷的聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒的混合物后，与弗氏佐剂比较，观察OVA特异性抗体产生和测量OVA特异性血清IgG产生的结果。
图5示出由含有各种分子量的PGA的PGA-壳聚糖纳米颗粒活化的IFN-γ-分泌CD8+T细胞的流式细胞仪分析结果，用来考察由于聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒，小鼠脾脏中的T细胞对OVA的细胞免疫反应。
图6示出流式细胞仪分析的IFN-γ-分泌CD8+T细胞分布的结果，用来考察经以不同混合顺序制备的聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒依据树突状细胞与T细胞的混合比例的T细胞活化。
图7示出为考察AI蛋白特异性抗体的产生，向小鼠皮下注射AI蛋白和聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒混合物或者向小鼠鼻腔给予该混合物后，测量的AI特异性血清IgG结果。
图8示出为了考察聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒诱导中和抗体的能力，使用HI(血凝抑制)测试方法，测量小鼠血清抗体滴度的结果。
图9是示出为了考察纳米颗粒产生抗体的能力，皮下注射或鼻腔给予聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒一段时间后，观察到的经病毒感染的小鼠的死亡数目变化的图表。
图10示出为了考察流感疫苗的抗原特异性抗体的产生，在向小鼠的肌肉中注射流感疫苗抗原与聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒混合物后，测量疫苗抗原特异性血清IgG的结果。
图11是示出为了考察混合物产生抗体的能力，肌肉注射流感疫苗抗原与聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒混合物一段时间后，观察到的经病毒感染的小鼠的体重变化的图表。
图12是示出为了考察混合物产生抗体的能力，肌肉注射流感疫苗抗原与聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒混合物一段时间后，观察到的经病毒感染的小鼠的死亡数目变化的图表。
发明的最佳实施方式
本发明涉及包含聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒的佐剂组合物以及包含聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒和抗原的疫苗组合物。
在本发明中，将通过聚γ-谷氨酸羧基反应基团的负电荷与壳聚糖的氨基反应基团质子化的正电荷之间的静电相互作用而形成的纳米颗粒用作聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒。
根据本发明的聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒是由简单的静电相互作用制备的，不具有对人体有害的蛋白质之间的交联，因此，这些纳米颗粒具有很高的安全性和有效性，从而适合作为佐剂使用。
聚γ-谷氨酸是由D和L-谷氨酸通过γ-谷氨酰键连接组成的粘性氨基酸聚合物，并且是芽孢杆菌(Bacillus sp.)菌株产生的天然的氨基酸材料。在本发明的一个方面，聚γ-谷氨酸通过发酵芽孢杆菌chungkookjang(Bacillus substilischungkookjang)(KCTC0697BP)制备，并且具有1-15,000kDa的平均分子量。
在本发明中，聚γ-谷氨酸可以通过合适的方法被切割成具有理想的分子量的片段，或者可以通过合适的方法被分离成具有理想的分子量的片段。
根据本发明的包含本发明聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒的佐剂是通过聚γ-谷氨酸与壳聚糖之间的简单的离子键合而不是通过化学结合来制备的，因而是具有高度的安全性、生物相容性和抗体产生能力的佐剂材料，所述聚γ-谷氨酸是通过发酵芽孢杆菌chungkookjang生产的生物聚合物。
用于制备本发明的聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒的聚γ-谷氨酸的分子量优选是50kDa-15,000kDa。如果聚γ-谷氨酸的分子量小于50kDa，其免疫增强作用将较低，而如果聚γ-谷氨酸的分子量大于15,000kDa，将会产生与其增加的粘度相关的问题。
在本发明中，壳聚糖的分子量优选是500Da-1,000kDa。如果壳聚糖的分子量小于500Da，将难以制备壳聚糖纳米颗粒，而如果壳聚糖的分子量大于1,000kDa，在中性水溶液中的溶解度将较低。
在本发明中，可以通过在制备聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒时增加聚γ-谷氨酸的比率来制备表面带负电荷的纳米颗粒。
在本发明中，所述聚γ-谷氨酸的表面可以是带负电荷的。
根据本发明的聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒不是通过化学方法，而是通过简单的离子反应来制备的，因而毒性低且安全性高。
在根据本发明的包含聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒的佐剂组合物中，基于重量(干重)计的100份疫苗组合物，可以包含以重量计0.001-5份聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒，优选以重量计0.01-3份。如果基于重量(干重)计的100份疫苗组合物中包含的聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒以重量计，小于0.001份，所述组合物将不具有产生抗体的能力，而如果包含的聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒的量按重量计超过5份，所述组合物的粘度将大大增加。
在本发明中，包含于疫苗组合物中的抗原，可以选自蛋白质、肽、核苷、核苷酸、病毒、抗病毒剂、抗肿瘤剂、抗生素和抗炎剂，等。
在本发明中，疫苗组合物可以用于预防或治疗由选自禽流感病毒、猪流感病毒和新型流感病毒中的任何一种或多种病毒引起的疾病。此外，疫苗组合物可用于预防或治疗选自由子宫颈癌、黑色素瘤皮肤、前列腺癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、头颈部癌、外阴癌、膀胱癌、脑癌和脑胶质瘤组成的组中的一种或多种疾病。
在另一方面，本发明涉及制备疫苗的方法，所述疫苗包含与表面带负电荷的抗原离子键合的聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒，所述方法包括步骤：(a)将壳聚糖离子键合至表面带负电荷的抗原上；及(b)向已键合至壳聚糖的抗原中添加聚γ-谷氨酸，在壳聚糖和聚γ-谷氨酸之间形成离子键，从而制备包含聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒和抗原的疫苗。
在制备本发明的聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒时，如果被键合的抗原或病毒带正电荷，那么聚γ-谷氨酸首先键合到所述抗原或病毒上，然后壳聚糖被键合，如果抗原或病毒带负电荷，那么壳聚糖首先被键合到所述抗原或病毒上，然后，聚γ-谷氨酸添加到其上，从而得到的聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒可以更有效地起到佐剂的作用。
在再另一个方面，本发明涉及制备疫苗的方法，所述疫苗包含与表面带正电荷的抗原离子键合的聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒，所述方法包括步骤：(a)将聚γ-谷氨酸离子键合至表面带正电的抗原上；及(b)向已键合至聚γ-谷氨酸的抗原中添加壳聚糖，在聚γ-谷氨酸和壳聚糖之间形成离子键，从而制备包含聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒和抗原的疫苗。
在又另一个方面，本发明涉及通过向不包括人类的动物一起给予佐剂组合物与抗原，或通过向不包括人类的动物给予疫苗组合物来提高产生针对该抗原的抗体的方法。
在本发明中，给药是通过选自由皮下注射、肌肉注射、皮内注射、腹腔注射、鼻腔给药、口服给药以及透皮给药组成的组中的任何一种而实现的。
在包含聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒的佐剂组合物或疫苗组合物中可以包含的载体、赋形剂和稀释剂的实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、淀粉、甘油、皂荚胶、海藻酸钠、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、甲基羟苯酸酯、羟基苯甲酸丙酯(propylhydroxybenzoate)、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。对于制剂，也可使用常用的稀释剂或赋形剂，如填充剂、膨胀剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂和表面活性剂等。非经肠道给药的制剂包括灭菌水溶液、非水溶剂、悬剂、乳剂、冻干剂、栓剂等。非水溶剂和悬剂可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、或可注射酯类如油酸乙酯来制备。
包含本发明的聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒的佐剂的剂量可以随着受试者的年龄、性别和体重、给药途径以及疾病的严重程度而变化。
此外，本发明的聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒可添加到包括用于预防和治疗癌症的预防或治疗性疫苗的药用组合物中，所述癌症尤其是皮肤黑色素瘤、前列腺癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、头颈部癌、外阴癌、膀胱癌、脑癌、和神经胶质瘤，以及慢性非传染性疾病。
实施例
下文将参照实施例进一步详细描述本发明。对本领域技术人员来说显而易见的是，这些实施例仅仅用于解释的目的，而非用于限制本发明的范围。
实施例1：超高分子量聚-γ-谷氨酸的制备
配制用作生产聚-γ-谷氨酸的基础培养基(补充3％L-谷氨酸；包含葡萄糖3％，(NH4)2SO4 1％，KH2PO4 0.27％，Na2HPO4·12H2O 0.17％，NaCl 0.1％，柠檬酸钠0.5％，大豆蛋白胨0.02％，MgSO4·7H2O 0.7％，维生素溶液10ml/L，PH 6.8)并灭菌。将芽孢杆菌chungkookjang(Bacillus subtilis var.chungkookjang)(KCTC0697BP)的培养基(LB培养基)以4％的浓度接种到5L发酵罐(工作体积3L)的培养基中，并以500rpm搅拌速度、1vvm吹气速率和37℃发酵48小时。接着使用小压滤机(1％硅藻土)移除细菌细胞，将剩余材料作为包含聚-γ-谷氨酸的样品溶液使用。
用2N硫酸溶液将包含聚-γ-谷氨酸的样品溶液的pH调节到2.0，然后于10℃或更低温度静置15小时，从而获得聚γ-谷氨酸沉淀。将得到的材料用足量的pH3.5或更高的冷蒸馏水(10℃或更低)冲洗，然后通过Nutsche过滤器过滤，收集聚γ-谷氨酸，然后冷冻干燥，从而制备超高分子量聚γ-谷氨酸。
实施例2：聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒的制备
使用在实施例1中制备的聚γ-谷氨酸和壳聚糖(Amicogen有限公司，韩国)来制备作为佐剂的纳米颗粒。
具体地，将聚γ-谷氨酸和壳聚糖溶解在0.85％的NaCl溶液中。将聚γ-谷氨酸溶液和壳聚糖溶液以1∶1-8∶1(聚γ-谷氨酸∶壳聚糖)的比例彼此混合，从而制备表面带负电荷的聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒。使用DLS(动态光散射)测量所制备的纳米颗粒的颗粒大小和表面电荷。结果看出，所制备的纳米颗粒具有200-300nm的颗粒大小和-20.8mV的表面电荷。此外，用电子显微镜观察所制备的纳米颗粒的表面形貌(见图1)。
[表1]聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒的颗粒大小和表面电荷
颗粒大小(nm)   表面电荷(mV)
  聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒(负电荷)   263   -20.8
实施例3：使用多种添加目标蛋白质的顺序制备聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒
为了验证实施例2制备的聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒作为佐剂来增强产生对相应蛋白的抗体的功能，测定所述相应蛋白的pI值，并使用所述蛋白质的多种添加顺序来制备纳米颗粒。首先，使通过将荧光物质FITC键合至OVA蛋白(Sigma公司，美国)获得的pI值为5.2的OVA-FITC键合至聚γ-谷氨酸-纳米颗粒。具体地，制备下述两种纳米颗粒：通过混合聚γ-谷氨酸和OVA-FITC，然后向其中加入壳聚糖而制备的纳米颗粒，以及通过混合壳聚糖与OVA-FITC，然后向其中加入聚γ-谷氨酸而制备的纳米颗粒。用荧光显微镜观察在所制备的纳米颗粒中的OVA的键合程度。
结果如图2所示，通过混合壳聚糖和OVA-FITC然后向其中加入聚γ-谷氨酸而制备的纳米颗粒样品，在其表面和内部显示出较轻的荧光。相信这是因为OVA在中性pH时带负电荷，从而更大量的OVA被引入到通过将OVA与带正电的壳聚糖键合然后加入聚γ-谷氨酸而制备的纳米颗粒样品中。
实施例4：聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒增强OVA特异性抗体的产生
在该实施例中，为了考察本发明的聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒是否显示出增强OVA抗原特异的免疫性的作用，考察了纳米颗粒对抗体特异性免疫反应中的B细胞介导的体液免疫反应(与抗体产生相关)的作用。
首先，在对照中，将OVA(100μg)与分子量5000kDa的聚γ-谷氨酸混合，并注射到C57/BL6小鼠的腹腔中。在测试组中，将具有分子量50kDa、500kDa、2000kDa、5000kDa和7000kDa的聚γ-谷氨酸各与壳聚糖混合，制备纳米颗粒，所述纳米颗粒接着与OVA(100μg)混合，并注射到C57/BL6小鼠的腹腔中。
另外，使用多种添加目标蛋白的顺序，用分子量为7000kDa的聚γ-谷氨酸来制备聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒。具体地，制备下述的纳米颗粒：通过混合聚γ-谷氨酸与壳聚糖，然后向其中添加OVA而制备的纳米颗粒，以及通过混合壳聚糖与OVA，然后向其中加入聚γ-谷氨酸而制备的纳米颗粒。作为对照，OVA与聚γ-谷氨酸或CFA一起注射。
每种样品都向小鼠腹腔注射两次，每周一次，注射后第3周收集小鼠血清，用ELISA(酶联免疫吸附分析)测量血清中的抗OVA抗体滴度。
在ELISA分析中，用PBS/5％脱脂牛奶封闭OVA(0.5μg/ml)包被的板，之后，将对照组和试验组的血清系列稀释为各种浓度，并于37℃在板上培养。然后，加入辣根过氧化物酶缀合的小鼠IgG抗体(特异于Fc)。进行1小时的板封闭和小鼠IgG抗体的添加，接着孵育血清2小时。上述每一步骤之后，用PBS/0.05％吐温20洗涤三次。将100μl的TMB(四甲基联苯胺(BDBiosciences，美国))作为底物加入使反应进行，之后，用ELISA酶标仪测量在450nm处的吸光度。
结果如图3所示，一起注射聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒(具有各种分子量)以及OVA的小鼠对OVA的抗体滴度明显高于注射OVA和聚γ-谷氨酸混合物的小鼠对OVA的抗体滴度。
另外，如图4所示，注射通过混合壳聚糖和聚γ-谷氨酸接着添加OVA而制备的纳米颗粒的小鼠中的抗体滴度与注射混合壳聚糖和OVA然后向其中添加聚γ-谷氨酸而制备的纳米颗粒的小鼠的抗体滴度相似。
实施例5：聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒增强细胞介导的免疫反应
考察由于聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒，小鼠脾脏中的细胞介导的T细胞对OVA的免疫反应。从实施例4处理的小鼠中，每组选择5只小鼠，移除每只小鼠的脾脏。将脾脏组织转移到灭菌的Petri盘中，用细胞滤网碾磨，并从碾磨后的组织被膜(tissue capsule)中分离细胞。将Petri盘中的所有内容物转移到装有RPMI培养基的15ml的试管中。接着将试管中的内容物以1,500rpm离心5分钟，移去上清。向沉淀中加入3ml的血红细胞裂解缓冲液(Sigma Aldrich，德国)，接着使其在37℃水箱中静置10分钟，裂解红细胞。用PBS洗涤试管中的细胞，接着悬浮于RPMI 1640培养基中以分离脾细胞。将经分离的脾细胞以1x106细胞/ml的密度涂布于24孔板上，并用2μl Golgi plug和1μg/ml的MHC I类限制的OVA肽处理12小时。然后将该细胞用CD8-特异抗体(PE-缀合的抗鼠CD8)在4℃染色1小时，所述CD8是T细胞表面分子。然后，用Cytofix/Cytoperm试剂盒(BD Biosciences，美国)穿孔细胞，并用IFN-γ特异抗体(FITC缀合的抗小鼠IFN-γ)染色细胞中的IFN-γ。
结果如图5所示，与对照组相比，聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒(包含各种分子量的聚γ-谷氨酸)促进了IFN-γ-分泌CD8+T细胞的活化。
此外，在使用多种抗原蛋白质添加顺序而制备的纳米颗粒情形下，如图6所示，与通过混合聚γ-谷氨酸和壳聚糖然后向其中加入OVA制备的纳米颗粒相比，通过混合壳聚糖和OVA然后向其中添加聚γ-谷氨酸制备的纳米颗粒，具有更高的诱导IFN-γ-分泌CD8+T细胞活化的能力(参见图6)。
实施例6：聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒增强对AI蛋白的细胞介导的免疫反应
在该实施例中，为考察本发明的聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒是否显示出增强对禽流感病毒(AIV)特异的抗原蛋白血凝素(HA)的特异免疫的作用，考察了纳米颗粒对抗体特异的免疫反应中B细胞介导的体液免疫反应(与抗体生产相关)的作用。
在实验中的HA蛋白是已知的具有主要的中和禽流感病毒抗体的表面抗原的HA(血凝素)[A/chicken/Korea/IS2/2006(H5N1)](Yong-Jeong Lee et al.EmergingInfectious Diseases.2008.14：487-490)。具体地，通过PCR合成与GenBank登录号EU233683相应的基因，将合成的基因插入到大肠杆菌表达载体(pRSET)中，在大肠杆菌中表达重组抗原蛋白并纯化抗原蛋白(Langzhou Song et al.PLoS ONE，2008.e2257)来制备。
作为对照组，将HA蛋白(7.128μg)单独皮下注射或鼻腔给予小鼠。在测试组中，将通过混合具有7000kDa的分子量的聚γ-谷氨酸和壳聚糖而制备的纳米颗粒，与HA蛋白(7.128μg)混合，并皮下注射或鼻腔给予小鼠。
第一次皮下注射或鼻腔给药后，以1周的间隔收集小鼠血清，并用ELISA(酶联免疫吸附分析)测量血清中针对HA蛋白的抗体滴度。
在ELISA分析中，将经HA蛋白包被的板用PBS/5％胎牛血清封闭，然后以各种稀释比率孵育对照组和试验组的血清。然后，向其中加入辣根过氧化物酶缀合的小鼠IgG抗体(特异于Fc)。所有的孵育在37℃进行1小时，在上述每一个步骤后，用PBS/0.05％吐温20洗涤三次。将1mg/ML的ABTS(2，2’-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)作为底物加入使反应进行，30分钟后，用ELISA酶标仪测量在450nm处的吸光度。
结果如图7所示，在经皮下注射或者鼻腔给予聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒和HA蛋白的小鼠中的抗HA蛋白抗体滴度，高于单独经皮下注射或者鼻腔给予HA蛋白的小鼠中的抗体滴度。
实施例7：聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒诱导中和抗体的能力
通过下列方式的HI(血凝抑制)测试方法测量各组小鼠血清中的抗体滴度。
用3倍体积的自霍乱弧菌(Vibrio cholerae)中提取的RDE(受体破坏酶，receptor-destroying enzyme)处理所有的血清(例如向30μl的RDE中加入10μl血清)，然后在培养箱中37℃孵育18-20小时。将去除血清中非特异性受体活性而获得的样品，在96孔圆底烧瓶中经每次25μl连续2倍稀释。然后，将相同体积的4HAU病毒加入血清样品中，并在37℃孵育30分钟。最后，向每孔中加入50μl含有0.5％鸡红细胞的PBS并在室温下孵育40分钟。计算在50μl稀释血清中的抗体滴度，并用log10N＝10N中的N值表示。
结果如图8所示，在皮下注射或鼻腔给予聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒和AI蛋白的试验组中，抗病毒的抗体滴度增加。
实施例8：聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒增强对抗病毒的免疫作用的效果
在该实施例中，为了考察聚γ-谷氨酸壳聚糖纳米颗粒的免疫增强作用，观察了感染了流感病毒的实验动物的死亡。
(1)病毒的准备
作为病原体，使用的流感病毒是在小鼠体内显示出高致病性的H1N1流感病毒株(A/Puerto Rico/8/34(H1N1))，其由忠北国立大学医学院微生物学系Young-KiChoi教授提供。病毒株在Madin Darby狗肾(MDCK)细胞中扩增，然后在实验中使用。使用6周龄雌性Balb/c小鼠作为实验动物。
通过下面的方式进行病毒株的纯化。
首先，将经分离的病毒在含有抗生素的PBS中稀释，并接种到受精的10天龄白莱航鸡蛋中。然后，受精后的病毒在37℃静置孵育48小时，之后，取受精卵的尿囊液获得经扩增的病毒。
同时，将MDCK细胞在6孔细胞培养板中的含青霉素、链霉素和5％胎牛血清(FBS)的α-MEM(最小必需培养基，MEM，Gibco公司，美国)中培养，并用PBS洗涤3次。然后，用含青霉素和链霉素(以下简称为“P/S”)的无FBS培养基稀释细胞，将培养板的每个孔用经稀释的病毒感染，接着在5％CO2培养箱中37℃培养1小时。向每孔中加入含有0.1％TPCK(N-α-对甲苯磺酰基-L-苯丙氯酮)处理的胰蛋白酶EDTA和P/S的无FBS的α-MEM培养基，并在培养箱中孵育。孵育24小时后，用PBS洗涤细胞培养板，并用包含0.1％的高贵级琼脂(noble agar)的培养基固定。
将经培养的噬菌斑接种到其中培养有MDCK细胞的24孔板的每孔中，接着向培养板的每孔中加入含有0.1％TPCK处理的胰蛋白酶EDTA和P/S的无FBS的α-MEM培养基，并于培养箱中孵育。48小时后，取每孔中的培养基并离心，将上清液感染如上所述的以相同的方式准备的MDCK细胞烧瓶。接着培养细胞36-48小时，离心细胞培养物。将上清液转移到微管中并于-80℃冰箱中保存，直到在动物试验中使用。
(2)动物试验
在对照组中，使用仅皮下注射或鼻腔给予流感病毒的小鼠。在测试组中，将聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒与AI抗原蛋白混合，然后皮下注射或鼻腔给予小鼠，并在第二天，用流感病毒感染小鼠。
为了用病毒感染，将实验动物用乙醚麻醉30秒，然后将30μl病毒(1.25x105EID50)给予到每只小鼠的鼻腔中。
结果如图9所示，对照组的所有小鼠在给予病毒8天后死亡，但在给予聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒与AI蛋白混合物的组中，所有小鼠都在给予病毒后存活了高达11天。因此，可以得出的结论是聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒诱导对AI蛋白质的抗体的产生，抑制病毒的感染，从而使小鼠存活。
实施例9：聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒增强对抗流感病毒的免疫力的作用
在该实施例中，为了考察聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒增强对抗流感病毒的免疫的影响，考察了聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒对流感疫苗的佐剂作用。
(1)流感疫苗
用作抗原的流感疫苗是H1N1流感病毒株(A/California/07/09(H1N1病毒))的疫苗抗原。
(2)实验动物
在对照组中，小鼠仅仅肌肉注射PBS。在测试组中，使用下面的小鼠：单独肌肉注射流感疫苗(0.2μg)的小鼠；肌肉注射流感疫苗(0.2μg)与铝佐剂混合物的小鼠；以及肌肉注射流感疫苗(0.2μg)与聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒(800μg)混合物的小鼠。
为了接种疫苗，将每个样品在2周的时间间隔内(第0天和第14天)肌肉注射两次。接种后14天，收集血清，用ELISA(酶联免疫吸附分析)测量血清中抗流感疫苗抗原的滴度。
在ELISA分析中，用PBS/1％BSA封闭包被流感疫苗抗原的板，对照组和试验组的所有血清都以不同的稀释比率孵育。然后，将辣根过氧化物酶缀合的鼠IgG抗体、IgG2a抗体和IgG1抗体各加入其中。所有的孵育都在37℃进行1小时，每一步骤后，将板用PBS/0.05％Tween20洗涤三次。添加100μl的TMB(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)A液和B液的1∶1混合物作为底物，使反应进行，此后，加入50μl 0.5N的H2SO4溶液以终止反应，然后用ELISA酶标仪在450nm测量吸光度。
结果如图10所示，在肌肉注射聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒和流感疫苗抗原的小鼠中对疫苗抗原的抗体滴度高于单独肌注流感疫苗的小鼠或流感疫苗和铝佐剂混合物的小鼠中的抗体滴度。
实施例10：聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒诱导中和抗流感病毒抗体的能力
通过下列方式的HI(血凝抑制)测试方法测量各组小鼠血清中的抗体滴度。
将所有的血清用10倍体积的自霍乱弧菌(Vibrio cholerae)中提取的RDE(受体破坏酶)进行处理，然后在培养箱中37℃孵育18小时。将去除血清中非特异性受体活性而获得的样品在96孔圆底烧瓶中经每次25μl连续2倍稀释。然后，向血清样品中加入相同体积的4HAU病毒(A/California/04/09(H1N1))并在室温下孵育30分钟。最后，向每孔中加入50μl含有0.5％火鸡红细胞的PBS，然后在室温下孵育30分钟。计算在50μl稀释血清中的抗体滴度，并用log10N＝10N中的N值表示。
结果如下表2所示，在注射聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒和流感疫苗抗原的小鼠中，抗体滴度约高出单独注射流感疫苗的小鼠或注射流感疫苗和铝佐剂混合物的小鼠中的抗体滴度的约5-6倍。
[表2]
aHI抗体滴度是通过在CA/04(H1N1)病毒的凝集被4HA单位病毒抑制的条件下，与最高稀释浓度的血清比较来测量。以阳性血清的几何平均数(≥10)表示。阳性血清的数量在括号中表示(阳性血清数/总血清数)。
实施例11：聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒对流感病毒感染的抗性
在各组最后一次接种14天后，给予流感病毒(A/California/04/09(H1N1))。
为了感染病毒，将实验动物麻醉，然后向每一动物鼻腔给予30μl病毒(107.25EID50)。
结果如图11和12所示，在肌肉注射单独的疫苗或者疫苗和铝佐剂混合物组中，小鼠的体重在病毒感染后2天开始下降，但在注射聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒和流感疫苗的混合物组中，并没有出现由病毒感染引起的体重下降。此外，在对照组中，所有的小鼠都在给予病毒5天后死去，但在注射聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒和流感疫苗的混合物组中，所有的小鼠在给予疫苗后存活高达14天。然而，在单独给予疫苗以及给予铝佐剂与疫苗的混合物组中，只有50％的小鼠存活。
因此，得出结论：聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒诱导针对流感疫苗的抗体的产生以抑制病毒的感染，从而使小鼠存活。
工业实用性
根据本发明的包含聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒的佐剂是通过有安全保证的天然材料之间的简单的离子键合来制备的，因此毒性和副作用很小或没有。此外，它可以与低免疫原性的抗原一起使用，表现出高的抗体滴度，并因此可用于佐剂组合物和包含该佐剂组合物的疫苗组合物。此外，聚γ-谷氨酸和壳聚糖的添加顺序，可以根据引入的抗原和病毒的表面电荷而调整，借此可以增加抗原和纳米颗粒之间的结合比率，因而疫苗组合物可以表现出更高的抗体滴度。

Claims (1)

1.一种制备包含聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒和表面带负电荷的抗原的疫苗的方法，所述方法包括步骤：(a)将壳聚糖离子键合至表面带负电荷的抗原上；及(b)向已键合至所述壳聚糖的所述抗原中添加聚γ-谷氨酸，以形成所述壳聚糖和所述聚γ-谷氨酸之间的离子键，从而制备包含键合至所述抗原的聚γ-谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒的所述疫苗。
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